CN107406868A - 利用限制了反应场的蛋白酶水解反应由抗体得到肽片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使来自靶单克隆抗体的、包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的收量增加的方法以及该方法中使用的试剂盒。所述方的特征在于，其包含如下工序：对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的、低于100rpm的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而进行前述靶单克隆抗体的消化，所述纳米颗粒具有大于前述多孔体的平均细孔直径的平均粒径；其中，前述多孔体的平均细孔直径为10nm～200nm的范围，前述纳米颗粒的平均粒径为50nm～500nm的范围。

Description

利用限制了反应场的蛋白酶水解反应由抗体得到肽片段的 方法
技术领域
本发明涉及用于使用质谱分析检测单克隆抗体的、利用限制反应场的蛋白酶水解反应由靶单克隆抗体得到包含特异性序列的肽片段的方法、优选增加收量地得到前述肽片段的方法。
背景技术
伴随着在医疗现场利用曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)等抗体药物进行治疗的展开，获知患者血液中的抗体浓度与患者的生存率有显著的相关性，要求高精度地对血液中的抗体浓度进行定量。此外，在药代动力学等的品质管理、确认仿制药在临床试验等中与原型药物(original drug)的等效性等方面，对抗体药物的鉴定、其血液中浓度的定量的需求日益增加。
就蛋白质的定量法而言，除了酶抗体测定法、荧光抗体测定法、放射免疫测定法等以外，还已知使用液相色谱-串联质谱分析(LCMS)装置的方法等(例如，专利文献1、专利文献2等)。LCMS法中，将LC法和MS法组合，对用蛋白酶消化靶蛋白质后生成的肽片段进行定量。专利文献1中记载了：在确定生物学样品中的抗体量的方法中，在用蛋白酶消化样品中的非免疫球蛋白后，通过胃蛋白酶样蛋白酶处理而生成至少包含CDR区的抗体片段，通过LCMS法对其进行定量。
就蛋白酶消化而言，其消化效率根据成为消化对象的底物蛋白的种类而不同，为了使供于质谱分析的肽片段样品的制备简单化，消化效率的提高变得重要。近些年，作为蛋白酶消化的高效率化方法，在纳米颗粒等的微小环境(微反应器：microreactor)中进行蛋白酶消化的方法受到关注，例如，非专利文献1中报道了如下例子：在尼龙多孔膜的细孔内固定胰蛋白酶，使白蛋白溶液从该多孔膜通过，由此使白蛋白的胰蛋白酶消化高效率化。此外，非专利文献2中报道了：通过使用细孔内固定化有胰蛋白酶的介孔多孔二氧化硅，从而能够对分子量小的蛋白质进行选择性地胰蛋白酶消化。这些方法都是将蛋白酶固定化在多孔体的细孔内、并使该固定化蛋白酶与液相内的底物蛋白反应的方法。众所周知，这样的方法具有如下优点：可以容易地进行固液分离，即蛋白水解产物与固定化蛋白酶的分离。
进而，还提供了使固定化蛋白酶与固定化蛋白质反应的方法，例如，非专利文献3公开了如下方法：利用固定化于约190nm±20nm粒径的纳米颗粒的蛋白酶，来消化介由Fc与细孔直径50～100nm的微细孔内的表面结合的蛋白G非共价结合的抗体，由此生成包含CDR肽或其一部分的抗体水解产物。该方法是本发明人等开发、提出的新方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-515020号公报
专利文献2：日本特开2012-197258号公报
非专利文献
非专利文献1：Fei Xu et.al.，Analytical Chemistry，2010，82：10045-10051
非专利文献2：Qianhao Min et.al.，Chemical Communications，2010，46：6144-6146
非专利文献3：NorikoIwamoto et.al.，Analyst，2014，139：576-580
发明内容
发明要解决的问题
在如上述非专利文献3所述那样使固相底物与固相酶反应的情况下，虽然是在液体中反应，但各固相具有由于重力而沉淀的特性，因此需要通过搅拌等来保持分散性。
用于解决问题的方案
本发明人等此次发现，对于固相底物(抗体蛋白)-固相酶(蛋白酶)反应而言，当对特定的固相-固相间的接触进行优化时，目标水解产物的收量显著增加，从而完成了本发明。
概括而言，本发明包含以下特征。
(1)一种由靶单克隆抗体得到包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的方法，其包含如下工序：对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体、和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的速度进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，利用前述蛋白酶消化前述靶单克隆抗体；所述纳米颗粒具有大于前述多孔体的平均细孔直径的平均粒径。
(2)一种使来自靶单克隆抗体的、包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的收量增加的方法，其特征在于，其包含如下工序：对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体、和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的低于100rpm的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而利用前述蛋白酶消化前述靶单克隆抗体，所述纳米颗粒具有大于前述多孔体的平均细孔直径的平均粒径；其中，前述多孔体的平均细孔直径为10nm～200nm的范围，前述纳米颗粒的平均粒径为50nm～500nm的范围。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其特征在于，前述纳米颗粒的平均粒径为多孔体的平均细孔直径的1.5倍～4倍大小。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，以50rpm以下的低速进行前述搅拌或轻敲旋转搅拌。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，前述蛋白酶选自由胰蛋白酶、Lys-C、Arg-C、Asp-N、糜蛋白酶、V8蛋白酶、和它们中的2种以上的组合组成的组。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其特征在于，前述靶单克隆抗体介由连接体分子结合在前述多孔体的细孔内表面。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其特征在于，前述肽片段为包含互补性决定区(CDR)或其一部分的肽片段。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，其特征在于，还包含如下工序：从生物学样品中分离靶单克隆抗体或包含该靶单克隆抗体的抗体群。
(9)根据(8)所述的方法，其特征在于，前述生物学样品为血液、血清、血浆、组织或细胞。
(10)根据(8)或(9)所述的方法，其特征在于，还包含如下工序：使包含前述靶单克隆抗体的抗体群结合在前述多孔体的细孔内表面。
(11)根据(1)～(10)中任一项所述的方法，其特征在于，前述液体为不含盐的缓冲液。
(12)根据(1)～(11)中任一项所述的方法，其特征在于，前述靶单克隆抗体为抗体治疗药。
(13)一种试剂盒，其特征在于，其为在(1)～(12)中任一项所述的方法中使用的试剂盒，其包含：(i)具有能固定化靶单克隆抗体的细孔的多孔体；(ii)表面固定化有蛋白酶的纳米颗粒；和(iii)使用说明书，所述使用说明书示出：对于前述靶单克隆抗体和前述蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的低于100rpm的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触；其中，前述纳米颗粒的平均粒径大于前述多孔体的细孔直径。
(14)根据(13)所述的试剂盒，其特征在于，还包含用于对抗体进行分离纯化的亲和单元。
(15)根据(13)或(14)所述的试剂盒，其特征在于，前述多孔体具有结合在颗粒表面和细孔内表面的连接体分子。
(16)根据(15)所述的试剂盒，其特征在于，前述连接体分子为抗体结合多肽。
