ES2649147T3 - Método para preparar fragmentos de péptidos, kit para preparar fragmentos de péptidos que se van a emplear en el mismo y método de análisis - Google Patents

Abstract

Un método para preparar fragmentos de péptidos, que comprende: una etapa de inmovilización del sustrato, para inmovilizar una proteína sustrato que se va proteolizar en los poros de un cuerpo poroso; y una etapa de proteolisis, para proteolizar la proteína sustrato con una proteasa poniendo en contacto entre sí el cuerpo poroso que presenta la proteína sustrato inmovilizada sobre él y micropartículas que presentan la proteasa inmovilizada sobre su superficie, en un líquido, en el que el diámetro promedio de partícula de las micropartículas es mayor que el diámetro promedio de poro del cuerpo poroso.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para preparar fragmentos de peptidos, kit para preparar fragmentos de peptidos que se van a emplear en el mismo y metodo de analisis

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar fragmentos de peptidos por medio de proteolizar de modo selectivo de sitio una protema, tal como un anticuerpo, empleando una proteasa, y un kit para preparar fragmentos de peptidos que se van a emplear en el. Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para analizar fragmentos de peptidos, que comprende la preparacion de dichos fragmentos mediante el metodo, y en analisis mediante espectrometna de masas para detectar o cuantificar una protema.

La demanda de farmacos de anticuerpos ha crecido con rapidez y la simple cuantificacion de la concentracion de un anticuerpo en la sangre ha adquirido importancia en la practica clmica. Hasta la fecha, la medicion precisa de la concentracion de un farmaco de anticuerpo en la sangre despues de la administracion no se ha considerado importante. Sin embargo, las mediciones de la concentracion de un anticuerpo en la sangre han adquirido un caracter fundamental en los ensayos clmicos, o similares, de farmacos de anticuerpos, puesto que se ha descubierto que, en ensayos clmicos realizados para expandir la aplicacion del trastuzumab (nombre comercial: Herceptin) al cancer gastrico, se observaron diferencias significativas en la concentracion del trastuzumab en sangre y la supervivencia global. Por ejemplo, tambien se requiere la identificacion de un farmaco de anticuerpo o la cuantificacion de la concentracion de un farmaco de anticuerpo en sangre para el control de calidad, tal como la determinacion farmacocinetica, la confirmacion de la identidad con farmacos originales en ensayos clmicos para farmacos genericos, o similares.

El ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay", ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) que emplea una reaccion de antfgeno-anticuerpo resulta excelente en especificidad y cuantitabilidad y, por tanto, se emplea mucho en ensayos clmicos o similares, por ejemplo, en la deteccion y la cuantificacion de un antfgeno o un anticuerpo en sangre. Sin embargo, el ELISA es un metodo previsto para detectar una unica protema (antfgeno o anticuerpo) y, por tanto, no puede detectar muchas protemas diferentes al mismo tiempo. Para detectar muchas protemas mediante ELISA, es necesario preparar un anticuerpo espedfico para cada diana de deteccion y ajustar las condiciones para medir la concentracion del anticuerpo espedfico, lo cual requiere mucho tiempo y coste. Ademas, el ELISA emplea una reaccion de antfgeno-anticuerpo y, por tanto, se sabe que presenta un problema, que consiste en que la reactividad cruzada con un farmaco o metabolito coadministrado puede influir en el resultado de una medicion, y asf es difteil aplicar ELISA a algunos farmacos de anticuerpos para analizar un especimen conservado o similar.

Por esta razon, ha surgido una demanda para el desarrollo de un metodo analftico generalmente aplicable a diversos anticuerpos. Con el desarrollo de la proteomica, se ha desarrollado una tecnica por la cual protemas pueden detectarse y cuantificarse a fondo mediante espectrometna de masas. En anos recientes, tambien ha resultado posible el analisis de una macrobiomolecula, tal como un anticuerpo. En la espectrometna de masas, una molecula que se va a medir debe ionizarse. Por tanto, una macrobiomolecula, tal como un anticuerpo, a menudo resulta difteil de analizar directamente mediante la espectrometna de masas. Por esta razon, se adopta un metodo en el que una protema se proteoliza (se fragmenta) mediante digestion con una proteasa, de entre los fragmentos de peptidos se selecciona un fragmento de peptido que tiene una secuencia de aminoacidos espedfica de la protema que se va a analizar, y este fragmento de peptido seleccionado se detecta y se cuantifica mediante un espectrometro de masas. Para mejorar la eficacia de la digestion, la digestion con la proteasa en general se realiza despues de desnaturalizar una protema sustrato en una disolucion de urea o guanidina a alta concentracion.

Cuando una protema, tal como un anticuerpo, se fragmenta mediante una digestion con proteasas para realizar una espectrometna de masas, resulta importante detectar selectivamente un fragmento de peptido sujeto. Sin embargo, en algunos casos, es difteil detectar un fragmento de peptido espedfico derivado de una protema que se va a analizar en una muestra biologica que contiene una amplia diversidad de impurezas. De modo mas espedfico, una muestra biologica, tal como sangre, contiene una amplia diversidad de impurezas y, por tanto, cuando se anade una proteasa a una muestra biologica, las protemas derivadas de las impurezas tambien se someten a la digestion con la proteasa, de modo que produce un numero enorme de fragmentos de peptidos. Para detectar y cuantificar selectivamente, dentro de estos fragmentos de peptidos, un fragmento de peptido diana derivado de una diana de deteccion (por ejemplo, un anticuerpo espedfico), es necesario que los fragmentos de peptidos, por ejemplo, se separen o se concentren antes de someterlos a una espectrometna de masas. Ademas, cuando un fragmento de peptido, que tiene una secuencia de aminoacidos en comun con un fragmento de peptido derivado de una protema que se va a detectar, se produce a partir de una protema que no es una diana de deteccion, puede aparecer una deteccion falsa o una reduccion en la cuantitabilidad. Por esta razon, la seleccion de un fragmento de peptido que se va detectar tiende a ser mas difteil a medida que aumenta el numero de fragmentos de peptidos producidos a partir de una muestra biologica.

A la vista de tal complejidad de una muestra biologica, se ha desarrollado un metodo en el que una protema espedfica en una muestra compleja, tal como una muestra biologica, se cuantifica sometiendo la muestra a un espectrometro de masas despues de una purificacion mediante cromatograffa lfquida ("liquid chromatography", LC), o mediante espectrometna de masas de multiples etapas, en la que la ruptura ionica es provocada por la disociacion

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inducida por colision ("collision-induced dissociation", CID) o similares, o mediante una combinacion de estos ("multiple reaction monitoring", MRM, control de multiples reacciones). Sin embargo, a medida que una muestra se hace mas compleja, es necesario combinar diversos modos de separacion, lo cual provoca problemas, de modo que es necesario un aparato experimental de alta precision y mucho tiempo para ajustar las condiciones analfficas.

Ademas, aunque se emplee una muestra purificada, se producen una serie de fragmentos de peptidos por la digestion con proteasas a partir de una macroprotema, tal como un anticuerpo. Por tanto, un fragmento de peptido que tiene una secuencia de aminoacidos espedfica para una diana de deteccion tiende a ser diffcil de detectar selectivamente y cuantificar en los fragmentos de peptidos producidos. A la vista de estos problemas, se ha desarrollado un metodo en el que una protema que se va a analizar se somete a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio para reducir el numero (de tipos) de fragmentos de peptidos en una muestra para mejorar la precision del analisis y simplificar el proceso de analisis. Por ejemplo, el documento de patente 1 propone un metodo en el que un anticuerpo se somete a una digestion con pepsina para producir un fragmento F(ab')2, y despues el fragmento F(ab')2 posteriormente se digiere con una proteasa, tal como tripsina, para producir fragmentos de peptidos que contienen la region determinante de la complementariedad ("complementarity determining region", CDR) del anticuerpo, y los fragmentos de peptidos que contienen CDR se detectan y se cuantifican mediante espectrometna de masas.

