CN105518447B - 肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、以及分析方法 - Google Patents

肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、以及分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种使用蛋白酶切断蛋白质从而制备肽片段的方法。本发明的方法具有如下步骤：使在细孔(29)内固定化有切断对象的基质蛋白(25)的多孔质体(20)与在表面固定化有蛋白酶(15)的微粒(10)在液体中接触。本发明中，前述微粒(10)的平均粒径大于前述多孔体(20)的平均孔径。根据本发明的方法，能够位置选择性地切断抗体的基质蛋白(25)。利用质谱法对通过上述方法得到的肽片段等进行分析，从而可以进行抗体的蛋白质的检测、定量分析。

Description

肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、 以及分析方法
技术领域
本发明涉及使用蛋白酶位置选择性地切断抗体等蛋白质从而制备肽片段的方法、及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒。进而，本发明涉及对利用该方法制备的肽片段利用质谱法等进行分析从而进行蛋白质的检测、定量的分析方法。
背景技术
抗体药物的需求正迅速扩大，在临床现场，对血液中的抗体浓度进行简便地定量的重要性在提高。一直以来，虽然并未重视正确测定给与抗体药物后的血药浓度，但伴随曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)在胃癌应用扩大的临床试验中，发现其血药浓度与生存期之间存在显著性差异之后，在抗体药物的临床试验等中，测定抗体的血药浓度也正成为必须的。例如，在确认药代动力学等质量管理、确认仿制药在临床试验等中与原药的等效性等方面也要求进行抗体药物的鉴定、其血药浓度的定量。
使用了抗原抗体反应的ELISA(酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay))法的特异性和定量性优异，所以在临床试验等中广泛用于血液中的抗原、抗体的检测/定量等。然而，ELISA法是以单一的蛋白质(抗原或抗体)的检测为目的的方法，不能同时检测多种不同的蛋白质。为了利用ELISA法检测多种蛋白质，需要针对每一个检测对象制作特异性抗体并设定浓度测定条件，需要巨大的精力和费用。另外，由于ELISA法利用抗原抗体反应，所以已知下述问题：联合用药、与代谢物的交叉反应可能影响测定结果，一部分的抗体药物难以用于保存被检体等。
因此，期待开发出能够普遍适用于各种抗体的分析方法。伴随蛋白质组学的发展，开发了利用质谱法可对蛋白质网罗性地检测/定量的技术，近年来，也可进行抗体等巨大生物体分子的解析。对于质谱，需要对测定对象分子进 行离子化，通常难以直接用质谱对抗体等巨大生物体分子进行分析。因此，采用了如下方法：利用蛋白酶消化来切断蛋白质(片段化)，从经片段化的肽中选择针对分析对象的蛋白质具有特异性的氨基酸序列的肽片段，利用质谱装置进行检测/定量的方法。通常，为了提高利用蛋白酶的消化效率，在使基质蛋白在高浓度的尿素、胍溶液中变性之后，进行蛋白酶消化。
在利用蛋白酶消化对抗体等蛋白质进行片段化并进行质量分析时，选择性地检测出作为检测对象的肽片段是很重要的。然而，有时会难以从含有多种多样的夹杂物的生物体试样中检测出源自分析对象的蛋白质的特定肽片段。即，由于血液等生物体试样含有多种多样的夹杂物，所以在生物体试样中添加蛋白酶时，源自夹杂物的蛋白质也会被蛋白酶消化，从而生成数量庞大的肽片段。为了从中选择性地检测/定量源自检测对象(例如特定的抗体)的目标肽片段，在供于质谱之前，需要对肽片段进行分离、浓缩等操作。另外，如果由检测对象之外的蛋白质产生具有与检测对象的蛋白质的肽片段相同的氨基酸序列的肽片段，则会成为误检、定量性降低的原因。因此，存在伴随由生物体试样产生的肽片段数的增加而作为检测对象的肽片段的选择变得更加困难的倾向。
鉴于这样的生物体试样的复杂性，开发出了如下的方法：在利用液相色谱(LC)纯化试样之后，供于质谱装置的方法；通过利用碰撞诱导解离(CID)等产生离子断裂的多级的质谱、或它们的组合(多反应监测，MRM)，从而对生物体试样等复杂试样中的特定的蛋白质进行定量的方法。然而，存在如下问题：试样变得越复杂，越需要组合各种各样的分离模式、越需要高精度的实验装置，或分析条件的设定越需要花费大量的时间。
另外，即使在使用了纯化后的试样的情况下，抗体等大蛋白也因蛋白酶消化而产生多种肽片段，因此，存在从中选择性地检测/定量针对检测对象具有特有的氨基酸序列的肽片段变得困难的倾向。鉴于这样的问题，开发出了：针对分析对象的蛋白质进行位置选择性地蛋白酶消化，使试样中的肽片段的数量(种类)减少，提高分析精度且简化分析的方法。例如，专利文献1中提出 了如下方法：在利用抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab’)2片段之后，进而用胰蛋白酶等蛋白酶消化F(ab’)2片段，产生含有抗体的互补性决定区(CDR)的肽片段，利用质谱对含有CDR的肽片段进行检测/定量。
在此对抗体的结构进行说明。所有的抗体具有2条重链(H链)和2条轻链(L链)。1条轻链和1条重链通过二硫键连接而形成异二聚体，进而2个异二聚体通过2个二硫(S-S)键连接而形成“Y”字型的异四聚体(参照图2)。抗体具有由重链形成的1个Fc(Fragment,crystallizable)结构域和由重链和轻链形成的2个Fab(Fragment,antigen binding)结构域，Fc结构域和Fab结构域借助铰链部连接。
抗体的Fc结构域主要承担引起抗体与抗原结合之后的反应的功能(效应子功能)，对于源自相同种类的抗体的大部分，Fc结构域的氨基酸序列是相同的。另一方面，Fab结构域的前端部分(N末端)具有与抗原结合的功能。Fab结构域之中，为了使N末端的部分能够结合于多种抗原，在氨基酸序列上可见各种变化。该区域称为可变区(V区)，轻链的可变区称为VL区，重链的可变区称为VH区。V区之外的Fab结构域和Fc结构域是氨基酸序列变化少的区域，称为恒定区(C区)。轻链的恒定区称为CL区，重链的恒定区称为CH区。CH区进一步分为CH1区、CH2区和CH3区这3个区。重链的Fab结构域包含VH区和CH1区，重链的Fc结构域包含CH2和CH3。铰链部位于CH1和CH2之间。
抗体的特异性(即与抗原的特异性结合性)是由V区的氨基酸序列的组合所决定的。轻链和重链分别在Fab结构域的V区内具有3个互补性决定区(CDR)。CDR也称为高变区，根据抗体种类不同则氨基酸序列不同。由于抗体在轻链和重链上分别具有3个CDR(总计6种CDR)，因而产生能够与各种各样的抗原结合的多样性。换言之，CDR是表征抗体的区域，通过特定抗体的CDR的氨基酸序列能够对抗体进行鉴定。
如上所述，抗体的Fab结构域和Fc结构域借助铰链部连接。由于作为蛋白酶之一的木瓜蛋白酶切断该铰链部，所以通过抗体的木瓜蛋白酶消化而产生2个Fab结构域和1个Fc结构域。另外，作为蛋白酶之一的胃蛋白酶切断铰 链部的2根二硫键的Fc结构域侧(C末端侧)，所以通过胃蛋白酶消化产生2个Fab结构域键合的F(ab’)2结构域和多个Fc结构域片段。
上述专利文献1的方法中利用胃蛋白酶消化或木瓜蛋白酶消化产生Fab结构域或F(ab’)2结构域，对Fab结构域或F(ab’)2结构域位置选择性地进行蛋白酶消化。利用该方法能降低利用蛋白酶消化而产生的肽的数量，能有效地产生含有CDR的肽，因此通过质谱法进行抗体的检测/定量得以简化。另外，专利文献2中报道了通过组合使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和特定的离子，从而基于这些蛋白酶的消化效率提高。
以抗体的Fab结构域的纯化为目的，也市售有对蛋白酶进行最优化后的纯化用试剂盒等。然而，由于上述专利文献1的方法需要在对Fab结构域或F(ab’)2结构域进行纯化之后进而进行蛋白酶处理，所以制备用于质谱的试样需要大量的时间和成本，难以称之为简便的方法。另外，根据作为消化对象的基质蛋白的种类的不同，蛋白酶消化(片段化)的消化效率不同，因此为了使制备用于质谱的肽片段试样简化，提高消化效率就变得至关重要。
近年来，作为蛋白酶消化的高效率化方法，在纳米颗粒等微小环境(微型反应器)内进行蛋白酶消化的方法受到关注。例如，在非专利文献1中报告了如下例子：通过在尼龙的多孔膜的细孔内固定化胰蛋白酶，使白蛋白溶液在该多孔膜内通过，从而使白蛋白的胰蛋白酶消化高效率化。在非专利文献2中报道了通过使用在细孔内固定了胰蛋白酶的中多孔二氧化硅，从而能够选择性地胰蛋白酶消化分子量小的蛋白质。这些方法均是在多孔体的细孔内固定化蛋白酶，使固相表面的蛋白酶与液相内的基质蛋白反应的方法。如此，通过在微小环境中将蛋白酶固定在固相来提高消化效率的方法认为由以下原因所引起：在固相与液相的界面这样的局部的/微小的环境中蛋白质易发生变性，或溶解度、三维结构的波动幅度等受到扰动，由此基质蛋白与蛋白酶的接触机会增大，反应概率提高。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/079914号国际公开小册子
专利文献2：日本特开2011-130749号公报
非专利文献
非专利文献1：Fei Xu et.al.,Anal.Chem.,2010,82,10045-10051.
