CN107709980A

CN107709980A - 单克隆抗体的定量方法

Info

Publication number: CN107709980A
Application number: CN201580080639.8A
Authority: CN
Inventors: 嶋田崇史; 岩本典子; 滨田哲畅
Original assignee: NATIONAL CANCER CENTER; Shimadzu Corp
Current assignee: NATIONAL CANCER CENTER; Shimadzu Corp
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: EP3306310A1; WO2016194114A1; JPWO2016194114A1; TWI675917B; CA2987005C; US20180148763A1; CN107709980B; EP3306310B1; CA2987005A1; SG11201709908QA; EP3306310A4; TW201643252A; JP6537605B2

Abstract

本发明提供一种单克隆抗体的定量方法，其包括如下步骤：使细孔内固定化有测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有特定的蛋白酶的微粒接触，进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤；以及，检测由前述消化得到的、包含源自前述单克隆抗体的重链或轻链的CDR2区的氨基酸的肽片段的步骤。

Description

单克隆抗体的定量方法

技术领域

本发明涉及利用质谱的单克隆抗体的定量方法，更具体而言，涉及：为了选择性消化而使用特定酶的方法，所述方法包括如下步骤：将包含单克隆抗体的特异序列的肽片段选择性消化的步骤；和，利用质谱检测所得肽片段的步骤。

背景技术

为了开发和给予副作用少且发挥高的药效的药剂，药物动力学特别是浓度监测(therapeutic drug monitoring,TDM)受到关注。通过浓度监测，可以确认给予的药剂是否为适合量、是否到达病变部位，可以评价药剂的有效性，且适当地调整给予量。另外，对于癌、自身免疫疾病等领域中成为主流的分子靶向药的有效性，医师本身能够迅速地判断药剂是否在病变部位蓄积并发挥药效是重要的。

作为分子靶向药，目前抗体药物受到关注。抗体药物对以癌为代表的病灶抗原、靶分子，生长因子等特异性地结合，因此，作为副作用少且预见有高的药效的药品受到关注，以大量的抗体进行临床研究。抗体在其性质上，显示出极高的分子特异性，另一方面，即使为相同种类的癌，也常见仅以其病灶的部位不同而不发挥药效的情况、在转移灶中没有效果的情况等。另外，还存在药价的问题，讨论了由适合使用进行最佳化医疗是重要的。

因此，测定抗体药物的局部存在、浓度并设定最佳的给药量是极重要的。另外，为了医师本身可以时常把握药效、能够确定积极的治疗战略，也需要更简便地进行血药浓度测定和肿瘤组织中浓度测定。进而，为了给予的药物的药效评价、伴随诊断药的开发等，对抗体浓度的定量也有大的需求，经常要求技术革新。

以往，作为用于定量抗体等蛋白质的最一般的技术，已知有ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附剂测定)，但存在耗费时间、成本等大量的课题。另一方面，使用质谱的蛋白质的定量和结构解析与质谱技术、数据解析服务器·软件的发展一起，飞跃性地扩大其应用范围。

本发明人等的小组发现了如下方法：通过抗体等蛋白质的选择性蛋白酶消化，可以得到为了使用质谱的蛋白质进行特异性检测最佳的肽片段。该方法通过将作为基质的蛋白质例如抗体和蛋白酶这两者固定化于固相，从而实现了单克隆抗体的位置选择性的蛋白酶消化(专利文献1和非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2015/033479号

非专利文献

非专利文献1：N.Iwamoto等,Selective detection of complementaritydetermining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to thesubstrate:nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis,Analyst,2014,139,576

发明内容

发明要解决的问题

为了利用质谱法简便地检测/定量蛋白质，有效的是，将测定对象的蛋白质位置选择性地切断，使该蛋白质产生特异性的肽片段，减小其他肽片段的产生量。因此，在为抗体的情况下，优选的是，将包含特异序列的Fab结构域、特别是Fab结构域的可变区进行位置选择性地消化，而另一方面抑制Fc结构域的消化。

上述专利文献1和非专利文献1记载的方法是可以利用固相-固相反应进行单克隆抗体的选择性的蛋白酶消化的划时代的方法。更具体而言，例如将抗体的C末端侧固定化在孔径约100nm的Protein G或者Protein A树脂上，以使抗体的可变区必定向溶液侧取向。接着，将蛋白酶固定化在粒径约200nm的微粒表面。通过限制蛋白酶对抗体的接触，可以形成进行可变区选择性的抗体分解反应的反应场。

然而，为了实际在临床上使用上述方法，尚有进一步研究的余地，为了提供更简便的定量方法，期望针对各抗体的标准化等的进一步配备。

用于解决问题的方案

本发明人等发现：为了进行使用了抗体的限制性蛋白酶消化的检测，检测单克隆抗体的可变区中、特别是CDR2区中所含的蛋白酶消化片段是最有效的。

通常，将蛋白酶消化后的肽片段供至质谱时，研究了使用自消化少、切断序列的选择性高的蛋白酶。因此，对于本领域技术人员来说，使用市售的蛋白酶时，使用有质谱级、序列确定(测序)等级的蛋白酶。已知例如，源自生物体的内源性的胰蛋白酶通过自消化而生成显示出糜蛋白酶样活性的疑似胰蛋白酶，因此切断部位的特异性低。因此，作为质谱级，市售有将胰蛋白酶的赖氨酸残基还原甲基化来提高对自消化的耐性的产品。

然而，本发明人等发现：使用上述所谓高品质的蛋白酶对作为测定对象的单克隆抗体进行消化时，使用所得肽片段有时无法进行定量检测。

本发明人等认为：上述结果暗示了，对于所得肽片段，可能产生内源性抗体的存在所导致的干涉，为了得到没有这样的干涉的肽片段，进一步进行了研究。其结果，令人惊奇的是发现：通过使用与以往使用的结构解析用酶相比特异性低的酶，使切断位点增加而产生不同序列的肽片段，其结果，可以取得最适于定量检测的肽，至此完成了本发明。

即，本发明的方案包含以下的发明。

(1)一种单克隆抗体的定量方法，其特征在于，包括以下的步骤：

使细孔内固定化有测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有蛋白酶且平均粒径大于多孔体的平均孔径的微粒接触，进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤；以及

