CN108680637A - 基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物的非同位素双标记绝对定量检测方法和相对定量检测方法，以两种结构类似的N取代马来酰亚胺衍生物分别作为非同位素标记试剂对巯基进行特异性标记，然后以质谱信号强度比以及样品浓度或浓度比作为坐标，得到标准曲线，进而对目标分析物进行定量分析。本发明选用的非同位素标记试剂成本低廉，反应迅速，标记效率高，反应条件简单温和快速，可对不同序列多肽进行质谱定量分析，并可同时实现绝对与相对定量。同时适用面广，只要含有巯基的大分子化合物都能适用，可同时检测多个目标分析物。该技术可用于测定纳米材料表面吸附的蛋白含量，定量检测含半胱氨酸的多肽类疾病标志物，分析含巯基多肽类药物代谢情况等。
Description
技术领域
本发明涉及大分子质谱技术领域，尤其涉及一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记方法。
背景技术
大分子质谱是一种高通量分析技术，在快速分析生物大分子(核酸，蛋白质，多肽等)领域取得了很大的成功，因此成为蛋白质组学中最常用的分析手段。但是，质谱信号的强度严重依赖于样品的结晶情况，即使在同一样品点的不同区域，其信号强度也存在很大差异，降低了信号的重现性，因此无法实现定量分析的目的，严重阻碍了质谱技术在蛋白质组学分析中的应用。
同位素标记内标定量法已经作为合适的质谱定量技术成功应用在蛋白质组学分析中，并已有商业化产品面世。其中包括在细胞培养液中稳定的同位素标记(SILAC)，用于相对和绝对定量的同位素标签(iTRAQ)以及同位素编码亲和标签(ICAT)等。它们通过内标的引入能克服结晶不均一导致的信号不均一的缺点，实现质谱定量分析检测多肽和蛋白质。尽管同位素内标定量法具有很高的精确度，且能实现高通量分析，但是依然存在许多不足之处。如SILAC技术依赖于细胞培养过程中进行标记，iTRAQ依赖于二级质谱分析差异，且这些定量方法适用于大规模组学分析，对单一或者少量分析物来说性价比不高。ICAT试剂分子量过大，标记效率偏低。此外同位素试剂的高昂成本也限制了其在蛋白质组学中的广泛使用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记方法(DuMalTagging技术)，非同位素标记试剂成本低，效率高，可对不同序列多肽进行质谱定量分析，并可以同时实现绝对与相对定量的质谱定量分析。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记绝对定量检测方法，包括以下步骤：
A)采用第一标记试剂标记目标分析物标准品，记为内标；
B)采用第二标记试剂标记目标分析物标准品，并配置成具有浓度梯度的标准品组；
C)将步骤A)得到的内标分别与步骤B)得到的具有浓度梯度的标准品组等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测；
D)以质谱信号强度比为纵坐标，步骤B)得到的标准品组的浓度为横坐标作图，得标准曲线；
E)采用第二标记试剂标记目标分析物，与步骤A)得到的内标等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，根据步骤D)得到的标准曲线得到目标分析物浓度；
所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。
本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记相对定量检测方法，包括以下步骤：
a)将两组样品分别用第一标记试剂和第二标记试剂标记后，以不同浓度比混合进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测；
b)以质谱信号强度比为纵坐标，样品浓度比为横坐标，得到标准曲线；
c)根据标准曲线对目标分析物进行相对定量分析；
所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。
优选的，所述标记的条件为：
采用磷酸钠水溶液作为缓冲液，标记试剂与被标记物摩尔比为300～500:1，室温反应15～30min。
上述被标记物可以指代步骤A)、B)中的目标分析物标准品，步骤E)中的目标分析物，或步骤a)中的两组样品。
优选的，所述磷酸钠水溶液的浓度为10～100mM，pH值为5～7。
优选的，所述目标分析物为含半胱氨酸，且巯基处于还原态的多肽或蛋白酶解液。
优选的，所述第一标记试剂为N-甲基马来酰亚胺，第二标记试剂为N-乙基马来酰亚胺；
或者所述第一标记试剂为N-乙基马来酰亚胺，第二标记试剂为N-甲基马来酰亚胺。