非专利文献2：Qianhao Min et.al.,Chem.Commun.,2010,46(33),6144-6146.
发明内容
发明要解决的问题
虽然上述非专利文献2的方法能够对分子量小的蛋白质进行选择性地蛋白酶消化，但却不适用于抗体这种大蛋白的选择性消化。另外，还未开发出利用如非专利文献1和非专利文献2所公开那样的微型反应器位置选择性地进行蛋白酶消化的方法。
如上所述，为了利用质谱法对蛋白质简便地进行检测/定量，需要对分析对象的蛋白质进行位置选择性地切断，使检测对象的蛋白质有效地产生特异性的肽片段，使除此之外的肽片段的产生量减少。例如，为了对抗体进行检测或定量分析，需要对Fab结构域、特别是Fab结构域的V区进行位置选择性地蛋白酶消化，抑制Fc结构域的蛋白酶消化。
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果发现通过在固相固定抗体等基质蛋白与蛋白酶这两者，能够实现基质蛋白的位置选择性的蛋白酶消化，从而完成了本发明。
本发明涉及一种利用蛋白酶消化蛋白质的肽片段的制备方法。本发明的方法具有使在细孔内固定化有切断对象的基质蛋白的多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒在液体中接触的步骤(消化步骤)。在细孔内固定化有基质蛋白的多孔体通过在多孔体的细孔内固定化切断对象的基质蛋白的步骤(基质固定步骤)而得到。本发明中，微粒的粒径优选大于多孔体的平均孔径。
当微粒的粒径大于多孔体的平均孔径时，固定化在微粒表面的蛋白酶能够接近多孔体的细孔的表层附近(多孔体与液相的界面附近)，但不能接近细孔深处的位置。如此，由于蛋白酶的可接近区域不受物理的(空间的)限制，所以蛋白酶对固定化在多孔体的细孔内的基质蛋白的特定位点选择性地接近。因此，可对基质蛋白进行位置选择性的蛋白酶消化(片段化)。
本发明中，优选基质蛋白的规定区域被固定化于多孔体上。在该方案中，固定化在多孔体上的区域位于细孔的深处，与被固定化的区域不同的区域位于细孔的表层附近。如果与基质蛋白的选择性切断位点不同的区域即优选不被蛋白酶消化的区域被固定化于多孔体上，则固定化在微粒表面的蛋白酶接近位于细孔的表层附近的基质蛋白的选择性切断位点，进行蛋白酶消化。因此，能够对基质蛋白所期望的位点进行位置选择性地蛋白酶消化。
优选在多孔体的细孔内固定化有与基质蛋白进行位点特异性地相互作用的接头分子。另外，基质蛋白优选借助接头分子固定化在多孔体的细孔内。作为基质蛋白为抗体时的接头分子，例如可举出蛋白G、蛋白A等。由于这些接头分子与抗体的Fc结构域进行位点特异性结合，所以抗体的Fc结构域被固定化在多孔体内，Fab结构域位于细孔的表层附近。根据该方案，能够对抗体的Fab结构域进行选择性地蛋白酶消化。
当在多孔体的细孔内固定化有接头分子时，接头分子与基质蛋白结合后的状态的分子大小优选为多孔体的平均孔径的0.5倍～1.5倍左右。通过如此调整分子大小，从而能够提高固定化在微粒表面的蛋白酶与基质蛋白的选择性切断位点的接近概率，并提高蛋白酶消化的位置选择性。
另外，优选用能够与蛋白酶结合的间隔分子修饰微粒的表面，并且蛋白酶借助该间隔分子固定化在微粒的表面。通过借助间隔分子对蛋白酶进行固定化，从而抑制蛋白酶从微粒表面脱离，提高了蛋白酶消化的位置选择性。另外，通过调整间隔物的分子大小，也可使蛋白酶选择性地接近基质蛋白的所期望的位置，而提高位置选择性。
本发明中，作为固定化在微粒表面的蛋白酶，优选为胰蛋白酶或胰蛋白 酶与其它蛋白酶的并用体系。基质蛋白为抗体的情况下，优选为单独使用胰蛋白酶、或在并用体系的情况下全部蛋白酶中的胰蛋白酶的量为90％以上。特别是基质蛋白为抗体的情况，通过使用胰蛋白酶而存在选择性地蛋白酶消化Fab结构域、抑制Fc结构域的蛋白酶消化的倾向。
多孔体的平均孔径优选为30～150nm左右，微粒的平均粒径优选为100nm以上。特别是，基质蛋白为抗体的情况下，平均孔径和平均粒径只要在上述范围内，就能够更可靠地位置选择性地切断Fab结构域。
进而，本发明涉及上述方法中使用的肽片段制备用试剂盒。本发明的肽片段制备用试剂盒包含：具有能够固定化蛋白质的细孔的多孔体和能够将蛋白酶固定化在表面的微粒。微粒也可以以在表面固定化有蛋白酶的状态提供。通过使该试剂盒的多孔体与试样(例如血液等被检体)接触，从而能够将试样中的目标物质(抗体等基质蛋白)固定化在多孔体的细孔内。通过使固定化基质蛋白之后的多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒在液体中接触，从而可对基质蛋白进行位置选择性地蛋白酶消化。
通过对利用上述方法得到的肽片段利用质谱等进行分析，可进行基质蛋白的检测(鉴定)、定量。本发明中，由于位置选择性地蛋白酶消化了基质蛋白，所以能够大幅减少测定试样中所含的肽片段的种类。因此，可简化质谱的条件设定，也可期待提高分析精度。
例如，基质蛋白为抗体时，根据本发明的方法，由于可对含有互补性决定区的Fab结构域进行位置选择性的蛋白酶消化，因而可将含有抗体的互补性决定区的至少一部分序列的肽片段作为检测对象。由于互补性决定区具有针对每个抗体的特异性氨基酸序列，因而可通过分析含有互补性决定区的序列的肽片段对抗体进行检测、定量。
发明的效果
根据本发明，能够通过简便的方法对抗体等蛋白质进行位置选择性地蛋白酶消化而得到肽片段。将本发明的方法应用于抗体时，抑制抗体的Fc结构域的消化，选择性地蛋白酶消化含有CDR的Fab结构域，提高了含有对于抗 体的鉴定重要的CDR的氨基酸序列的肽片段在试样中的浓度。
根据本发明的方法，由于能够大幅减少测定试样中所含的肽的种类，因而可简化质谱的条件设定，也可期待提高分析精度。通过对所得到的肽片段进行分析，也可对血液中的抗体药物浓度进行定量。因此，本发明的方法也可作为临床前或临床试验中的抗体药物的浓度测定体系的前处理方法而应用。
另外，本发明的方法不限于抗体药物，可适用于很多蛋白质，除了在医药产业上的应用扩展之外，也可期待应用在以生物体分子的相互作用解析为首的基础研究领域等中。
附图说明
图1是用于说明本发明的位置选择性切断的原理的概念图。
图2是用于说明抗体的结构的示意图。
图3是表示肽片段制备用试剂盒的一个方式的示意图。
图4是蛋白酶的量比研究实验的电泳图谱。
图5是蛋白酶的量比研究实验的质谱(MALDI-TOFMS)图谱。
图6是消化时间研究实验的质谱(MALDI-TOFMS)图谱。
图7是基于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化片段的质谱结果的数据库解析结果。
图8是曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化片段的质谱(MALDI-TOFMS)图谱。
图9是曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化片段的LS-MS测定的色谱图。
图10是曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化片段的质谱(LS-MS)图谱。
图11是表示曲妥珠单抗的重链(A)和轻链(B)的氨基酸序列的图。图中的下划线表示通过本实验的质谱所鉴定的肽片段。
图12是混合蛋白酶消化研究实验的电泳图谱。
图13是混合蛋白酶消化研究实验的质谱(MALDI-TOFMS)图谱。
具体实施方式
本发明的肽片段的制备方法中，在多孔体的细孔内固定化切断对象的基质蛋白，使固定化有基质蛋白的多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒在液体中接触。图1是用于说明本发明中的蛋白酶消化的原理的概念图。
在微粒10(平均粒径D1)的表面固定化有蛋白酶15。多孔体20具有多个细孔29(平均孔径D2)，在细孔内固定化有基质蛋白25。如此，本发明的方法中，蛋白酶15和基质蛋白25两者以微小区域被固定在固相上，通过固相彼此的接触进行蛋白酶消化。
微粒10的平均粒径D1大于多孔体20的平均孔径D2。因此，微粒10能够接近细孔29的表层附近，但不能接近细孔29的深处。与此同时，固定化在微粒10表面的蛋白酶15也不能接近细孔29的深处。图1中细孔29附近的虚线表示蛋白酶15能够接近的区域的边界。
如此，位置特异性限制了蛋白酶15接近细孔29内的基质蛋白25，提高了基质蛋白相对液相侧(图1中“Y”字的部分)的接近概率。由此能够对基质蛋白25进行位置选择性地蛋白酶消化，得到肽片段。
[基质蛋白]