检测由前述消化得到的、包含源自前述单克隆抗体的重链或轻链的CDR2区的氨基酸的肽片段的步骤，

作为前述蛋白酶，使用具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶。

(2)根据(1)所述的方法，其中，具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶为未进行还原甲基化处理的胰蛋白酶。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，前述单克隆抗体为莫考珠单抗(Mogamulizumab)。

(4)根据(3)所述的方法，其中，前述肽片段为具有序列号10所示的氨基酸序列的肽。

(5)一种试剂盒，其用于利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的定量检测，其包含：

多孔体，其用于将测定对象的单克隆抗体固定化；

微粒，其固定化有具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶；

反应容器，其用于使前述多孔体与前述微粒接触并对单克隆抗体进行选择性消化；和

缓冲液，其与前述微粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应。

(6)根据(5)所述的试剂盒，其中，具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶为未进行还原甲基化处理的胰蛋白酶。

(7)根据(5)或(6)所述的试剂盒，其中，测定对象为莫考珠单抗，内标肽为具有序列号10所示的氨基酸序列的肽。

(8)一种记录介质，其为(1)～(4)中任一项所述的方法中使用的、记录有用于执行质谱分析的数据的计算机能够读取的记录介质，前述数据包括：关于前述单克隆抗体的由蛋白酶消化得到的肽的、母离子、碎片离子、和对质谱仪的电极施加的电压的数据。

(9)一种分析方法包，其用于利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的定量检测，其包含(8)所述的记录介质。

发明的效果

本发明的方法由于使用限制性蛋白酶反应场，因此可以将抗体的受限制的区域、特别是CDR2区选择性地分解并回收。CDR2区在抗体中是最接近于表面而露出的部位，因而能够优先被分解。通过利用这一点，可以更有效地进行质谱中的单克隆抗体的检测。通过将包含抗体药物的CDR2区的氨基酸的肽片段回收并定量，可以从生物体试样直接地测定抗体药物的浓度。

如果使用本发明的方法，则可以利用质谱确实地进行各抗体的定量。另外，如果可以针对各抗体提供标准的分析条件，则在临床现场医师本身参与样品的分析，可以迅速地评价给予的抗体的有效性。

附图说明

图1示出莫考珠单抗的重链和轻链的氨基酸序列(序列号1和2)，以及定量用中使用的Trypsin Gold切断片段的序列和重链或轻链的氨基酸序列中的位置。

图2示出莫考珠单抗的Trypsin Gold切断片段(序列号3～9)的MRM色谱图。上图示出莫考珠单抗原粉的解析结果，下图示出在血浆中掺加莫考珠单抗而得到的样品的解析结果。纵轴表示峰强度，横轴表示保留时间。需要说明的是，源自同一肽的片段在同一保留时间被检测到，各片段离子的生成效率的差用峰高表示。

图3示出使用在血浆中掺加的莫考珠单抗的Trypsin Gold切断片段(序列号3～9)而制作的标准曲线。

图4示出莫考珠单抗的定量用中使用的Trypsin TPCK-treated切断片段的序列、以及重链和轻链的氨基酸序列中的位置。

图5示出莫考珠单抗的Trypsin TPCK-treated切断片段(序列号10～14)的MRM色谱图。上图示出莫考珠单抗原粉的解析结果，下图示出在血浆中掺加了莫考珠单抗而得到的样品的解析结果。纵轴表示峰强度，横轴表示保留时间。需要说明的是，源自同一肽的片段在同一保留时间被检测到，各片段离子的生成效率的差用峰高表示。

图6示出使用血浆中掺加的莫考珠单抗的Trypsin TPCK-treated切断片段(序列号10～14)而制作的标准曲线。

图7示出精密质谱中的莫考珠单抗靶肽SYYPDSVK(序列号10)的结构鉴定结果。

具体实施方式

本发明涉及一种单克隆抗体的定量方法，其特征在于，包括以下的步骤：

本发明的方法意在维持测定对象的特异性并减少解析对象的母集团。另外，作为蛋白酶，使用具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶而不是以往质谱分析中最适于使用的胰蛋白酶，由此，可以得到适于检测的肽片段。

抗体中，氨基酸置换频率特别多的区域被称为“互补决定区(complementaritydetermining region:CDR)”。本说明书，“CDR2(区)”是指，用抗体的一次结构中的特定的连续氨基酸残基作为CDR2规定的区域以外，还包含抗体的立体结构中与该区域接近且以整体规定抗体的特异性的区域。一般已知，即使为被称为构架区(FR)的区域，由于抗体不同而序列也会有差异。FR区的序列还可能取决于源自抗体蛋白质、制作工序等。对于本领域技术人员来说，通过目标抗体与其他抗体的氨基酸序列的多重对比、以及确认目标抗体与内源性抗体的交差反应性等，从而确定用于有效地检测目标抗体的特异性的包含源自CDR2区的氨基酸的氨基酸序列，可以预测并选择检测对象的肽片段。

另外，本说明书中，“包含源自CDR2区的氨基酸的氨基酸序列”是指，包含1个以上源自目标抗体中特有的CDR2区的氨基酸的氨基酸序列，换言之，也可以是指包含CDR2区的一部分的氨基酸序列。使用了质谱的分析中，如果限定特异性的氨基酸残基为1个以上，则可以确实地检测其特异性。需要说明的是，“包含源自CDR2区的氨基酸的氨基酸序列”是指，意在该氨基酸序列以整体构成目标抗体的氨基酸序列的一部分连续的序列，而不意在包含“源自CDR2区的氨基酸”的任意氨基酸序列。

以下，对本发明的方法进行具体说明。

[质谱分析]

为了通过质谱分析检测抗体，需要首先从生物体试样提取抗体，溶解于适当的溶剂。另外，对抗体直接进行分析时分子大，因此通过蛋白酶分解成肽，之后用液相色谱仪分离后进行质谱分析。适于分析的肽的分子量约为1000～3000Da左右。

对抗体分子进行蛋白酶分解时，生成远超过200条的肽片段。另外，将生物体试样中所含的抗体作为测定对象时，成为巨大的样品集合。为了从上述巨大且复杂的样品中仅对目标特异序列进行分析并定量，在质谱分析步骤前，需要高分辨率和重现性良好的液相色谱仪。