与现有技术相比，本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记绝对定量检测方法和相对定量检测方法，以两种结构类似的N取代马来酰亚胺衍生物组合分别作为非同位素标记试剂对巯基进行特异性标记，然后以质谱信号强度比以及样品浓度或浓度比作为坐标，得到标准曲线，进而对目标分析物进行定量分析。本发明选用的非同位素标记试剂成本低廉，反应迅速，标记效率高，反应条件简单温和快速，分子量小，对质谱鉴定的干扰性小，可对不同序列多肽进行质谱定量分析，并可以同时实现绝对与相对定量。同时适用面广，只要含有巯基的大分子化合物都能适用，可同时检测多个目标分析物。该技术可用于测定纳米材料表面吸附的蛋白含量，定量检测含半胱氨酸的多肽类疾病标志物如铁调素等，分析含巯基的多肽类药物代谢情况等。
附图说明
图1为本发明标记反应的反应示意图；
图2为本发明绝对定量检测方法的流程和质谱分析图；
图3为本发明相对定量检测方法的流程和质谱分析图；
图4为NMM/NEM标记含巯基多肽CCP2的质谱图；
图5为CCP2绝对定量检测质谱图和标准曲线图；
图6为CCP2绝对定量检测应用质谱图；
图7为用DuMalTagging技术对CCP2进行相对定量检测的质谱图和标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记绝对定量检测方法，包括以下步骤：
A)采用第一标记试剂标记目标分析物标准品，记为内标；
B)采用第二标记试剂标记目标分析物标准品，并配置成具有浓度梯度的标准品组；
C)将步骤A)得到的内标分别与步骤B)得到的具有浓度梯度的标准品组等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)检测；
D)以质谱信号强度比为纵坐标，步骤B)得到的标准品组的浓度为横坐标作图，得标准曲线；
E)采用第二标记试剂标记目标分析物，与步骤A)得到的内标等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测，根据步骤D)得到的标准曲线得到目标分析物浓度；
所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。
本发明选用N-取代马来酰亚胺衍生物作为非同位素标记试剂对巯基进行特异性标记，优选的，所述N取代马来酰亚胺衍生物为N-甲基马来酰亚胺(式Ⅰ所示，记为NMM)或N-乙基马来酰亚胺(式Ⅱ所示，记为NEM)。
首先采用第一标记试剂标记目标分析物标准品，记为内标。
所述标记的条件优选为：
采用磷酸钠水溶液作为缓冲液，标记试剂与被标记物，即目标分析物标准品，摩尔比为300～500:1，室温反应15～30min。
更优选的，所述摩尔比为400:1。
所述磷酸钠水溶液的浓度优选为10～100mM，pH值为5～7。更优选的，所述磷酸钠水溶液的浓度为100mM，pH值为6。
本发明中，为防止过标记，可加入过量二硫苏糖醇(DTT)终止反应，再用透析或C18柱除盐的方式除去多余反应物和DTT。
上述标记的反应机理为迈克尔加成反应，反应示意图如图1所示。
同时，采用第二标记试剂标记目标分析物标准品，并配置成具有浓度梯度的标准品组。
上述标记过程同上，在此不再赘述。
两次标记没有先后顺序之分。
所述内标的浓度优选为100～500nM(纳摩尔每升)，在本发明的某些具体实施例中，所述内标的浓度为200nM。
所述标准品组的个数以及浓度、浓度梯度可以根据内标的浓度自行确定，本发明对此没有特殊限定。在本发明的某些具体实施例中，最大检测浓度与内标浓度的比值为10:1。
然后将上述得到的内标分别与具有浓度梯度的标准品组等体积混合，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪)检测。
检测得到质谱图后，以质谱信号强度比为纵坐标，上述标准品组的浓度为横坐标作图，得到线性拟合曲线，作为标准曲线。
最后采用第二标记试剂标记目标分析物(即待测样品)，与上述内标等体积混合，进行MALDI-TOF-MS检测，根据标准曲线得到目标分析物浓度。
本发明中，上述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺，且第一标记试剂和第二标记试剂不同。
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物，优选为生物大分子化合物，如蛋白、多肽、脂类、糖类、寡聚核苷酸类化合物或天然产物。
在本发明的某些具体实施例中，所述目标分析物为含有半胱氨酸的多肽或蛋白酶解液。
在本发明的某些具体实施例中，所述第一标记试剂为N-甲基马来酰亚胺，第二标记试剂为N-乙基马来酰亚胺。
在本发明的另外一些具体实施例中，所述第一标记试剂为N-乙基马来酰亚胺，第二标记试剂为N-甲基马来酰亚胺。
当第一标记试剂和第二标记试剂分别为N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺时，二者之间化学结构仅相差一个亚甲基，被标记物分子量分别增加111.13(NMM)和125.13(NEM)，对巯基标记反应特异性强，高效快速。
本发明中，所述第一标记试剂和第二标记试剂还可以独立的选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺。检测机理与方法同上。