基质蛋白25是作为分析对象的蛋白质。基质蛋白的种类没有特别限定，从进行位置选择性切断的观点出发，优选为分子直径大于蛋白酶15的物质。需要说明的是，基质蛋白也可为蛋白质的复合体。分子直径可从文献、数据库等中获得基于通过X射线、NMR等的结构解析所确定的数值。例如，抗体的分子直径约为15nm。另外，也可通过小角X射线散射等求出分子直径，也可由分子量通过估算而得出。作为参考例，在表1中示出了在对超滤膜的分离特性进行研究时用作标记分子的蛋白质的分子量和分子直径。
[表1]
蛋白质 分子量(Da) 分子直径(nm)
蔗糖 340 1.1
棉子糖 590 1.3
维生素B12 1,360 1.7
杆菌肽 1,410 1.7
胰岛素 5,700 2.7
细胞色素C 13,400 3.8
肌红蛋白 17,000 4.0
α-糜蛋白酶原 25,000 4.6
胃蛋白酶 35,000 5.0
卵白蛋白 43,000 5.6
牛白蛋白 67,000 6.4
醛缩酶 142,000 8.2
γ-球蛋白 150,000 8.4
基质蛋白25优选为在多孔体20的细孔29内进行位点特异性结合的物质。通过基质蛋白25进行位点特异性结合，从而除该结合位点之外的位点被选择性地蛋白酶消化。例如在C末端、N末端等附加了His标签(包含6个左右连续的组氨酸残基的标签肽)、生物素化肽等标签序列的蛋白质，或者与特定的基质进行特异性结合的酶等也可用作位点特异性结合的蛋白质。
本发明中，作为在多孔体的细孔内可进行位点特异性结合的基质蛋白，特别优选使用抗体。只要在多孔体20上固定化抗体的Fc结构域，就可对Fab结构域进行选择性地蛋白酶消化。抗体的种类没有特别限制，但优选为单克隆抗体。作为单克隆抗体，例如可举出帕尼单抗(Vectibix)、奥法木单抗(Aruzera)、戈利木单抗(Shinponi)、易普利姆玛(Yaboi)等人抗体；托珠单抗(Actemra)、曲妥珠单抗(Herceptin)、贝伐单抗(Avastin)、奥马珠单抗(Xolair)、美泊利单抗(Bosatoria)、吉妥单抗(Mylotarg)、帕利珠单抗(Synagis)、兰尼单抗(Lucentis)、赛妥珠单抗(Cimzia)、Ocrelizumab、Mogamulizumab(Poteligeo)、艾库组单抗(Soririsu)等人源化抗体；利妥昔单抗(Rituxan)、西妥昔单抗(Erbitux)、英夫利昔单抗(Remicade)、巴利昔单抗(Simulect)等嵌合抗体等。 这些抗体用作抗体药物(分子靶向治疗药)，在临床试验等中需要对血液中的抗体浓度进行定量。
正如之后在实施例中说明的那样，根据本发明的方法，能够对单克隆抗体的Fab结构域进行位置选择性地蛋白酶消化，通过得到的肽片段的质谱，从而可对抗体进行鉴定、定量。本发明的分析方法是通过对源自抗体的可变区的肽片段进行检测，从而对抗体进行鉴定(检测)、定量的方法，是直接测定源自抗体的肽片段的方法。因此，本发明的分析方法不需要抗原等特异性结合物质，无论抗体的种类如何均能应用。因此，本发明的方法不限于上述示例的抗体，也可适用于新开发的单克隆抗体等。
[多孔体]
多孔体20只要具有多个细孔29，则其材料没有特别限定。图1中示出了半球形状的细孔，但细孔的形状没有特别限定。另外，也可使用如多孔膜那样形成了贯通多孔体的细孔的物质。
作为多孔体20，可使用活性碳、多孔膜、多孔树脂珠、金属颗粒等。其中优选为可选择性地结合上述基质蛋白的物质，特别优选为可位点特异性结合基质蛋白的物质。例如，用于特定的蛋白质等的纯化的亲和柱载体珠可满足这样的条件。
本发明中，优选使用在多孔体20的细孔29内固定化有与基质蛋白25进行位点特异性相互作用的接头分子21的物质。作为基质蛋白与接头分子的相互作用，可举出化学键、氢键、离子键、络合物形成、疏水性相互作用、范德华相互作用、静电相互作用、立体选择性相互作用等。
接头分子可根据基质蛋白的种类、结合位点从氨基、羧基、环氧基等官能团；生物素、地高辛等标记化合物；抗生物素蛋白、链霉亲和素蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白等蛋白质；各种配体；酶的基质化合物；二氧化硅；金属螯合物等中适当选择最合适的物质。
基质蛋白25为抗体的情况下，作为接头分子21优选使用蛋白G、蛋白A等。蛋白A、蛋白G与抗体的Fc结构域进行位点特异性结合。通过使用在细 孔29内固定化有蛋白A、蛋白G等接头分子21的多孔体20，从而在细孔内位点特异性地固定化抗体(基质蛋白25)的Fc结构域，Fab结构域位于液相侧(细孔的表层附近)。由此可见，通过在细孔内以一定方向对抗体进行固定化，从而可控制在细孔内的抗体的取向，能够进行利用蛋白酶的Fab结构域的位置选择性消化。
另外，通过在细孔内对基质蛋白进行固定化，使其处于固相和液相的界面这样微细的环境中，从而基质蛋白易发生变性，分子的波动受到扰动，提高了受蛋白酶侵蚀的概率。另外，可认为本发明中通过将蛋白酶固定化在颗粒上而成为立体稳定且难以产生自身消化的环境，所以蛋白酶的稳定性增加。因此，根据本发明的方法，除了可进行位置选择性的蛋白酶消化之外，还能够维持蛋白酶的高活性。
多孔体20的细孔29的大小没有特别限定。细孔的大小优选考虑基质蛋白的分子直径等来确定，使得在对基质蛋白25进行固定化时，基质蛋白的前端部分、即应该被选择性消化的位点位于细孔29的表层附近。关于多孔体20的平均孔径D2例如为10nm～500nm左右的范围、且在比微粒10的平均粒径D1小的范围内进行适当设定。关于多孔体20的平均孔径D2，例如优选为20nm～200nm左右、更优选为30nm～150nm左右。特别是基质蛋白25为抗体的情况下，为了在细孔内固定化Fc结构域、对Fab结构域进行位置选择性地蛋白酶消化，多孔体的孔径优选为30nm～150nm、更优选为40nm～120nm、进而优选为50nm～100nm。
考虑到细孔、基质蛋白的大小，接头分子的大小以基质蛋白的选择性切断位点位于细孔的表层附近的方式进行选择。接头分子与基质蛋白结合的状态的分子大小优选为多孔体的孔径的0.5倍～1.5倍左右、更优选为0.6倍～1.2倍左右、进而优选为0.7倍～1.1倍左右、特别优选为0.8倍～1倍左右。需要说明的是，在多孔体20上未固定接头分子、而基质蛋白直接结合在多孔体的细孔内的情况下，基质蛋白的分子直径与多孔体的孔径优选满足上述关系。
[基质蛋白的固定化]
将基质蛋白25固定化在多孔体20的细孔29内的方法没有特别限定，可根据基质蛋白和多孔体(或固定化在多孔体的接头分子)的特性等采用适宜的方法。例如，在细孔内固定化有蛋白A、蛋白G的多孔体上固定化抗体的情况下，通过混合多孔体的悬浮液和含有抗体的溶液，从而能够容易地将抗体固定化在细孔内。
多孔体与基质蛋白的量比可根据目的适当设定。例如，在对基质蛋白进行定量分析时，期望在多孔体上固定化试样中几乎全部的基质蛋白。因此，优选以相对于试样中的基质蛋白的估计含量、多孔体的量过剩的方式设定量比。
[蛋白酶]
蛋白酶15识别基质蛋白的氨基酸序列，对特定序列的特定结合进行选择性切断。本发明中，蛋白酶15在特定的氨基酸序列位点切断固定化在多孔体20的细孔29内的基质蛋白25，得到肽片段。
作为蛋白酶，可举出胰蛋白酶(在碱性氨基酸残基(Arg和Lys)的C末端侧切断肽)、赖氨酰肽链内切酶(在Lys残基的C末端侧切断肽)、精氨酸肽链内切酶(在Arg残基的C末端侧切断肽)、糜蛋白酶(在芳香族氨基酸残基(Phe、Tyr和Trp)的C末端侧切断肽)、V8蛋白酶(在Glu残基的C末端侧切断肽)、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。需要说明的是，蛋白酶也可组合2种以上使用。
在将蛋白酶消化后的基质蛋白的肽片段作为测定资料用于质谱时，优选使用自身消化少，切断序列的选择性高的蛋白酶。在使用市售的蛋白酶时，优选使用质谱等级、序列测定(序列)等级的蛋白酶。例如，已知源自生物体的天然胰蛋白酶由于产生通过自身消化显示糜蛋白酶样活性的伪胰蛋白酶，因而切断位点的特异性低。因此，作为质谱等级，市售的是对胰蛋白酶的赖氨酸残基进行还原甲基化并提高了耐自身消化性能的物质。
为了提高基质蛋白的蛋白酶消化的位置选择性，对蛋白酶可接近基质蛋白的区域进行限定是很重要的。因此，蛋白酶的分子直径优选小于基质蛋白的分子直径。更具体而言，蛋白酶的分子直径优选为10nm以下、更优选为8nm 以下、进而优选为6nm以下、特别优选为5nm以下。需要说明的是，胰蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶等分子量为30kDa左右的蛋白质的分子直径为4nm左右(参照前述的表1)。