A continuacion se describira la estructura de un anticuerpo. Todos los anticuerpos presentan dos cadenas pesadas (cadenas H) y dos cadenas ligeras (cadenas L). Una cadena ligera y una cadena pesada estan unidas a traves de un enlace disulfuro (S-S) para formar un heterodfmero, y los dos heterodfmeros tambien estan unidos a traves de dos enlaces disulfuro para formar un heterotetramero con forma de "Y" (vease la figura 2). Un anticuerpo tiene un dominio Fc (“F”, fragmento; “c”, cristalizable) que comprende cadenas pesadas y dos dominios Fab (“F”, fragmento; “ab”, de union al anffgeno [“antigen binding”]) que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y el dominio Fc y los dominios Fab estan unidos entre sf a traves de una region bisagra.

El dominio Fc de un anticuerpo fundamentalmente tiene la funcion de iniciar una reaccion despues de que el anticuerpo se haya unido a un anffgeno (funcion de efector), y la mayona de los anticuerpos derivados de la misma especie tienen una secuencia de aminoacidos comun en el dominio Fc. Por otra parte, el extremo (en el lado N- terminal) del dominio Fab tiene la funcion de unirse a un anffgeno. La parte N-terminal del dominio Fab cambia diversamente con respecto su secuencia de aminoacidos para ser capaz de unirse a diversos anffgenos. Esta region se denomina region variable (region V), y la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada se denominan region VL y region VH, respectivamente. Los dominios Fab y Fc distintos de la region V se denominan region constante (region C) que vana poco con respecto a la secuencia de aminoacidos. La region constante de la cadena ligera se denomina region CL, y la region constante de la cadena pesada se denomina region CH. La region CH se divide ademas en tres regiones, region CH1, region CH2 y region CH3. El dominio Fab de la cadena pesada comprende la region VH y la region CH1, y el dominio Fc de la cadena pesada comprende CH2 y CH3. La region bisagra se localiza entre CH1 y CH2.

La especificidad (es decir, la capacidad de union espedfica a un anffgeno) de un anticuerpo se determina mediante la combinacion de las secuencias de aminoacidos de la region V. La cadena ligera y la cadena pesada tienen, cada una, regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en la region V del dominio Fab. La CDR tambien se denomina region hipervariable y vana con respecto a la secuencia de aminoacidos dependiendo del tipo de anticuerpo. Existen 3 CDR en cada cadena pesada y ligera de un anticuerpo (6 tipos de CDR en total), que crean la diversidad que permite que el anticuerpo se una a diversos anffgenos. En otras palabras, las CDR son regiones que caracterizan un anticuerpo y, por tanto, un anticuerpo puede identificarse identificando las secuencias de aminoacidos de sus CDR.

Tal como se describio anteriormente, los dominios Fab y el dominio Fc de un anticuerpo estan unidos a traves de una region bisagra. La papama, que es un tipo de proteasa, proteoliza la region bisagra y, por tanto, la digestion con papama de un anticuerpo produce dos dominios Fab y un dominio Fc. Ademas, la pepsina, que es un tipo de proteasa, proteoliza uno de los dos enlaces disulfuro, es decir, el enlace disulfuro del lado del domino Fc (lado C- terminal) de la region bisagra y, por tanto, la digestion con pepsina produce un dominio F(ab')2 que tiene dos dominios Fab unidos entre sf y muchos fragmentos del dominio Fc.

En el metodo descrito en el documento de patente 1, se produce un dominio Fab o un dominio F(ab')2 por la digestion con pepsina o la digestion con papama, y el dominio Fab o el dominio F(ab')2 se somete a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio. Este metodo puede reducir el numero de peptidos producidos por la proteolisis con proteasas y, por tanto, puede producir con eficacia peptidos que contienen CDR, lo cual simplifica la deteccion y la cuantificacion de un anticuerpo mediante espectrometna de masas. Ademas, el documento de patente 2 indica que el uso combinado de pepsina o papama y un ion espedfico mejora la eficacia de la proteolisis con dicha proteasa.

Esta disponible en el mercado un kit de purificacion, o similar, que presenta una proteasa optimizada para purificar el dominio Fab de un anticuerpo. Sin embargo, en el metodo descrito en el documento de patente 1, el tratamiento con proteasas debe realizarse despues de la purificacion del dominio Fab o dominio F(ab')2 y, por tanto, resulta mucho mas largo y costoso preparar una muestra para ser sometida a una espectrometna de masas. Por esta razon, es diffcil decir que este metodo sea un metodo simple. Ademas, la eficacia de la proteolisis con proteasas

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(fragmentacion) varta dependiendo del tipo de protema sustrato que se va a proteolizar y, por tanto, resulta importante mejorar la eficacia de la proteolisis para simplificar la preparacion de una muestra de fragmented de peptidos que va a someterse a una espectrometna de masas.

En anos recientes, ha atratelo la atencion un metodo en el que la digestion con proteasas se realiza en un microentorno (microrreactor), tal como nanopartteulas, puesto que el metodo puede mejorar la eficacia de la digestion con proteasas. Por ejemplo, el documento que no es patente 1 indica un ejemplo en el que la eficacia de la digestion de la albumina con tripsina aumenta haciendo pasar una disolucion de albumina a traves de una membrana porosa de nailon que presenta tripsina inmovilizada en sus poros. El documento que no es patente 2 indica que una protema que tiene un peso molecular pequeno puede someterse selectivamente a una digestion con tripsina empleando sflice mesoporosa que presenta tripsina inmovilizada en sus poros. Esta previsto que ambos metodos hagan reaccionar a una protema sustrato en una fase lfquida con una proteasa inmovilizada en los poros de un cuerpo poroso como fase solida. Se considera que la razon por la cual la eficacia de la digestion aumenta inmovilizando una proteasa sobre una fase solida en un microentorno es debida a una mayor probabilidad de reaccion entre la protema sustrato y la proteasa. En un microentorno local en la interfase entre la fase solida y la fase lfquida, es probable que la protema este desnaturalizada, y la solubilidad, la gama de fluctuacion de la estructura tridimensional, o similar, se ve perturbada. Por tanto, es probable que aumenten las oportunidades de contacto entre la protema sustrato y la proteasa para aumentar la probabilidad de reaccion.

Documento de patente 1: WO 2008/079914

Documento de patente 2: JP 2011-130749 A

Documento que no es patente 1: Fei Xu et al., Anal. Chem., 2010, 82, 10045-10051

Documento que no es patente 2: Qianhao Min et al., Chem. Commun., 2010, 46(33), 6144-6146

El metodo descrito en el documento que no es patente 2 puede lograr la digestion con proteasas selectiva de una protema que tiene un peso molecular pequeno, pero no puede aplicarse a la digestion selectiva de una protema grande, tal como un anticuerpo. Ademas, no se ha desarrollado ningun metodo para realizar la proteolisis con proteasas selectiva de sitio empleando un microrreactor como el descrito en el documento que no es patente 1 o 2.

Tal como se describio anteriormente, para simplificar la deteccion y la cuantificacion de una protema mediante espectrometna de masas, la protema que se va a analizar debe proteolizarse de modo selectivo de sitio para producir, de forma eficaz, un fragmento de peptido espedfico de la protema que se va a analizar y para reducir la cantidad de otros fragmentos de peptidos producidos. Por ejemplo, para detectar y analizar cuantitativamente un anticuerpo, el dominio Fab, en especial la region V del dominio Fab, debe someterse a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio para suprimir la proteolisis del dominio Fc.

Los inventores han realizado un estudio a fondo para descubrir que la inmovilizacion de una protema sustrato, tal como un anticuerpo, y de una proteasa sobre fases solidas permite lograr una proteolisis con proteasas selectiva de sitio de la protema sustrato. Este descubrimiento ha conducido a la presente invencion.

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar fragmentos de peptidos por medio de proteolizar una protema con una proteasa. El metodo de la presente invencion incluye una etapa de proteolizar una protema sustrato con una proteasa poniendo en contacto entre sf un cuerpo poroso, en el que una protema sustrato que se va a proteolizar esta inmovilizada en sus poros, y micropartteulas que presentan una proteasa inmovilizada sobre su superficie, en un lfquido (etapa de proteolisis). El cuerpo poroso sobre el cual la protema sustrato que se va a proteolizar esta inmovilizada en sus poros se obtiene mediante una etapa de inmovilizar una protema sustrato que se va a proteolizar en los poros de un cuerpo poroso (etapa de inmovilizacion del sustrato). En la presente invencion, un diametro promedio de partteula de las micropartteulas es preferiblemente mayor que un diametro promedio de poro del cuerpo poroso.