本发明的方法提供作为用于通过LCMS法准确地测定血液等生物学样品中的抗体药物的浓度的前处理的、使靶单克隆抗体的蛋白酶消化产物的收量增加的方法，因此关系到抗体药物用分析试剂盒制品的操作流程优化，且具有能够保证分析再现性的优点。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2015-047740号的公开内容。
附图说明
图1是用于说明本发明的限制了反应场的蛋白酶消化的原理的示意图。
图2是用于确定底物：蛋白酶的最适量比的试验中的蛋白酶消化的电泳图。
图3是消化时间研究实验的质谱分析(MALDI-TOFMS)谱图。
图4是轻敲旋转搅拌(转速1～5rpm；轻敲次数为2次/分钟)或涡流(Voltex)搅拌(转速100rpm)下的蛋白酶反应中的、曲妥珠单抗抗体的利用胰蛋白酶消化时的肽收量的比较。图中，黑色棒表示轻敲旋转搅拌(Rotate)的结果，白色棒表示涡流搅拌(Voltex)的结果。(A)和(B)分别示出固定化抗体为10μg/ml、3.3μg/ml的抗体浓度(每1个反应的抗体量分别为1μg、0.33μg。)、固定化胰蛋白酶使用胰蛋白酶3μg进行反应时的结果。横轴表示靶肽和MRM瞬态(transition)，纵轴表示将涡流搅拌下的肽收量设为1时的轻敲旋转搅拌下的肽收量的相对值(变化倍率)。MRM为Multiple Reaction Monitoring(多反应监测)的简称，是针对于在离子化探头中离子化后的各种离子、在Q1(第1级MS)中选择特定离子(前体离子)、在碰撞室(q2，collision cell)中将离子解体(碰撞诱导裂解)、在Q3(第2级MS)中从解体后的离子(产物离子)中检测特定离子的方法。MRM瞬态的数字表示Q1的值(前体)>Q3的值(产物)。所测定的肽片段为IYPTNGYTR(序列号 1)、FTISADTSK(序列号 2)、ASQDVNTAVAWYQQKPGK(序列号3)、NTAYLQMNSLR(序列号4)、GLEWVAR(序列号5)、DTYIHWVR(序列号6)。**表示p>0.01。
图5是轻敲旋转搅拌(转速1～5rpm；轻敲次数为2次/分钟)与涡流(Voltex)搅拌(转速100rpm)下的贝伐单抗抗体的利用胰蛋白酶消化时的肽片段收量的比较。图中，黑色棒表示轻敲旋转搅拌(Rotate)的结果，白色棒表示涡流搅拌(Voltex)的结果。(A)、(B)和(C)分别示出固定化抗体为10μg/ml、3.3μg/ml、1.1μg/ml的抗体浓度(每1个反应的抗体量分别为1μg、0.33μg、0.11μg。)、固定化胰蛋白酶使用胰蛋白酶3μg进行反应时的结果。横轴表示靶肽和MRM瞬态，纵轴表示将涡流搅拌下的肽收量设为1时的轻敲旋转搅拌下的肽收量的相对值(变化倍率)。MRM瞬态(MRM-transition)的数字表示Q1的值(前体)>Q3的值(产物)。所测定的肽为STAYLQMNSLR(序列号7)、FTFSLDTSK(序列号8)。**表示p>0.01。
具体实施方式
对本发明进行进一步具体说明。
1.抗体的蛋白酶消化产物(肽片段)的取得方法和收量增加方法
根据本发明的第1方式，提供一种由靶单克隆抗体得到包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的方法，其包含如下工序：对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体、和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的速度进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而利用前述蛋白酶消化前述靶单克隆抗体；所述纳米颗粒具有大于前述多孔体的平均细孔直径的平均粒径。
此外，根据与上述方法关联的本发明的第2方式，提供一种使来自靶单克隆抗体的、包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的收量增加的方法，其特征在于，其包含如下工序：对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体、和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的低于100rpm的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而利用前述蛋白酶消化前述靶单克隆抗体，所述纳米颗粒具有大于前述多孔体的平均细孔直径的平均粒径；其中，前述多孔体的平均细孔直径为10nm～200nm的范围，前述纳米颗粒的平均粒径为50nm～500nm的范围。
＜靶抗体>
本发明的方法中的测定对象为单克隆抗体，优选为抗体治疗药(也称为“抗体药物”。)。
本说明书中使用的“单克隆抗体”这一术语除了包含以下定义的单克隆抗体以外，还包括维持该抗体的特异性且附加有进一步的功能的复合物，例如抗体融合蛋白(例如依那西普等)、抗体-药物复合物(例如曲妥珠单抗-美坦辛等)等。
单克隆抗体是免疫球蛋白IgG，为具有2条重链(分子量约50kDa)和2条轻链(分子量约25kDa)通过多个二硫键连接的结构的生物高分子。Fab结构域与Fc结构域借助铰链而连接，此外，重链和轻链分别由恒定区和可变区构成。恒定区具有保持抗体特征性的Y字形形状的结构，来自同一种属的抗体几乎都具有共通的氨基酸序列。另一方面，可变区中分别存在各3个被称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)的具有特异性序列的位点。该CDR(CDR1、CDR2、CDR3)区所规定的立体结构关系到与抗原的特异性结合，通过该特异性结合而形成抗体-抗原复合物。在重链和轻链的可变区的CDR1之前、CDR1与CDR2之间、CDR2与CDR3之间、CDR3之后分别存在框架1(FR1)、框架2(FR2)、框架3(FR3)、框架4(FR4)。
相对于具有稳定(rigid)结构的恒定区，在抗体的高维结构中更具特征性的结构是非常灵活(flexible)的铰链区。已知在重链的C末端侧(特别是Fc区的CH2～CH3的区域)存在被称为蛋白A、蛋白G的特定蛋白质所结合的位点。
近些年，作为可以特异性地作用于各种疾病的抗体药物，开发出了数量众多的单克隆抗体，其中的几个已被用于临床场合。本发明提供对于利用了LCMS分析来准确地检测、定量生物学样品中的靶单克隆抗体而言有用的方法，作为该方法中可成为测定对象的单克隆抗体，没有限定，例如可列举出：帕尼单抗、奥法木单抗、戈利木单抗、伊匹单抗(ipilimumab)等人抗体；托珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1、贝伐单抗、奥马珠单抗、美泊利单抗、吉妥单抗、帕利珠单抗、兰尼单抗、赛妥珠单抗、奥可丽单抗(Ocrelizumab)、莫加母丽珠单抗(Mogamulizumab)、依库丽单抗(eculizumab)单抗等的人源化抗体；利妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗等的嵌合抗体等。需要说明的是，单克隆抗体的分子直径为约14.5nm。
根据本发明的方法，能够通过区域选择性蛋白酶消化来切出靶单克隆抗体的重链和轻链的可变区或其一部分和/或Fab区或其一部分，根据情况，能够切出恒定区的一部分(例如Fc区)、优选切出至少包含CDR区(CDR1、CDR2和/或CDR3)或其一部分的区域，从而能够使肽片段的收量增加，将由此得到的该抗体中特征性且特异性的肽片段上样到质谱分析中，而可以进行靶抗体的准确的鉴定、定量。本发明方法无论抗体的种类如何都能适用，因此不限于上述示例的抗体，也适用于新开发的单克隆抗体等。
在确定抗体的CDR区时，可以通过目标抗体的氨基酸置换频度分布、目标抗体与其它抗体的氨基酸序列的多序列比对、目标抗体与内源性抗体的交叉反应性等的确认来确定3个CDR区。本说明书中的“CDR(区)”是指CDR1(区)、CDR2(区)、CDR3(区)、或它们中的2个以上CDR区的组合。
在临床现场对患者给予抗体药物(通常，单克隆抗体)时，要求准确地测定血液中的该抗体量，从而在治疗计划中有效利用。由于血液中除了靶抗体外还包含较多的免疫球蛋白，因此通过惯用的离心分离等从含有该靶抗体的血液中回收血清或血浆，将得到的血清或血浆作为用于确定靶抗体的血液中浓度的样品。此外，必要时，可以将具有靶抗体的组织、介由膜受体而结合有靶抗体的细胞分离，通过惯用方法例如破碎、离心分离、亲和色谱(例如蛋白G结合或蛋白A结合)等分离抗体级分，来制成样品。
根据本发明的实施方式，可以进一步包含如下工序：由生物学样品(例如血液)中分离靶抗体或包含该靶抗体的抗体群。
本发明中，通过利用LCMS，即使是血液、血浆、血清、组织、细胞等的生物学样品，也能够进行靶单克隆抗体的定性和定量测定。这种情况下，在分析之前，需要确定了该单克隆抗体的该CDR序列。
