CN117581103A - 分析抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种能够在不使用作为测定对象的抗体制作标准曲线的情况下通过质谱分析对抗体进行定量的方法。提供一种分析抗体的方法,其包括下述步骤:将生物蛋白及靶抗体用蛋白酶消化;对经消化的所述生物蛋白及所述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和,基于通过所述质谱分析得到的所述生物蛋白的检测强度与所述靶抗体的检测强度之比,对所述靶抗体进行定量,所述用蛋白酶消化包括下述步骤:将所述生物蛋白及所述靶抗体固定在载体的微孔内;和,使具有大于所述微孔直径的直径且表面固定有所述蛋白酶的微粒与所述载体接近,所述生物蛋白具有能够固定在所述微孔内的结构域。
Description
技术领域
本发明涉及分析抗体的方法。具体而言,涉及利用了质谱分析的抗体定量方法。
背景技术
作为蛋白质定量方法,通过进行ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附测定)。但是,ELISA存在如下课题:需要对每种待检测蛋白质准备特异性抗体;不能同时检测多种蛋白质;等。因此,作为代替ELISA的蛋白质定量方法,正在开发使用质谱分析的方法。
本发明人等的研究小组发现了如下方法:通过将抗体等蛋白质利用蛋白酶进行位置选择性消化,从而能够得到对于使用质谱分析的蛋白质特异性检测而言最佳的肽片段。得到的肽片段能够利用液相色谱-质谱分析高效地检测及定量(专利文献1:国际公开第2015/033479号、专利文献2:国际公开第2016/194114号、非专利文献1:Iwamoto N et.al.,Analyst.2014Feb 7;139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2015/033479号
专利文献2:国际公开第2016/194114号
非专利文献
非专利文献1:Iwamoto N et.al.,Selective detection of complementarity-determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to thesubstrate:nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis,Analyst.2014Feb 7;139(3):576-80.DOI:10.1039/c3an02104a
发明内容
发明要解决的问题
为了通过质谱分析对抗体进行定量,通常使用作为测定对象的抗体制作标准曲线。但是,在对多种抗体进行测定的情况下,针对每个测定对象制作标准曲线的方式效率低。况且,对于在功能分析方面日益重要的中和抗体、新克隆等的抗体而言,通常也无法稳定地得到用于制作标准曲线的抗体。本发明提供在不使用作为测定对象的抗体制作标准曲线的情况下也能够通过质谱分析对抗体进行定量的方法。
用于解决问题的方案
本发明涉及一种分析抗体的方法,其包括下述步骤:
将生物蛋白及靶抗体用蛋白酶消化;
对经消化的上述生物蛋白及上述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于通过上述质谱分析得到的上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比,对上述靶抗体进行定量,
上述用蛋白酶消化包括下述步骤:
将上述生物蛋白及上述靶抗体固定在载体的微孔内;
使具有大于上述微孔直径的直径且表面固定有上述蛋白酶的微粒与上述载体接近,
上述生物蛋白具有能够固定在上述微孔内的结构域。
本发明涉及分析抗体的方法,其包括下述步骤:
将生物蛋白和包含至少2种靶抗体的试样用蛋白酶消化;
对经消化的上述生物蛋白及上述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比,对上述靶抗体进行定量,
上述生物蛋白为单克隆抗体。
本发明涉及一种程序,其为用于上述分析抗体的方法的程序,
上述程序使处理装置执行如下的处理:
接收从质谱分析装置输出的质谱;
从存储部读出上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比;
对从上述质谱算出的上述生物蛋白的检测量进行校正;
算出上述靶抗体的量。
发明的效果
根据本发明,能够在不使用作为测定对象的抗体制作标准曲线的情况下通过质谱分析对抗体进行定量。
附图说明
图1为示出对抗体进行位置选择性切断的方法的一例的图。
图2为示出实施例中使用的抗体的特征肽序列及CDR3序列的表。
图3为示出实施例中使用的抗体的特征肽序列的表。
图4为说明实验3中用蛋白酶消化抗体的步骤的图。
图5为实验3中对单一试样进行质谱分析时的离子计数值(cps)与对混合试样进行质谱分析时的各抗体的cps的对比图。横轴表示各抗体的缩写,纵轴表示cps。
图6为实验3中使用内标校正单一试样的检测量而得的值与使用内标校正混合试样中的各抗体的检测量而得的值的对比图。横轴表示各抗体的缩写,纵轴表示使用内标校正而得的值(内标校正值)。
图7为示出实验4中各抗体的cps相对于曲妥珠单抗(Trastuzumab)的cps之比的图。横轴表示各抗体的浓度,纵轴表示各抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比。
图8为示出实验4中各抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比的图。横轴表示各抗体的浓度,纵轴表示各抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比。
图9为示出实验4中各抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比的图。横轴表示各抗体的浓度,纵轴表示各抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比。
图10为实验5中基于使用曲妥珠单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗(Ipilimumab)的浓度(横轴)与基于使用伊匹木单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图11为实验5中基于使用曲妥珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗(Pembrolizumab)的浓度(横轴)与基于使用帕博利珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图12为实验6中基于使用伊匹木单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(横轴)与基于使用曲妥珠单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图13为实验6中基于使用帕博利珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(横轴)与基于使用曲妥珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图14A为实验6中基于使用伊匹木单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(横轴)与基于使用各参照蛋白的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图14B为实验6中基于使用伊匹木单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(横轴)与基于使用各参照蛋白的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图15A为实验6中基于使用帕博利珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(横轴)与基于使用各参照蛋白的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(纵轴)的对比图。
图15B为实验6中基于使用帕博利珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(横轴)与基于使用各参照蛋白的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(纵轴)的对比图。
具体实施方式
[分析抗体的方法]
本实施方式的分析抗体的方法包括下述步骤:
将生物蛋白及靶抗体用蛋白酶消化;
对经消化的上述生物蛋白及上述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于通过上述质谱分析得到的上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比,对上述靶抗体进行定量。
本实施方式中,“生物蛋白”是指源自细胞、生物组织等生物体的蛋白质或人工合成这些蛋白质而得的蛋白质。本实施方式的一个方面中,上述生物蛋白在本实施方式的分析抗体的方法中可作为参照物质使用,因此也可以作为“参照蛋白”来把握。上述生物蛋白优选为生物制品。本实施方式中,“生物制品”是指使用生物来进行制造、提取、合成等而得的药品。上述生物制品也可以作为“生物药品”、“生物学制剂”来把握。在本实施方式的另一方面中,作为上述生物蛋白,可列举例如后述的抗体(例如参照抗体等)、Fc融合蛋白以及源自小鼠、大鼠及兔子等的单克隆抗体等。本实施方式中,上述生物蛋白优选包含参照抗体或Fc融合蛋白。
本实施方式的一个方面中,上述生物蛋白优选包含参照抗体。
即,本实施方式的分析抗体的方法优选包括下述步骤:
将参照抗体及靶抗体用蛋白酶消化的步骤;
对经消化的参照抗体及靶抗体的肽片段进行质谱分析的步骤;和