Cuando el diametro de partteula de las micropartteulas es mayor que el diametro promedio de poro del cuerpo poroso, la proteasa inmovilizada sobre la superficie de las micropartteulas puede acceder a las partes someras de los poros y la vecindad del cuerpo poroso (la interfase entre el cuerpo poroso y la fase lfquida y su vecindad), pero no puede acceder a las partes profundas de los poros. De esta forma, la region accesible de la protema esta ffsicamente (espacialmente) limitada y, por tanto, la proteasa accede selectivamente a un sitio espedfico de la protema sustrato inmovilizada en los poros del cuerpo poroso. Esto hace posible lograr una proteolisis (fragmentacion) con proteasas selectiva de sitio de la protema sustrato.

En la presente invencion, una region predeterminada de la protema sustrato preferiblemente se inmoviliza sobre el cuerpo poroso. En esta realizacion, la region inmovilizada sobre el cuerpo poroso esta localizada en las partes profundas de los poros, de modo que una region diferente de la region inmovilizada esta localizada cerca de las partes someras de los poros. Cunado una region diferente del sitio de proteolisis selectiva de la protema sustrato, es decir, una region que se prefiere que no se someta a una proteolisis con proteasas, esta inmovilizada sobre el cuerpo poroso, la proteasa inmovilizada sobre la superficie de las micropartteulas accede al sitio de proteolisis selectiva de la protema sustrato localizado cerca de las partes someras de los poros, de modo que se realiza la

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proteolisis con la proteasa. Esto permite lograr una proteolisis con proteasas selectiva de sitio en un sitio deseado de la protema sustrato.

Una molecula conectora capaz de realizar una interaccion espedfica de sitio con una protema sustrato preferiblemente se inmoviliza en los poros del cuerpo poroso. La protema sustrato se inmoviliza en los poros del cuerpo poroso preferiblemente a traves de la molecula conectora. Los ejemplos de moleculas conectoras empleadas cuando la protema sustrato es un anticuerpo incluyen protema G y protema A. Esta molecula conectora se une de modo espedfico de sitio con la region Fc del anticuerpo y, por tanto, la region Fc del anticuerpo se inmoviliza sobre el cuerpo poroso, de modo que la region Fab del anticuerpo se localiza cerca de las partes someras de los poros. Segun esta realizacion, la region Fab del anticuerpo puede someterse a una proteolisis con proteasas selectiva.

Cuando la molecula conectora esta inmovilizada en los poros del cuerpo poroso, una molecula, en la que la molecula conectora se une a la protema sustrato, preferiblemente tiene un tamano de 0,5 veces a 1,5 veces el diametro promedio de poro del cuerpo poroso. Este ajuste del tamano molecular permite aumentar la probabilidad de acceso de la proteasa inmovilizada sobre la superficie de las micropartmulas al sitio de ruptura selectiva de la protema sustrato, mejorando con ello la selectividad de sitio de la proteolisis con proteasas.

Se prefiere que la superficie de las micropartmulas se modifique con una molecula espaciador capaz de unirse con la proteasa, y la proteasa se inmoviliza sobre la superficie de las micropartmulas a traves de la molecula espaciadora. La inmovilizacion de la proteasa a traves de la molecula espaciador hace posible suprimir el desprendimiento de la proteasa de la superficie de las micropartmulas, mejorando con ello la selectividad de sitio de la proteolisis con proteasas. Ademas, el ajuste del tamano molecular del espaciador permite a la proteasa acceder selectivamente a una posicion deseada en la protema sustrato para mejorar la selectividad de sitio.

En la presente invencion, la proteasa que se va a inmovilizar sobre la superficie de las micropartmulas es preferiblemente tripsina o una combinacion de tripsina y otra proteasa. Cuando la protema sustrato es un anticuerpo, la tripsina se emplea preferiblemente sola o en una combinacion de proteasas. Cuando se emplean proteasas en una combinacion, la cantidad de tripsina es preferiblemente 90% o mas de la cantidad total de proteasas. En particular, cuando la protema sustrato es un anticuerpo, el dominio Fab tiende a someterse a una proteolisis con proteasas selectiva empleando tripsina, de modo que se suprime la proteolisis por proteasas del dominio Fc.

El diametro promedio de poro del cuerpo poroso es preferiblemente de aproximadamente 30 a 150 nm, y el diametro promedio de partmula de las micropartmulas es preferiblemente de 100 nm o mayor. En particular, cuando la protema sustrato es un anticuerpo y el diametro promedio de poro y el diametro promedio de partmula estan dentro de los anteriores intervalos, la region Fab puede proteolizarse de modo selectivo de sitio de una manera mas fiable.

La presente invencion tambien se refiere a un kit para la preparacion de fragmentos de peptidos empleados para el metodo anterior. El kit de preparacion de fragmentos de peptidos de la presente invencion incluye un cuerpo poroso que tiene poros capaces de inmovilizar una protema sustrato, y micropartmulas capaces de inmovilizar una proteasa sobre su superficie. Las micropartmulas pueden proporcionarse en un estado en el que la proteasa esta inmovilizada sobre su superficie. El cuerpo poroso del kit y una muestra (por ejemplo, un especimen, tal como sangre) se ponen en contacto entre sf de modo que la sustancia sujeto (una protema sustrato, tal como un anticuerpo) en la muestra puede inmovilizarse en los poros del cuerpo poroso. La protema sustrato se somete a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio poniendo en contacto entre sf el cuerpo poroso despues de la inmovilizacion de la protema sustrato, y las micropartmulas que presentan la proteasa inmovilizada sobre su superficie, en un lfquido.

Los fragmentos de peptidos obtenidos por el metodo anterior se analizan mediante espectrometna de masas o similar, lo cual permite detectar (identificar) o cuantificar la protema sustrato. En la presente invencion, la protema sustrato se somete a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio y, por tanto, puede reducirse significativamente el numero de tipos de fragmentos de peptidos contenidos en una muestra de medicion. Por tanto, el ajuste de las condiciones de medicion de la espectrometna de masas puede simplificarse y tambien se espera que la precision del analisis mejore.

Por ejemplo, cuando la protema sustrato es un anticuerpo, el metodo segun la presente invencion puede lograr una proteolisis con proteasas selectiva de sitio de la region Fab que contiene una region determinante de complementariedad y, por tanto, puede producirse un fragmento de peptido que contiene al menos parte de la secuencia de la region determinante de la complementariedad del anticuerpo, como diana de deteccion. La region determinante de la complementariedad tiene una secuencia de aminoacidos espedfica en cada anticuerpo. Por tanto, el anticuerpo puede detectarse o cuantificarse analizando el fragmento de peptido que contiene la secuencia de la region determinante de la complementariedad.

Segun la presente invencion, una protema, tal como un anticuerpo, puede someterse a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio por medio de un metodo simple para obtener fragmentos de peptidos. Cuando el metodo segun la presente invencion se aplica a un anticuerpo, se suprime la proteolisis de la region Fc del anticuerpo, y la region Fab que contiene la CDR se somete a una proteolisis con proteasas selectiva y, por tanto, la concentracion del fragmento de peptido que contiene la secuencia de aminoacidos de CDR, que es importante para la identificacion del anticuerpo, en una muestra aumenta.

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El metodo segun la presente invencion permite reducir significativamente el numero de tipos de peptidos contenidos en una muestra de medicion. Por tanto, el ajuste de las condiciones de la espectrometna de masas puede simplificarse y tambien se espera que la precision del analisis mejore. Tambien puede cuantificarse la concentracion de un farmaco de anticuerpo en sangre analizando los fragmentos de peptido obtenidos Por tanto, el metodo segun la presente invencion tambien puede aplicarse como metodo de pretratamiento para un sistema para medir la concentracion de un farmaco de anticuerpo en un ensayo preclmico o clmico.