＜多孔体>
本发明的方法中使用的多孔体(例如“抗体Fc固定化树脂”)只有具有很多细孔即可，对其材料没有特别限定，可以使用活性炭、多孔膜、多孔树脂珠、金属颗粒等。这些当中，特别优选能够位点特异性地结合抗体的材料。
图1中示出了半球形的细孔，但对细孔的形状没有特别限定。此外，还可以使用多孔膜之类的形成有贯穿多孔体的细孔的类型。对多孔体的细孔的大小没有特别限定，优选考虑抗体的分子直径等来确定，从而在对抗体进行固定化时，使应该选择性消化的位点位于细孔的表层附近。关于多孔体的平均细孔直径D2，可在例如10nm～200nm左右的范围且小于纳米颗粒的平均粒径D1的范围内适宜设定。多孔体的平均细孔直径D2例如优选20nm～200nm左右，更优选30nm～150nm左右。为了将抗体的Fc区固定化在细孔内、对Fab区进行区域选择性蛋白酶消化，多孔体的细孔直径优选30nm～150nm，更优选40nm～120nm，进一步优选50nm～100nm、特别优选约100nm。
本发明的方法中，将作为测定对象的单克隆抗体固定化在多孔体的细孔内。通过将抗体固定化在细孔内、使其存在于固相与液相的界面这一微细的环境中，从而抗体容易发生变性、分子的波动受到扰动、被蛋白酶攻击的概率提高。此外可认为：如后所述，在本发明中通过蛋白酶被固定化于纳米颗粒，而成为立体性稳定、不易发生自体分解的环境，因此使蛋白酶的稳定性增加。因此，根据本发明的方法，除了能够进行区域选择性蛋白酶消化以外，还可以维持蛋白酶的高活性。
在本发明中，可优选使用在多孔体的细孔内固定化有与抗体进行位点特异性相互作用的连接体分子的多孔体。作为抗体与连接体分子的相互作用，可列举出化学键、氢键、离子键、络合、疏水性相互作用、范德华力、静电相互作用、立体选择性相互作用等。
作为连接体分子，优选使用抗体结合多肽，例如与抗体的特定位点特异性结合的蛋白A、蛋白G、IgG结合肽等。已知蛋白A和蛋白G位点特异性地与抗体(特别IgG)的Fc区结合。
蛋白A是存在于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中的46.7kDa的蛋白，特异性地与免疫球蛋白(特别IgG)的Fc区结合。关于蛋白A与人免疫球蛋白的结合性，已知与人IgG1、IgG2、IgG4强力结合，但与人IgG3几乎不发生结合。
蛋白G是存在于G溶血链球菌(group G streptococci)细胞壁中的蛋白质，已知特异性地与免疫球蛋白(特别IgG)的Fc区结合，与Fab片段也微弱结合。
IgG结合肽为例如国际公开WO2013/027796A1中记载的、特异性地与IgG结合且由约13～17个氨基酸构成的公知多肽。
通过使用在表面和细孔内固定化有这些连接体分子的多孔体，从而能够介由细孔内的连接体分子使抗体固定化在其Fc区，使抗体的重链和轻链的可变区或Fab区位于细孔的表层附近。从而，通过控制细孔内的抗体的取向，从而能够通过蛋白酶进行的抗体的重链和轻链的可变区或Fab区、优选包含可变区内的CDR(CDR1、CDR2、和/或CDR3)或其一部分的区域的区域选择性消化。在此，关于“其一部分”，例如在称为“CDR1的一部分”时，是指包含至少1个以上、优选多个在CDR1区的氨基酸序列中连续的氨基酸残基的部分。
连接体分子的大小按照使抗体的选择性切断位点位于细孔的表层附近的方式来进行选择。连接体分子与抗体结合的状态的分子尺寸优选为多孔体的细孔直径的0.2倍～1.5倍左右，更优选为0.6倍～1.2倍左右，进一步优选为0.7倍～1.1倍左右，特别优选为0.8倍～1倍左右。需要说明的是，多孔体上未固定连接体分子而直接使细孔内与抗体结合的情况下，抗体的分子直径和多孔体的细孔直径优选满足上述关系。
作为可适用于本发明的多孔体，没有特别限定，例如可列举出蛋白G Ultralink树脂(Pierce公司制)、TOYOPEARL、TSKgel(TOSOH公司制)等。例如，已知在蛋白G Ultralink树脂的情况下，与树脂结合的蛋白G的95％位于细孔内。
＜抗体向多孔体的固定化>
对将抗体固定化在多孔体的细孔内的方法没有特别限定，可以根据抗体和多孔体或连接体分子的特性等采用适当的方法。例如，在使抗体固定化于在细孔内预先固定化有蛋白A、蛋白G、IgG结合肽等抗体结合多肽的多孔体的情况下，通过将多孔体的悬浮液和包含抗体的溶液混合，从而能够容易地将抗体固定化在细孔内。
在生物学样品为血液、血浆或血清的情况下，能够将包含前述靶抗体的抗体群结合于前述多孔体的细孔内表面。即使在这种情况下例如也可进行通过液相色谱(LC)的精密分离，因此通过与质谱分析组合而能够利用LCMS分析对靶抗体中特征性的肽片段进行定性和定量。
多孔体与抗体的量比可以根据目的来适宜设定。例如，在进行抗体的定量分析的情况下，期望样品中的抗体几乎全部固定化于多孔体。因此，优选按照多孔体的量相对于样品中的抗体推定含量达到过量的方式来设定量比。
＜纳米颗粒>
在本发明的方法中，纳米颗粒是出于在其表面固定化蛋白酶、控制蛋白酶接近固定化在多孔体的细孔内的抗体的目的而使用的。因此，纳米颗粒设为其平均粒径D1大于多孔体的平均细孔直径D2的程度，以避免进入到多孔体的细孔的深处(图1)。
对纳米颗粒的形状没有特别限定，从使蛋白酶接近多孔体的均匀化的观点出发，优选球状的纳米颗粒。此外，纳米颗粒优选分散性高、直径偏差小、平均粒径均匀的纳米颗粒。
纳米颗粒的平均粒径D1为50nm～500nm的范围，更优选多孔体的平均细孔直径D2的1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上，特别优选1.8倍以上。考虑到固相-固相间的蛋白酶消化反应的效率性，虽然不限定在以下范围内，但纳米颗粒的平均粒径D1优选为多孔体的平均细孔直径D2的1.5倍～4倍，进一步优选为1.8倍～2.5倍、例如约2倍。例如，在多孔体的平均细孔直径为30～150nm左右的情况下，纳米颗粒的平均粒径D1优选100nm以上，更优选150nm以上。在多孔体的平均细孔直径为50nm～100nm左右的情况下，纳米颗粒的平均粒径优选为120nm以上，更优选为150nm以上，特别优选为170nm以上。从提高通过蛋白酶的消化效率的观点出发，纳米颗粒的平均粒径D1的上限优选500nm以下，进一步优选300nm以下。
纳米颗粒只要表面能够固定化上述蛋白酶则对其材质没有特别限定，可适宜使用金属、树脂等。此外，还可以使用用树脂包覆金属表面而成的颗粒、用金属包覆树脂表面而成的颗粒等。
作为纳米颗粒的种类，优选能够分散或悬浮于水性介质且能够容易地通过磁性分离或磁性沉淀分离从分散液或悬浮液中回收的磁性纳米颗粒。此外，就不易发生聚集这样的观点而言，更优选其表面被有机聚合物包覆的磁性纳米颗粒。作为磁性纳米颗粒的基材，可列举出氧化铁(磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ‐Fe2O3))、铁氧体(Fe/M)3O4等强磁性合金。铁氧体(Fe/M)3O4中，M表示能够与铁离子一起使用、形成磁性金属氧化物的金属离子，典型的是使用Co2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+等。此外，作为包覆磁性纳米颗粒的有机聚合物，可以列举聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)、GMA与苯乙烯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酸甲酯(PMA)等。作为被有机聚合物包覆的磁性纳米珠的具体例子，可列举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品，例如可适宜使用多摩川精机株式会社(东京、日本)制的FG beads(被聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)包覆铁氧体颗粒而成的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
为了抑制非特异性的蛋白质吸附和蛋白酶的选择性固定化，上述纳米颗粒优选用能够与蛋白酶结合的间隔物分子进行了修饰。通过介由间隔物分子来固定化蛋白酶，从而可抑制蛋白酶从纳米颗粒表面脱离，可提高蛋白酶消化的区域选择性。此外，通过调整间隔物的分子尺寸，还能够使蛋白酶选择性接近抗体的期望位置、从而提高区域选择性。
间隔物优选能够与蛋白酶结合且不使蛋白酶失活。从对固定化在纳米颗粒表面的蛋白酶的接近范围进行控制的观点出发，间隔物优选分子直径小的物质。间隔物的分子直径优选5nm以下，更优选3nm以下，进一步优选2nm以下。此外，间隔物的分子量优选2000以下，更优选1500以下，进一步优选1000以下。