[抗体]

本发明的方法中的测定对象为单克隆抗体。单克隆抗体的重链和轻链分别由恒定区和可变区构成。恒定区具有与源自同一种的抗体基本共通的氨基酸序列。另一方面，可变区中存在有互补决定区(CDR)各3个(CDR1、CDR2、CDR3)。这些区域规定的立体结构参与与抗原的特异性结合，由此形成抗体-抗原复合体。

抗体的立体结构解析的结果确认了，参与与抗原的特异性结合的CDR区域基本位于抗体分子的外侧。其中，CDR2区位于最外侧(图8)，作为本发明的限制性蛋白酶消化的靶是最佳的。临床上使用的抗体中，公开了其全部氨基酸序列和CDR的序列。另外，对于本领域技术人员来说，基于抗体的氨基酸序列信息，可以特定其CDR区域。

作为本发明的方法中能成为测定对象的单克隆抗体，没有限定，例如可以举出莫考珠单抗(Mogamulizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)，奥法木单抗(Ofatumumab)，戈利木单抗(Golimumab)，伊曲利单抗(Ipilimumab)等人抗体；托珠单抗(Tocilizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)，米替珠单抗(Mepolizumab)，吉妥珠单抗(Gemtuzumab)，帕利珠单抗(Palivizumab)，兰尼单抗(Ranibizumab)，赛妥珠单抗(Certolizumab)，奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)，莫考珠单抗，依库丽单抗(Eculizumab)等人源化抗体；西妥昔单抗(Cetuximab)，英夫利昔单抗(Infliximab)，巴利昔单抗(Basiliximab)等嵌合抗体等。需要说明的是，单克隆抗体的分子直径约为14.5nm。

根据本发明的方法，可以将单克隆抗体的特别是CDR2区位置选择性地进行蛋白酶消化，用质谱检测所得CDR2区的肽片段，从而可以进行抗体的鉴定、定量检测。无论抗体的种类均可以应用，因此本发明的方法不限定于上述示例的抗体，也可以用于新开发的单克隆抗体等。

[多孔体]

本发明的方法中使用的多孔体只要具有大量细孔，就对其材料没有特别限定，可以使用活性炭、多孔质膜、多孔质树脂珠、金属颗粒等。其中，优选能部位特异性结合抗体的物质。

细孔的形状没有特别限定。另外，也可以使用如多孔质膜那样、形成有贯通多孔体的细孔的物质。多孔体的细孔的大小没有特别限定，优选的是，考虑抗体的分子直径等，使其在固定化抗体时位于在细孔的表层附近应选择性消化的部位从而确定。多孔体的平均孔径D2例如在10nm～200nm左右的范围内、且小于微粒的平均粒径D1的范围内适宜设定。例如，多孔体的平均孔径D2优选20nm～200nm左右，更优选30nm～150nm、40nm～120nm、50nm～100nm的范围，特别是进一步优选约100nm。

本发明中，优选使用多孔体的细孔内固定化有与抗体部位特异性地相互作用的接头分子(linker molecule)的物质。作为接头分子，优选使用与抗体的Fc结构域部位特异性结合的Protein A、Protein G等。通过使用细孔内固定化有这些接头分子的多孔体，将抗体的Fc结构域固定化于细孔内，Fab结构域位于细孔的表层附近。如此，通过控制细孔内的抗体的取向，可以利用蛋白酶进行Fab结构域、特别是CDR2的位置选择性消化。

选择接头分子的大小，使得抗体的选择性切断部位位于细孔的表层附近。接头分子与抗体结合的状态的分子尺寸优选多孔体的孔径的0.5倍～1.5倍左右，更优选0.6倍～1.2倍左右，进一步优选0.7倍～1.1倍左右，特别优选0.8倍～1倍左右。需要说明的是，使抗体直接结合于细孔内而不使接头分子固定于多孔体的情况下，抗体的分子直径与多孔体的孔径优选满足上述关系。

作为本发明中可以适合使用的多孔体，没有特别限定，例如可以举出Protein GUltralink树脂(Pierce公司制)，Toyopearl(TOSO公司制)等。例如可知Protein GUltralink树脂中，与树脂结合的Protein G的95％处于细孔内。

[抗体对多孔体的固定化]

将抗体固定化于多孔体的细孔内的方法没有特别限定，可以根据抗体与多孔体或者接头分子的特性等而采用适宜的方法。例如，将抗体固定化于细孔内固定化有proteinA、protein G的多孔体的情况下，将多孔体的悬浮液和包含抗体的溶液混合，从而可以将抗体容易地固定化于细孔内。

多孔体与抗体的量比可以根据目的而适宜设定。例如，进行抗体的定量分析时，期望试样中的抗体的几乎总量固定化于多孔体。因此，优选以多孔体的量相对于试样中的抗体的推定含量成为过剩的方式设定量比。

[微粒]

本发明的方法中，微粒是出于在其表面固定化蛋白酶、控制蛋白酶与固定化于多孔体的细孔内的抗体接近的目的而使用的。因此，为了不使微粒进入至多孔体的细孔的深处，微粒的平均粒径D1设为大于多孔体的平均孔径D2。

微粒的形状没有特别限定，从使蛋白酶与多孔体的细孔接近均匀化的观点出发，优选球状的微粒。另外，微粒优选平均粒径均匀。

微粒的平均粒径D1优选50nm～500nm的范围，更优选多孔体的平均孔径D2的1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上，特别优选1.8倍以上、例如约2倍。多孔体的平均孔径为30～150nm左右时，微粒的平均粒径D1优选100nm以上，更优选150nm以上。多孔体的平均孔径为50nm～100nm左右时，微粒的平均粒径优选120nm以上，更优选150nm以上，特别优选170nm以上。从提高利用蛋白酶的消化效率的观点出发，微粒的平均粒径D1的上限优选500nm以下，进一步优选300nm以下。

微粒只要是表面可以固定化上述蛋白酶的物质就对其材质没有特别限定，可以适宜使用金属、树脂等。另外，也可以使用将金属表面用树脂覆盖的微粒、将树脂表面用金属覆盖的微粒等。