Ademas, el metodo segun la presente invencion puede aplicarse no solo a farmacos de anticuerpos, sino tambien a muchas protemas y, por tanto, puede esperarse que se aplique ampliamente en la industria farmaceutica. Ademas, tambien puede esperarse que el metodo segun la presente invencion se aplique, por ejemplo, en el campo de la investigacion fundamental, tal como en el analisis interactivo de biomoleculas.

En las figuras:

La figura 1 es un diagrama conceptual para ilustrar el principio de la proteolisis selectiva de sitio segun la presente invencion.

La figura 2 es un diagrama esquematico que ilustra la estructura de un anticuerpo.

La figura 3 es un diagrama esquematico de una realizacion de un kit para preparar fragmentos de peptidos.

La figura 4 muestra los patrones electroforeticos obtenidos en un experimento para estudiar la proporcion cuantitativa de una proteasa.

La figura 5 muestra los espectros de masas (MALDI-TOFMS) obtenidos en el experimento para estudiar la proporcion cuantitativa de una proteasa.

La figura 6 muestra los espectros de masas (MALDI-TOFMS) obtenidos en un experimento para estudiar el tiempo de proteolisis.

La figura 7 muestra el resultado del analisis de una base de datos basandose en el resultado de una espectrometna de masas de fragmentos tnpticos de trastuzumab.

La figura 8 muestra un espectro de masas (MALDI-TOFMS) de fragmentos tnpticos de trastuzumab.

La figura 9 muestra cromatogramas del analisis LC-MS de fragmentos tnpticos de trastuzumab.

La figura 10 muestra los espectros de masas (LS-MS) de fragmentos tnpticos de trastuzumab.

Las figuras 11(A) y 11(B) muestran las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera de trastuzumab, respectivamente, en las que los fragmentos de peptidos identificados mediante espectrometna de masas en este experimento estan subrayados.

La figura 12 muestra los patrones electroforeticos obtenidos en un experimento para estudiar la proteolisis con proteasas mixta.

La figura 13 muestra los espectros de masas (MALDI-TOFMS) obtenidos en el experimento para estudiar la proteolisis con proteasas mixta.

Segun un metodo para preparar fragmentos de peptidos de la presente invencion, una protema sustrato que se va a proteolizar se inmoviliza en poros de un cuerpo poroso, y el cuerpo poroso que presenta la protema sustrato inmovilizada sobre el se pone en contacto, en un lfquido, con micropartmulas que presentan una proteasa inmovilizada sobre su superficie. La figura 1 es un diagrama conceptual para ilustrar el principio de la proteolisis con proteasas en la presente invencion.

Sobre la superficie de micropartmulas 10 (diametro promedio de partmula D1), se inmoviliza una proteasa 15. Un cuerpo poroso 20 tiene una pluralidad de poros 29 (diametro promedio de poro D2), y una protema sustrato 25 esta inmovilizada en los poros. En el metodo segun la presente invencion, tal como se describio anteriormente, tanto la proteasa 15 como la protema sustrato 25 se inmovilizan sobre fases solidas en una microrregion, y se realiza la proteolisis con proteasas poniendo en contacto las fases solidas.

El diametro promedio de partmula D1 de las micropartmulas 10 es mayor que el diametro promedio de poro D2 del cuerpo poroso 20. Por tanto, las micropartmulas 10 pueden acceder a las partes someras de los poros 29 y su vecindad, pero no pueden acceder a las partes profundas de los poros 29. Como resultado, la proteasa 15 inmovilizada sobre la superficie de las micropartmulas 10 no puede acceder a las partes profundas de los poros 29. En la figura 1, una lmea de puntos cerca de los poros 29 indica el lfmite de la region accesible para la proteasa 15.

De esta forma, la accesibilidad de la proteasa 15 a la protema sustrato 25 en los poros 29 esta limitada de forma selectiva de sitio, de modo que aumenta la probabilidad relativa de accesibilidad de la proteasa 15 al lado de la fase

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Kquida (sitio en forma de "Y" en la figura 1) de la protema sustrato. Esto permite someter la protema sustrato 25 a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio para obtener fragmentos de peptidos

Protema sustrato

La protema sustrato 25 es una protema que se va a analizar. El tipo de protema sustrato no esta particularmente limitada. Sin embargo, desde el punto de vista de realizar la proteolisis selectiva de sitio, la protema sustrato preferiblemente tiene un diametro molecular mayor que el de la proteasa 15. La protema sustrato puede ser un complejo de protemas. Con respecto al diametro molecular, esta disponible un valor determinado basandose en el analisis estructural mediante rayos X o RMN en diversos documentos o bases de datos. Por ejemplo, el diametro molecular de un anticuerpo es de aproximadamente 15 nm. Como alternativa, el diametro molecular puede determinarse, por ejemplo, mediante dispersion de angulo pequeno de rayos X o puede calcularse aproximadamente a partir de un peso molecular. Como ejemplos de referencia, la tabla 1 muestra los pesos moleculares y los diametros moleculares de protemas empleadas como moleculas marcadoras para determinar las propiedades de separacion de una membrana de ultrafiltracion.

Tabla 1

protema

peso molecular [Da] diametro molecular [nm]

sacarosa

340 1,1

rafinosa

590 1,3

vitamina B12

1.360 1,7

bacitracina

1.410 1,7

insulina

5.700 2,7

citocromo C

13.400 3,8

mioglobina

17.000 4,0

a-quimotripsinogeno

25.000 4,6

pepsina

35.000 5,0

ovoalbumina

43.000 5,6

albumina bovina

67.000 6,4

aldolasa

142.000 8,2

Y-globulina

150.000 8,4

La protema sustrato 25 es preferiblemente una protema que pueda unirse de modo espedfico de sitio dentro de los poros 29 del cuerpo poroso 20. La union espedfica de sitio de la protema sustrato 25 permite someter otro sitio distinto al sitio de union a una proteolisis con proteasas selectiva. Por ejemplo, una protema que porta, en su extremo C- o N-terminal, una secuencia marcadora, tal como un marcador His (un peptido marcador que contiene aproximadamente 6 restos histidina continuos) o un peptido biotinilado, una enzima que se une espedficamente a un sustrato espedfico o similares, tambien puede utilizarse como protema que puede unirse de modo espedfico de sitio.

En la presente invencion, un anticuerpo se emplea de modo particularmente preferible como protema sustrato que puede unirse de modo espedfico de sitio dentro de los poros del cuerpo poroso. La inmovilizacion del dominio Fc del anticuerpo sobre el cuerpo poroso 20 permite someter el dominio Fab del anticuerpo a una proteolisis con proteasas selectiva. Aunque el tipo de anticuerpo no esta particularmente limitado, se prefiere un anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos humanos, tales como panitumumab (Vectibix), ofatumumab (Arzerra), golimumab (Simponi), e ipilimumab (Yervoy); anticuerpos humanizados, tales como tocilizumab (Actemra), trastuzumab (Herceptin), bevacizumab (Avastin), omalizumab (Xolair), mepolizumab (Bosatria), gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg), palivizumab (Synagis), ranibizumab (Lucentis), certolizumab (Cimzia), ocrelizumab, mogamulizumab (Poteligeo), y eculizumab (Soliris); y anticuerpos quimericos, tales como rituximab (Rituxan), cetuximab (Erbitux), infliximab (Remicade), y basiliximab (Simulect). Estos anticuerpos se emplean como farmacos de anticuerpos (farmacos dirigidos de modo molecular), y las concentraciones de los anticuerpos en sangre deben cuantificarse en ensayos clmicos y similares.