为上述分子直径且能够固定化蛋白酶的间隔物分子优选非蛋白质，优选在末端具有氨基、羧基、酯基、环氧基、甲苯磺酰基、羟基、巯基、醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、生物素、抗生物素蛋白、螯合物等官能团的分子。例如，在胰蛋白酶的固定中，优选具有经活化的酯基的间隔物分子。此外，在间隔物分子中，除了上述官能团以外的间隔物的臂部分可使用：聚乙二醇和其衍生物、聚丙二醇和其衍生物、聚丙烯酰胺和其衍生物、聚乙烯亚胺和其衍生物、聚(环氧乙烷)和其衍生物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)和其衍生物等的亲水性分子。
用这样的间隔物分子进行了表面修饰的纳米颗粒也有销售，利用它们的市售品即可。例如，用具有被N-羟基琥珀酰亚胺活化了的酯基(活性酯基)的间隔物分子进行了修饰的纳米颗粒以商品名“FG beads NHS”(多摩川精机株式会社)进行销售。FG beads NHS的粒径为约200nm±20nm，作为纳米颗粒是非常均质的。
＜蛋白酶>
本发明的方法中，蛋白酶在特定的氨基酸序列位点切断固定化在多孔体的细孔内的抗体，优选生成包含抗体的重链和轻链的可变区内的CDR区或其一部分的肽片段。
在本发明中，固定化于纳米颗粒的蛋白酶的种类，根据作为通过质谱分析进行的定量或鉴定对象的蛋白质的种类进行适宜选择即可，虽然不限于此，但例如可列举出：胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶(Lys-C)、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶等。蛋白酶也可以组合使用两种以上。
在本发明中，上述蛋白酶中特别优选使用胰蛋白酶。胰蛋白酶的底物特异性高，此外，切断后的肽的C末端存在Lys或Arg，因此可以使肽的电荷量和电荷定位均质，特别适合制作用于质谱分析的样品。此外，胰蛋白酶的分子直径小(约3.8nm)，并且活性位点存在于分子内部。因此，可限制活性位点能够接近抗体的区域，能够提高蛋白酶消化的区域选择性。
在将蛋白酶消化后的抗体的肽片段作为测定样品供于质谱分析的情况下，优选使用自体分解少且切断序列的选择性高的蛋白酶。在使用市售的蛋白酶的情况下，优选使用质谱分析级、序列确定(测序)级的蛋白酶。例如，已知来自生物体的天然胰蛋白酶由于残存有自体分解活性、或者残存有显示糜蛋白酶样活性的伪胰蛋白酶，因而切断位点的特异性和活性低。因此，作为质谱分析级，销售的是将胰蛋白酶的赖氨酸残基还原甲基化、从而提高对自体分解的抗性的胰蛋白酶。
作为可适用于本发明的方法的蛋白酶，例如可列举出Trypsin Gold(PromegaCorporation制)、Trypsin TPCK-treated(西格玛公司制)等。
＜胰蛋白酶向纳米颗粒的固定化>
对在纳米颗粒的表面固定化蛋白酶的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶和纳米颗粒(或修饰纳米颗粒表面的间隔物分子)的特性等采用适当的方法，例如，在经间隔物修饰的纳米颗粒表面固定化蛋白酶的情况下，通过将纳米颗粒的悬浮液和包含蛋白酶的溶液混合，从而能够将蛋白酶固定化在纳米颗粒表面。优选介由上述间隔物分子的官能团进行的纳米颗粒与蛋白酶的胺偶联法。例如，可以用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将纳米颗粒表面所修饰的羧基酯化，形成活化酯基，再使蛋白酶的氨基与该酯基结合。该偶联反应可以使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺(DIPC)等碳二亚胺在缩合剂存在下进行。此外，还可以使用戊二醛、2官能性琥珀酰亚胺、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)、磺酰氯、马来酰亚胺、吡啶基二硫化物等的交联剂，使蛋白酶的氨基与纳米颗粒表面所修饰的氨基结合。
介由间隔物分子的官能团进行的纳米颗粒与蛋白酶的偶联法可以通过简单的操作来进行，即，在纳米颗粒的悬浮液中添加蛋白酶溶液，在一定的条件下混合搅拌。对反应条件没有特别限定，例如，将添加有蛋白酶的纳米颗粒的悬浮液在温度1～10℃、pH7.0下以50～200rpm搅拌0.5～1小时。
在纳米颗粒表面固定化蛋白酶后，可以对纳米颗粒表面的未结合蛋白酶的活性部分进行非活性化。例如，当纳米颗粒表面存在未固定化蛋白酶的间隔物分子时，有时未结合的间隔物分子与样品中的杂质等结合而对蛋白酶消化产生不良影响，或者发生由蛋白酶消化所产生的肽片段被固定化在纳米颗粒等不良情况，等等。在固定化蛋白酶后，对未结合的间隔物分子进行封闭，从而可抑制这样的不良情况。作为使未结合蛋白酶的活性部分非活性化的方法，优选化学修饰。例如，活化酯基可以通过与伯胺的反应形成酰胺键，从而使其非活性化。
＜蛋白酶消化>
根据本发明，对于固定化有成为靶的单克隆抗体的上述多孔体和表面固定化有蛋白酶的上述纳米颗粒，以使其在液体中保持均匀分散的程度的低于100rpm的低速搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而抗体被蛋白酶消化，增加收量地由该抗体产生包含其Fab区或可变区或者其一部分的肽片段。本方法的包含搅拌的条件与涡流搅拌(转速100rpm)相比，可以使目标肽片段的收量增加约2～5倍左右。
本说明书中使用的“液体”这一术语是指：用于使底物(固相)和酶(固相)在液相中接触、反应的介质，意指适合于蛋白酶消化反应的水性介质。
本发明中的蛋白酶消化的必要条件之一是，对于固定化有靶单克隆抗体的多孔体和固定化有蛋白酶的纳米颗粒，以使其在液体中保持均匀分散的程度的低于100rpm、更优选为50rpm以下、进一步优选为20rpm以下的低速下搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而进行蛋白酶消化反应。如果为这样的范围内的速度，则能够得到与后述实施例的效果同等或接近的效果。
本说明书中的“搅拌”只要满足上述条件则可以以任意的搅拌方式来实施。作为搅拌的例子，非限定性例子为利用能调整成低速的旋转混合机、搅拌器、涡流混合机等进行的搅拌。
本说明书中使用的“轻敲旋转搅拌”是指：通过在上述范围内的缓慢的旋转来进行搅拌且伴有周期性的轻敲。在这样的搅拌中，“缓慢的旋转”例如是指3～10rpm左右的转速，此外，“轻敲”是指弹压之类的或者施加振荡或冲击之类的瞬间动作(频率：例如每分钟1～5次、优选2～4次)，由此使抗体固定化多孔体和蛋白酶固定化纳米颗粒均保持均匀分散状态，并且纳米颗粒上的蛋白酶实质上优先攻击多孔体的细孔内的单克隆抗体的N末端侧的重链和轻链的Fab区或可变区，提高蛋白酶消化反应效率。
轻敲旋转搅拌具体可以使用市售的轻敲旋转混合机、例如带振荡(轻敲)的旋转混合机NRC-20D(日伸理化(东京、日本)；转速1～15rpm、轻敲2次/分钟)等搅拌装置来进行。
进一步的必要条件是，反应时使用的上述液体为不含盐的缓冲液。盐是指除了缓冲剂成分以外的盐，尤其是氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)。存在盐时，颗粒(固相)间的斥力减弱，容易发生颗粒间的碰撞，因此蛋白酶消化变得难以进行。
作为蛋白酶消化的其它条件，通常根据蛋白酶的种类在调整为其最适pH或其附近的缓冲溶液中选择最适温度或其附近的温度。在蛋白酶为胰蛋白酶时，缓冲溶液通常为pH7.5～9.0、例如为pH8.0的Tris缓冲液等，此外，温度通常为约35～40℃、例如为37℃左右。在本发明的方法中，作为反应的孵育时间，可以非限定性地设为约2小时～20小时左右，由于缩短总体分析时间也是重要的因素，因此也可以通过对抗体量与蛋白酶量的比率、多孔体的细孔直径与纳米颗粒的粒径的比率进行优化，从而将反应时间设为例如1小时～2小时或更少。尤其是，我们认为，在确定多孔体的细孔直径与纳米颗粒的粒径的比率时，通过设为上述比率，能够使蛋白酶区选择性地攻击结合在多孔体的细孔内的抗体的重链和轻链的可变区的CDR(CDR1、CDR2和/或CDR3)，从而缩短反应时间。
对固定化有单克隆抗体的多孔体与表面固定化有蛋白酶的纳米颗粒的混合量比没有特别限制，例如为底物：蛋白酶＝100：1～20：1(重量比)左右。在本发明中，通过多孔体和纳米颗粒的组合，单克隆抗体与蛋白酶的接近受到物理性限制，因此与通常的蛋白酶消化相比，优选将蛋白酶量设为较多。例如，优选单克隆抗体：蛋白酶＝30：1～3：1左右，更优选15：1～4：1左右，进一步优选10：1～5：1左右。
在本发明的方法中，在直接将单克隆抗体固定化于多孔体的状态下进行利用固定化蛋白酶的消化。通过蛋白酶消化而产生的肽片段存在于液相内，因此不进行抗体的洗脱、变性操作而可区域选择性地得到目标肽片段。根据本发明的方法，可以通过比现有方法简便的操作且优选进行区域选择性切断地、实现使包含抗体的重链和轻链的可变区的CDR(CDR1、CDR2和/或CDR3)区或其一部分的肽片段的收量增加。