作为微粒的种类，优选可以分散或悬浮于水性介质且能够通过应用磁场容易地从分散液或悬浮液回收的磁微粒。另外，从不易引起聚集的方面出发，更优选其表面用有机聚合物覆盖的磁微粒。作为磁微粒的基材，可以举出氧化铁(磁铁体(Fe₃O₄)、红铁矿(γ-Fe₂O₃))、铁氧体(Fe/M)₃O₄等强磁性合金。铁氧体(Fe/M)₃O₄中，M是指可以与铁离子一起使用而形成磁性金属氧化物的金属离子，典型地可以使用Co²⁺，Ni²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺等。另外，作为覆盖磁微粒的有机聚合物，可以举出聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)、GMA与苯乙烯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酸甲酯(PMA)等。作为用有机聚合物覆盖的磁性纳米珠的具体例，可以举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品，例如适合使用多摩川精机株式会社制的FG beads(将铁氧体颗粒用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(polyGMA)覆盖的粒径约200nm的聚合物磁性微粒)。

为了进行非特异性的蛋白质的吸附抑制和蛋白酶的选择性固定化，上述微粒优选用可以与蛋白酶结合的间隔臂分子进行修饰。通过借助间隔臂分子固定化蛋白酶，蛋白酶从微粒表面的脱离被抑制且蛋白酶消化的位置选择性得到提高。另外，通过调整间隔臂的分子尺寸，可以使蛋白酶选择性地接近抗体的期望位置，也可以提高位置选择性。

间隔臂优选能与蛋白酶结合且不使蛋白酶失活的物质。从控制固定化于微粒表面的蛋白酶的接近范围的观点出发，间隔臂优选分子直径小。间隔臂的分子直径优选5nm以下，更优选3nm以下，进一步优选2nm以下。另外，间隔臂的分子量优选2000以下，更优选1500以下，进一步优选1000以下。

可以以上述分子直径固定化蛋白酶的间隔臂分子优选非蛋白质，优选末端具有氨基、羧基、酯基、环氧基、甲苯磺酰基、羟基、巯基、醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、生物素、抗生物素、螯合物等官能团的分子。例如，胰蛋白酶的固定中，优选具有活性化的酯基的间隔臂分子。另外，间隔臂分子中，除上述官能团以外的间隔臂臂部分可以使用聚乙二醇和其衍生物、聚丙二醇和其衍生物、聚丙烯酰胺和其衍生物、聚乙烯亚胺和其衍生物、聚(环氧乙烷)和其衍生物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和其衍生物等亲水性分子。

用这样的间隔臂分子进行了表面修饰的微粒也有市售，也可以利用它们。例如，以具有用N-羟基琥珀酰亚胺活性化的酯基(活性酯基)的间隔臂分子修饰的微粒以商品名“FGbeads NHS”(多摩川精机株式会社)被市售。FG beads NHS的粒径约为200nm±20nm，作为微粒是非常均质的。

[蛋白酶]

本发明的方法中，作为固定化于微粒的蛋白酶，使用具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶。

胰蛋白酶的基质特异性高且切断后的肽的C末端具有Lys或Arg，因此，可以使肽的电荷量和电荷均质地局部存在，适合于制作用于质谱的试样。另外，胰蛋白酶的分子直径小(约3.8nm)且活性部位存在于分子的内部。因此，活性部位可以接近抗体的区域受到限制，从而可以提高蛋白酶消化的位置选择性。

本发明人等发现：通过使用具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶而不是通常使用的质谱级的胰蛋白酶，可以得到最适于各抗体的定量检测的肽片段。

作为本发明的方法中使用的蛋白酶，例如，可以使用：已知利用自消化显示出糜蛋白酶样的活性的源自生物体的内源性的胰蛋白酶。将胰蛋白酶的赖氨酸残基还原甲基化来提高对自消化的耐性的蛋白酶作为质谱级的胰蛋白酶被市售，但本发明中使用的胰蛋白酶优选为这样的赖氨酸残基未进行还原甲基化处理的胰蛋白酶。

例如Trypsin Gold(Promega Corporation制)是重组胰蛋白酶且TPCK处理后实施了还原甲基化反应。另一方面，Trypsin TPCK-treated(Sigma公司制)是对从牛提取的胰蛋白酶进行TPCK处理而使糜蛋白酶活性降低的物质，是未实施还原二甲基化反应的蛋白酶。

本发明的方法通过使用具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶，可以使用质谱级的胰蛋白酶的消化中无法得到的肽片段，对使用不具有糜蛋白酶活性的胰蛋白酶、例如质谱级的胰蛋白酶的情况下无法定量检测的单克隆抗体进行定量检测。

作为“具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶”，假定使用显示出上述糜蛋白酶样的活性的胰蛋白酶，作为其他实施方式，也可以使用胰蛋白酶与糜蛋白酶的混合物。此时，作为胰蛋白酶，例如可以使用Promega Corporation的Trypsin gold，作为糜蛋白酶，例如可以使用Sigma公司的胰蛋白酶TPCK处理。胰蛋白酶与糜蛋白酶的比率适合按照以蛋白酶活性(U)计为9：1～1：1的比率使用。

作为本发明的方法中可以特别适合使用的蛋白酶，例如可以举出Trypsin TPCK-treated(Sigma公司制)等。

[蛋白酶对微粒的固定化]

将蛋白酶固定化于微粒的表面的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶和微粒(或者修饰微粒表面的间隔臂分子)的特性等而采用适宜的方法，例如，将蛋白酶固定化于经间隔臂修饰的微粒表面时，通过将微粒的悬浮液和包含蛋白酶的溶液混合，可以将蛋白酶固定化于微粒表面。优选借助上述间隔臂分子的官能团的微粒与蛋白酶的胺偶联法。例如，将微粒上经过表面修饰的羧基用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化而形成活性化酯基，可以使蛋白酶的氨基与其结合。可以在缩合剂的存在下使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺(DIPC)等碳二亚胺进行该偶联反应。另外，可以使用戊醛、2官能性琥珀酰亚胺、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)、磺酰氯、马来酰亚胺、吡啶基二硫化物等交联剂，使蛋白酶的氨基与微粒上经过表面修饰的氨基结合。