在上述蛋白酶中，本发明中特别优选使用胰蛋白酶。如上所述，胰蛋白酶的分子直径小，且活性位点存在于分子的内部。因此，能够限制活性位点可接近基质蛋白的区域，能够提高蛋白酶消化的位置选择性。特别是，基质蛋白为抗体的情况下，作为蛋白酶优选使用胰蛋白酶。
在蛋白质组分析研究中，作为提高肽片段回收率的技术，近些年利用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶进行混合消化正受到关注(J.Proteome Res.,2012,11(11),5145-5156)。可认为该技术由以下原因引起：胰蛋白酶具有从立体结构的外侧进行阶段性分解反应的特征，与此相对，赖氨酰肽链内切酶主要在最初切断抗体的铰链部。对此，为了抑制切断抗体的铰链部、选择性地切断Fab结构域(更优选为Fab结构域的V区)，本发明中在单独使用胰蛋白酶、或组合使用赖氨酰肽链内切酶等的情况下，均优选使全部蛋白酶中的胰蛋白酶的量为90％以上。
[微粒]
对于微粒10，在其表面固定蛋白酶15，以控制蛋白酶接近固定化在多孔体20的细孔29内的基质蛋白25为目的而使用。因此，为了不让微粒10进入至多孔体20的细孔29的深处，其平均粒径D1优选大于多孔体20的平均孔径D2。微粒10的平均粒径D1更优选为多孔体20的平均孔径D2的1.2倍以上，进而优选为1.5倍以上，特别优选为1.8倍以上。
微粒10的形状没有特别限定，从蛋白酶向多孔体20的细孔29接近的均匀化的观点出发，优选为球状的微粒。另外，微粒10优选平均粒径均匀。
多孔体20的平均孔径为30～150nm左右时，微粒10的平均粒径D1优选为100nm以上、更优选为150nm以上。基质蛋白25为抗体、多孔体20的平均孔径为50nm～100nm左右时，微粒10的平均粒径优选为120nm以上、更优选为150nm以上、特别优选为170nm以上。微粒10的平均粒径D1的上限没有特别 限定，从提高利用蛋白酶的消化效率的观点出发，优选为1μm以下、更优选为500nm以下、进而优选为300nm以下。
微粒10只要是可将上述的蛋白酶固定化在表面的物质，则其材质没有特别限定，可适宜使用金属、树脂等。另外，也可使用用树脂覆盖金属表面而得到的微粒、或用金属覆盖树脂表面而得到的微粒等。
微粒10优选为抑制非特异性蛋白质吸附至表面、可选择性地固定化蛋白酶的物质，例如，如图1所示，优选使用微粒的表面用与蛋白酶特异性结合的间隔物11所修饰的微粒。间隔物优选为可与蛋白酶结合、且不会使蛋白酶失活的物质。
另外，从对固定化在微粒10表面的蛋白酶15的接近范围进行控制的观点出发，间隔物11优选为分子直径小的物质。间隔物的分子直径优选为5nm以下、更优选为3nm以下、进而优选为2nm以下。另外，间隔物的分子量优选为2000以下、更优选为1500以下、进而优选为1000以下、特别优选为800以下。在上述分子直径中，可固定化蛋白酶的间隔分子优选为非蛋白质、优选为具有氨基、酰胺基、酯基、环氧基、羧基、生物素、抗生物素蛋白、螯合物等官能团的分子。例如，胰蛋白酶的固定优选使用具有酯基的间隔物。另外，为了提高蛋白酶的固定化效率，作为间隔物也可优选使用酯基被活化的分子。
本发明中也可使用通过间隔分子修饰的微粒的市售品。例如，作为亲和纯化用微粒，作为商品名“FG beads NHS”市售有通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯基的间隔分子所修饰的微粒。
[蛋白酶固定化微粒的制备]
将蛋白酶15固定化在微粒10表面的方法没有特别限定，可根据蛋白酶和微粒(或修饰微粒表面的间隔分子)的特性等采用适宜的方法。例如，在将胰蛋白酶固定化在进行了间隔物修饰的微粒表面时，通过混合微粒的悬浮液和含有胰蛋白酶的溶液，从而可将蛋白酶固定化在微粒表面。
在微粒表面固定化蛋白酶之后，优选使微粒表面的未与蛋白酶结合的活 性部分失活。例如，若在微粒表面存在未固定化蛋白酶的间隔分子时，有时会产生以下不良情况：未结合的间隔分子与试样中的夹杂物等结合、对蛋白酶消化产生不良影响，或由蛋白酶消化所产生的肽片段被固定化在微粒上。在固定化蛋白酶后，对未结合的间隔物进行封闭，由此可抑制这样的不良情况。作为使未与蛋白酶结合的活性部分失活的方法，优选化学修饰。例如，活化酯基通过与胺的反应形成酰胺键而失活。
[蛋白酶消化]
通过使固定化有基质蛋白25的多孔体20与在表面固定化有蛋白酶15的微粒10在液体中接触，从而基质蛋白被蛋白酶消化而产生肽片段。
本发明中的蛋白酶消化的条件没有特别限定，可适宜采用与通常的蛋白酶消化相同的条件。例如，优选在将蛋白酶调节为最适pH附近的缓冲溶液中、在通常37℃左右的温度下培养4小时～20小时左右。
固定化有基质蛋白的多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒的混合重量比也没有特别限制，只要以为与基质蛋白的量对应的蛋白酶量的方式进行设定即可。需要说明的是，通常的蛋白酶消化条件为基质：蛋白酶＝100：1～20：1(重量比)左右。与此相对，本发明中通过组合多孔体和微粒，从而物理性地限制了基质蛋白与蛋白酶的接近，因此优选与通常的蛋白酶消化相比增大蛋白酶量。例如，优选为基质蛋白：蛋白酶＝30：1～3：1左右，更优选为15：1～4：1左右，进而优选为10：1～5：1左右。
通常，在对血液等生物体试样中的抗体进行选择性地蛋白酶消化时，首先，需要将固定化有蛋白G等的颗粒与试样进行混合，使抗体固定化在颗粒上，除去夹杂物之后，使抗体从颗粒洗脱，用尿素、胍对洗脱后的抗体进行改性并进行蛋白酶消化。而在本发明的方法中，以使抗体固定化在多孔体的状态下直接进行蛋白酶消化。另外，由于通过蛋白酶消化所产生的肽片段存在于液相内，所以在不进行抗体的洗脱、变性操作的情况下，能够位置选择性地得到Fab结构域的肽片段。如此，与现有方法相比，根据本发明的方法能够以简便的操作且位置选择性地进行肽片段回收。
[肽片段制备用试剂盒]
也可使用预先准备的肽片段制备用试剂盒，进行根据本发明的肽片段的制备。本发明的肽片段制备用试剂盒包含：具有能够固定化基质蛋白的细孔的多孔体和能够将蛋白酶固定化在表面的微粒。试剂盒也可以进一步包含蛋白酶。另外，也可以以在表面固定化有蛋白酶的状态提供微粒。
图3是表示本发明的肽片段制备试剂盒的一个实施方式的图。图3中，能够在表面固定化蛋白酶的微粒110以悬浮液131的形式提供。试剂盒也可进一步包含蛋白酶。另外，微粒110也可以以在表面固定化有蛋白酶的状态提供。离心柱132包括内容器135和外容器136，它们形成了可装卸的形状。在内容器135的底部配置有具有能够固定化基质蛋白的细孔的多孔膜120。多孔膜120具有在常压下不透过液体的程度的孔径。
在使用该离心柱进行肽片段的制备时，首先，将含有基质蛋白的试样(例如，血液等被检体)加入至离心柱的内容器135内，使试样与多孔膜接触。为了使试样与多孔膜均匀地接触，也可根据需要振荡容器。通过该操作将抗体等基质蛋白固定化在多孔膜120的细孔内。
将基质蛋白固定化于多孔膜之后的试样液体优选从内容器135排出。可利用移液等操作从内容器的开口部排出液体，也可通过离心分离等借助多孔膜从内容器的底部排出液体。之后，根据需要利用适宜的溶液进行洗涤。
在多孔膜120上固定化有基质蛋白的内容器135内加入在表面固定化有蛋白酶的微粒110。如上所述，蛋白酶可以以预先固定化在微粒上的状态提供，也可以在即将使用之前将蛋白酶固定化在微粒表面而使用。
以蛋白酶消化条件的最优化等为目的，可根据需要进一步加入缓冲液等溶液。固定化在内容器内的多孔膜120上的基质蛋白被固定化在微粒110表面上的蛋白酶消化。可如上所述那样适宜设定蛋白酶消化的条件。通过蛋白酶消化所产生的肽片段移动至液相内。
通过回收蛋白酶消化后的液相，从而可得到位置选择性地切断基质蛋白的肽片段。液相的回收方法没有特别限定，通过离心分离借助多孔膜从内容 器135的底部回收至外容器136内的方法简便。之后，以保持在多孔膜的细孔内的肽片段的洗脱等为目的，也可进行清洗、洗脱等操作等。
如此，通过使用试剂盒，可使根据本发明的肽片段制备的操作更简便，也可使利用装置的自动化更容易。特别是，对于胰蛋白酶等，由于即使处于被固定化在微粒表面的状态下也可保持活性，所以只要以蛋白酶被固定化在微粒表面的状态作为试剂盒的构成要素来提供，就可进一步简化肽片段制备的操作。
[分析]
通过利用色谱、质谱对含有如上得到的肽片段的试样进行分析，从而可进行基质蛋白的鉴定、定量。本发明中，由于位置选择性地蛋白酶处理基质蛋白，所以减少了试样中所含的肽片段的种类。因此，能够很容易地设定基于质谱等的分析条件。在进行分析时，也可根据需要在进行脱盐、增溶、萃取、浓缩、干燥等处理之后，对试样进行分析。