基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比,对靶抗体进行定量的步骤。
本实施方式的方法中,不需要对每个测定对象制作标准曲线,因此可期待用于制作标准曲线的抗体的削减及质谱分析的简便化。在抗体药物现场简便地对生物内、例如血液或组织中的抗体量进行定量的重要性日益提高。根据本实施方式,在无法利用作为测定对象的抗体制作标准曲线时,也能够以其它抗体为基准而算出试样中的抗体药物的浓度。另外,根据本实施方式的方法,可以将通用的一种抗体用作基准,因此在想要同时测定试样所包含的2种以上抗体时也有用。根据本实施方式的方法,预期可使药物动力学试验简便化且可削减成本。
在生物体内,除了作为药物而给予的抗体(例如单克隆抗体)以外,还存在多种生物体内产生的抗体。生物内产生的抗体不容易制作标准曲线,以往难以通过质谱分析对这样的抗体进行定量。根据本实施方式的方法,也能够通过质谱分析来实现生物内产生的中和抗体、自身抗体及其时型(chronotype)等的定量。
<将抗体用蛋白酶消化的步骤>
对于通过质谱分析法简便且高精度地对蛋白质进行检测及定量而言,将测定对象蛋白质进行位置选择性切断而高效地产生该蛋白质特异性的肽片段、并且减小其它肽片段的产生量的方式是有效的。测定对象为抗体时,例如,通过一方面将Fab结构域或Fab结构域的可变区进行位置选择性消化、另一方面抑制Fc结构域的消化,由此能够以高灵敏度来检测抗体。
本实施方式的方法中,靶抗体为要定量的对象抗体,参照抗体是为了对靶抗体进行定量而进行对比的抗体。上述参照抗体相当于上述生物蛋白。本说明书中,有时将靶抗体及参照抗体统称为“抗体”。抗体的一例是Fc结构域与Fab结构域通过铰链部连接而成的免疫球蛋白IgG。构成抗体分子的2条重链及2条轻链分别具有恒定区和可变区。恒定区具有在源自同一物种的抗体之间几乎共通的氨基酸序列。可变区中分别存在各3个被称为互补决定区(CDR)的具有特异性序列的部位。该CDR(CDR1、CDR2及CDR3)所规定的立体结构决定了与抗原的特异性。
参照抗体的蛋白酶消化和靶抗体的蛋白酶消化可以在进行完一者之后再进行另一者,优选同时进行。靶抗体和参照抗体可以包含在同一试样中,也可以包含在不同试样中。
靶抗体可以包含制造而得的抗体,也可以包含生物内产生的抗体。靶抗体例如可以包含单克隆抗体或多克隆抗体。靶抗体可以包含通过免疫反应而在生物内产生的抗体,也可以包含中和抗体、自身抗体和/或其时型。靶抗体可以包含2种以上抗体。能够同时定量的抗体的种类可以为3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、40种、60种、80种或其以上。多种靶抗体可以包含于同一试样中,也可以包含于不同试样中。
靶抗体可以为培养细胞、培养组织或其培养上清中所含的抗体,优选为生物试样中所含的抗体。生物试样可以是由被检体得到的血液,也可以是生物组织、尿、粪便、汗、唾液、淋巴液、羊水、母乳、胸水、腹水、脑脊液、泪液等。源自血液的生物试样可以是全血,优选为血浆或血清。试样可以用生理盐水、缓冲液等进行了稀释。被检体可以为动物,例如为包括人在内的哺乳类。被检体可以为给予了作为抗体药物的单克隆抗体的患者。生物试样可以根据生物试样的种类适当采集,采集后可以于室温或低温下保存。靶抗体为生物试样所包含的抗体时,利用本实施方式的方法可以确定生物内的靶抗体的浓度。
参照抗体可以使用作为靶抗体而例示的抗体。参照抗体是与靶抗体不同的抗体。本实施方式的一个方面中,参照抗体也可以作为相对于靶抗体而言至少可变区的氨基酸序列不同的抗体来把握。在一次分析中作为参照抗体来使用的抗体在其它分析中可以为靶抗体。参照抗体优选浓度已确定。可以使用具有多种浓度的参照抗体制作标准曲线。参照抗体可以用稳定性同位素氨基酸标记,也可以未进行标记。
参照抗体优选为容易获得的抗体。从容易确定浓度及氨基酸序列的观点出发,参照抗体优选为单克隆抗体。作为单克隆抗体,没有特别限定,可以为完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体,可列举曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1、贝伐单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗、本妥昔单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗、莫格利珠单抗、雷莫芦单抗、阿特珠单抗、度伐利尤单抗、阿维鲁单抗、英夫利昔单抗、托珠单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、美泊利珠单抗、乌司奴单抗、依库珠单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、吉妥珠单抗、帕利珠单抗、雷珠单抗、赛妥珠单抗、奥瑞珠单抗、巴利昔单抗等。单克隆抗体的分子直径约14.5nm。维持单克隆抗体的特异性且附加有进一步功能的复合体、例如抗体-药物复合体(例如维布妥昔单抗、吉妥珠单抗-奥唑米星、曲妥珠单抗-美坦新偶联物等)也包含在本实施方式的方法的单克隆抗体中。可以在分析之前先使复合体的结合发生解离、并且仅对抗体部分进行分析,也可以以复合体的形态直接供于分析。
本实施方式中,上述生物蛋白可以为Fc融合蛋白。在此,“Fc融合蛋白”是指将功能性蛋白或其结构域与免疫球蛋白的Fc结构域融合而成的重组蛋白。作为上述功能性蛋白或其结构域,可列举例如人细胞杀伤性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的胞外结构域、人血管内皮生长因子(VEGF)受体1及2蛋白的胞外结构域、以及肿瘤坏死因子(TNF)受体等。上述Fc融合蛋白可列举例如阿巴西普(CTLA-4的胞外结构域与免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白)、阿柏西普(VEGF受体1及2蛋白的胞外结构域与免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白)及依那西普(TNF受体与免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白)等。本实施方式的一个方面中,上述Fc融合蛋白优选选自由阿巴西普、阿柏西普及依那西普组成的组。
本实施方式的一个方面中,用蛋白酶消化的步骤优选包括下述步骤:
(a)将生物蛋白及靶抗体固定在载体的微孔内的步骤;和
(b)使具有大于微孔直径的直径且表面固定有蛋白酶的微粒与载体接近的步骤。
本实施方式的另一方面中,为了将Fab结构域(或Fc融合蛋白中的功能性蛋白的结构域)位置选择性地消化,将抗体用蛋白酶消化的步骤优选包括下述步骤:
(a)将参照抗体(或Fc融合蛋白)及靶抗体固定在载体的微孔内的步骤;和
(b)使具有大于微孔直径的直径且表面固定有蛋白酶的微粒与载体接近的步骤。
(a)将参照抗体及靶抗体固定在载体的微孔内的步骤
固定抗体的载体为具有多个微孔的多孔体即可,能够在微孔内结合抗体。载体的材料没有特别限定,可以使用活性炭、多孔膜、多孔树脂珠、金属颗粒等。
微孔的形状没有特别限定,可以为半球形状,也可以为贯穿载体的形状。优选考虑抗体的分子直径等而决定微孔的大小,以使得在固定抗体时抗体的前端部分、即应被选择性消化的部位位于微孔的开口部附近。例如在10nm以上且500nm以下程度的范围内且在比微粒的平均粒径小的范围内适当设定载体的平均微孔直径。载体的平均微孔直径例如可以为20nm以上、30nm以上、40nm以上或50nm以上,可以为200nm以下、150nm以下、120nm以下或100nm以下。载体的平均微孔直径可通过电子显微镜法求出。
为了将抗体固定在载体的微孔内,优选使用在微孔内固定有可与抗体发生部位特异性相互作用的连接体(linker)的载体。作为抗体与连接体的相互作用,可列举化学键、氢键、离子键、形成络合物、疏水相互作用、范德华相互作用、静电相互作用、立体选择性相互作用等。从容易固定在微孔内的观点出发,优选参照抗体、更优选参照抗体及靶抗体具有能够固定在微孔中的结构域。能够固定在微孔中的结构域例如为抗体的Fc结构域。本实施方式的一个方面中,生物蛋白具有能够固定在上述微孔内的结构域。
作为连接体,优选使用可与抗体的Fc结构域进行部位特异性结合的蛋白A、蛋白G等。通过使用在微孔内固定有这些连接体的载体,从而抗体的Fc结构域被固定在微孔内、Fab结构域位于微孔的开口部附近。通过控制抗体在微孔内的取向,能够利用蛋白酶进行Fab结构域的位置选择性消化。
作为本实施方式中可优选使用的载体,没有特别限定,可列举例如蛋白GUltralink树脂(Pierce公司制)、TOYOPEARL TSKgel(TOSOH公司制)、TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F树脂(TOSOH公司制)、蛋白A琼脂糖(GE health care)、KanCapA(KANEKA)等。
将抗体固定在载体的微孔内的方法没有特别限定,例如,在于微孔内固定有蛋白A或蛋白G的载体中固定抗体时,通过将载体悬浮液与包含抗体的溶液混合,可以容易地将抗体固定在微孔内。载体与抗体的量比可以根据目的而适当设定。然后,用适当的缓冲液清洗载体而除去非特异性结合的抗体及试样中所含的分子。作为缓冲液,可使用例如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、含有正辛基硫代葡糖苷(OTG)的PBS等。例如,可以使用内置过滤器的板通过抽吸或离心操作对多样品同时自动化地进行清洗。
(a’)在酸性条件下进行还原反应的步骤
在上述的(a)将参照抗体及靶抗体固定在载体的微孔内的步骤之后,可以实施(a’)在酸性条件下对抗体进行还原反应的步骤。抗体中,由于某些机制、例如基于S-S键(二硫键)的半胱氨酸结(cysteine knot)结构的存在而存在非常刚性的区域,有时会对蛋白酶产生抗性。例如,已知约20~30%的单克隆抗体具有局部性的蛋白酶抵抗性。通过进行酸性还原处理,有时可提高这样的刚性抗体的蛋白酶消化效率。酸性还原条件下,蛋白A或蛋白G与Fc结构域的结合不会解离,因此认为能在将抗体分子保持于载体上的状态下解开半胱氨酸结结构。