借助间隔臂分子的官能团的微粒与蛋白酶的偶联法可以通过在微粒的悬浮液中添加蛋白酶溶液、在一定的条件下进行混合搅拌这样简便的操作进行。

将蛋白酶固定化于微粒表面后，优选使微粒表面的蛋白酶与未结合的活性部分非活性化。

[蛋白酶消化]

通过使固定化有抗体的多孔体与表面固定化有蛋白酶的微粒接触，抗体被蛋白酶消化，产生肽片段。接触优选在液体中进行。此处，“液体”是指，基质(固相)和酶(固相)在液相中接触而且意在适于蛋白酶消化反应的水性介质。

本发明中的蛋白酶消化的条件没有特别限定，可以适宜采用与一般的蛋白酶消化同样的条件。例如，优选的是，在调整至蛋白酶的最适pH附近的缓冲溶液中，通常在37℃左右的温度下，进行4小时～20小时左右孵育。

固定化有抗体的多孔体与表面固定化有蛋白酶的微粒的混合量比也没有特别限制，可以设定成为与抗体量相对应的蛋白酶量。本发明中，通过组合多孔体与微粒，物理上抗体与蛋白酶的接近受到限制，因此，与一般的蛋白酶消化相比，优选增多蛋白酶量。例如，优选抗体：蛋白酶＝30：1～3：1左右，更优选15：1～4：1左右，进一步优选10：1～5：1左右。

本发明的方法中，在保持使抗体固定化于多孔体的状态下进行蛋白酶消化。由蛋白酶消化产生的肽片段存在于液相内，因此，可以位置选择性地得到目标肽片段而不进行抗体的洗脱、变性操作。根据本发明的方法，可以以比以往方法简便的操作且位置选择性地进行肽片段的回收。

接着，检测由蛋白酶消化得到的目标肽片段。为了进行检测，优选去除多孔体和微粒。其可以通过对蛋白酶消化后的样品进行过滤、离心分离、磁分离、透析等操作而达成。例如通过使用聚偏二氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF，孔径0.2μm，Millipore公司制)进行过滤，可以简便地去除多孔体和微粒。

[液相色谱-质谱(LC-MS)]

将包含上述中所得的肽片段的试样通过LC-MS进行分析，从而可以进行抗体的鉴定、定量。

为了使肽片段的分离更确实、提高分析精度等，将供于质谱分析前的试样通过液相色谱仪(LC)进行分离/浓缩。通过LC进行试样的分离时，可以将来自LC的洗脱液直接离子化并供于质谱分析。也可以通过将LC与串联质谱组合而成的LC/MS/MS、LC/MSn进行分析。另外，也可将来自LC的洗脱液一次性分级后供于质谱。LC的柱没有特别限定，可以适宜地选择肽的分析中一般使用的C30、C18、C8、C4等疏水柱、亲水性亲和色谱法用的载体等来使用。

质谱分析可以确定氨基酸序列，因此可以判断肽片段是否为源自抗体等特定蛋白质的肽片段。另外，可以基于峰强度确定试样中的肽片段的浓度。分析时，根据需要可以进行脱盐、增溶、提取、浓缩、干燥等处理后将试样用于分析。

质谱分析中的离子化法没有特别限定，可以采用电子离子化(EI)法、化学离子化(CI)法、电场脱离(FD)法、高速原子轰击(FAB)法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾离子化(ESI)法等。离子化的试样的分析方法也没有特别限定，可以根据离子化法而适宜确定磁场偏转型、四级杆(Q)型、离子捕获(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)型等。另外，也可以使用三重四级杆型质谱装置等，进行MS/MS分析、或者MS3以上的多级质谱分析。

作为适于实施本发明的方法的质谱装置，没有限定，例如可以举出LCMS-8030、LCMS-8040和LCMS-8050(均为株式会社岛津制作所制)等液相色谱仪-三重四级杆型质谱装置、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF(均为株式会社岛津制作所制)等分析精密质量的结构解析用质谱装置。

如果可以检测抗体中包含特异的CDR2区的氨基酸序列的肽片段，则可以对目标抗体进行鉴定/定量。为了基于质谱分析结果鉴定抗体，也可以使用现有的数据库。另外，也可以通过多级质谱分析等，特定肽片段的氨基酸序列，从而鉴定抗体。

需要说明的是，基于检测结果进行抗体的鉴定、定量时，检测对象的肽的氨基酸残基数优选5～30左右，更优选7～25左右。

定量抗体的浓度时，可以基于检测到的肽片段离子(多级MS的情况下，由母离子的裂解得到的碎片离子)的峰面积、峰强度算出抗体的量。例如，通过使预先求出的标准曲线(校正曲线)与峰面积的关联、使源自试样中添加的内标的峰面积与源自试样的峰面积的关联等，算出试样中的肽片段的浓度，基于肽片段浓度算出抗体的量、浓度。

质谱分析中，继蛋白酶消化，例如通过利用阳离子交换树脂(WCX和MCX)进行纯化，也可以进行抗体药物的特异的肽的高灵敏度分析。

[包含CDR2区的氨基酸的肽]

本发明的方法中的检测对象的肽片段具有包含源自抗体药物等单克隆抗体的重链或轻链的CDR2区的氨基酸的氨基酸序列。

想要作为抗体药物使用的单克隆抗体的氨基酸序列信息等已经被公开，可以获得重链和轻链的氨基酸序列、Fab和Fc结构域、CDR区域、二硫键等信息。另外，通过本发明的方法，抗体与蛋白酶的接触受到限制，因此，通过选择性蛋白酶消化得到的肽的种类也受到限制。因此，对于本领域技术人员来说，可以预测被特定的蛋白酶消化的肽片段的氨基酸序列。

因此，通过本发明的方法，也可以同时并行地进行所预测的多个肽片段的检测，进行抗体的检测/定量。然而，为了进行更简便的测定且为了缩短测定所需的时间和削减成本，优选事先选择各抗体中最佳的肽片段。如果可知最佳的肽片段，则可以确定仅适于检测该肽片段的质谱条件，可以提供这样的信息。