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Tal como se describira a continuacion con referencia a los ejemplos, segun el metodo de la presente invencion, el dominio Fab del anticuerpo monoclonal puede someterse a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio para obtener fragmentos de peptidos, y el anticuerpo puede identificarse y cuantificarse mediante espectrometna de masas de los fragmentos de peptidos obtenidos. El metodo de analisis segun la presente invencion es un metodo en el que fragmentos de peptidos derivados de la region variable del anticuerpo se detectan para identificar (detectar) o cuantificar el anticuerpo, es decir, un metodo en el que los fragmentos de peptidos derivados del anticuerpo se miden directamente. Por tanto, el metodo de analisis segun la presente invencion no requiere una sustancia de union espedfica, tal como un antigeno, y, por tanto, puede aplicarse independientemente del tipo de anticuerpo. Por tanto, el metodo segun la presente invencion puede aplicarse no solo a los anticuerpos mencionados anteriormente, sino tambien a anticuerpos monoclonales recientemente desarrollados.

Cuerpo poroso

El material del cuerpo poroso 20 no esta particularmente limitado, con la condicion de que el material tenga poros 29. Aunque los poros mostrados en la figura 1 tienen forma semiesferica, la forma de los poros no esta particularmente limitada. Tambien puede emplearse un cuerpo poroso con agujeros que lo atraviesan, tal como una membrana porosa.

Para el cuerpo poroso 20 puede utilizarse carbono activado, una membrana porosa, esferas de resina porosa, partmulas metalicas o similares. Entre estos, se prefiere un cuerpo poroso que se una espedficamente con la protema sustrato, y se prefiere particularmente un cuerpo poroso que pueda unirse de modo espedfico de sitio con la protema sustrato. Por ejemplo, las esferas de carga de columnas de afinidad empleadas para purificar una protema espedfica o similares pueden cumplir dicho requisito.

El cuerpo poroso 20 preferiblemente empleado en la presente invencion es un cuerpo poroso en el que una molecula conectora 21 que puede interaccionar de modo espedfico de sitio con la protema sustrato 25 esta inmovilizada en sus poros 29. Los ejemplos de la interaccion entre la protema sustrato y la molecula conectora incluyen los enlaces qmmicos, enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, formacion de complejos, interaccion hidrofoba, interaccion de van der Waals, interaccion electrostatica, e interaccion estereoselectiva.

La molecula conectora optima puede seleccionarse de modo apropiado, dependiendo del tipo o sitio de union de la protema sustrato, de grupos funcionales, tales como un grupo amino, un grupo carboxilo, y un grupo epoxi; compuestos marcadores, tales como biotina y digoxigenina; protemas, tales como avidina, estreptavidina, protema A, protema G, e inmunoglobulina; diversos ligandos; compuestos sustrato para enzimas; sflice; y quelatos de metales.

Se emplea preferiblemente protema G, protema A o similares como la molecula conectora 21 cuando la protema sustrato 25 es un anticuerpo. La protema A o la protema G se une de modo espedfico de sitio con el dominio Fc del anticuerpo. El uso del cuerpo poroso 20 que presenta la molecula conectora 2l, tal como protema A o protema G, inmovilizada en los poros 29 permite que el dominio Fc del anticuerpo (protema sustrato 25) sea inmovilizado de modo espedfico de sitio en los poros, de forma que el dominio Fab del anticuerpo esta localizado en el lado de la fase lfquida (cerca de las partes someras de los poros). Esta inmovilizacion del anticuerpo en los poros en una direccion concreta controla la orientacion del anticuerpo en los poros y, por tanto, el dominio Fab puede proteolizarse de modo selectivo de sitio con la proteasa.

Ademas, cuando la protema sustrato se inmoviliza en los poros para que este presente en un microentorno en la interfase entre la fase solida y la fase lfquida, es probable que la protema sustrato se desnaturalice y que se alteren las fluctuaciones moleculares, de modo que aumenta la probabilidad de ser atacada por la proteasa. Ademas, en la presente invencion, la proteasa se inmoviliza sobre las partmulas y, por tanto, se crea un entorno en el que la proteasa es estericamente estable y es menos probable que se produzca una autolisis. Se considera que esto aumenta la estabilidad de la proteasa. Por tanto, segun el metodo de la presente invencion, puede realizarse una proteolisis con proteasas selectiva de sitio y, ademas, puede mantenerse una alta actividad de la proteasa.

El tamano de los poros 29 del cuerpo poroso 20 no esta particularmente limitado. El tamano de los poros preferiblemente se determina tomando en consideracion el diametro molecular de la protema sustrato, etc., de modo que el extremo de la protema sustrato, es decir, el sitio que se va proteolizar de modo selectivo, se localice cerca de las partes someras de los poros 29 cuando la protema sustrato 25 se inmoviliza. El diametro promedio de poro D2 del cuerpo poroso 20 se ajusta de modo apropiado para que este en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 10 nm a 500 nm y para que sea menor que el diametro promedio de partmula D1 de las micropartmulas 10. El diametro promedio de poro D2 del cuerpo poroso 20 es, por ejemplo, preferiblemente de aproximadamente 20 nm a 200 nm, mas preferiblemente de aproximadamente 30 nm a 150 nm. En particular, cuando la protema sustrato 25 es un anticuerpo, para inmovilizar el dominio Fc del anticuerpo en los poros para someter el dominio Fab del anticuerpo a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio, el diametro de poro del cuerpo poroso es preferiblemente de 30 nm a 150 nm, mas preferiblemente de 40 nm a 120 nm, aun mas preferiblemente de 50 nm a 100 nm.

El tamano de la molecula conectora se selecciona tomando en consideracion el tamano de los poros o el tamano de la protema sustrato, de modo que el sitio de la proteolisis selectiva de la protema sustrato se localice cerca de las

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partes someras de los poros. El tamano de una molecula en la que la molecula conectora se une a la protema sustrato, es preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 1,5 veces, mas preferiblemente de aproximadamente 0,6 a 1,2 veces, aun mas preferiblemente de aproximadamente 0,7 a 1,1 veces, en particular preferiblemente de aproximadamente 0,8 a 1 veces el diametro de poro del cuerpo poroso. Cuando la molecula conectora no esta inmovilizada sobre el cuerpo poroso 20 y la protema sustrato se une directamente dentro de los poros del cuerpo poroso, el diametro molecular de la protema sustrato y el diametro de poro del cuerpo poroso preferiblemente cumplen la anterior relacion.

Inmovilizacion de la protema sustrato

El metodo para inmovilizar la protema sustrato 25 en los poros 29 del cuerpo poroso 20 no esta particularmente limitado, y puede adoptarse un metodo apropiado dependiendo de las propiedades de la protema sustrato y el cuerpo poroso (o la molecula conectora inmovilizada sobre el cuerpo poroso), etc. Por ejemplo, cuando el cuerpo poroso presenta protema A o protema G inmovilizada en sus poros, el anticuerpo puede inmovilizarse con facilidad en los poros mezclando una suspension del cuerpo poroso y una disolucion que contiene el anticuerpo.

La proporcion cuantitativa entre el cuerpo poroso y la protema sustrato puede ajustarse de modo apropiado dependiendo del objetivo. Por ejemplo, en el caso del analisis cuantitativo de la protema sustrato, se desea que casi la cantidad completa de la protema sustrato en una muestra se inmovilice sobre el cuerpo poroso. Por tanto, la proporcion cuantitativa se ajusta preferiblemente de modo que la cantidad del cuerpo poroso sea mayor que la cantidad calculada de la protema sustrato contenida en la muestra.

Proteasa

La proteasa 15 reconoce la secuencia de aminoacidos de la protema sustrato y proteoliza selectivamente un enlace especifico en una secuencia espedfica. En la presente invencion, la protema sustrato 25 se inmoviliza en los poros 29 del cuerpo poroso 20, y la proteasa 15 proteoliza la protema sustrato 25 en un sitio espedfico de la secuencia de aminoacidos, de modo que se obtienen fragmentos de peptidos.

Los ejemplos de proteasa incluyen tripsina (que proteoliza un peptido en el lado C-terminal de restos aminoacidos basicos (Arg y Lys)), lisil endopeptidasa (que proteoliza un peptido en el lado C-terminal de un resto Lys), arginina endopeptidasa (que proteoliza un peptido en el lado C-terminal de un resto Arg), quimotripsina (que proteoliza un peptido en el lado C-terminal de restos aminoacidos aromaticos (Phe, Tyr, y Trp)), proteasa V8 (que proteoliza un peptido en el lado C-terminal de un resto Glu), pepsina, y papama. Pueden emplearse dos o mas de estas proteasas en combinacion.