基于通过蛋白酶消化所产生的肽片段对基质蛋白进行鉴定、定量时，质谱是适宜的。由于质谱可确定氨基酸序列，因而能够辨别肽片段是否为源自抗体等特定蛋白质的肽片段。另外，基于峰强度能够确定试样中肽片段的浓度。
质谱中的离子化法没有特别限定，可采用电子电离化(EI)法、化学电离化(CI)法、场解吸(FD)法、快原子轰击(FAB)法、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)法、电喷雾离子化(ESI)法等。进行离子化后的试样的分析方法也没有特别限定，可根据离子化法适宜确定磁偏转型、四极(Q)型、离子阱(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)型等。另外，也可使用三重四级杆型质谱装置等进行MS/MS分析、或MS3以上的多级质谱。
为了使肽片段的分离更可靠、提高分析精度等，也可利用液相色谱(LC)、固相萃取(SPE)等对供于质谱前的试样进行分离/浓缩。在利用LC对试样进行分离时，作为质谱的前段也可使用具有LC的LC/MS，对来自LC的洗脱液直接进行离子化并供于质谱。也可通过组合了LC和串联质谱的LC/MS/MS、 LC/MSn进行分析。另外，也可对来自LC的洗脱液进行一次分级之后供于质谱。LC的柱、SPE的载体没有特别限定，可适宜选择使用通常用于肽的分析的C30、C18、C8、C4等疏水柱、亲水性亲合色谱用的载体等。
为了基于质谱结果对抗体等蛋白质进行鉴定，也可使用现有的数据库。由于本发明中使用了抗体等基质蛋白被位置特异性地蛋白酶消化所得到的肽片段，所以提高了通过数据库检索的命中率、数据的准确度。另外，通过利用多级质谱等对肽片段的氨基酸序列进行特定，从而也能够鉴定基质蛋白。例如，基质蛋白为抗体的情况下，只要能确定抗体中含有具有特异性氨基酸序列的互补性决定区(CDR)的至少一部分氨基酸序列的肽片段的氨基酸序列，即可鉴定抗体。
需要说明的是，在基于含有CDR的序列的特定肽片段的检测结果对抗体进行检测、定量时，检测对象的肽的氨基酸残基数优选为5～30左右、更优选为7～25左右。若氨基酸残基数过小，则难以与夹杂物或源自同一蛋白质的不同位点的肽片段区别，可能会成为导致误检等的原因。另外，若氨基酸残基数过大，则由于难以离子化等原因，存在检测变得困难、或定量性降低的情况。
在对基质蛋白的浓度进行定量时，可基于检测出的肽片段离子(多级MS的情况是通过肽片段离子的断裂而得到的碎片离子)的峰面积、峰强度，计算出基质蛋白的量。例如，根据预先求出的标准曲线(校准曲线)与峰面积的关联、在试样中添加的源自内标的峰面积与源自试样的峰面积的关联等，计算出试样中肽片段的浓度，基于肽片段浓度计算出基质蛋白的量、浓度。
如上述所说明，根据本发明，通过将基质蛋白和蛋白酶两者固定在固相上，物理性控制两者的接近，从而能够对基质蛋白的特定位点进行位置选择性地蛋白酶消化。可利用质谱法等已知方法对得到的肽片段进行分析，无需复杂的工序就可对试样中的蛋白质进行鉴定、定量。
本发明的方法特别适合于抗体的检测、定量，对Fab结构域进行选择性地蛋白酶消化，通过得到的肽片段试样的质谱，能够确定含有互补性决定区的氨基酸序列的肽片段的序列、量。另外，由于本发明的方法操作简便、且能确保再现性、定量性，同时也能自动化，因而也可适用于药代动力学分析、使用了抗原抗体反应的相互作用的解析、各种相互作用组解析、免疫沉淀蛋白的鉴定等基础研究。此外，也可期待应用于抗体药物等生物体分子药物的序列分析、质量保证、仿制药的等效性确认等。
实施例
以下，示出根据本发明的方法对人免疫球蛋白G(IgG)和曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)进行蛋白酶消化、将得到的肽片段试样供于质谱的实验例。需要说明的是，本发明并不限于以下的例子。
以下，％的记载只要没有特别说明，则表示重量％。本实验例中使用的试剂等如下所述。
胰蛋白酶(序列等级、promega)
赖氨酰肽链内切酶(质谱等级、和光纯药工业)
2-吗啉乙磺酸，(MES、同人化学)
2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES、同人化学)
三(羟甲基)氨基甲烷(Tris、和光纯药工业)
除上述试剂之外的有机溶剂等，没有特别记载的试剂从和光纯药工业获得。
另外，各缓冲液使用用精密pH计调节了pH后的以下缓冲液。
MES缓冲液：25mM MES-NaOH,pH 5.5
HEPES缓冲液：25mM HEPES-NaOH,pH 7.0
乙醇胺缓冲液：1M ethanolamine-HCl,pH 8.0
Tris缓冲液：25mM Tris-HCl,pH 8.0
＜抗体固定化多孔体的制作＞
在200μL MES缓冲液中加入在多孔珠的表面结合了蛋白G的树脂珠的悬浮液(Pierce Biotechnology,Protein G UltraLink resin,平均粒径:100μm、孔径:50～100nm)5μL，在其加入抗体溶液之后，在室温下缓慢搅拌约1小时， 使抗体结合在树脂珠表面的蛋白G上进行固定化。之后，在4℃下进行离心(15000rpm，1分钟)使树脂珠沉降，除去上清液之后，重复两次利用Tris缓冲液进行的洗涤和离心，使多孔珠悬浮在Tris缓冲液(200μL)中。需要说明的是，作为上述抗体溶液使用了人免疫球蛋白(IgG)溶液(10mg/mL,Sigma-Aldrich)和曲妥珠单抗(Herceptin,20mg/mL,中外制药)溶液。
＜蛋白酶固定化微粒的制备＞
使用了通过羧基被N-羟基琥珀酰亚胺活化的间隔物(参照下述化学式(L为与微粒表面的结合位点)、间隔物长度1nm)修饰平均粒径190nm的微粒表面而得到的蛋白酶固定化用纳米颗粒(多摩川精机，FG beads NHS)。
在4℃下对50μL FG珠的异丙醇悬浮液进行离心(15000rpm，5分钟)，使微粒沉降，除去上清液之后，用甲醇洗涤。将含有50μg蛋白酶的溶液溶解于200μL的HEPES缓冲液中，并将其加入上述微粒中，使微粒悬浮。需要说明的是，在悬浮时，以不使悬浮液温度上升的方式进行了几秒钟的超声波处理。
在4℃下搅拌该微粒的悬浮液30分钟，在4℃下进行离心(15000rpm，5分钟)使微粒沉降，除去上清液之后，加入200μL乙醇胺缓冲液使珠悬浮，在4℃下搅拌30分钟，利用乙醇胺对微粒表面剩余的N-羟基琥珀酰亚胺基进行封闭。之后，在4℃下进行离心(15000rpm，5分钟)使微粒沉降，除去上清液之后，重复两次利用Tris缓冲液进行的洗涤和离心，使其悬浮在Tris缓冲液(100μL)中。该悬浮液中的蛋白酶浓度为0.5μg/μL。
[实验1：在多孔体上的抗体固定化量的确认]
在抗体固定化多孔体的制作中，使相对于100μg的IgG的蛋白G结合树脂珠悬浮液的量在0～20μL的范围内变化，用SDS-PAGE电泳来分析上清液，基于电泳图谱条带像素数求出上清液中残留的未结合IgG的估算量(抗体余量)。 观察到随着蛋白G结合树脂珠量的增加、抗体余量下降的倾向，能够确认蛋白G结合树脂珠量为10μL时的抗体余量约为3％，几乎再现了蛋白G结合树脂珠的产品目录规范(数据未图示)。
[实验2：抗体和蛋白酶的量比的研究]
将IgG固定化多孔体悬浮液(蛋白G-IgG)和蛋白酶固定化微粒(FG珠-胰蛋白酶(FGbeads-Tripsin))混合，在37℃下缓慢搅拌15小时，同时进行蛋白酶消化。之后，在4℃下进行离心(15000rpm，5分钟)使树脂沉降，回收液相(上清液)。改变蛋白酶固定化微粒的量，使得蛋白酶的量成为5μg(水准1)、10μg(水准2)、25μg(水准3)，进行了上述实验。对于水准4～6，直接使用未固定化IgG的多孔体(蛋白G UltraLink resin)代替IgG固定化多孔体悬浮液，进行了相同的实验。另外，对于水准7、8，不使用多孔体，在37℃下仅培养蛋白酶固定化微粒(FG珠-胰蛋白酶)15小时。
将上述各实验的水准示于表2。表2中的重量(μg)是试样中蛋白质(IgG或胰蛋白酶)的量。将得到的上清液的SDS-PAGE电泳图谱示于图4。图4中，左端的泳道为分子量标记物。
[表2]
(质谱)