因此，本发明的方法中，作为一实施方式，包括：选择包含适于定量各单克隆抗体的CDR2区的氨基酸的肽片段。另外，本发明的其他实施方式提供一种方法，其包括：检测适于定量各单克隆抗而选择的包含CDR2区的氨基酸的肽片段。

例如，利用本发明的方法将莫考珠单抗用质谱级的胰蛋白酶、例如Trypsin Gold(Promega Corporation制)消化时得到的肽中，预测为适于质谱分析的肽为序列号3～9所示的肽。然而，本发明人等进行的试验中，这些肽在血清试样中可能由于内源性抗体的干涉而无法进行依赖于浓度的定量检测。

FSGVPDR(序列号3)

FTISR(序列号4)

FSGSGSGTDFTLK(序列号5)

NSLYLQMNSLR(序列号6)

HSDGNFAFGYWGQGTLVTVSSASTK(序列号7)

GLEWVATISSASTYSYYPDSVK(序列号8)

NIVHINGDTYLEWYLQPKGQSPQLLIYK(序列号9)

针对于此，使用Trypsin TPCK-treated(Sigma公司制)作为蛋白酶时得到的肽中预测为适于质谱分析的肽是序列号10～14所示的肽。对于这些肽实际进行了检测，结果以肽SYYPDSVK(序列号10)可以得到良好的结果。

SYYPDSVK(序列号10)

GMSWVR(序列号11)

ISRVEAEDVGVY(序列号12)

YLQKPGQSPQLLIYK(序列号13)

NIVHINGDTYLEW(序列号14)

因此，成为测定对象的单克隆抗体为莫考珠单抗时，优选选择具有序列号10所示的氨基酸序列的肽作为检测对象。此时，例如将表1中记载的条件作为指标，可以通过利用三重四级杆型质谱装置(例如LCMS-8050，株式会社岛津制作所)的多重反应监测进行检测。

[表1]

[试剂盒]

本发明涉及一种试剂盒，其用于利用上述高效液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的定量检测，其包含：

多孔体，其用于将测定对象的单克隆抗体固定化；

利用质谱的测定可以进行非常高精度的分析，另一方面，制备适当的样品和设定适合的分析条件是非常重要的。例如临床现场中为了更简便地获得准确的检查结果，本发明提供可以用于实施上述方法的试剂盒。

本发明的试剂盒中所含的多孔体和微粒如上述。作为反应容器，只要为可以使固定化于多孔体的单克隆抗体与固定化于微粒的蛋白酶在液相中接触的容器就可以为任意者，没有特别限定，如果考虑为利用质谱检测的样品制备用，则优选设为微管、板。考虑利用用于进行反应的涡流或旋转器进行的混合、用于分离反应后的肽与多孔体和微粒的过滤等反应工序，对于本领域技术人员来说可以假定适当的反应容器。

本发明的试剂盒中所含的缓冲液是与前述微粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应的物质，提供适于蛋白酶消化的反应条件。反应条件可以根据选择的蛋白酶等适宜确定，缓冲液的组成也可以适宜确定。

本发明的试剂盒还可以包含过滤膜，所述过滤膜用于在蛋白酶消化反应后将前述多孔体和前述微粒去除、并将消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。这是由于，为了将通过蛋白酶消化得到的目标肽片段供于质谱，必须去除多孔体和微粒。

过滤膜优选的是，作为在不施加压力或离心力的条件下基本不使缓冲液和通过蛋白酶消化生成的肽透过而作为“反应容器的底”发挥功能，且离心分离等操作时可以透过缓冲液和肽的作为“滤器”发挥功能。

作为为了过滤膜可以透过缓冲液和肽而施加的离心分离条件，没有限定，优选例如3000～10000g的范围。作为本发明的试剂盒中可以适合使用的过滤膜，例如可以举出聚偏二氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF，孔径0.2μm，Millipore公司制)。

试剂盒为用于同时处理多样品的试剂盒时，例如可以使用：过滤膜为PVDF制、壳体原材料为聚丙烯腈树脂、例如Barex(注册商标)(MITSUI FINE CHEMICALS,Inc.制)的试剂盒。

本发明的试剂盒中还可以包含：记载有试剂盒的使用方法和/或用于检测单克隆抗体的质谱条件的说明书。

本发明的试剂盒还可以包含1个以上的内标肽。内标肽通过与样品同时地或分别地在相同条件下进行分析，从而提供更确实的分析结果。内标肽包含测定对象的单克隆抗体的特异性氨基酸序列，形成通过利用本发明的试剂盒中所含的蛋白酶进行的消化而产生的肽。内标肽中也可以包含用稳定同位素氨基酸标记了的肽，此时，与不含同位素的肽相比，由于质谱定量条件不同，因此，优选附上内标用定量条件。

例如测定对象为莫考珠单抗时，内标肽可以包含具有序列号10的氨基酸序列的肽。

通过使用本发明的试剂盒，可以使得用于鉴定/定量单克隆抗体的肽片段制备的操作更简便，也可以容易进行利用装置的自动化。特别是，如果蛋白酶以固定化于微粒表面的状态作为试剂盒的构成要素提供，则可以使肽片段制备的操作进一步简略化。

[记录介质和分析方法包]

本发明还提供一种记录介质，其为本发明的方法中使用的、记录有用于执行质谱分析的数据的计算机能够读取的记录介质，前述数据包括：关于前述单克隆抗体的由蛋白酶消化得到的肽的、母离子、碎片离子、和对质谱仪的电极施加的电压的数据；以及，提供一种包含上述记录介质的、用于利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的定量检测的分析方法包。

本说明书中，“分析方法包”是指，可以以能读取的形态包含针对特定测定对象的液相色谱-质谱的分析条件，能够单独流通。通过将分析方法包中所含的数据导入至LC-MS，可以在详细的研究最终得到的最佳测定条件下进行分析。分析方法包中还可以包含上述记录介质的使用说明书。

如上述，利用质谱的测定可以进行非常高精度的分析，另一方面，根据目标离子而分析条件完全不同，因此，设定适合的分析条件是非常重要的，并且非常困难，为了条件设定而需要巨大的时间。通过预先准备这样的条件，可以提高实际进行质谱分析的使用者的便利性。本申请人至此，为了使用者可以更简便地进行例如农药、动物药品的质谱分析，提供用于利用它们的LC-MS进行分析的分析方法包。因此，本发明还提供：用于利用LC-MS鉴定/定量试样中的单克隆抗体的分析方法包。