Cuando los fragmentos de peptidos de la protema sustrato despues de la proteolisis con proteasas se someten a una espectrometna de masas como una muestra de medicion, la proteasa que se va a utilizar preferiblemente es una proteasa con baja autolisis y alta selectividad por una secuencia que se va a proteolizar. Cuando se emplea una proteasa disponible en el mercado, se emplea preferiblemente una proteasa de calidad de espectrometna de masas o una proteasa de calidad de secuenciacion. Por ejemplo, se sabe que la tripsina nativa procedente de un cuerpo vivo tiene baja especificidad para un sitio de proteolisis, porque se genera pseudotripsina, que muestra una actividad similar a la quimotripsina, debido a la autolisis. Por tanto, esta disponible en el mercado una tripsina de calidad de espectrometna de masas que logra una alta resistencia a la autolisis debido a la metilacion reductora de los restos lisina de la tripsina.

Para mejorar la selectividad de sitio de la proteolisis con proteasas de la proteasa sustrato, es importante limitar la region en la cual la proteasa puede acceder a la protema sustrato. Por tanto, el diametro molecular de la proteasa es preferiblemente mas pequeno que el de la protema sustrato. De modo mas espedfico, el diametro molecular de la proteasa es preferiblemente 10 nm o menor, mas preferiblemente 8 nm o menor, preferiblemente 6 nm o menor, en particular preferiblemente 5 nm o menor. Una protema que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa, tal como tripsina o lisil endopeptidasa, tiene un diametro molecular de aproximadamente 4 nm (vease la anterior tabla 1).

Entre las proteasas mencionadas anteriormente, la tripsina se emplea preferiblemente en particular en la presente invencion. Tal como se describio anteriormente, la tripsina tiene un diametro molecular pequeno y su sitio activo esta presente dentro de su molecula. Esto limita la region en la cual el sitio activo puede acceder a la protema sustrato, lo cual permite mejorar la selectividad de sitio de la proteolisis con proteasas. En particular, cuando la protema sustrato es un anticuerpo, la proteasa que se va a utilizar es preferiblemente tripsina.

En estudios de analisis de proteoma, la digestion con una combinacion de tripsina y lisil endopeptidasa ha atrafdo la atencion en anos recientes como tecnica para mejorar la tasa de recuperacion de fragmentos de peptidos (J. Proteome Res., 2012, 11(11), 5145-5156). Se considera que la razon de esto es que la tripsina tiene la propiedad de permitir que una reaccion de descomposicion avance en etapas desde el exterior de una estructura esterica, y una lisil endopeptidasa primero proteoliza principalmente la region bisagra de un anticuerpo. Por otra parte, en la presente invencion, se prefiere utilizar la tripsina por sf sola, o cuando se emplea la lisil endopeptidasa o similar en combinacion con tripsina, la cantidad de tripsina es preferiblemente 90% o mayor que la cantidad total de proteasas utilizadas, para suprimir la proteolisis de la region bisagra de un anticuerpo y para proteolizar selectivamente el

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dominio Fab (mas preferiblemente, la region V del dominio Fab) del anticuerpo.

Micropartmulas

Las micropartmulas 10 se emplean para inmovilizar la proteasa 15 sobre su superficie para controlar la accesibilidad de la proteasa a la protema sustrato 25 inmovilizada en los poros 29 del cuerpo poroso 20. Por tanto, el diametro promedio de partmula Di de las micropartmulas 10 es preferiblemente mayor que el diametro promedio de poro D2 del cuerpo poroso 20, de modo que las micropartmulas 10 no entran en la parte profunda de los poros 29 del cuerpo poroso 20. El diametro promedio de partmula D1 de las micropartmulas 10 es preferiblemente 1,2 veces o mas, aun mas preferiblemente 1,5 veces o mas, en particular preferiblemente 1,8 veces o mas el diametro promedio de poro D2 del cuerpo poroso 20.

Aunque la forma de las micropartmulas 10 no esta particularmente limitada, se prefieren las micropartmulas esfericas desde el punto de vista de igualar la accesibilidad de la proteasa a los poros 29 del cuerpo poroso 20. Ademas, las micropartmulas 10 preferiblemente tienen un diametro promedio de partmula uniforme.

Cuando el diametro promedio de poro del cuerpo poroso 20 es de aproximadamente 30 a 150 nm, el diametro promedio de partmula D1 de las micropartmulas 10 es preferiblemente 100 nm o mayor, mas preferiblemente 150 nm o mayor. Cuando la protema sustrato 25 es un anticuerpo, y el diametro promedio de poro del cuerpo poroso 20 es de aproximadamente 50 nm a 100 nm, el diametro promedio de partmula de las micropartmulas 10 es preferiblemente 120 nm o mayor, mas preferiblemente 150 nm o mayor, en particular preferiblemente 170 nm o mayor. El lfmite superior del diametro promedio de partmula D1 de las micropartmulas 10 no esta particularmente limitado, pero preferiblemente es 1 pm o menor, mas preferiblemente 500 nm o menor, aun mas preferiblemente 300 nm o menor, desde el punto de vista de mejorar la eficacia de la proteolisis con proteasas.

El material de las micropartmula 10 no esta particularmente limitado, con la condicion de que la proteasa pueda inmovilizarse sobre su superficie, y de forma apropiada se emplea un metal, una resina o similares. Como alternativa, puede emplearse un material obtenido revistiendo la superficie de un metal con una resina, un material obtenido mediante el revestimiento de la superficie de la resina con un metal, o similares.

Las micropartmulas 10 preferiblemente tienen una superficie capaz de suprimir la adsorcion de protemas no espedfica y de inmovilizar selectivamente la proteasa sobre ella. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1, se emplean de forma adecuada micropartmulas cuya superficie se modifica mediante un espaciador 11 que puede unirse espedficamente con la proteasa. El espaciador es preferiblemente un espaciador que pueda unirse con la proteasa y que no desactive la proteasa.

Ademas, desde el punto de vista de controlar los lfmites de accesibilidad de la proteasa 15 inmovilizada sobre la superficie de las micropartmulas 10, el espaciador 11 preferiblemente tiene un diametro molecular pequeno. El diametro molecular del espaciador es preferiblemente 5 nm o menor, mas preferiblemente 3 nm o menor, aun mas preferiblemente 2 nm o menor. Ademas, el peso molecular del espaciador es preferiblemente 2000 o menor, mas preferiblemente 1500 o menor, aun mas preferiblemente 1000 o menor, en particular preferiblemente 800 o menor. La molecula espaciadora que tiene un diametro molecular dentro del anterior intervalo y que es capaz de inmovilizar la proteasas preferiblemente no es una protema y preferiblemente contiene un grupo funcional, tal como un grupo amino, un grupo amida, un grupo ester, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, biotina, avidina, o un quelato. Por ejemplo, el espaciador empleado preferiblemente para inmovilizar la tripsina contiene un grupo ester. Ademas, tambien se emplea preferiblemente como espaciador una molecula que presenta un grupo ester activado para mejorar la eficacia de la inmovilizacion de la proteasa.

En la presente invencion, tambien pueden emplearse micropartmulas disponibles en el mercado modificadas con una molecula espaciadora. Por ejemplo, en el mercado estan disponibles micropartmulas modificadas con una molecula espaciadora que presenta un grupo ester activado por N-hidroxisuccinimida como micropartmulas para la purificacion por afinidad con el nombre comercial de "FG beads NHS".

Preparacion de las micropartmulas con proteasa inmovilizada

El metodo para inmovilizar la proteasa 15 sobre la superficie de las micropartmulas 10 no esta particularmente limitado, y puede adoptarse un metodo apropiado dependiendo de las propiedades de la proteasa y de las micropartmulas (o de la molecula espaciadora que modifica la superficie de las micropartmulas), etc. Por ejemplo, cuando se inmoviliza la tripsina sobre la superficie de las micropartmulas modificadas con el espaciador, se mezcla una suspension de las micropartmulas y una disolucion que contiene tripsina. De esta forma, la proteasa puede inmovilizarse sobre la superficie de las micropartmulas.