更具体而言，例如，使抗体的C末端侧与细孔直径约90～120nm的蛋白G固定化树脂上的蛋白G非共价结合，抗体的可变区必然向溶液侧取向。然后，在粒径约180～240nm的纳米颗粒表面固定化蛋白酶。通过限制蛋白酶与抗体的接触，从而能够形成反应场以可变区选择性地进行抗体的蛋白酶水解反应。此外，通过使用相对表面积非常大的纳米颗粒表面作为蛋白酶反应场，从而能够提高与抗原的接触概率。
关于这一点，图1中，由于纳米颗粒的平均粒径D1大于多孔体的平均细孔直径D2，因此纳米颗粒可接近细孔的表层附近，但不能接近细孔的深处。与此相伴随地，固定化在纳米颗粒表面的蛋白酶也不能接近细孔的深处。图1中，细孔附近的虚线表示蛋白酶能够接近的(即，可接近的)区域的边界。由此，可位置特异性限制蛋白酶接近细孔内的抗体，可相对提高接近抗体的液相侧(特别是可变区或Fab区)的概率。从而，能够对抗体进行区域选择性蛋白酶消化，能够得到抗体的特征性肽片段。
在后述的实施例中，将作为抗体药物的曲妥珠单抗和贝伐单抗作为具体例子实施了基于本发明方法的蛋白酶消化反应。其结果是，轻敲旋转搅拌(转速3～10rpm、轻敲次数2次/分钟)时的肽片段的收量与反应规模约200μL、胰蛋白酶3μg、抗体浓度1.1μg/mL～10μg/mL(使用100μL)、温度37℃、反应时间6小时且涡流搅拌(转速100rpm)的情况相比，用曲妥珠单抗时显示增加约3～5倍的倾向，用贝伐单抗时显示增加约1.4～4倍的倾向。进而，此外已确认，通过基于本方法进行曲妥珠单抗和贝伐单抗的蛋白酶消化，以增加的收量回收了包含表征这些抗体的CDR区或其一部分的肽片段。这样的肽片段的例子如下所示。
在利用胰蛋白酶进行的曲妥珠单抗消化中，例如为TNGYTR(序列号1：VH CDR2的一部分)、FTISADTSK(序列号2：VH CDR3的一部分)、ASQDVNTAVAWYQQKPGK(序列号3：VL CDR1的一部分)、NTAYLQMNSLR(序列号4：VH CDR3的一部分)、GLEWVAR(序列号5：VH CDR2的一部分)、DTYIHWVR(序列号6：VH CDR1的一部分)。
在利用胰蛋白酶进行的贝伐单抗消化中，例如为STAYLQMNSLR(序列号7：VH CDR3的一部分)、FTFSLDTSK(序列号8：VH CDR3的一部分)、GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR(序列号9：VH CDR2的一部分和CDR2)、VLIYFTSSLHSGVPSR(序列号10：VL CDR2的一部分、CDR2、CDR3的一部分)。
为了将通过蛋白酶消化得到的目标肽片段供于质谱分析，需要从反应体系中去除多孔体和纳米颗粒。这可以通过对蛋白酶消化后的样品进行过滤、离心分离、磁性分离、透析等的操作来实现。例如，通过使用聚偏氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-bindinghydrophilic PVDF、孔径0.2μm、Millipore公司制)进行过滤，从而能够简便地去除多孔体和纳米颗粒。
2.抗体肽片段的定量
通过利用色谱、质谱分析对包含在上述得到的肽片段的样品进行分析，从而可以进行抗体的鉴定、定量。本发明中，由于区域选择性地对底物蛋白进行蛋白酶处理，所以减少了试样中所含的肽片段的种类。因此，可以容易地设定利用质谱分析等的分析条件。进行分析时，也可根据需要在进行脱盐、增溶、萃取、浓缩、干燥等的处理之后，将样品用于分析。
为了通过蛋白酶消化而产生的肽片段进行底物蛋白的鉴定、定量，质谱是适宜的。由于质谱分析可确定氨基酸序列，因而能够辨别肽片段是否为来自抗体等的特定蛋白质的肽片段。此外，基于峰强度能够确定样品中肽片段的浓度。
对质谱分析中的离子化法没有特别限定，可以采用电子电离化(EI)法、化学电离化(CI)法、电场解吸附(FD)法、快原子轰击(FAB)法、底物辅助激光解吸离子化(MALDI)法、电喷雾离子化(ESI)法等。对离子化后的样品的分析方法也没有特别限定，可根据离子化法适宜确定磁偏转型、四极(Q)型、离子阱(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)型等。此外，也可以使用三重四级杆型质谱分析装置等进行MS/MS分析、或MS3以上的多级质谱分析。
为了使肽片段的分离更可靠、提高分析精度等，也可以利用液相色谱(LC)、固相萃取(SPE)等对供于质谱分析前的样品进行分离、浓缩。在利用LC进行样品的分离时，作为质谱分析的预处理，也可以使用具备LC的LC/MS，将来自LC的洗脱液直接离子化而供于质谱分析。也可以通过组合了LC和串联质谱分析的LC/MS/MS、LC/MSn进行分析。此外，也可以对来自LC的洗脱液进行一次分级之后供于质谱分析。对LC的柱、SPE的载体没有特别限定，可适宜选择使用通常用于肽的分析的C30、C18、C8、C4等的疏水柱、亲水性亲合色谱用的载体等。LC对于例如从来自血液样品的结合在多孔体上的来自其它抗体的肽片段中区分、分离靶抗体特征性肽片段是有用的。
为了基于质谱分析结果来鉴定抗体等蛋白质，也可以使用现有的数据库。由于本发明中使用了抗体等底物蛋白位置特异性地被蛋白酶消化所得到的肽片段，所以提高了通过数据库检索的命中率、数据的准确度。此外，通过利用多级质谱分析等对肽片段的氨基酸序列进行特定，从而也能够鉴定作为底物蛋白的抗体。例如，只要能确定抗体中包含具有特异性氨基酸序列的互补性决定区(CDR)的至少一部分的氨基酸序列的肽片段的氨基酸序列，即可鉴定抗体。
需要说明的是，在基于包含CDR或其一部分的序列的特定肽片段的检测结果来进行抗体的检测、定量时，作为检测对象的肽的氨基酸残基数优选5～30左右、更优选7～25左右。氨基酸残基数过小时，难以区分开夹杂物、来自同一蛋白质的不同位点的肽片段，可能会成为导致误检等的原因。此外，氨基酸残基数过大时，由于难以离子化等的原因，而存在检测变得困难的情况、定量性降低的情况。
在对作为底物蛋白的抗体的浓度进行定量时，可基于检测出的肽片段离子(多级MS的情况是通过肽片段离子的裂解而得到的裂解离子)的峰面积、峰强度，计算出抗体的量。此外，进行定量时，还可以使用标记有稳定同位素的内标。例如，根据预先求出的标准曲线(校准曲线)与峰面积的关联、来自添加到样品中的内标的峰面积与来自样品的峰面积的关联等，计算出样品中的肽片段浓度，基于肽片段浓度计算出抗体的量、浓度。
以下示出LCMS条件的一例，优选设为适合于所使用的装置的条件。
(HPLC条件(Nexera LC30A液相色谱系统(岛津制作所、京都、日本)))
溶剂A：0.1％甲酸、溶剂B：0.1％甲酸+乙腈
流速：0.5ml/分钟
梯度时间：1％B(1.5分钟)、1～40％B梯度(5分钟)、95％B(5分钟)、1％B(5分钟)
柱：L-column2ODS，2×50mm(化学物质评价研究机构、东京、日本)
柱温度：50℃
(MS接口条件(LCMS-8050(岛津制作所))
雾化气体：3L/分钟
加热气体：10L/分钟
干燥气体：10L/分钟
接口温度：300℃
DL温度：250℃
热封闭温度：400℃
3.肽片段制备用试剂盒
根据第3方式，本发明进一步提供一种试剂盒，其特征在于，其为在上述1的方法中使用的试剂盒，其包含：(i)具有能固定化靶单克隆抗体的细孔的多孔体；(ii)表面固定化有蛋白酶的纳米颗粒；和(iii)使用说明书，其示出：对于前述靶单克隆抗体和前述蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的100rpm以下的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，其中，前述纳米颗粒的平均粒径大于前述多孔体的细孔直径。
在一实施方式中，前述试剂盒中可以还包含用于从生物学样品等中分离纯化抗体的亲和单元。
这样的亲和单元为在固相凝胶颗粒上结合有抗体结合多肽的单元等，例如在琼脂糖凝胶上共价结合蛋白A或蛋白G而得到的亲和柱，通常可以为市售品。
在另一实施方式中，前述多孔体可以具有与颗粒表面和细孔内表面结合的连接体分子。优选的连接体分子如上所述为抗体结合多肽，具体为蛋白A、蛋白G、IgG结合肽等。
本发明的试剂盒中所包含的多孔体和纳米颗粒如上述说明，此外，前述使用说明书记载有：能够通过本发明的方法使来自靶抗体的肽片段的收量增加的步骤、条件。
使用者可以按照该使用说明书通过靶抗体的位置特异性蛋白酶消化以增加收量地得到目标肽片段。
在另一实施方式中，优选的蛋白酶为胰蛋白酶，但也可以用于固定化上述所记载、示例的各种蛋白酶。
胰蛋白酶具有如下优点：底物特异性高且切断后，在肽的C末端存在Lys或Arg，因此可以使肽的带电量和电荷定位均匀，特别适合制作用于质谱分析的样品，抗体的重链和轻链的可变区的氨基酸序列中适度存在碱性氨基酸，因此可以切出适度尺寸的肽片段，等。