即，本发明提供一种记录介质，其为下述方法中使用的、记录有用于执行前述质谱分析的数据的计算机能读取的记录介质：使细孔内固定化有测定对象的单克隆抗体的多孔体、与固定化有具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶的微粒接触进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化，将所得肽片段利用液相色谱-质谱(LC-MS)分析从而进行前述单克隆抗体的检测的方法，前述数据没有限定，包含例如针对具有前述单克隆抗体的被蛋白酶消化得到的CDR2区的氨基酸的氨基酸序列的肽至少对母离子、碎片离子、质谱仪的电极、例如对三重四级杆的各自(第1四级杆、第2四级杆、第3四级杆)施加的电压的数据。上述记录介质中还可以包括：预计保留时间等进一步的数据。需要说明的是，上述预计保留时间、电压数据等是根据使用的设备和测定条件等而变动的数值，优选与设备相匹配地提供。另外，如本领域技术人员所理解那样，对于根据条件而变动的数值，优选也一并提供其变动幅度。

记录介质可以为任意形态，没有特别限定。例如可以举出：可以以磁方式、光学方式记录信息的光盘、存储器。

更具体而言，上述分析方法包中，例如可以包括以下的信息和软件功能。

·最佳化※的母离子m/z值

·最佳化的碎片离子m/z值

·最佳化的Q1预偏置(pre bias)电压值

·最佳化的Q2碰撞能量(collision energy)电压值

·最佳化的Q3预偏置(pre bias)电压值

·目标离子的预计保留时间和质谱分析时间

·定量值换算式

·解析结果报告输出功能

※：实测各条件项目，采用离子强度最高者、和最有重现性的m/z值，将其作为最佳值。

本发明还提供一种用于利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的检测的分析方法包，其包含上述记录介质。分析方法包中也可以包含上述记录介质的使用说明书。

作为上述记录介质或分析方法包的例子，可以举出：仅包含特定的单克隆抗体中限定的信息。因此，单克隆抗体例如为莫考珠单抗时，可以提供记载有适于其分析的条件的记录介质或分析方法包。此时，记录介质中所含的数据例如可以涉及：针对具有序列号10的氨基酸序列的肽的分析条件。

分析方法包可以记载多个质谱装置中共通的数据，或者也可以记载适于利用特定的质谱装置进行分析的各种数据。

记录介质或分析方法包可以与上述本发明的试剂盒一起或者与试剂盒分别地提供。

实施例

根据以下的实施例对本发明进一步进行具体说明，但本发明不受实施例的限定。

[蛋白酶的固定化]

通过以下步骤将蛋白酶固定化于微粒。

1.FG珠清洗

对FG珠NHS 200mg(多摩川精机株式会社制)进行离心分离(15000g×5分钟,4℃)，将保存用上清异丙醇去除。上清也包含沉淀乃至浮游物，慎重地去除。

2.酶准备

将Trypsin Gold 1mg(Promega Corporation制)或Trypsin TPCK 5mg(Sigma-Aldrich Co.LLC.制)开封，溶解于冷却至4℃的25mM HEPES-NaOH,pH7.0。溶解后，取至50ml离心管，在冰上静置。酶使用25mM HEPES-NaOH、pH7.0进行1次共洗，尽量回收。最终缓冲液量成为25ml左右。

3.FG珠清洗

分别加入10ml的经过冰冷却的甲醇，在经过冰冷的超声波清洗机中，确认FG珠的悬浮后进行离心分离(15000g×5分钟,4℃)，将上清甲醇去除。

4.酶固定化反应

在FG珠的沉淀200mg中加入Trypsin Gold或Trypsin TPCK溶液。使用经过冰冷的超声波清洗机，确认FG珠的悬浮后，以保持悬浮的最低限的速度连续地进行涡流30分钟。

反应30分钟后，进行离心分离(15000g×5分钟,4℃)，去除上清。将上清回收，通过BCA分析进行偶联效率确认试验。

5.活性基封端

在FG珠的沉淀200mg中分别加入25ml的1M 2-氨基乙醇盐酸盐、pH8.0，使用经过冰冷的超声波清洗机，确认FG珠的悬浮后，以保持悬浮的最低限的速度进行连续涡流。反应30分钟并封闭后，进行离心分离，将上清去除。

6.酶珠清洗

在FG珠的沉淀200mg中分别加入25ml的25mM HEPES-NaOH、50mM NaCl、pH7.0，使用经过冰冷的超声波清洗机，确认FG珠的悬浮后，以保持悬浮的最低限的速度进行连续涡流。清洗5分钟后，进行离心分离，将上清去除。

7.保存

以蛋白酶终浓度成为0.5μg/μl的方式，加入25mM Tris-HCl、pH8.0，使用经过冰冷的超声波清洗机，确认FG珠的悬浮后，分别分注至500μl。之后以-80℃保存。

[蛋白酶消化]

血浆试样中的单克隆抗体的蛋白酶消化通过以下的步骤实施。

1.单克隆抗体从血浆的回收

取血浆20μl，用180μl的PBS+0.1％正辛基-β-D-硫苷(同仁化学)稀释。

向其中加入Protein G Ultralink树脂(Pierce公司制)的50％悬浮液40μl。以室温缓慢地涡流1～2小时、或者在旋转混合机中旋转，从而使血浆中的抗体分子与树脂结合。通过离心分离使树脂沉淀，弃去上清。

添加200μl的PBS+0.1％正辛基-β-D-硫苷进行3次清洗，从而清洗与树脂非特异性地结合的血浆中蛋白质。接着，用200μl的PBS清洗1次，将表面活性剂去除。

2.蛋白酶反应

在残留有Protein G Ultralink树脂的管中加入200μl的25mM Tris-HCl、pH8.0。接着，向其中加入上述中制备的固定化有胰蛋白酶(Trypsin Gold或Trypsin TPCK)的珠80μl，安装于旋转器，以37℃缓慢旋转6小时。