酸性条件下的还原反应例如可以通过在有机磷系还原剂存在下的孵育而实施。作为有机磷系还原剂,可列举例如三(2-羧基乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine:TCEP)或其盐酸盐、三丁基膦等。这些还原剂可以从Sigma-Aldrich公司、NACALAI TESQUE,INC.、FUNAKOSHI株式会社等获得。反应液中的TCEP的浓度例如可以为100mM以上且500mM以下,例如250mM。
还原反应优选在pH2.5以下的强酸性条件下、例如pH1.5、pH2.0、PH2.5等下实施。还原反应的时间没有限定,为10分钟以上且60分钟以下则是充分的,例如,也可以为20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟。虽然也可以进行超过60分钟还原反应,但是这种情况下测定用的操作时间将变长。反应温度没有限定,例如可以为15℃以上且30℃以下,可以在室温下实施反应。优选反应温度为约25℃。
可以将未经酸性还原处理的试样和经过酸性还原处理的试样同时供于质谱分析。具体而言,将载体和抗体溶液混合而成的溶液一分为二,一份直接进行清洗。另一份在进行酸性还原处理后进行清洗。将清洗后的两份载体合并,进行接下来的蛋白酶消化步骤。由此,可以将进行了TCEP酸性还原处理的抗体所产生的肽片段和未经TCEP酸性还原处理的抗体所产生的肽片段这两者作为1个样品供于质谱分析。
(b)使具有大于微孔直径的直径且表面固定有蛋白酶的微粒与载体接近的步骤
固定于微粒的蛋白酶的种类可根据成为质谱分析的定量对象的抗体的种类来适当选择,例如可以单独或组合使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰内肽酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶。作为蛋白酶,优选使用胰蛋白酶。作为本实施方式的方法中可优选使用的蛋白酶,可列举例如Trypsin Gold(Promega公司制)、Trypsin TPCK-treated(西格玛公司制)等。
微粒是出于在其表面固定蛋白酶、控制蛋白酶与固定在载体的微孔内的抗体的靠近的目的而使用的。因此,为了避免微粒进入载体的微孔深处,使用其平均粒径大于载体的平均微孔直径的微粒。微粒的平均粒径可以为载体的平均微孔直径的1.2倍以上、1.5倍以上、1.8倍以上,可以为约2倍。微粒的平均粒径可以为50nm以上、100nm以上、120nm以上、150nm以上或170nm以上,可以为500nm以下或300nm以下。微粒的平均粒径可通过电子显微镜法来求出。
微粒的形状没有特别限定,从使蛋白酶与载体的靠近均一化的观点出发,优选为球状。微粒优选分散性高、平均粒径均匀。
微粒只要能够在表面固定蛋白酶即可,其材质没有特别限定,可适当使用金属及树脂等。另外,也可以使用用树脂覆盖金属表面而成的微粒、用金属覆盖树脂表面而成的微粒等。
微粒可以分散或悬浮于水性介质,优选为可以从分散液或悬浮液中通过磁分离或磁性沉淀分离而容易地回收的磁性纳米颗粒。从不易发生聚集的观点出发,优选其表面被有机聚合物覆盖。作为被有机聚合物覆盖的磁性纳米珠的具体例,可列举FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品,优选使用例如多摩川精机株式会社制造的FG beads(将铁氧体颗粒用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)覆盖而成的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
为了非特异性的蛋白质吸附抑制和蛋白酶的选择性固定,微粒优选利用可与蛋白酶结合的间隔基(spacer)进行了修饰。通过借助间隔基来固定蛋白酶,可抑制蛋白酶从微粒表面脱离,提高蛋白酶消化的位置选择性。通过调整间隔基的分子尺寸,还可以使蛋白酶选择性地与抗体的期望位置靠近,提高位置选择性。
间隔基优选能与蛋白酶结合且不使蛋白酶失活的间隔基。从控制蛋白酶的靠近范围的观点出发,间隔基优选分子直径小的间隔基。间隔基的分子直径优选为5nm以下,更优选为3nm以下,进一步优选为2nm以下。间隔基的分子量优选为2000以下,更优选为1500以下,进一步优选为1000以下。
间隔基优选为非蛋白质,优选末端具有氨基、羧基、酯基、环氧基、对甲苯磺酰基、羟基、硫醇基、醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、生物素、亲和素、鳌和物等官能团的分子。例如,在固定胰蛋白酶时,优选使用具有经活化的酯基的间隔基。间隔基中,上述官能团以外的间隔基臂部分可使用聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚(环氧乙烷)、聚对苯二甲酸乙二醇酯及它们的衍生物等亲水性分子。
作为用间隔基进行了表面修饰的微粒,可列举例如用具有经N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯基(活性酯基)的间隔基修饰的微粒,以商品名“FG beads NHS”(多摩川精机株式会社制)在销售。
将蛋白酶固定在微粒表面的方法没有特别限定,可根据蛋白酶和微粒(或对微粒表面进行修饰的间隔基)的特性等采用适当的方法。例如,通过将经间隔基修饰的微粒的悬浮液与包含蛋白酶的溶液混合,可以得到表面固定有蛋白酶的微粒。关于固定有胰蛋白酶作为蛋白酶的微粒的市售品,也可以优选使用LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL AntibodyBA Kit”(岛津制作所制)所包含的“FG beads Trypsin DART(注册商标)”。
通过使固定有抗体的载体与固定有蛋白酶的微粒接近或接触,从而抗体的可变区被蛋白酶选择性消化。
蛋白酶消化例如可以在调节成蛋白酶的最适pH附近的缓冲溶液中实施。蛋白酶消化优选在pH7以上且9以下的范围、更优选pH约8.0下实施。蛋白酶消化可以在约37℃的环境下进行,优选在饱和蒸气压下、约50℃下进行。反应时间例如可以为30分钟以上且20小时以下,例如可以为1小时以上或3小时以上,可以为5小时以下或8小时以下。为了防止反应液蒸发,优选在饱和蒸气压下进行反应。
用蛋白酶消化的步骤中,可以对反应液进行搅拌而促进载体与微粒的接触。可以在全部反应时间都进行反应液的搅拌,也可以仅在部分反应时间、例如仅在反应初期进行搅拌。
通过蛋白酶消化而产生的肽片段被释放到反应液中。为了将肽片段供于质谱分析,需要除去载体及微粒。这可以通过对蛋白酶消化后的反应液进行过滤、离心分离、磁分离、透析等操作来实现。
载体及微粒与肽片段的分离例如可以通过使用聚偏氟乙烯(PVDF)制过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、密理博公司制)、聚四氟乙烯(PTFE)制过滤膜(Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、密理博公司制)等进行过滤来简便地实施。通过进一步进行离心,能够迅速且简便地过滤。
将抗体用蛋白酶消化的上述工序可以应用本发明人等的研究小组先前开发的纳米表面及分子取向限制的蛋白分解方法(nano-surface and molecular-orientationlimited proteolysis:nSMOL法)(注册商标),可以适当使用LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所制)。nSMOL法的细节例如记载于国际公开第2015/033479号及Iwamoto Net.al.,Analyst.2014Feb 7;139(3):576-80,doi:10.1039/c3an02104a。nSMOL法的改进技术等在例如国际公开第2016/143223号、国际公开第2016/143224号、国际公开第2016/143226号、国际公开第2016/143227号、国际公开第2019/130549号、国际公开第2019/155576号、Iwamoto N et.al.,Bioanalysis,doi:10.4155/bio-2016-0018、及Iwamoto N et.al.,Biological&Pharmaceutical Bulletin,2016,doi:10.1248/bpb.b16-00230等中有公开。这些文献的公开内容通过参照而整合于本说明书。
nSMOL法的规程的例子如下。
<步骤(a)>
1.将包含抗体的生物学样品5-10μL稀释到约10-20倍量的PBS+0.1%正辛基硫代葡糖苷(OTG)中。
2.对于稀释而得的生物学样品,加入免疫球蛋白收集树脂(ImmunoglobulinCollection Resin)(TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F,50%浆料)25μL,得到混合液。
3.将得到的混合液通过涡旋混合平稳地搅拌5分钟左右。
4.将上述混合液全部回收到Ultrafree low-protein binding Durapore PFDF(0.22μm)中。
5.离心除去上清(10000g,1分钟)。
6.加入PBS+0.1%OTG 300μL,离心除去上清(10000g,1分钟)。
7.重复步骤6。
8.为了除去表面活性剂(OTG)而加入PBS 300μL,离心除去上清(10000g,1分钟)。
9.重复步骤8。
10.加入反应溶液或增强反应溶液75-100μL。该溶液中可以添加10fmol/μL的P14R合成肽。
<步骤(b)>
11.加入化学修饰胰蛋白酶固相化FG珠(0.5mg/ml的FG珠悬浮液)5-10μL。
12.在饱和蒸气压下在50℃下,边平稳地搅拌边反应4-6小时。
13.向反应液中加入10%甲酸10μL而使反应停止。
14.进行离心过滤(10000g,1分钟),回收溶液。
15.将收容有上述溶液的管立在磁性架上,静置约1-2分钟,从上述溶液中除去剩余的树脂。