Despues de inmovilizar la proteasa sobre la superficie de las micropartmulas, preferiblemente se desactivan las porciones activas que no se unen con la proteasa sobre la superficie de las micropartmulas. Por ejemplo, si la molecula espaciadora que no presenta la proteasa inmovilizada sobre ella esta presente sobre la superficie de las micropartmulas, puede aparecer el problema de que la molecula espaciadora sin unir se una a una impureza, o similar, en una muestra de modo que la proteolisis con la proteasa se vea afectada de modo adverso, el problema de que los fragmentos de peptidos producidos por la proteolisis con la proteasa se inmovilicen sobre las

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micropartmulas, o similares. Estos problemas se evitan bloqueando el espaciador no unido despues de la inmovilizacion de la proteasa. La desactivacion de las porciones activas que no se unen con la proteasa preferiblemente se realiza mediante modificacion qmmica. Por ejemplo, un grupo ester activado se desactiva formando un enlace amida a traves de una reaccion con una amina.

Proteolisis con proteasas

La protema sustrato se somete a una proteolisis con proteasas poniendo en contacto entre sf el cuerpo poroso 20 que presenta la protema sustrato 25 inmovilizada sobre el y las micropartmulas 10 que presentan la proteasa 15 inmovilizada sobre su superficie, en un lfquido, de modo que se producen fragmentos de peptidos.

En la presente invencion, la condicion de la proteolisis de la proteasa no esta particularmente limitada y pueden adoptarse de modo apropiado condiciones similares a las de la digestion con proteasas general. Por ejemplo, la proteolisis con proteasas preferiblemente se realiza mediante una incubacion en una disolucion tampon que tiene un pH ajustado a aproximadamente el valor de pH optimo de la proteasa a una temperatura habitualmente de aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 4 horas a 20 horas.

La proporcion de mezcla cuantitativa entre el cuerpo poroso que presenta la protema sustrato inmovilizada sobre el y las micropartmulas que presentan la proteasa inmovilizada sobre su superficie tampoco esta particularmente limitada, y puede ajustarse de modo que la cantidad de la proteasa sea apropiada para la cantidad de la protema sustrato. Se advertira que la digestion con proteasa generalmente se realiza en condiciones en las que la proporcion (proporcion en peso) de protema sustrato:proteasa = aproximadamente 100:1 a 20:1. Por otra parte, en la presente invencion, la cantidad de la proteasa es preferiblemente mayor que la que se emplea en general en la digestion con proteasas, porque el acceso entre la protema sustrato y la proteasa esta ffsicamente limitado debido al uso combinado del cuerpo poroso y las micropartmulas. Por ejemplo, la proporcion de protema sustrato:proteasa es preferiblemente de aproximadamente 30:1 a 3:1, mas preferiblemente de aproximadamente 15:1 a 4:1, aun mas preferiblemente de aproximadamente 10:1 a 5:1.

En general, cuando un anticuerpo en una muestra biologica, tal como sangre, se somete a una digestion con proteasas selectiva, la digestion con proteasas debe realizarse despues de que la muestra primero se mezcle con partmulas que presentan protema G o similar inmovilizada sobre ellas para inmovilizar el anticuerpo a las partmulas, se retiren las impurezas y despues se eluya el anticuerpo de las partmulas y se desnaturalice con urea o guanidina. Por contraste, en el metodo segun la presente invencion, la proteolisis con proteasas se realiza en un estado en el que el anticuerpo se mantiene inmovilizado sobre el cuerpo poroso. Ademas, los fragmentos de peptidos producidos por la proteolisis con proteasas estan presentes en una fase lfquida y, por tanto, los fragmentos de peptidos del dominio Fab del anticuerpo pueden obtenerse de modo selectivo de sitio sin realizar una elucion o desnaturalizacion del anticuerpo. De esta forma, segun el metodo de la presente invencion, los fragmentos de peptidos pueden recuperarse de forma selectiva de sitio mediante una operacion mas sencilla, comparado con el metodo convencional.

Kit para preparar fragmentos de peptidos

Los fragmentos de peptidos pueden prepararse empleando un kit previamente preparado para preparar fragmentos de peptidos segun la presente invencion. El kit para preparar fragmentos de peptidos segun la presente invencion comprende un cuerpo poroso que tiene poros capaces de inmovilizar una protema sustrato, y micropartmulas capaces de inmovilizar una proteasa sobre su superficie. El kit puede comprender ademas una proteasa. Las micropartmulas pueden proporcionarse en un estado en el que una proteasa este inmovilizada sobre su superficie.

La figura 3 es un diagrama que muestra una realizacion del kit para preparar fragmentos de peptidos segun la presente invencion. En la figura 3, las micropartmulas 110 capaces de inmovilizar una proteasa sobre su superficie se proporcionan como una suspension 131. El kit puede comprender ademas una proteasa. Las micropartmulas 110 pueden proporcionarse en un estado en el que una proteasa este inmovilizada sobre su superficie. Una columna de centrifugacion 132 comprende un recipiente interno 135 y un recipiente externo 136, y estos estan configurados para estar unidos de modo que puedan separarse. Al fondo del recipiente interno 135 se proporciona una membrana porosa 120 que presenta poros capaces de inmovilizar una protema sustrato. La membrana porosa 120 tiene un diametro de poro tal que evita que un lfquido permee la membrana porosa 120 a una presion normal.

Cuando se preparan fragmentos de peptidos empleando una columna de centrifugacion, una muestra (por ejemplo, un especimen, tal como sangre) que contiene una protema sustrato primero se coloca en el recipiente interno 135 de la columna de centrifugacion para poner en contacto la muestra con la membrana porosa. Si es necesario, el recipiente puede agitarse para que la muestra establezca un contacto uniforme con la membrana porosa. Esta operacion permite que la protema sustrato, tal como un anticuerpo, se inmovilice en los poros de la membrana porosa 120.

El lfquido de muestra, despues de la inmovilizacion de la protema sustrato sobre la membrana porosa, preferiblemente se retira del recipiente interno 135. El lfquido puede retirarse por la abertura del recipiente interno mediante manipulacion, tal como pipeteado, o puede salir por el fondo del recipiente interno a traves de la membrana porosa mediante centrifugacion o similar. Despues, si es necesario, se realiza un lavado con una

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disolucion apropiada.

Las microparffculas 110 que presentan una proteasa inmovilizada sobre su superficie se anaden al recipiente interno 135 provisto con la membrana porosa 120 que presenta la protema sustrato inmovilizada sobre ella. Tal como se describio anteriormente, la proteasa puede inmovilizarse previamente sobre las microparffculas o puede inmovilizarse sobre la superficie de las microparffculas justo antes del uso.

Si es necesario, puede anadirse despues una disolucion, tal como un tampon, para, por ejemplo, optimizar las condiciones de la proteolisis con proteasas. La protema sustrato inmovilizada sobre la membrana porosa 120 en el recipiente interno es proteolizada por la proteasa inmovilizada sobre la superficie de las microparffculas 110. Tal como se describio anteriormente, las condiciones de la proteolisis con proteasas pueden ajustarse de modo apropiado. Los fragmentos de peptidos producidos por la proteolisis con proteasas migran hacia la fase lfquida.

Los fragmentos de peptidos producidos mediante la proteolisis selectiva de sitio de la protema sustrato se obtienen recuperando la fase ffquida despues de la proteolisis con proteasas. El metodo para recuperar la fase ffquida no esta particularmente limitado. La fase ffquida puede recuperarse simplemente mediante centrifugacion. En este caso, la fase ffquida sale por el fondo del recipiente interno 135 a traves de la membrana porosa y se recupera en el recipiente externo 136. Despues puede realizarse una operacion, tal como un lavado o elucion, para, por ejemplo, la elucion de los fragmentos de peptidos contenidos en los poros de la membrana porosa.