通过MALDI-TOFMS(岛津制作所，AXIMA Resonance MALDI-QIT TOF MS)分析了上述水准1～6的上清液。首先，在20μL上清液中以最终浓度为0.5％的方式添加三氟乙酸，使用疏水性树脂填充片(Millipore,ZipTip uC18)进行纯化之后，用1μL进行了两次洗脱。将洗脱液直接涂布在MALDI不锈钢靶板上，在净化工作台内使其风干。风干后，层叠涂布1μL10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHBA,岛津GLC,水/乙腈＝50/50)，进行质谱分析。需要说明的是，装置的m/z使用血管紧张素II肽(Angiotensin II peptide)(m/z＝1046.54,Sigma-Aldrich)和ACTH片段肽(ACTH fragment peptide)(m/z＝2465.20,Sigma-Aldrich)进行。将MS图谱示于图5。
图4的水准4～6的条带均与水准7、8的条带相同。另外，在图5的水准4～6中检测出的m/z＝842、1045、2211、2283的峰均为胰蛋白酶的自身消化片段。由这些结果可知，即便使蛋白酶固定化微粒与蛋白G多孔体接触，蛋白G也不会被消化。可认为其原因是：由于多孔体的孔径小于蛋白酶固定化微粒的粒径，所以固定化在微粒表面的胰蛋白酶无法接近细孔内的蛋白G。
在图5的水准1～3中，除了胰蛋白酶的自身消化片段之外，还检测出m/z＝835、913、1187、1287、1510、1678、1946的峰，并确认了这些峰均为IgG的胰蛋白酶消化肽片段。由该结果表明通过使固定化有IgG的多孔体与固定化有胰蛋白酶的微粒接触，从而能够选择性地消化IgG，而不会消化多孔体的蛋白G。
若比较图4的水准1～3，则可知随着胰蛋白酶量的增加，高分子一侧的条带减少，抗体的消化反应顺利地进行。另一方面，随着胰蛋白酶量的增加，自身消化也变得显著。根据这些结果，将水准2(基质：酶比率＝10：1)设定为标准条件，进行了以下研究。
需要说明的是，通常的蛋白酶消化条件为基质蛋白：蛋白酶＝100：1～20：1。本方法中通过组合多孔体和微粒，物理性地限制了基质蛋白与蛋白酶的接近，所以与通常的蛋白酶消化相比蛋白酶量变多，可推测最适合的基质酶比率为10：1～5：1左右。
[实验3：针对消化时间的回收肽的评价]
上述实验2的水准2的条件为：将IgG固定化多孔体悬浮液(IgG固相量100μg)和蛋白酶固定化微粒(胰蛋白酶固相量10μg)混合，将37℃下的消化时间设为(1)15分钟、(2)45分钟、(3)90分钟、(4)180分钟、(5)360分钟、(6)15小时(整夜、O/N)。除此之外，与上述实验2同样地进行了胰蛋白酶消化，对得到的试样进行了质谱分析。将MS图谱示于图6。
如图6所示，可知随着消化时间的增加，肽片段的峰增大，肽片段的回收量增加。若比较(5)360分钟和(6)整夜，则可观察到如下倾向：整夜的回收率高，尤其是m/z＝1187、1510、1678等容易受到蛋白酶消化的片段的集聚变得更加显著。然而，这些片段是源自抗体C区的片段，是无助于分析含有CDR的肽片段的物质。因此，将蛋白酶消化时间设定为6小时，进行了以下研究。
[实验4：曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化及质谱]
使用Herceptin代替IgG作为抗体制作抗体固定化多孔体，在上述实验2、3中所选择的条件下，即，在相对于100μg抗体固相量的蛋白酶固定微粒量：10μg、消化时间：6小时的条件下进行胰蛋白酶消化，并进行质谱分析，基于质谱结果进行了数据库(Mascot server)解析。如图7所示，可知以极其高的得分鉴定了Herceptin(链B、源自人源化抗P185-Her2抗体4d5的3个变体的抗原结合结构域的X射线结构、以及与分子模拟的比较(Chain B,X-RayStructures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of HumanizedAnti-P185-Her2Antibody 4d5And Comparison With Molecular Modeling))。
本实验中，为了确认通过质谱对Herceptin的肽片段进行检测，进行了更详细地分析。图8表示质谱(MALDI-TOFMS)图谱。
另外，通过LC-MS(岛津制作所,LCMS-8080Triple-quadrupole ultra high-performance liquid chromatography-MS)对消化后的上清液进行了分析。将LC-MS的色谱图示于图9、MS图谱示于图10。需要说明的是，在进行LC-MS的测定时，以最终浓度成为0.5％的方式在上清液中加入甲酸，使用其作为试样，LC条件如下所示。
＜HPLC溶液＞
溶液A：0.1％甲酸、1％乙腈/水溶液
溶液B：0.1％甲酸、乙腈溶液
＜柱＞
ShimPack ODS XR-ODS II(内径2mm、柱长50mm)
柱温：40℃
流速：0.4mL/分钟
注入量：20μL
＜梯度程序＞
0-2分钟：％B＝0
2-10分钟：％B＝0-40梯度
10-11分钟：％B＝40-98梯度
11-13分钟：％B＝98
13-13.5分钟：％B＝98-0梯度
13.5-15分钟：％B＝0
在曲妥珠单抗的重链(图11(A)，序列表的序列号1)和轻链(图11(B)，序列表的序列号2)中用下划线示出了在上述质谱中检测/鉴定出的肽序列部分。如图11(A)所示，可知重链的CDR1(序列表的序列号3)、CDR2(序列表的序列号4)、CDR3(序列表的序列号5)全部被检测出来。另外，如图11(B)所示，在轻链中CDR1(序列表的序列号6)和CDR2(序列表的序列号7)被检测出来。关于轻链的CDR3(序列表的序列号8)，含有该序列的胰蛋白酶消化片段的长度为4个氨基酸残基或37个氨基酸残基，无法得到适于质谱的片段，因此未能进行鉴定，但认为若改变蛋白酶的种类，就可制备可通过质谱检测出轻链的CDR3的肽片段。另外，在本实验中，虽然未能检测轻链的CDR3，但由于重链和轻链的总计6个CDR之中检测出5个，因此，如图7所示，通过数据库解析鉴定了曲妥珠单抗。
如上所述，可知由于利用本发明的方法制备的肽片段对抗体进行位置特 性蛋白酶消化，所以能够通过不需要设定复杂的测定条件的质谱测定来鉴定抗体。
[实验5：混合蛋白酶消化的研究]
以下，为了研究本发明的体系中的混合蛋白酶消化的可应用性，利用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶(Lys-C)的并用体系进行了蛋白酶消化实验。
与上述各实验例同样地，将在多孔体的蛋白G上固定化有100μg抗体(IgG或Herceptin)的抗体固定化多孔体、与固定化有10μg的蛋白酶的微粒在37℃下搅拌6小时，进行了抗体的蛋白酶消化。分别针对作为抗体使用IgG的情况和使用Herceptin的情况，将胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的比(重量比)设为(1)10：0、(2)9：1、(3)8：2、(4)0：10进行了实验，用SDS-PAGE电泳分别对消化后的上清液和多孔体表面的固定化成分进行了分析。将电泳图谱示于图12。图12中左端的泳道为分子量标记物。
与上述实验2同样地对使用Herceptin作为抗体时的上述水准1～4的消化后的上清液进行了质谱分析。将MS图谱示于图13。另外，基于质谱结果，与实验4同样地进行了基于Mascot server的数据库解析。需要说明的是，水准1(胰蛋白酶100％)与上述的实验4(图7和图8)相同。水准2～4的数据库解析结果如下所示(数据未图示)。
＜水准2：胰蛋白酶：赖氨酰肽链内切酶＝90：10＞
混合物(Mixture)
gi|442924质量:23708得分:117预期:4.9e-007匹配:13
链B、源自人源化抗P185-Her2抗体4d5的3个变体的抗原结合结构域的X射线结构、以及与分子模拟的比较
(gi|442924Mass:23708Score:117Expect:4.9e-007Matches:13
Chain B,X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains
From Three Variants Of Humanized Anti-P185-Her2Antibody 4d5AndComparison With Molecular Modeling)
gi|184747质量:36012得分:64预期:0.11匹配:10
免疫球蛋白γ-1重链恒定区[人类]
(gi|184747Mass:36012Score:64Expect:0.11Matches:10