图1示出通过nSMOL法对抗体进行位置选择性切断的情况的一例。在具有平均粒径D1的微粒10的表面固定有蛋白酶15。蛋白酶15通过间隔基11而固定于微粒。载体20具有多个微孔29且固定有能够与抗体特异性结合的连接体21,所述微孔29具有平均微孔直径D2。抗体25借助连接体21而固定在微孔内。微孔29附近的虚线表示蛋白酶15所能靠近的区域的边界。通过限制蛋白酶对微孔内表面所结合的抗体的Fc结构域的靠近,蛋白酶对位于相较于与微孔的结合部位而言较远处的开口部附近的Fab结构域靠近的概率可相对提高。由此,可以通过蛋白酶对抗体的Fab结构域进行位置选择性切断并得到肽片段。
<对肽片段进行质谱分析的步骤>
将通过上述步骤而得到的肽片段供于质谱分析。参照抗体的肽片段和靶抗体的肽片段可以包含在同一试样中,也可以包含在不同试样中。由多种靶抗体得到的肽片段可以包含在同一试样中,也可以包含在不同试样中。
为了更可靠地进行肽片段的分离、提高分析精度,优选通过液相色谱(LC)对供于质谱分析之前的试样进行分离及浓缩。在通过LC进行试样的分离时,可以将来自LC的洗脱液直接电离并供于质谱分析。也可以通过将LC和串联质谱分析组合而成的LC/MS/MS或LC/MSn来进行分析。也可以将来自LC的洗脱液暂时取出后再供于质谱分析。LC的柱没有特别限定,可以适当选择并使用通常用于肽分析的C30、C18、C8、C4等疏水柱、亲水性亲和色谱用载体等。可以根据需要在进行脱盐、增溶、提取、浓缩、干燥等处理后将试样用于质谱分析。
质谱分析中的电离方法没有特别限定,可采用电子电离(EI)法、化学电离(CI)法、场解吸(FD)法、快原子轰击(FAB)法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾电离(ESI)法等。经过电离的试样的分析方法也没有特别限定,可根据电离方法适当决定磁场偏向型、四级杆(Q)型、离子阱(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)型等。还可以使用三重四级杆型质谱分析装置等,来进行MS/MS分析、MS3以上的多级质谱分析或多重反应监测(multiple reaction monitoring:MRM)。
本实施方式的方法中特别适合的装置没有特别限定,可列举例如LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060、LCMS-9030、LCMS-IT-TOF(均为岛津制作所制)。
通过利用质谱分析来检测包含靶抗体特异性Fab区域、例如重链和/或轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列的肽片段,能够鉴定靶抗体。为了鉴定靶抗体,可以使用现有的数据库。若利用nSMOL法,则可使用利用蛋白酶将抗体位置特异性消化而得的肽片段,因此数据库检索的命中率及数据的准确性提高。可以选择源自Fab区域的多个肽片段中的、尤其适合于抗体的鉴定的肽片段作为分析对象。如此选择出的肽片段也被称为“特征肽”(signature peptide)。
在基于包含CDR序列的特定肽片段的检测结果进行抗体的鉴定时,检测对象的肽片段的氨基酸残基数优选为5以上且30以下左右,更优选为7以上且25以下左右。若氨基酸残基数过小,则难以与源自杂质或同一蛋白的其它部位的肽片段相区别,可能导致错误检测等。另外,若氨基酸残基数过大,则有时会由于电离变困难等原因而难以进行检测、或者定量性下降。
<对靶抗体进行定量的步骤>
基于通过质谱分析而得到的参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比,对靶抗体进行定量。本实施方式中,“检测强度”是指供于质谱分析而得到的质谱中的、源自对象的肽片段的峰面积或峰强度。即,“参照抗体的检测强度”是指供于质谱分析而得到的质谱中的、源自参照抗体的肽片段的峰面积或峰强度。“靶抗体的检测强度”是指供于质谱分析而得到的质谱中的、源自靶抗体的肽片段的峰面积或峰强度。可以基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比、及参照抗体的检测量与靶抗体的检测量之比对靶抗体进行定量。可以基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比对靶抗体的检测量或参照抗体的检测量进行校正。参照抗体的检测量和靶抗体的检测量可以基于上述的参照抗体及靶抗体的肽片段的通过质谱分析而得到的质谱的峰面积或峰强度来算出。
例如,可以基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比而将参照抗体的检测量变换为靶抗体的标准量,将其与靶抗体的实际检测量进行对比,对靶抗体进行定量。例如,可以基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比而将靶抗体的检测量变换为参照抗体的检测量,将其与参照抗体的实际检测量(标准量)进行对比,对靶抗体进行定量。参照抗体可以在1个浓度下进行质谱分析,也可以在多种浓度下进行质谱分析。在多种浓度下对参照抗体进行质谱分析时,可基于质谱分析的结果来制作参照抗体的标准曲线。例如,可以基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比而将参照抗体的标准曲线变换为靶抗体的标准曲线,对靶抗体进行定量。
参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比可以通过对具有规定浓度的参照抗体及具有规定浓度的靶抗体进行质谱分析来确定。例如,可以将等量的参照抗体和靶抗体在相同条件下用蛋白酶消化,供于质谱分析,将得到的质谱的峰面积或峰强度之比作为参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比。参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比可以是进行5次独立分析而得到之比率的中位值或平均值。通常,参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比是固定的,不因其浓度而变化。可以预先确定参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比。通过预先进行确定,可以简便地进行靶抗体的定量。参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比可以作为用于对靶抗体进行定量的常数而普遍使用。
即,本实施方式的一个方面中,上述分析抗体的方法优选还包括下述步骤:
对具有规定浓度的上述生物蛋白及具有规定浓度的上述靶抗体进行质谱分析;和
基于上述质谱分析的结果,预先确定上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比。
本实施方式的另一方面中,上述分析抗体的方法优选还包括下述步骤:
对具有规定浓度的上述参照抗体及具有规定浓度的上述靶抗体进行质谱分析;
预先确定上述参照抗体的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比。
具有规定浓度的参照抗体及具有规定浓度的靶抗体的质谱分析没有特别限定,可以通过上述的对参照抗体及靶抗体进行质谱分析的步骤中记载的方法来进行。具有规定浓度的参照抗体及具有规定浓度的靶抗体的质谱分析可以与上述的对参照抗体及靶抗体进行质谱分析的步骤同时进行,也可以在上述的对参照抗体及靶抗体进行质谱分析的步骤之前进行。对参照抗体及靶抗体进行质谱分析的步骤优选在与具有规定浓度的参照抗体及具有规定浓度的靶抗体的质谱分析相同的条件下进行。
[试剂盒]
本实施方式的试剂盒包含:
上述生物蛋白、
上述表面固定有蛋白酶的微粒、和
上述设置有微孔的载体。
上述试剂盒为用于上述的分析抗体的方法的试剂盒。
本实施方式的试剂盒包含:
参照抗体、
表面固定有蛋白酶的微粒、和
设置有微孔的载体。
试剂盒可以为用于上述的分析抗体的方法的试剂盒。
生物蛋白、参照抗体、微粒及载体可以为上述的方法中记载的生物蛋白、参照抗体、微粒及载体。试剂盒可以还包含可用于上述的方法的微型板及管等反应容器、内置过滤器的板、缓冲液、清洗液、蛋白酶反应液、酸性还原剂、过滤膜、吸头、分析柱。试剂盒可以包含记载有试剂盒的使用方法和/或用于检测抗体的质谱分析条件的说明书。试剂盒可以包含示出了生物蛋白的检测强度与靶抗体的检测强度之比的对应表、或示出了参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比的对应表。
通过使用本实施方式的试剂盒,可以更简便地进行用于检测抗体的肽片段的制备操作,可实现利用装置的自动化。通过使用本实施方式的试剂盒,还可简便地进行质谱分析及靶抗体的定量。
[程序]
本实施方式的程序为用于上述分析抗体的方法的程序,
上述程序可以使处理装置执行如下的处理:
接收从质谱分析装置输出的质谱;
从存储部读出上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比;
对从上述质谱算出的上述生物蛋白的检测量进行校正;
算出上述靶抗体的量。
本实施方式的程序使处理装置执行如下的处理:
接收从质谱分析装置输出的质谱;
从存储部读出参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比;
对从上述质谱算出的上述参照抗体的检测量进行校正;
算出上述靶抗体的量。
本实施方式的程序可以为实现上述的分析抗体的方法中的对靶抗体进行定量的步骤的程序。
程序的一例为:根据从质谱分析装置输出的质谱来鉴定参照抗体及靶抗体并算出各自的检测量。参照抗体的种类及其浓度可从用户处接收。根据所接收的参照抗体,从存储部读出参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比。参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比如上所述可以为通过对具有规定浓度的参照抗体及具有规定浓度的靶抗体进行质谱分析而确定的值。该值优选已预先存储在存储部。基于参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比,将从质谱算出的参照抗体的检测量乘以常数倍,可以变换为靶抗体的标准量。将该值与从质谱得到的靶抗体的检测量进行对比,可以确定靶抗体的浓度。