实施例
以下示出如下实验例：作为单克隆抗体，选择曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)和贝伐单抗(商品名：Avastin)作为具体例子，在使用轻敲旋转搅拌(本发明)或涡流搅拌(比较)的条件下对各抗体进行蛋白酶消化，将得到的消化产物、即肽片段供于质谱分析并确定收量。需要说明的是，本发明的保护范围不限定于以下的具体例子。
＜试剂类等>
以下，只要没有特别声明，则％这一记载表示重量％。本实验例中使用的试剂等如下所述。
胰蛋白酶(序列等级、promega)
赖氨酰肽链内切酶(质谱分析级、和光纯药工业(大阪、日本))
2-吗啉乙磺酸，(MES、同人化学(熊本、日本))
2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES、同人化学)
三(羟甲基)氨基甲烷(Tris、和光纯药工业)
除了上述以外的有机溶剂等在没有特别声明时均由和光纯药工业获得。
此外，各缓冲液使用了用精密pH计调节了pH后的以下缓冲液。
MES缓冲液：25mM MES-NaOH，pH5.5
HEPES缓冲液：25mM HEPES-NaOH，pH7.0
乙醇胺缓冲液：1M乙醇胺(ethanolamine)-HCl，pH8.0
Tris缓冲液：25mM Tris-HCl，pH8.0
＜抗体固定化多孔体的制作>
在MES缓冲液200μL中加入在多孔珠的表面结合有蛋白G的树脂珠的悬浮液(Pierce Biotechnology,ProteinG UltraLink resin,平均粒径：100μm、细孔直径：50～100nm)5μL，在其中加入抗体溶液，然后在室温下缓慢搅拌约1小时，使抗体结合在树脂珠表面的蛋白G上而进行固定化。然后，在4℃下进行离心分离(15000rpm，1分钟)，使树脂珠沉淀，去除上清液之后，重复2次利用Tris缓冲液进行的清洗和离心分离，使多孔珠悬浮在Tris缓冲液(200μL)中。需要说明的是，作为上述抗体溶液，使用了曲妥珠单抗(商品名：Herceptin、20mg/mL、中外制药)和贝伐单抗(商品名：Avastin、20mg/mL、中外制药)溶液。
＜蛋白酶固定化纳米颗粒的制备>
使用了通过平均粒径190nm的纳米颗粒的表面被间隔物修饰而得到的蛋白酶固定化用纳米颗粒(多摩川精机(东京、日本)，FG beads NHS)，所述间隔物是羧基被N-羟基琥珀酰亚胺活化的间隔物(参照下述化学式(L为与纳米颗粒表面的结合位点)、间隔物的长度为1nm)。
在4℃下对FG珠的异丙醇悬浮液50μL进行离心分离(15000rpm，5分钟)，使纳米颗粒沉淀，去除上清液之后，用甲醇清洗。将包含50μg蛋白酶的溶液溶解于200μL的HEPES缓冲液中而成的溶液加入至上述纳米颗粒中，使纳米颗粒悬浮。需要说明的是，在进行悬浮时，以不使悬浮液温度上升的方式进行了几秒钟的超声波处理。
在4℃下搅拌该纳米颗粒的悬浮液30分钟，在4℃下进行离心分离(15000rpm，5分钟)，使纳米颗粒沉淀，去除上清液之后，加入乙醇胺缓冲液200μL使珠悬浮，在4℃下搅拌30分钟，利用乙醇胺对纳米颗粒表面剩余的N-羟基琥珀酰亚胺基进行封闭。然后，在4℃下进行离心(15000rpm，5分钟)使纳米颗粒沉淀，去除上清液之后，重复2次利用Tris缓冲液进行的清洗和离心分离，使其悬浮在Tris缓冲液(100μL)中。该悬浮液中的蛋白酶浓度为0.5μg/μL。
[实验1：多孔体上的抗体固定化量的确认]
在抗体固定化多孔体的制作中，使相对于100μg的IgG的蛋白G结合树脂珠悬浮液的量在0～20μL的范围内变化，用SDS-PAGE电泳来分析上清液，基于电泳图谱条带像素数求出上清液中残留的未结合IgG的估算量(抗体余量)。观察到随着蛋白G结合树脂珠量的增加、抗体余量下降的倾向，能够确认蛋白G结合树脂珠量为10μL时的抗体余量为约3％，几乎再现了蛋白G结合树脂珠的产品目录规范。
[实验2：抗体与蛋白酶的量比的研究]
将IgG固定化多孔体悬浮液(蛋白G-IgG)和蛋白酶固定化纳米颗粒(FG珠-胰蛋白酶(FGbeads-Tripsin))混合，在37℃下缓慢搅拌15小时，同时进行蛋白酶消化。然后，在4℃下进行离心分离(15000rpm，5分钟)，使树脂沉淀，回收液相(上清液)。改变蛋白酶固定化纳米颗粒的量，使得蛋白酶的量成为5μg(水准1)、10μg(水准2)、25μg(水准3)，从而进行了上述实验。对于水准4～6，直接使用未固定化IgG的多孔体(蛋白G UltraLink resin(ThermoFisher Scientific))代替IgG固定化多孔体悬浮液，进行了同样的实验。此外，对于水准7、8，不使用多孔体，在37℃下仅孵育蛋白酶固定化纳米颗粒(FG珠-胰蛋白酶)15小时。
将上述各实验的水准示于表1。表1中的重量(μg)是样品中的蛋白质(IgG或胰蛋白酶)的量。将得到的上清液的SDS-PAGE电泳图谱示于图2。图2中，左端的泳道为分子量标记物。
[表1]
进而，通过质谱分析进行蛋白酶消化产物的解析。
通过MALDI-TOFMS(岛津制作所、AXIMA Resonance MALDI-QIT TOF MS)分析上述水准1～6的上清液。首先，在上清20μL中以最终浓度为0.5％的方式添加三氟乙酸，使用疏水性树脂填充片(Millipore、ZipTip uC18)进行纯化之后，用1μL进行2次洗脱。将洗脱液直接上样到MALDI不锈钢靶上，在洁净工作台内使其风干。风干后，层叠10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHBA、岛津GLC、水/乙腈＝50/50)1μL，进行质谱分析。需要说明的是，装置的m/z使用人血管紧张素II肽(m/z＝1046.54、Sigma-Aldrich)和ACTH片段肽(m/z＝2465.20、Sigma-Aldrich)来进行。
图2的水准4～6的条带均与水准7、8的条带相同。此外，在水准4～6中检测出的m/z＝842、1045、2211、2283的峰均为胰蛋白酶的自体分解片段。由这些结果可知，即便使蛋白酶固定化纳米颗粒与蛋白G多孔体接触，蛋白G也不会被消化。可认为其原因是：由于多孔体的细孔直径小于蛋白酶固定化纳米颗粒的粒径，所以固定化在纳米颗粒表面的胰蛋白酶无法接近细孔内的蛋白G。
在水准1～3中，除了胰蛋白酶的自体分解片段之外，还检测出m/z＝835、913、1187、1287、1510、1678、1946的峰，并确认了这些峰均为IgG的胰蛋白酶消化肽片段。该结果表明，通过使固定化有IgG的多孔体与固定化有胰蛋白酶的纳米颗粒接触，从而能够选择性地消化IgG，而不会消化多孔体的蛋白G。
若比较图2的水准1～3，则可知随着胰蛋白酶量的增加，高分子侧的条带减少，抗体的消化反应顺利地进行。另一方面，随着胰蛋白酶量的增加，自体分解也变得显著。根据这些结果，将水准2(底物：蛋白酶比率＝10：1)设定为标准条件，进行了以下条件的研究。
需要说明的是，常规的蛋白酶消化条件为底物蛋白：蛋白酶＝100：1～20：1。本方法中通过组合多孔体和纳米颗粒，物理性地限制了底物蛋白与蛋白酶的接近，所以与常规的蛋白酶消化相比蛋白酶量变多，可推测出最适的底物：蛋白酶比率为10：1～5：1左右。
[实验3：针对消化时间的回收肽的评价]
设为上述实验2的水准2的条件，即，将IgG固定化多孔体悬浮液(IgG固相量100μg)和蛋白酶固定化纳米颗粒(胰蛋白酶固相量10μg)混合，将在37℃下的消化时间设为(1)15分钟、(2)45分钟、(3)90分钟、(4)180分钟、(5)360分钟、(6)15小时(整夜、O/N)。除此之外，与上述实验2同样地进行了胰蛋白酶消化，对得到的样品进行质谱分析。将MS图谱示于图3。
如图3所示，可知随着消化时间的增加，肽片段的峰增大，肽片段的回收量增加。若比较(5)360分钟和(6)整夜，则可观察到如下倾向：整夜的回收率高，尤其是m/z＝1187、1510、1678等容易受到蛋白酶消化的片段的集聚变得更加显著。然而，这些片段是来自抗体C区的片段，是无助于分析包含CDR的肽片段的物质。因此，将蛋白酶消化时间设定为6小时，进行了以下的研究。
[实验4：曲妥珠单抗或贝伐单抗的胰蛋白酶消化和质谱分析]
作为抗体，使用曲妥珠单抗或贝伐单抗代替IgG来制作抗体固定化多孔体，在上述实验2、实验3中选择的条件下，即，在相对于抗体固相量100μg的蛋白酶固定纳米颗粒量：10μg、消化时间：6小时的条件下进行胰蛋白酶消化并进行质谱分析，基于质谱分析结果进行数据库(Mascot server)解析。其结果是，以极高的得分鉴定出曲妥珠单抗、贝伐单抗。
本实验中，为了确认通过质谱分析检测出了曲妥珠单抗或贝伐单抗的肽片段，进行了更详细的质谱分析。