上述定量检测方法内标与分析物之间具有高度相似的化学结构，通过标准曲线法对多肽进行精确定量分析；适用面广，可对一切含有巯基的生物大分子进行定量分析，且可同时分析多组样品。
上述绝对定量检测方法的流程和质谱分析如图2所示。
本发明还提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记相对定量检测方法，包括以下步骤：
a)将两组样品分别用第一标记试剂和第二标记试剂标记后，以不同浓度比混合进行MALDI-TOF-MS检测；
b)以质谱信号强度比为纵坐标，样品浓度比为横坐标，得到标准曲线；
c)根据标准曲线对目标分析物进行相对定量分析；
所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。
其中，两种样品，可记为样品1和样品2，可以是来源于不同处理条件或者细胞状态的多肽混合液样品，也可以是简单的一条多肽在不同背景中。若样品过于复杂，如细胞裂解液等，可在标记前先使用巯丙基琼脂糖凝胶6B树脂进行富集纯化，以降低样品复杂度，提高标记效率和目标分析物的相对丰度。相对丰度越高，拟合曲线线性范围越大，结果越可靠。
上述两组样品分别用第一标记试剂和第二标记试剂标记的条件同上，在此不再赘述。
上述第一标记试剂、第二标记试剂、目标分析物同上，在此不再赘述。
上述相对定量检测方法可用于分析两组不同处理条件样品直接的差异比较，可直观看出差异，且不需要知道目标分析物具体序列组成，通常用于未知样品的差异筛选，如巯基翻译后修饰分析等，且在复杂背景样品中同样适用。
上述相对定量检测方法的流程和质谱分析如图3所示。
本发明提供的上述绝对定量和相对定量的检测方法，可用于含巯基生物分子质谱检测、质谱定量、蛋白质组学、酶活性检测和疾病机理研究等领域。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于马来酰亚胺衍生物的非同位素双标记方法进行详细描述。
实施例1对多肽CCP2(CFRGLRGFK,分子量1083.33)进行标记，绝对定量与相对定量
1、标记反应：10μL(1mM，毫摩尔每升)CCP2添加到170μL 100mM Na3PO4溶液中(pH值6.0)，然后加入20μL新制的100mMNMM或NEM(马来酰亚胺/多肽，摩尔比例:400/1)，避光孵育15分钟后，将稀释后的混合物滴在靶板上，并在室温下干燥，然后进行质谱分析。对照组采用β-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液作为不含半胱氨酸的多肽混合物，分别在相同的条件下用NMM或NEM标记。标记后的质谱图见图4。
其中，(A)CCP2(m/z 1083.33)；(B)NMM标记的CCP2(m/z1194.46)；(C)NEM标记的CCP2(m/z 1208.46)；(D)β-酪蛋白酶解液；(E)β-酪蛋白酶解液和NMM混合物；(F)β-酪蛋白酶解液和NEM的混合物。纵坐标为强度，横坐标为质荷比。Δ表示CCP2,※表示NMM标记的CCP2，#表示NEM标记的CCP2。其中β-酪蛋白酶解液(不含半胱氨酸的多肽混合物)作为副对照来验证DuMalTagging技术对半胱氨肽的标记特异性。
2、绝对定量检测：以200nMNMM-CCP2为内标，与一系列不同浓度的NEM-CCP2等体积混合。随后，用MALDI-TOF MS对样品进行定量检测。检测结果见图5，图5是CCP2绝对定量质谱图和标准曲线图。
其中，(A-E)依次为NEM-CCP2以15.6、31.3、125、500和2000nM的浓度与200nMNMM-CCP2等体积混合，其中NMM-CCP2作为内标。(F)为质谱信号强度比(IE/IM)对NEM-CCP2浓度的线性拟合曲线(R2＝0.994)。误差条为标准偏差(n＝3)。※表示NMM标记的CCP2，#表示NEM标记的CCP2。
绝对定量检测：将200nM的NEM-CCP2与内标(200nM)的NMM-CCP2混合，测质谱，测试四个不同的样品点，计算出强度比的平均值，再代入标准曲线方程中，计算出浓度，并与实际值比较。结果如图6所示，强度比分别为0.789(图A)；0.798(图B)；0.791(图C)；平均值为0.793。取对数值代入y＝1.38x-3.22得x＝2.26。因此测定的浓度为102.26＝182nM。误差为(200-182)/200＝9％。结果比较精确。
3、相对定量检测：CCP2的溶液(50μM)分别被NMM和NEM标记，然后稀释至200nM作为母液。对于相对定量，采用梯度稀释法，将NMM标记的CCP2和NEM标记的CCP2稀释后等体积混合，配成一系列不同浓度比的混合液(10:1,7:1,5:1,3:1,2:1,1:1,1:2,1:3,1:5,1:7,1:10)，应用于MALDI-TOF MS分析。为了进一步验证相对定量的可行性，其它4种含有不同氨基酸序列的CCPs在相同条件下被标记，并作定量分析。检测结果如图7所示，图7为用DuMalTagging技术对CCP2进行相对定量的质谱图和标准曲线图。