程序可以记录在计算机可读取的记录介质中。记录有本实施方式的程序的记录介质与记录有下述的用于执行质谱分析的数据的记录介质可以相同也可以不同。记录介质中记录的程序可以被计算机系统读入、执行。本说明书中“计算机系统”包括OS(OperatingSystem,操作系统)及周边设备的硬件。“计算机可读取的记录介质”包括软盘、光磁盘、光盘、存储卡等便携式记录介质、计算机系统内置的硬盘等存储装置。“计算机可读取的记录介质”可以包括:借助互联网等网络及电信线路等通信线路发送程序的情况下的通信线之类的、在短时间内动态地保持程序的记录介质;这种情况下的成为服务器、客户端的计算机系统内部的挥发性存储器之类的在一定时间内保持程序的记录介质。程序可以为通过与已记录在计算机系统中的程序组合来执行处理的程序。
[记录有用于执行质谱分析的数据的记录介质]
本实施方式还可提供用于本实施方式的方法的、记录有用于执行质谱分析的数据的计算机可读取的记录介质。数据没有特别限定,可以包含:关于1个以上的具有各抗体所特有的氨基酸序列的肽片段的、母离子、碎片离子、预测保留时间、及三重四级杆各自(第1四级杆、第2四级杆、第3四级杆)的电压数据。数据可以包含与特定抗体相关的信息。
上述的预测保留时间、电压数据等是根据所使用的设备及测定条件等而变化的数值,优选与设备一起提供。关于根据条件而变化的数值,如本领域技术人员所理解那样,优选也一并提供其变动幅度。
[方法包]
本实施方式还可提供用于通过液相色谱-质谱分析(LC-MS)来进行靶抗体的检测及定量的方法包,其包含记录有上述的程序和/或数据的记录介质。
本说明书中,“方法包”是指:以可读取的方式包含针对特定测定对象的液相色谱-质谱分析的分析条件和/或用于对靶抗体进行定量的程序且可单独流通的物品。通过将方法包中所含的数据输入LC-MS,能够在详细研究后而得到的最佳测定条件下进行分析。通过执行方法包中所含的程序,能够进行靶抗体的定量。方法包也可以包含上述记录介质的使用说明书。
利用质谱分析的测定一方面可以实现非常高精度的分析,另一方面由于分析条件根据目标离子而完全不同,因此合适的分析条件的设定非常重要也非常困难,为了设定条件而需要非常多的时间。通过预先准备这样的条件,可以提高实际进行质谱分析的用户的便利性。
方法包可以记载在多种质谱分析装置中通用的数据,也可以记载适合于利用特定质谱分析装置进行分析的各种数据。
记录介质或方法包可以与上述的本实施方式的试剂盒一起提供,或者可以与试剂盒分开提供。
实施例
以下列举实施例更详细地说明本发明,但是本发明不受这些限定。
<实验1>
验证通过质谱分析能否同时鉴定基于nSMOL法用蛋白酶消化的多种抗体。将从血清分级出的抗体基于nSMOL法消化。将得到的肽片段供于质谱分析而鉴定序列。血清使用人类标准品试剂(10名被检体的混合样品、Innovative Research公司制、制品名“PooledHuman AB Serum Plasma Derived”)。质谱分析装置使用LCMS-9030(岛津制作所制),获得的MS谱输出为mzML文件格式后,使用Peaks Studio version10.5进行分析。由于个别的源自人的抗体的序列信息(抗体的氨基酸序列信息)不存在,因此对公共数据库(IMGT数据库)实施了谱图匹配及检索。
基于nSMOL法的抗体消化使用“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所制)按照下述方式进行。
(1)将血清10μL稀释于约10倍量的PBS+0.1%OTG。
(2)对于经稀释的血清,加入免疫球蛋白收集树脂(微孔内固定有蛋白A的载体、微孔直径100nm)25μL,得到混合液。
(3)将得到的混合液通过涡旋混合平稳地搅拌5分钟。
(4)将上述混合液全部回收到Ultrafree low-protein binding Durapore PVDF(0.22μm)(离心分离式的超滤过滤器)中。
(5)离心除去上清(10000g,1分钟)。
(6)加入PBS+0.1%OTG 300μL,离心除去上清(10000g,1分钟)。
(7)重复步骤(6)。
(8)为了除去表面活性剂(OTG),加入PBS 300μL,离心除去上清(10000g、1分钟)。
(9)重复步骤(8)。
(10)加入增强反应溶液100μL。
(11)加入化学修饰胰蛋白酶固相化FG珠DART(直径200nm)(表面固定有蛋白酶的微粒)5μL。
(12)在饱和蒸气压下、50℃下,边平稳地搅拌边反应5小时。
(13)向反应液中加入10%甲酸10μL,由此使反应停止。
(14)进行离心过滤(10000g,1分钟),回收溶液。
(15)将收容有上述溶液的管立在磁性架上,静置约1分钟,从上述溶液中除去剩余的磁珠。
(16)将上述溶液供于LCMS分析。
作为比较例,将用胃蛋白酶(Promega公司制、制品名“Pepsin”)或IdeS酶(Promega公司制、制品名“IdeS Protease”)消化抗体而得的肽片段供于质谱分析。将结果示于表1。
[表1]
胃蛋白酶法 | IdeS蛋白酶法 | nSMOL法 | |
血清量 | 10mL | 10mL | 10μL |
鉴定肽数 | 368 | 653 | 1257 |
鉴定IgG数 | 18 | 52 | 142 |
De novo测序鉴定数 | 1554 | 2539 | 7660 |
高变区CDR3鉴定数 | 0 | 5 | 31 |
确认基于nSMOL法能够同时进行多种抗体的鉴定。根据nSMOL法,与胃蛋白酶法及IdeS蛋白酶法相比,能够从更少的血清量中鉴定更多的序列。
<实验2>
进一步使用序列已知的单克隆抗体验证通过质谱分析是否能够同时鉴定基于nSMOL法消化的多种抗体。将包含曲妥珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗、本妥昔单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗、莫格利珠单抗、雷莫芦单抗、阿特珠单抗、度伐利尤单抗、阿维鲁单抗、英夫利昔单抗、托珠单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、美泊利珠单抗、乌司奴单抗及依库珠单抗的20种单克隆抗体混合到人血清(Innovative Research公司制、制品名“Pooled Human AB Serum Plasma Derived”)中。将该样品与实验1同样地基于nSMOL法消化,将得到的肽片段供于质谱分析。质谱分析装置使用LCMS-9030(岛津制作所制)。获得的MS谱输出为mzML文件格式后,使用Peaks Studio version10.5对内部单克隆抗体FASTA数据库实施谱图匹配及检索。其结果是,对于所使用的所有抗体,均能够鉴定特征肽及CDR3序列。表明利用nSMOL法的质谱分析能普遍用于抗体的定量。各抗体的特征肽序列及CDR3序列(序列号1~43)示于图2。
<实验3>
验证了对抗体逐一进行分析时的定量值与对多种抗体同时进行分析时的定量值的误差。对比了添加1种抗体的单一试样的定量值与添加多种抗体的混合试样的定量值。单一试样为将本妥昔单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、英夫利昔单抗、阿特珠单抗、贝伐单抗、帕博利珠单抗、曲妥珠单抗、依库珠单抗、美泊利珠单抗、托珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹木单抗、纳武单抗、雷莫芦单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、阿巴西普、阿柏西普及依那西普这21种单克隆抗体或Fc融合蛋白之中的1种混合到人血清中而成的试样,混合试样为包含全部这些抗体及Fc融合蛋白的试样。各抗体及Fc融合蛋白的混合量为50μg/mL。将各抗体的特征肽序列示于图2及图3。需要说明的是,后文的记载中有时将单克隆抗体及Fc融合蛋白统称为“抗体”。
将该试样通过以下所示的改良nSMOL法(图4)消化。相较于实验2的变更之处在于,改良nSMOL法在微型板上进行反应,以处理多个样品。为了简化离心操作,使用内置过滤器的微型板。为了分析显示蛋白酶抵抗性的抗体,在强酸还原条件下对抗体进行了前处理。通过将未进行强酸还原处理的抗体和进行了强酸还原处理的抗体合并进行分析,提高了蛋白酶处理效率。
具体操作如下所述。
(1)将10μL的试样用90μL的PBS+0.1%OTG稀释。
(2)将经过稀释的试样转移到低吸附微型板(Eppendorf公司制、制品名“ProteinLoBind Plate”)中,进一步加入IgG收集树脂(微孔内固定有蛋白A的载体、微孔直径100nm)25μL。
(3)将IgG收集树脂两等分。一份直接用PBS+0.1%OTG清洗,另一份在酸性还原处理(250mM TCEP-HCl)后进行清洗。清洗在内置过滤器的微型板(Whatman公司制、“UNIFILTER filter plate”、孔径20μm)上实施,用真空多联器(Vacuum Manifold)进行废液处理。
(4)将内置过滤器的微型板上的IgG收集树脂用增强反应溶液悬浮后,加入到低吸附微型板的同一孔中,将2种条件的树脂混合。
(5)加入10μL的FG beads Trypsin DART(直径200nm)(表面固定有蛋白酶的微粒)。
(6)在饱和蒸气压下、在50℃下边平稳地搅拌边反应5小时。
(7)反应后,加入10%甲酸10μL使反应停止,回收到内置过滤器的微型板(NihonPall Ltd.制、“AcroPrep advance 96-well Filter plate”、孔径200nm)上。
(8)离心(1500g,10分钟),回收包含肽片段的溶液。
LCMS在下述条件下进行。
[LC]NexeraX2系统(岛津制作所制)
柱:Shim-pack GISS C18(50mm×2.1mm)