此外，通过LC-MS(岛津制作所、LCMS-8080Triple-quadrupole ultra high-performance liquid chromatography-MS)对消化后的上清液进行了分析。需要说明的是，在LC-MS测定时，使用按照终浓度达到0.5％的方式向上清液中加入甲酸而成的物质作为样品，LC条件如下所述。
＜HPLC溶液>
溶液A：0.1％甲酸、1％乙腈/水溶液
溶液B：0.1％甲酸、乙腈溶液
＜柱>
ShimPack ODS XR-ODS II(内径2mm、柱长50mm；SHIMADZU GLC Ltd.(京都、日本))
柱温度：40℃
流速：0.4mL/分钟
进样量：20μL
＜梯度程序>
0-2分钟：％B＝0
2-10分钟：％B＝0-40梯度
10-11分钟：％B＝40-98梯度
11-13分钟：％B＝98
13-13.5分钟：％B＝98-0梯度
13.5-15分钟：％B＝0
就曲妥珠单抗的重链(VH)和轻链(LH)而言，通过上述质谱分析检测/鉴定出的肽序列在曲妥珠单抗的情况下为例如IYPTNGYTR(序列号1：VH CDR2的一部分)、FTISADTSK(序列号2：VH CDR3的一部分)、ASQDVNTAVAWYQQKPGK(序列号3：VL CDR1的一部分)、NTAYLQMNSLR(序列号4：VH CDR3的一部分)、GLEWVAR(序列号5：VH CDR2的一部分)、DTYIHWVR(序列号6：VH CDR1的一部分)等，在贝伐单抗的情况下，为例如STAYLQMNSLR(序列号7；VH CDR3的一部分)、FTFSLDTSK(序列号8：VH CDR3的一部分)、GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR(序列号9：VH CDR2的一部分和CDR2)、VLIYFTSSLHSGVPSR(序列号10：VL CDR2的一部、CDR2、CDR3的一部分)等。因为检测出了曲妥珠单抗和贝伐单抗的各氨基酸序列特征性序列，因此实际上鉴定出了这些抗体。
[实验5：混合蛋白酶消化的研究]
以下，为了研究在本发明体系中混合蛋白酶消化的可应用性，通过胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶(Lys‐C)的组合体系进行了蛋白酶消化实验。
与上述各实验例同样地，将在多孔体的蛋白G上固定化有抗体(IgG或Herceptin)100μg的抗体固定化多孔体和固定化有10μg蛋白酶的纳米颗粒在37℃下搅拌6小时，进行抗体的蛋白酶消化。对于使用IgG作为抗体的情况和使用Herceptin作为抗体的情况，分别将胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶之比(重量比)设为(1)10：0、(2)9：1、(3)8：2、(4)0：10来进行实验，分别用SDS-PAGE电泳对消化后的上清液和多孔体表面的固定化成分进行分析。
与上述实验2同样地对使用了Herceptin作为抗体时的上述水准1～4的消化后的上清液进行质谱分析。此外，基于质谱分析结果，与实验4同样地利用Mascot server(Matrix Science，USA)进行数据库解析。
在组合使用了胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的水准2、3中，作为解析结果，除了示出Herceptin的抗原结合区以外，还示出了来自人的抗体的恒定区。此外，在仅使用了赖氨酰肽链内切酶的水准4中，显示出了不包含Herceptin、仅优先检测出抗体的恒定区的解析结果。
根据电泳结果，可知：有随着赖氨酰肽链内切酶比率的上升、上清液的肽片段数增加、条带面积也增加的倾向，消化效率和肽回收率增加了。此外，根据质谱质谱分析结果，随着赖氨酰肽链内切酶的比率的增大，所检测到的肽片段的种类和量增加。但是，在水准2～4中新检测出的肽片段大多为来自Herceptin的Fc结构域的片段，可知蛋白酶消化的区域选择性(选择性消化Fab区的特性)降低。
由这些结果可知，虽然随着赖氨酰肽链内切酶的用量增大，抗体的消化效率提高，但蛋白酶消化的区域选择性降低，伴随恒定区的肽片段的产生量增大，V区的肽片段的相对产生量减少，因此出现抗体的检测/鉴定精度降低的倾向。因此，从通过本发明的方法对抗体的Fab区进行区域选择性的切断、对CDR进行特异性检测的观点出发，可以说：优选单独使用胰蛋白酶，在并用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的情况下，优选使赖氨酰肽链内切酶的混合量为10％以下。
进而，此外在仅使用了赖氨酰肽链内切酶的水准4中未进行位点特异性消化，而在仅使用了胰蛋白酶的水准1(实验4)中，通过数据库解析有效地检测出了CDR，由此可知选择性地对Fab区的V区进行了蛋白酶消化。根据以上结果，可以说，表明了在底物蛋白为抗体的情况下，只要使用胰蛋白酶并应用本发明，就能够适当控制针对抗体的蛋白酶的空间接近，能够进行区域选择性的蛋白酶消化。
此外，根据本实验，表明了在同时使用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的情况下，可以切断固定化在细孔内的底物蛋白而不会使各蛋白酶丧失其功能。就抗体而言，V区存在于分子的前端，所以在赖氨酰肽链内切酶的用量增加时，会出现位置特异性降低的倾向，但暗示了：在使用其它蛋白质作为底物的情况下，有利用蛋白酶的组合体系实现区域选择性、消化效率的提高的可能性。
以上，如各实验例中所示，可知根据本发明能够以简便的方法对抗体等蛋白质进行区域选择性地蛋白酶消化，从而得到肽片段样品，得到的肽片段样品适合于通过质谱分析进行的蛋白质的鉴定、定量。
[实验6：在抗体的蛋白酶消化中的肽片段的收量增加的研究]
以下研究对作为药物抗体的曲妥珠单抗或贝伐单抗进行胰蛋白酶消化时的、能使肽片段的收量增加的条件。
＜实验步骤>
按照以下步骤进行实验。
(步骤1)
取抗体药物(曲妥珠单抗、贝伐单抗)加入至低吸附管(Richell MicroresicoTube 92017(Richell(富山、日本)))，用180μL PBS稀释。关于稀释溶液的浓度，以10μg/mL为起点，以3倍稀释系列调整为10μg/mL、3.3μg/mL、1.1μg/mL。各样品以N＝6进行分析。
(步骤2)
将抗体分级珠(Pierce 53126Protein G UltraLink Resin(Pierce))10μL分注到过滤管(Millipore UFC30LG00Ultrafree-C3LCR(Millipore)0.2μm)中。
(步骤3)
将步骤1的血清稀释样品转移到步骤2的过滤管中。
(步骤4)
一边用轻敲旋转混合机(NRC-20D型、日伸理化(东京、日本))轻轻轻敲，一边在室温下搅拌2小时。
(步骤5)
进行离心过滤(10000×g、1分钟)，将溶液分离。加入PBS 200μL并离心过滤，弃掉滤液。进行3磁该操作，回收抗体分级珠(抗体量分别为1.0μg、0.33μg、0.11μg)。
(步骤6)
向步骤5的抗体分级珠中加入酶反应缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0)200μL。
(步骤7)
将抗体水解用FG珠(胰蛋白酶3μg)在冰上迅速用超声波清洗机或涡流混合机分散至均匀，并加入到步骤6的酶反应缓冲液中。
(步骤8)
将溶液回收用管安装到过滤管中，使用帕拉胶膜(parafilm)将盖子侧密封。用转速1～5rpm且轻敲次数调整为2次/分钟的轻敲旋转混合机一边轻敲一边在37℃下搅拌6小时，进行抗体的蛋白酶消化反应。此时，作为比较组，通过涡流混合机进行搅拌。
(步骤9)
对步骤8的反应混合液进行离心过滤(10,000×g、1分钟)而去除树脂，回收滤液。
(步骤10)
在步骤9的滤液中加入酶反应终止液(10％甲酸)15μL。
(步骤11)
将步骤10的反应终止后的溶液转移到LCMS套瓶(岛津GLC GLC4010-VP targetvial VP、C4010-630P Target PP Polyspring)中，去除底部的气泡，作为分析用样品。
(步骤12)
将步骤11的分析用样品设置在LCMS的进样器中，进行分析。
＜结果>
从通过质谱分析检测、鉴定出的肽序列中，分别地，在曲妥珠单抗的情况下选择IYPTNGYTR(序列号1：VH CDR2的一部分)、FTISADTSK(序列号2：VH CDR3的一部分)、ASQDVNTAVAWYQQKPGK(序列号3：VL CDR1的一部分)、NTAYLQMNSLR(序列号4：VH CDR3的一部分)、GLEWVAR(序列号5：VH CDR2的一部分)、DTYIHWVR(序列号6：VH CDR1的一部分)，另一方面在贝伐单抗的情况下选择STAYLQMNSLR(序列号7：VH CDR3的一部分)、FTFSLDTSK(序列号8：VH CDR3的一部分)、GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR(序列号9：VH CDR2的一部分和CDR2)、VLIYFTSSLHSGVPSR(序列号10：VL CDR2的一部分、CDR2、CDR3的一部分)，由LCMS数据(MRM离子强度)确定在轻敲旋转搅拌或涡流搅拌下进行反应时各肽片段的收量。定量值的差异显著性使用T检验来进行，标记为p＜0.05(*)、p＜0.01(**)。