其中，(A-E)依次为NEM-CCP2与NMM-CCP2以不同浓度比混合的质谱图(NMM-CCP2与NEM-CCP2的浓度比依次为10:1,2:1,1:1,1:2,1:10)。(F)为质谱信号强度比(IE/IM)对浓度比(CE/CM)的线性拟合曲线(R2＝0.999)。误差条为标准差(n＝3)。※表示NMM标记的CCP2，#表示NEM标记的CCP2。
相对定量检测验证：将NEM-CCP2与NMM-CCP2以不同的浓度比混合，依次为0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,6。通过质谱检测，将所得的强度比代入标准曲线方程y＝1.60x-0.089。将计算所得的浓度比与实际浓度比比较，结果如表1所示。误差小于5％，显示出很高的准确度。
表1相对定量检测结果汇总
| 混合浓度比 | 计算浓度比 | 标准偏差 | 相对误差(％) |
| 0.2 | 0.204 | 0.020 | 2.0 |
| 0.4 | 0.398 | 0.027 | -0.5 |
| 0.6 | 0.606 | 0.002 | 0.6 |
| 0.8 | 0.797 | 0.056 | -0.4 |
| 1 | 1.006 | 0.027 | 0.6 |
| 2 | 1.986 | 0.110 | -0.7 |
| 6 | 6.146 | 1.371 | 2.4 |
由上述实施例可知，本发明可以同时实现绝对定量和相对定量检测，且准确率较高。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记绝对定量检测方法，包括以下步骤：
A)采用第一标记试剂标记目标分析物标准品，记为内标；
B)采用第二标记试剂标记目标分析物标准品，并配置成具有浓度梯度的标准品组；
C)将步骤A)得到的内标分别与步骤B)得到的具有浓度梯度的标准品组等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测；
D)以质谱信号强度比为纵坐标，步骤B)得到的标准品组的浓度为横坐标作图，得标准曲线；
E)采用第二标记试剂标记目标分析物，与步骤A)得到的内标等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测，根据步骤D)得到的标准曲线得到目标分析物浓度；
所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。
2.一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记相对定量检测方法，包括以下步骤：
a)将两组样品分别用第一标记试剂和第二标记试剂标记后，以不同浓度比混合进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测；
b)以质谱信号强度比为纵坐标，样品浓度比为横坐标，得到标准曲线；
c)根据标准曲线对目标分析物进行相对定量分析；
所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；
所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述标记的条件为：
采用磷酸钠水溶液作为缓冲液，标记试剂与被标记物摩尔比为300～500:1，室温反应15～30min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸钠水溶液的浓度为10～100mM，pH值为5～7。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述目标分析物为含半胱氨酸的多肽或蛋白酶解液。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述第一标记试剂为N-甲基马来酰亚胺，第二标记试剂为N-乙基马来酰亚胺；
或者所述第一标记试剂为N-乙基马来酰亚胺，第二标记试剂为N-甲基马来酰亚胺。
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| 王伯沄: "《免疫细胞（组织）化学和分子病理学技术》", 30 November 2010, 第四军医大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111239402A (zh) * | 2018-11-29 | 2020-06-05 | 北京大学 | 一种可用于疾病标志物检测的质谱免疫分析方法及应用 |
| CN111239402B (zh) * | 2018-11-29 | 2021-07-09 | 北京大学 | 一种可用于疾病标志物检测的质谱免疫分析方法及应用 |
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