immunoglobulin gamma-1heavy chain constant region[Homo sapiens])
＜水准3：胰蛋白酶：赖氨酰肽链内切酶＝80：20＞
混合物(Mixture)
gi|442924质量:23708得分:115预期:7.8e-007匹配:13
链B、源自人源化抗P185-Her2抗体4d5的3个变体的抗原结合结构域的X射线结构、以及与分子模拟的比较
(gi|442924Mass:23708Score:115Expect:7.8e-007Matches:13
Chain B,X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains
From Three Variants Of Humanized Anti-P185-Her2Antibody 4d5AndComparison With Molecular Modeling)
gi|184747质量:36012得分:54预期:1.1匹配:9
免疫球蛋白γ-1重链恒定区[人类]
(gi|184747Mass:36012Score:54Expect:1.1Matches:9
immunoglobulin gamma-1heavy chain constant region[Homo sapiens])
＜水准4：赖氨酰肽链内切酶100％＞
gi|184747质量:36012得分:71预期:0.021匹配:8
免疫球蛋白γ-1重链恒定区[人类]
(gi|184747Mass:36012Score:71Expect:0.021Matches:8
immunoglobulin gamma-1heavy chain constant region[Homo sapiens])
在组合使用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的水准2、3中，作为解析结果，除了Herceptin的抗原结合区域之外，还显示出了源自人的抗体的恒定区。另外，在仅使用赖氨酰肽链内切酶的水准4中，显示出不含Herceptin、仅显著地检测出抗体的恒定区的解析结果。
在图12的电泳图谱中，可知随着赖氨酰肽链内切酶比率的上升，有上清液的肽片段数增加、条带面积也增加的倾向，消化效率和肽回收率增大。另 外，在图13中，随着赖氨酰肽链内切酶比率的上升，检测出的肽片段的种类、量也增加。然而，可知在水准2～4中新检测出的肽片段多源自Herceptin的Fc结构域，蛋白酶消化的位置选择性(选择性地消化Fab结构域的特性)降低。
从这些结果可知，虽然随着赖氨酰肽链内切酶的用量增大，抗体的消化效率提高，但蛋白酶消化的位置选择性降低，伴随恒定区的肽片段的产生量增大，V区的肽片段的相对产生量减少，因此出现抗体的检测/鉴定精度降低的倾向。因此，从根据本发明的方法对抗体的Fab结构域进行位置选择性的切断、对CDR进行特异性检测的观点出发，可以说优选单独使用胰蛋白酶，在组合使用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的情况下，优选使赖氨酰肽链内切酶的混合量为10％以下。
需要说明的是，在仅使用了赖氨酰肽链内切酶的水准4中未进行位点特异性消化，而在仅使用了胰蛋白酶的水准1(实验4)中，通过数据库解析有效地检测出了CDR，由此可知Fab结构域的V区被选择性地蛋白酶消化。根据上述结果，可以说表明了在基质蛋白为抗体的情况下，只要使用胰蛋白酶并应用本发明，就能够适当控制针对抗体的蛋白酶的空间接近，能够进行位置选择性的蛋白酶消化。
另外，表明了在根据本实验组合使用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶的情况下，可切断固定化在细孔内的基质蛋白而不会使各蛋白酶丧失其功能。由于抗体的V区存在于分子的前端，所以在赖氨酰肽链内切酶的用量增加时，会出现位置特异性降低的倾向，但暗示了在使用其它蛋白质作为基质的情况下，利用蛋白酶的并用体系实现提高位置选择性、消化效率的可能性。
以上，如各实验例中所示，可知根据本发明能够以简便的方法对抗体等蛋白质进行位置选择性地蛋白酶消化，从而得到肽片段试样，得到的肽片段试样适合于基于质谱的蛋白质的鉴定、检测。
附图标记说明
10 微粒
11 间隔物
15 蛋白酶
20 多孔体
21 接头分子
25 基质蛋白
29 细孔
110 微粒
120 多孔膜
131 微粒悬浮液
132 离心柱
135 内容器
136 外容器

Claims (14)

1.一种肽片段的制备方法，其特征在于，具有如下步骤：
基质固定步骤，在多孔体的细孔内固定化切断对象的基质蛋白；和
消化步骤，使固定化有基质蛋白的所述多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒在液体中接触，进行所述基质蛋白的蛋白酶消化，
所述微粒的平均粒径大于所述多孔体的平均孔径。
2.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，在所述基质固定步骤中，所述基质蛋白的规定区域被固定化于所述多孔体上，与所述规定区域不同的区域位置选择性地被蛋白酶消化。
3.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，在所述多孔体的细孔内固定化有与所述基质蛋白进行位点特异性地相互作用的接头分子，
在所述基质固定步骤中，所述基质蛋白借助所述接头分子固定化在所述多孔体的细孔内。
4.根据权利要求3所述的肽片段的制备方法，其中，在所述基质固定步骤后，所述接头分子与所述基质蛋白结合后的状态的分子大小为所述多孔体的孔径的0.5倍～1.5倍。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的肽片段的制备方法，其中，所述微粒的表面被能够与所述蛋白酶结合的间隔分子修饰，所述蛋白酶借助所述间隔分子固定化在所述微粒的表面。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的肽片段的制备方法，其中，所述基质蛋白为抗体。
7.根据权利要求6所述的肽片段的制备方法，其中，所述抗体为单克隆抗体。
8.根据权利要求6所述的肽片段的制备方法，其中，在所述基质固定步骤中，在所述多孔体上固定化所述抗体的Fc结构域，
在所述消化步骤中，利用所述蛋白酶位置选择性地切断所述抗体的Fab结构域。
9.根据权利要求1～4中任一项所述的肽片段的制备方法，其中，所述蛋白酶为胰蛋白酶。
10.根据权利要求1～4中任一项所述的肽片段的制备方法，其中，所述多孔体的平均孔径为30～150nm，所述微粒的平均粒径为100nm以上。
11.一种肽片段制备用试剂盒，其特征在于，其用于权利要求1～10中任一项所述的方法，
其包含：具有能够固定化基质蛋白的细孔的多孔体和能够将蛋白酶固定化在表面的微粒，
所述微粒的平均粒径大于所述多孔体的孔径。
12.根据权利要求11所述的肽片段制备用试剂盒，其中，所述微粒以在表面固定化有蛋白酶的状态提供。
13.一种分析方法，其利用质谱法对根据权利要求1～10中任一项所述的方法制备的肽片段进行分析。
14.根据权利要求13所述的分析方法，其中，分析对象的肽片段为含有抗体的互补性决定区的至少一部分氨基酸序列的肽片段。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015033479A1 (ja) 2013-09-09 2015-03-12 株式会社島津製作所 ペプチド断片の調製方法およびそれに用いられるペプチド断片調製用キット、ならびに分析方法
BR112017017854A2 (pt) 2015-03-09 2018-04-10 Shimadzu Corporation método para detecção de anticorpo monoclonal utilizando espectrometria de massa
US20180052172A1 (en) * 2015-03-10 2018-02-22 Shimadzu Corporation Kit for preparing sample for detecting monoclonal antibody
WO2016194114A1 (ja) * 2015-06-01 2016-12-08 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の定量方法