柱温度:50℃
溶剂A:0.1%甲酸/水
溶剂B:0.1%甲酸/乙腈
梯度:1%B(1分钟)/1-50%B(5分钟)/95%B(1.5分钟)/1%B(10.5分钟)
流速:0.4mL/分钟
注入量:10μL
[MS]LCMS-9030(岛津制作所制)
电离:ESI正模式
DL温度:250℃
加热块温度:400℃
界面温度:300℃
雾化气体:3L/分钟
干燥气体:10L/分钟
加热气体:10L/分钟
质谱分析装置及分析方法与实验2相同。
首先,对于单一试样(N=3)及混合试样(N=3),确认标准曲线的重现性及准确性足够高。针对作为绝对数值的离子计数值及使用内标校正后的值来进行单一试样与混合试样的对比。将对单一试样进行质谱分析时的离子计数值(cps)与对混合试样进行质谱分析时的各抗体的cps的对比结果示于图5。将使用内标校正单一试样的检测量而得的值与使用内标校正混合试样中的各抗体的检测量而得的值的对比结果示于图6。内标使用P14R合成肽(PPPPPPPPPPPPPPR:序列号47)。图5及图6为设单一试样的值为100时的、混合试样中的各抗体的相对值。对抗体逐一进行分析时和同时分析多种抗体时的定量准确性为6.7%(0.62%~15.9%、中位值6.5%)。根据美国食品药品监督管理局(FDA)的验证指导标准的误差范围为±15%以内。确认将多种抗体同时供于质谱分析而得到的定量值具有高的准确性。例如,表明了即使是由生物体获得的临床样品,也能够通过质谱分析对多种抗体同时进行定量。
<实验4>
求出了1种抗体的检测强度与其它抗体的检测强度之比。使用将实验3中记载的21种单克隆抗体及Fc融合蛋白全部添加到血清中而成的混合试样,算出其它抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比。也可以以曲妥珠单抗以外的抗体为基准来算出1种抗体的检测强度与其它抗体的检测强度之比。抗体的蛋白酶消化方法及质谱分析条件与实验3相同。混合试样为4种浓度,对于各浓度进行了5次独立分析(N=5)。该条件满足FDA标准。
表明了其它抗体的cps相对于曲妥珠单抗的cps之比(即,靶抗体的检测强度与参照抗体的检测强度之比)与抗体的浓度无关,是固定的(图7~图9)。若利用该比(常数),则能够使用由曲妥珠单抗制作的标准曲线来对曲妥珠单抗以外的抗体进行定量。其它抗体相对于1种抗体的cps比可以为多次实验的平均值或中位值。
<实验5>
基于使用曲妥珠单抗(参照抗体)制作的标准曲线,对临床被检体中所含的抗体(靶抗体)进行定量。临床被检体为给予了伊匹木单抗的人血清(N=71)及给予了帕博利珠单抗的人血清(N=95)。定量通过与实验3中记载的方法相同的方法来进行。曲妥珠单抗的标准曲线通过稀释系列法(以达到1000μg/mL的方式向人血清中添加曲妥珠单抗,通过二倍稀释系列将其制成标准曲线样品)而制作。对于曲妥珠单抗的标准曲线,基于实验4中算出的曲妥珠单抗的检测强度与伊匹木单抗的检测强度之比进行校正。基于校正后的标准曲线确定伊匹木单抗的浓度。通过相同方法,基于曲妥珠单抗的检测强度与帕博利珠单抗的检测强度之比对使用曲妥珠单抗制作的标准曲线进行校正,确定帕博利珠单抗的浓度。
为了确认定量值的重现性,基于使用伊匹木单抗制作的标准曲线,对相同临床被检体中的伊匹木单抗进行定量。伊匹木单抗的标准曲线通过稀释系列法(以达到1000μg/mL的方式向人血清中添加伊匹木单抗,通过二倍稀释系列将其制成标准曲线样品)来制作。通过相同方法,基于使用帕博利珠单抗制作的标准曲线对临床被检体中的帕博利珠单抗进行定量。
对比了基于曲妥珠单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度与基于伊匹木单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度。对于通过2种方法而得到的数值进行皮尔逊积矩相关分析,为R2=0.81,表明两者具有高的重现性(图10)。同样,对比了基于曲妥珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度与基于帕博利珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度。对于通过2种方法得到的数值进行皮尔逊积矩相关分析,为R2=0.86,表明两者具有高的重现性(图11)。可知,利用参照抗体的检测强度与靶抗体的检测强度之比,以1种参照抗体为基准,能够求出临床被检体中所含的多种靶抗体的浓度。
<实验6>
基于实验5的结果,验证了能否使用曲妥珠单抗以外的抗体及Fc融合蛋白作为参照蛋白(即,生物蛋白)。即,基于使用以下所示的参照蛋白中的任一种制作的标准曲线,对临床被检体中所含的抗体(靶抗体)进行了定量。临床被检体为给予了伊匹木单抗的人血清(N=71)及给予了帕博利珠单抗的人血清(N=74)。定量通过与实验3中记载的方法相同的方法进行。参照蛋白的标准曲线通过稀释系列法(以达到1000μg/mL的方式向采集的人血清中添加参照蛋白,通过二倍稀释系列将其制成标准曲线样品。)来制作。基于通过与实验4同样的方法算出的该参照蛋白的检测强度与伊匹木单抗的检测强度之比,对该参照蛋白的标准曲线进行了校正。基于校正后的标准曲线确定伊匹木单抗的浓度。通过相同方法,基于参照蛋白的检测强度与帕博利珠单抗的检测强度之比对使用参照蛋白制作的标准曲线进行了校正,确定帕博利珠单抗的浓度。
(使用的参照蛋白)
曲妥珠单抗(Tra)、维布妥昔单抗(Bre)、西妥昔单抗(Cet)、利妥昔单抗(Rit)、英夫利昔单抗(Ifx)、阿特珠单抗(Atz)、贝伐单抗(Bev)、帕博利珠单抗(Pem)、依库珠单抗(Ecu)、美泊利珠单抗(Mep)、托珠单抗(Toc)、阿维鲁单抗(Ave)、度伐利尤单抗(Dyr)、伊匹木单抗(Ipi)、纳武单抗(Niv)、雷莫芦单抗(Ram)、阿达木单抗(Ada)、戈利木单抗(Gol)、阿巴西普(Abt)及依那西普(Etn)。
另外,为了确认定量值的重现性,基于使用伊匹木单抗制作的标准曲线对相同临床被检体中的伊匹木单抗进行定量。伊匹木单抗的标准曲线通过稀释系列法(以达到1000μg/mL的方式向人血清中添加伊匹木单抗,通过二倍稀释系列将其制成标准曲线样品)来制作。通过相同方法,基于使用帕博利珠单抗制作的标准曲线对临床被检体中的帕博利珠单抗进行了定量。
对比了基于参照蛋白的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度与基于伊匹木单抗的标准曲线而定量的伊匹木单抗的浓度(图12、14A、14B)。对于通过2种方法得到的数值行皮尔逊积矩相关分析,在任意参照蛋白情况下,R2的值均为0.99以上,表明具有高的重现性(表2)。
[表2]
参照mAb | 拟合优度r2 |
维布妥昔单抗 | 0.998 |
西妥昔单抗 | 0.9993 |
利妥昔单抗 | 0.9997 |
英夫利昔单抗 | 1 |
阿特珠单抗 | 0.9999 |
贝伐单抗 | 0.9999 |
帕博利珠单抗 | 1 |
曲妥珠单抗 | 1 |
依库珠单抗 | 1 |
美泊利珠单抗 | 1 |
托珠单抗 | 0.9995 |
阿维鲁单抗 | 0.9974 |
度伐利尤单抗 | 0.9999 |
纳武单抗 | 1 |
雷莫芦单抗 | 0.9999 |
阿达木单抗 | 1 |
戈利木单抗 | 0.999 |
阿巴西普 | 1 |
依那西普 | 1 |
同样地,对比了基于参照蛋白的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度与基于帕博利珠单抗的标准曲线而定量的帕博利珠单抗的浓度(图13、15A、15B)。对于通过2种方法得到的数值进行皮尔逊积矩相关分析,在任意参照蛋白情况下,R2的值均为0.99以上,表明具有高的重现性(表3)。由以上结果可知,利用参照蛋白的检测强度与靶抗体的检测强度之比,以1种参照蛋白为基准能够求出临床被检体中所含的多种靶抗体的浓度。
[表3]
参照mAb | 拟合优度r2 |
维布妥昔单抗 | 1 |
西妥昔单抗 | 1 |
利妥昔单抗 | 1 |
英夫利昔单抗 | 1 |
阿特珠单抗 | 1 |
贝伐单抗 | 1 |
曲妥珠单抗 | 1 |
依库珠单抗 | 1 |
美泊利珠单抗 | 0.9999 |
托珠单抗 | 1 |
阿维鲁单抗 | 0.9991 |
度伐利尤单抗 | 1 |
伊匹木单抗 | 1 |
纳武单抗 | 1 |
雷莫芦单抗 | 1 |
阿达木单抗 | 1 |
戈利木单抗 | 1 |
阿巴西普 | 1 |
依那西普 | 1 |
[方式]
本领域技术人员可理解,上述多个例示性实施方式及实施例为以下方式的具体例。
(第1项)
一方式的分析抗体的方法包括下述步骤:
将生物蛋白及靶抗体用蛋白酶消化;
对经消化的上述生物蛋白及上述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于通过上述质谱分析得到的上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比,对上述靶抗体进行定量,
上述用蛋白酶消化包括下述步骤:
将上述生物蛋白及上述靶抗体固定在载体的微孔内;和
使具有大于上述微孔直径的直径且表面固定有上述蛋白酶的微粒与上述载体接近,
上述生物蛋白具有能够固定在上述微孔内的结构域。
根据第1项所述的分析抗体的方法,能够在不制作作为测定对象的抗体的标准曲线的情况下通过质谱分析对抗体进行定量。
(第2项)
在第1项所述的分析抗体的方法中,还包括下述步骤:
对具有规定浓度的上述生物蛋白及具有规定浓度的上述靶抗体进行质谱分析;和
基于上述质谱分析的结果,预先确定上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比。
如果预先确定了生物蛋白(例如参照抗体等)的检测强度与靶抗体的检测强度之比,则能够简便地进行靶抗体的定量。
(第3项)
在第1项或第2项所述的分析抗体的方法中,生物蛋白包含参照抗体或Fc融合蛋白。
参照抗体及Fc融合蛋白的通用性高且容易获得,因此适合作为生物蛋白。
(第4项)
在第3项所述的分析抗体的方法中,参照抗体为单克隆抗体。
单克隆抗体容易获得且容易确定浓度及氨基酸序列,因此适合作为参照抗体。