关于结果，将由序列号1～6的氨基酸序列构成的肽片段的相对收量示于图4，将由序列号7～8的氨基酸序列构成的肽片段的相对收量示于图5。
由图可知，曲妥珠单抗和贝伐单抗的蛋白酶消化反应结果由于搅拌方式(即，轻敲旋转搅拌、涡流搅拌)而导致作为反应产物的肽片段的收量的差异较大，轻敲旋转搅拌时的肽片段收量与涡流搅拌(转速100rpm)时相比，曲妥珠单抗显示出增加约3～5倍的倾向，贝伐单抗显示出增加约1.4～4倍的倾向。通过轻敲旋转搅拌(合适转速：3～10rpm、合适轻敲次数：1～5次)可以使蛋白酶消化高效进行。
进而，由图可知，通过改变底物：酶的量比而使轻敲旋转搅拌：涡流搅拌的相对收量比发生变化，因此需要以实现最适的肽片段收量的方式在抗体浓度、例如包含1.1μg/mL～10μg/mL(每200μL反应规模使用100μL)的范围内确定最适的底物：酶的量比。
进而可知，在步骤8的抗体的蛋白酶消化反应中，通过使用不含盐(NaCl)的酶反应缓冲液(合适pH：7.0～9.0；胰蛋白酶的情况下，pH约8.0)，从而防止固相颗粒彼此的聚集，可以得到良好的扩散。
产业上的可利用性
虽然限制反应场的蛋白酶水解反应是已知的，但迄今为止几乎未实现提高固相-固相间的反应效率、使作为抗体的水解产物的肽片段(主要是包含抗体的重链和轻链可变区或Fab区或其一部分的肽片段)的收量增加，通过本发明，可以以非常简单的方法高效地增加抗体的肽片段收量。由此，可以利用LCMS对血液等的生物学样品中的药物抗体进行准确的定量，因此能够在医疗现场降低对患者的副作用，且使医生进行有效的治疗。
序列号1～10：抗体片段
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用而原样纳入本说明书中。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所(SHIMADZU CORPORATION)
<120> 利用了限制反应场的蛋白酶水解反应由抗体得到肽片段的方法
<130> PH-6400-PCT
<150> JP 2015-047740
<151> 2015-03-10
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 1
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 2
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
1 5
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 3
Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 4
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 5
Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 6
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 7
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 8
Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys
1 5
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 9
Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg
20
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 抗体片段
<400> 10
Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
1 5 10 15

Claims (16)

1.一种由靶单克隆抗体得到包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的方法，其包含如下工序：
对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体、和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的速度进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而利用所述蛋白酶消化所述靶单克隆抗体，
所述纳米颗粒具有大于所述多孔体的平均细孔直径的平均粒径。
2.一种使来自靶单克隆抗体的、包含该抗体的Fab区或可变区或者其一部分的肽片段的收量增加的方法，其特征在于，其包含如下工序：
对于固定化在多孔体的细孔内表面的靶单克隆抗体、和固定化在纳米颗粒的表面的蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的、低于100rpm的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，从而利用所述蛋白酶消化所述靶单克隆抗体，
所述纳米颗粒具有大于所述多孔体的平均细孔直径的平均粒径，
其中，所述多孔体的平均细孔直径为10nm～200nm的范围，所述纳米颗粒的平均粒径为50nm～500nm的范围。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒的平均粒径为多孔体的平均细孔直径的1.5倍～4倍大小。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，以50rpm以下的低速进行所述搅拌或轻敲旋转搅拌。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶选自由胰蛋白酶、Lys-C、Arg-C、Asp-N、糜蛋白酶、V8蛋白酶、和它们中的2种以上的组合组成的组。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶单克隆抗体介由连接体分子结合在所述多孔体的细孔内表面。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽片段为包含互补性决定区(CDR)或其一部分的肽片段。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，还包含如下工序：从生物学样品中分离靶单克隆抗体或包含该靶单克隆抗体的抗体群。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物学样品为血液、血清、血浆、组织或细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，还包含如下工序：使包含所述靶单克隆抗体的抗体群结合在所述多孔体的细孔内表面。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体为不含盐的缓冲液。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶单克隆抗体为抗体治疗药。
13.一种试剂盒，其特征在于，其为在权利要求1～12中任一项所述的方法中使用的试剂盒，其包含：
(i)具有能固定化靶单克隆抗体的细孔的多孔体；
(ii)表面固定化有蛋白酶的纳米颗粒；和
(iii)使用说明书，其示出：对于所述靶单克隆抗体和所述蛋白酶，以使其在液体中保持均匀分散的程度的低于100rpm的低速进行搅拌或轻敲旋转搅拌而使其接触，
其中，所述纳米颗粒的平均粒径大于所述多孔体的细孔直径。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，还包含用于对抗体进行分离纯化的亲和单元。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于，所述多孔体具有结合在颗粒表面和细孔内表面的连接体分子。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述连接体分子为抗体结合多肽。
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