US20180231563A1 (en) * 2015-08-03 2018-08-16 Shimadzu Corporation Method for parallel quantification of protein variant
EP3480577A4 (en) * 2016-06-30 2020-07-29 Shimadzu Corporation SET OF CONTAINERS AND SAMPLE PREPARATION PROCESS USING IT
JPWO2018025346A1 (ja) * 2016-08-03 2019-05-23 株式会社島津製作所 ペプチド断片の調製方法およびそれに用いられるプロテアーゼの調製方法、ならびにペプチド断片調製用キット
JPWO2018167847A1 (ja) * 2017-03-14 2020-01-23 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の同時定量方法
US11619616B2 (en) 2017-06-22 2023-04-04 Shimadzu Corporation Method for quantifying monoclonal antibody having antigen or anti-antibody bonded thereto
US11085856B2 (en) 2017-09-15 2021-08-10 Thermo Finnigan Llc Method and product for preparing a protein-containing sample for analysis by mass spectrometry
US20210003587A1 (en) * 2017-12-28 2021-01-07 Shimadzu Corporation Method for improving monoclonal antibody detection results
JP6835260B2 (ja) * 2017-12-28 2021-02-24 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の簡素化された定量方法
WO2019226347A1 (en) * 2018-05-24 2019-11-28 Sigma-Aldrich Co. Llc Quantitative analysis of proteins
GB2607739B (en) * 2018-06-06 2023-04-05 Bruker Daltonics Gmbh & Co Kg Targeted protein characterization by mass spectrometry
JPWO2022270126A1 (zh) 2021-06-23 2022-12-29

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370518A (zh) * 2005-01-28 2009-02-18 盖伦生物公司 免疫活性组合物
CN101541822A (zh) * 2006-09-21 2009-09-23 维莱尼姆公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071409A (en) * 1976-05-20 1978-01-31 Corning Glass Works Immobilization of proteins on inorganic support materials
GB8902770D0 (en) * 1989-02-08 1989-03-30 Bioprocessing Ltd Improvements in or relating to supports for immunoaffinity separations
GB0006046D0 (en) * 2000-03-13 2000-05-03 Univ Warwick Time of flight mass spectrometry apparatus
NZ524065A (en) 2000-07-18 2005-02-25 Invitrogen Corp Device and methods for subdividing and filtering gel material and extracting molecules therefrom
AU2003221671A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving and deglycosylating antibodies to promote ligand binding
DE102004021351A1 (de) * 2004-04-23 2005-11-17 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Funktionalisierter poröser Träger für Mikroarrays
US7258990B2 (en) * 2004-08-19 2007-08-21 Biocept, Inc. Alleviation of non-specific binding in microarray assays
CA2499657A1 (en) * 2005-03-03 2006-09-03 Richard Oleschuk Polymer entrapped particles
EP1958006B1 (en) * 2005-11-10 2011-05-11 Microsoft Corporation Discover biological features using composite images
US20100015652A1 (en) * 2006-12-21 2010-01-21 Brian Walter Granda Antibody quantitation
US8074494B2 (en) * 2007-12-10 2011-12-13 Proxeon Biosystems A/S Plugged flow 2D chromatography
US8592555B2 (en) * 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
JP2011130749A (ja) 2009-12-25 2011-07-07 Bio Matrix Research Inc 抗体のフラグメント化促進剤
CA2829606C (en) * 2011-03-09 2020-06-02 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
WO2015033479A1 (ja) * 2013-09-09 2015-03-12 株式会社島津製作所 ペプチド断片の調製方法およびそれに用いられるペプチド断片調製用キット、ならびに分析方法
BR112017017854A2 (pt) * 2015-03-09 2018-04-10 Shimadzu Corporation método para detecção de anticorpo monoclonal utilizando espectrometria de massa
JP6835260B2 (ja) * 2017-12-28 2021-02-24 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の簡素化された定量方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370518A (zh) * 2005-01-28 2009-02-18 盖伦生物公司 免疫活性组合物
CN101541822A (zh) * 2006-09-21 2009-09-23 维莱尼姆公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

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US11650210B2 (en) 2023-05-16
US10539571B2 (en) 2020-01-21
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