(第5项)
在第3项所述的分析抗体的方法中,参照抗体选自由曲妥珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗、本妥昔单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗、莫格利珠单抗、雷莫芦单抗、阿特珠单抗、度伐利尤单抗、阿维鲁单抗、英夫利昔单抗、托珠单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、美泊利珠单抗、乌司奴单抗及依库珠单抗组成的组。
上述抗体的通用性高且容易获得,因此适合作为参照抗体。
(第6项)
在第3项所述的分析抗体的方法中,Fc融合蛋白选自由阿巴西普、阿柏西普及依那西普组成的组。
上述Fc融合蛋白的通用性高且容易获得,因此适合作为生物蛋白。
(第7项)
在第1项~第6项中任一项所述的分析抗体的方法中,靶抗体为生物试样中所含的抗体。
根据第7项所述的分析抗体的方法,能够对从被检体采集的生物试样中所含的靶抗体进行定量。
(第8项)
在第1项~第7项中任一项所述的分析抗体的方法中,靶抗体包含至少2种抗体。
根据第8项所述的分析抗体的方法,能够以一种生物蛋白(例如参照抗体等)为基准进行多种靶抗体的定量。能够同时对2种以上抗体进行定量。
(第9项)
在第1项~第8项中任一项所述的分析抗体的方法中,靶抗体包含生物体内产生的抗体。
根据第9项所述的分析抗体的方法,即使是难以制作标准曲线的生物体内产生的抗体,也能够进行定量。
(第10项)
一方式的分析抗体的方法包括下述步骤:
将生物蛋白和包含至少2种靶抗体的试样用蛋白酶消化;
对经消化的上述生物蛋白及上述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于通过上述质谱分析得到的上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比,对上述靶抗体进行定量,
上述生物蛋白为单克隆抗体。
根据第10项所述的分析抗体的方法,能够在不使用作为测定对象的抗体制作标准曲线的情况下通过质谱分析对抗体进行定量。
(第11项)
一方式的试剂盒为用于第1项~第10项中任一项所述的分析抗体的方法的试剂盒,所述试剂盒包含:
上述生物蛋白;
上述表面固定有蛋白酶的微粒;和
上述设置有微孔的载体。
根据第11项所述的试剂盒,能够简便地进行第1项的方法。
(第12项)
一方式的程序为用于第1项~第10项中任一项所述的分析抗体的方法的程序,
上述程序使处理装置执行如下的处理:
接收从质谱分析装置输出的质谱;
从存储部读出上述生物蛋白的检测强度与上述靶抗体的检测强度之比;
对从上述质谱算出的上述生物蛋白的检测量进行校正;
算出上述靶抗体的量。
根据第12项所述的程序,能够简便地进行基于生物蛋白的检测强度与靶抗体的检测强度之比对靶抗体进行定量的处理。
附图标记说明
10微粒、11间隔基、15蛋白酶、20载体、21连接体、25抗体、29微孔。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所(Shimadzu Corporation)
<120> 分析抗体的方法
<130> 9210139WO01
<150> US 63/213852
<151> 2021-06-23
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 曲妥珠单抗特征肽
<400> 1
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg
1 5
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 曲妥珠单抗H-CDR3
<400> 2
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 贝伐单抗特征肽
<400> 3
Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys
1 5
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 贝伐单抗H-CDR3
<400> 4
Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
1 5 10 15
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 西妥昔单抗特征肽
<400> 5
Ser Gln Val Phe Phe Lys
1 5
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 西妥昔单抗H-CDR3
<400> 6
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 利妥昔单抗特征肽
<400> 7
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 利妥昔单抗H-CDR3
<400> 8
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly
1 5 10 15
Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳武单抗特征肽
<400> 9
Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg
1 5 10 15
<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳武单抗H-CDR3
<400> 10
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Trp Gly
1 5 10 15
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 维布妥昔单抗特征肽
<400> 11
Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg
1 5 10 15
<210> 12
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 维布妥昔单抗H-CDR3
<400> 12
Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln Leu
1 5 10 15
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn Tyr
20 25 30
Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Thr Lys
50
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 帕博利珠单抗特征肽
<400> 13
Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg
1 5 10 15
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 帕博利珠单抗H-CDR3
<400> 14
Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 伊匹木单抗特征肽
<400> 15
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 伊匹木单抗H-CDR3
<400> 16
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 莫格利珠单抗特征肽
<400> 17
Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
Tyr Pro Asp Ser Val Lys
20
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 莫格利珠单抗H-CDR3
<400> 18
His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 雷莫芦单抗特征肽
<400> 19
Ala Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
1 5 10
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 雷莫芦单抗H-CDR3
<400> 20
Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿特珠单抗特征肽
<400> 21
Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Asp Ser Val Lys
20
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿特珠单抗H-CDR3
<400> 22
His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 度伐利尤单抗特征肽
<400> 23
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
1 5 10 15
Pro Arg
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 度伐利尤单抗H-CDR3
<400> 24
Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
1 5 10 15
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿维鲁单抗特征肽
<400> 25
Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 26
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿维鲁单抗H-CDR3
<400> 26
Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 英夫利昔单抗特征肽
<400> 27
Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 英夫利昔单抗H-CDR3
<400> 28
Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 托珠单抗特征肽
<400> 29
Val Thr Met Leu Arg
1 5
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 托珠单抗H-CDR3
<400> 30
Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿达木单抗特征肽
<400> 31
Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿达木单抗H-CDR3
<400> 32
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
1 5 10 15
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 戈利木单抗特征肽
<400> 33
Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 戈利木单抗H-CDR3
<400> 34
Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25 30
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 美泊利珠单抗特征肽
<400> 35
Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 美泊利珠单抗H-CDR3
<400> 36
Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 美泊利珠单抗H-CDR3
<400> 37
Leu Asp Tyr Trp Gly Arg
1 5
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 美泊利珠单抗H-CDR3
<400> 38
Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 美泊利珠单抗H-CDR3
<400> 39
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 40
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 乌司奴单抗特征肽
<400> 40
Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys
20 25
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 乌司奴单抗H-CDR3
<400> 41
Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys
20 25
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 依库珠单抗特征肽
<400> 42
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg
1 5 10 15
<210> 43
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 依库珠单抗H-CDR3
<400> 43
Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
1 5 10 15
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
20 25
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿巴西普特征肽
<400> 44
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿柏西普特征肽
<400> 45
Ile Ile Trp Asp Ser Arg
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 依那西普特征肽
<400> 46
Val Phe Cys Thr Lys
1 5
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P14R
<400> 47
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg
1 5 10 15
Claims (12)
1.一种分析抗体的方法,其包括下述步骤:
将生物蛋白及靶抗体用蛋白酶消化;
对经消化的所述生物蛋白及所述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于通过所述质谱分析得到的所述生物蛋白的检测强度与所述靶抗体的检测强度之比,对所述靶抗体进行定量,
所述用蛋白酶消化包括下述步骤:
将所述生物蛋白及所述靶抗体固定在载体的微孔内;和
使具有大于所述微孔直径的直径且表面固定有所述蛋白酶的微粒与所述载体接近,
所述生物蛋白具有能够固定在所述微孔内的结构域。
2.根据权利要求1所述的分析抗体的方法,其还包括下述步骤:
对具有规定浓度的所述生物蛋白及具有规定浓度的所述靶抗体进行质谱分析;和
基于所述质谱分析的结果,预先确定所述生物蛋白的检测强度与所述靶抗体的检测强度之比。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分析抗体的方法,其中,所述生物蛋白包含参照抗体或Fc融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的分析抗体的方法,其中,所述参照抗体为单克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的分析抗体的方法,其中,所述参照抗体选自由曲妥珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗、本妥昔单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗、莫格利珠单抗、雷莫芦单抗、阿特珠单抗、度伐利尤单抗、阿维鲁单抗、英夫利昔单抗、托珠单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、美泊利珠单抗、乌司奴单抗及依库珠单抗组成的组。
6.根据权利要求3所述的分析抗体的方法,其中,所述Fc融合蛋白选自由阿巴西普、阿柏西普及依那西普组成的组。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的分析抗体的方法,其中,所述靶抗体为生物试样中所含的抗体。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的分析抗体的方法,其中,所述靶抗体包含至少2种抗体。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的分析抗体的方法,其中,所述靶抗体包含生物体内产生的抗体。
10.一种分析抗体的方法,其包括下述步骤:
将生物蛋白和包含至少2种靶抗体的试样用蛋白酶消化;
对经消化的所述生物蛋白及所述靶抗体的肽片段进行质谱分析;和
基于通过所述质谱分析得到的所述生物蛋白的检测强度与所述靶抗体的检测强度之比,对所述靶抗体进行定量,
所述生物蛋白为单克隆抗体。
11.一种试剂盒,其用于权利要求1或权利要求2所述的分析抗体的方法,所述试剂盒包含:
所述生物蛋白;
所述表面固定有蛋白酶的微粒;和
所述设置有微孔的载体。
12.一种程序,用于权利要求1或权利要求2所述的分析抗体的方法,
所述程序使处理装置执行如下的处理:
接收从质谱分析装置输出的质谱;
从存储部读出所述生物蛋白的检测强度与所述靶抗体的检测强度之比;
对从所述质谱算出的所述生物蛋白的检测量进行校正;
算出所述靶抗体的量。
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US20180051272A1 (en) | 2015-03-09 | 2018-02-22 | Shimadzu Corporation | Immobilized protease with improved resistance to change in external environment |
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KR20170120178A (ko) | 2015-03-10 | 2017-10-30 | 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼 | 모노클로날 항체의 검출을 위한 샘플 조제용 키트 |
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- 2022-04-08 WO PCT/JP2022/017389 patent/WO2022270126A1/ja active Application Filing
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