反应后，用0.2μm的低结合性亲水性PVDF膜(Millipore公司制)过滤，从而将Protein G树脂和固定化有胰蛋白酶的珠一起去除，将反应溶液回收。

[质谱分析]

在市售的血浆(Sigma公司制)中掺加抗体药物，检测通过蛋白酶消化得到的肽。作为单克隆抗体，使用莫考珠单抗(药品名POTELIGEO，Kyowa Kirin株式会社)。质谱的条件如以下所述。

＜HPLC条件(Nexera LC30A液相色谱仪系统)＞

溶剂A：0.1％甲酸，溶剂B：0.1％甲酸+乙腈

流速：0.5ml/分钟

梯度时间：1％B(1.5分钟)，1-40％B梯度(5分钟)，95％B(5分钟)，1％B(5分钟)

柱：L-column2ODS,2×50mm(化学物质评价研究机构)

柱温：50℃

＜MS接口条件(LCMS-8050(株式会社岛津制作所))＞

雾化气体：3L/分钟

加热气体：10L/分钟

干燥气体：10L/分钟

接口温度：300℃

DL温度：250℃

加热块温度：400℃

[利用Trypsin Gold的消化片段的检测]

图1中示出莫考珠单抗的重链和轻链的氨基酸序列(序列号1和2)、以及利用定量中使用的Trypsin Gold的切断片段的序列(序列号3～9)以及重链或轻链的氨基酸序列中的位置。

通过上述分析条件，将莫考珠单抗的Trypsin Gold切断片段(序列号3～9)供于MRM色谱而得到的结果示于图2。如图2所示，直接分析莫考珠单抗原粉时(上图)，观察到与添加量相对应的峰；但对于在血浆中掺加了莫考珠单抗的样品(下图)，能够检测到的峰减少。

基于用在血浆中掺加的Trypsin Gold切断片段(序列号3～9)检测到的峰制成标准曲线，将其结果示于图3。由图3的结果可知，使用Trypsin Gold作为蛋白酶时，根据在血浆中掺加的肽片段的量无法制成标准曲线，判定：这些肽片段均不适于依赖于浓度的定量检测。

[利用Trypsin TPCK的消化片段的检测]

图4示出莫考珠单抗的定量用中使用的Trypsin TPCK切断片段的序列(序列号10～14)、以及重链和轻链的氨基酸序列中的位置。在与上述同样的条件下分析莫考珠单抗的Trypsin TPCK切断片段(序列号10～14)，将其结果示于图5。根据图5的结果，直接分析莫考珠单抗原粉时(上图)、在血浆中掺加莫考珠单抗时(下图)均确认到源自5种肽片段的峰。

使用在血浆中掺加的Trypsin TPCK切断片段(序列号10～14)制成标准曲线，结果如图6所示，可以得到为了用肽SYYPDSVK(序列号10)进行定量检测的合适的标准曲线，可以判定其是为了定量莫考珠单抗而最佳的。

接着，选择肽SYYPDSVK(序列号10)作为精密质谱中的莫考珠单抗靶肽，利用精密质谱进行结构鉴定，将其结果示于图7。由图7的结果可以确认：可以进行根据肽序列预测的结构的鉴定。

对检测到的肽SYYPDSVK(序列号10)进行结构科学解析，结果确认到：其源自Fv区域且在Protein Data Bank中得到的人免疫球蛋白分子的立体结构中位于最外侧。

产业上的可利用性

根据本发明的方法，使用特定的蛋白酶对抗体进行选择性消化，对所得肽片段进行质谱分析，可以定量试样中的抗体。本发明的方法的操作简便、且可以确保重现性、定量性。

现在，抗体药物已经有40种类上市，进而据说前临床试验为300种左右，包括动物试验的全临床试验中为2000种以上，也包括研究阶段、种子阶段时超过5000种。本发明可以针对这样各种抗体药物提供通用性极高的分析方法，可以有利于今后的抗体药物开发的加速。

将本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接作为参考引入至本说明书。

序列表

<110> 株式会社岛津制作所(SHIMADZU CORPORATION)

国立研究开发法人日本国立癌症研究中心(National Cancer Center)

<120> 单克隆抗体的定量方法

<130> PH-6200-PCT

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体重链

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 2

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体轻链

<400> 2

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 3

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 4

Phe Thr Ile Ser Arg

1 5

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 5

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 6

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 7

His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

1 5 10 15

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

20 25

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 8

Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Ser Val Lys

20

<210> 9

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 9

Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Pro Lys Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys

20 25

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 10

Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 11

Gly Met Ser Trp Val Arg

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 12

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 13

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体片段

<400> 14

Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp

1 5 10

Claims

1.一种单克隆抗体的定量方法，其特征在于，包括以下的步骤：

检测由所述消化得到的、包含源自所述单克隆抗体的重链或轻链的CDR2区的氨基酸的肽片段的步骤，

作为所述蛋白酶，使用具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶为未进行还原甲基化处理的胰蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述单克隆抗体为莫考珠单抗(Mogamulizumab)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述肽片段为具有序列号10所示的氨基酸序列的肽。

5.一种试剂盒，其用于利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的定量检测，其包含：

多孔体，其用于将测定对象的单克隆抗体固定化；

反应容器，其用于使所述多孔体与所述微粒接触并对单克隆抗体进行选择性消化；和

缓冲液，其与所述微粒和多孔体一起被导入至所述反应容器内、且用于利用所述蛋白酶进行消化反应。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，具有胰蛋白酶活性和糜蛋白酶活性的蛋白酶为未进行还原甲基化处理的胰蛋白酶。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，测定对象为莫考珠单抗(Mogamulizumab)，内标肽为具有序列号10所示的氨基酸序列的肽。

8.一种记录介质，其为权利要求1～4中任一项所述的方法中使用的、记录有用于执行质谱分析的数据的计算机能够读取的记录介质，所述数据包括：关于所述单克隆抗体的由蛋白酶消化得到的肽的、母离子、碎片离子、和对质谱仪的电极施加的电压的数据。

9.一种分析方法包，其用于利用液相色谱-质谱(LC-MS)进行单克隆抗体的定量检测，其包含权利要求8所述的记录介质。