Tal como se describio anteriormente, el uso del kit permite realizar con mas sencillez la operacion de preparar los fragmentos de peptidos segun la presente invencion y automatizar facilmente la operacion empleando un dispositivo. En particular, la tripsina, o similar, puede mantener su actividad incluso en un estado en el que se encuentra inmovilizada sobre la superficie de las microparffculas. Por tanto, la operacion de preparar fragmentos de peptidos puede simplificarse aun mas proporcionando, como componente del kit, una proteasa en un estado en el que se encuentra inmovilizada sobre la superficie de las microparffculas.

Analisis

Una muestra que contiene los fragmentos de peptidos obtenidos anteriormente puede analizarse mediante cromatograffa o espectrometna de masas para identificar o cuantificar la protema sustrato. En la presente invencion, la protema sustrato se somete a un tratamiento con proteasas selectivo de sitio y, por tanto, se reduce el numero de tipos de fragmentos de peptidos contenidos en una muestra. Por tanto, las condiciones de analisis mediante espectrometna de masas o similar pueden ajustarse con facilidad. Si es necesario, la muestra empleada para el analisis puede someterse a un pretratamiento, tal como desalacion, solubilizacion, extraccion, concentracion o secado, antes del analisis.

La espectrometna de masas resulta adecuada para la identificacion o la cuantificacion de la protema sustrato a partir de los fragmentos de peptidos producidos mediante la proteolisis con proteasas. La espectrometna de masas puede determinar las secuencias de aminoacidos de fragmentos de peptidos y, por tanto, puede determinar si los fragmentos de peptidos proceden o no de una protema espedfica, tal como un anticuerpo. Ademas, las concentraciones de los fragmentos de peptidos en la muestra pueden determinarse basandose en las intensidades de los picos.

El metodo de ionizacion empleado en la espectrometna de masas no esta particularmente limitado y puede ser, por ejemplo, ionizacion de electrones (EI), ionizacion qrnmica (CI), desorcion de campo (FD), bombardeo de atomos rapidos (FAB), ionizacion de desorcion de laser asistida con matriz (MALDI), o ionizacion de electronebulizacion (ESI). El metodo para analizar la muestra ionizada no esta particularmente limitado, y puede determinarse de modo apropiado dependiendo del metodo de ionizacion empleado. Los ejemplos del metodo incluyen un metodo de defleccion magnetica, un metodo de cuadrupolo (Q), un metodo de atrapamiento de iones (IT), un metodo de tiempo de vuelo (TOF), y un metodo de resonancia de ciclotron de iones de transformada de Fourier (FT-ICR). Como alternativa, puede emplearse un espectrometro de masas de cuadrupolo triple o similar para realizar un analisis de MS/MS o una espectrometna de masas de multiples etapas, tal como MS3 o una MS de orden superior.

Con el fin, por ejemplo, de separar de modo mas fiable los fragmentos de peptidos para mejorar la precision del analisis, la muestra puede separarse y concentrarse mediante una cromatograffa ffquida (LC), extraccion en fase solida (SPE), o similares, antes de someterla a una espectrometna de masas. Cuando la muestra se separa mediante LC, puede emplearse LC/MS que incluye LC antes de la espectrometna de masas de modo que un eluato de LC directamente se ionice y se somete a una espectrometna de masas. La muestra puede analizarse mediante LC/MS/MS o LC/MSn, que es una combinacion de LC y espectrometna de masas en tandem. El eluato de LC puede fraccionarse una vez antes de someterse a una espectrometna de masas. La columna para LC o el vehffculo para SPE no estan particularmente limitados y pueden seleccionarse de modo apropiado. Por ejemplo, puede emplearse una columna hidrofobica, tal como C30, C18, C8, o C4, que se usa en general para el analisis de peptidos, o un vehffculo para la cromatograffa de afinidad hidrofoba.

Pueden emplearse bases de datos existentes para identificar una protema, tal como un anticuerpo, basandose en el resultado de la espectrometna de masas. En la presente invencion, se emplean fragmentos de peptidos obtenidos mediante una proteolisis con proteasas selectiva de sitio de la protema sustrato, tal como un anticuerpo, y, por tanto,

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se aumenta la tasa de aciertos en la busqueda en bases de datos o la precision de los datos. Ademas, la protema sustrato tambien puede identificarse identificando las secuencias de aminoacidos de los fragmentos de peptidos mediante una espectrometna de masas de multiples etapas o similares. Por ejemplo, cuando la protema sustrato es un anticuerpo, el anticuerpo puede identificarse determinando la secuencia de un fragmento de peptido que contiene al menos parte de la secuencia de aminoacidos de una region determinante de la complementariedad (CDR) que tiene una secuencia de aminoacidos espedfica para el anticuerpo.

Cuando el anticuerpo se detecta o se cuantifica basandose en el resultado de la deteccion de un fragmento de peptido espedfico que contiene la secuencia de CDR, el peptido que se va a detectar preferiblemente tiene de aproximadamente 5 a 30 restos aminoacidos, mas preferiblemente de aproximadamente 7 a 25 restos aminoacidos. Si el numero de restos aminoacidos es demasiado pequeno, el peptido que se va a detectar resulta diffcil de distinguir de los fragmentos de peptidos procedentes de impurezas o de otros sitios de la misma protema, lo cual puede provocar una deteccion falsa, etc. Por otra parte, si el numero de restos aminoacidos es demasiado alto, la deteccion se dificulta o se reduce cuantitativamente porque la ionizacion se dificulta o similar.

Cuando se cuantifica la concentracion de la protema sustrato, la cantidad de la protema sustrato puede calcularse basandose en las areas de los picos o las intensidades de los picos de los iones de los fragmentos de peptidos detectados (en el caso de una MS de multiples etapas, los fragmentos de iones obtenidos por la fragmentacion de los iones de los fragmentos de peptidos). Por ejemplo, las concentraciones de los fragmentos de peptidos en la muestra se calculan basandose en la asociacion entre una curva de calibracion previamente determina y las areas de los picos, la asociacion entre las areas de los picos derivadas de un patron interno anadido a la muestra y las areas de los picos derivadas de la muestra, o similares, y la cantidad o la concentracion de la protema sustrato se calcula basandose en la concentracion de los fragmentos de peptidos.

Tal como se describio anteriormente, segun la presente invencion, la protema sustrato y la proteasa se inmovilizan sobre fases solidas para controlar ffsicamente el acceso entre ellas, de modo que un sitio espedfico en la protema sustrato puede someterse a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio. Los fragmentos de peptidos obtenidos de este modo pueden analizarse mediante un metodo conocido, tal como espectrometna de masas y, por tanto, la protema en la muestra puede identificarse o cuantificarse sin procesos complicados.

El metodo segun la presente invencion resulta particularmente adecuado para la deteccion o la cuantificacion de un anticuerpo. La secuencia o la cantidad de un fragmento de peptido que contiene la secuencia de aminoacidos de una region determinante de la complementariedad puede determinarse mediante espectrometna de masas de una muestra de un fragmento de peptido obtenida sometiendo la region Fab de un anticuerpo a una proteolisis con proteasas selectiva. Ademas, el metodo segun la presente invencion puede ponerse en practica mediante una operacion sencilla, puede asegurar la reproducibilidad o cuantitabilidad, y tambien puede automatizarse. Por tanto, el metodo puede aplicarse tambien a la investigacion fundamental, tal como a analisis farmacocineticos, analisis interactivos que emplean una reaccion de antfgeno-anticuerpo, diversos analisis de interactomas, y la identificacion de protemas inmunoprecipitadas. Ademas, puede esperarse que el metodo segun la presente invencion se aplique al analisis de secuenciacion de farmacos biomoleculares, tales como farmacos de anticuerpos, garantfas de seguridad, confirmacion de la identidad de farmacos genericos, etc.

Ejemplos

A continuacion, se describiran ejemplos experimentales en los que una muestra de fragmentos de peptidos obtenida sometiendo a la inmunoglobulina G (IgG) humana o al trastuzumab (nombre comercial: Herceptin) a una proteolisis con proteasas mediante el metodo segun la presente invencion, se somete a una espectrometna de masas. Debe advertirse que la presente invencion no se limita a los siguientes ejemplos.

En la siguiente descripcion, % representa el porcentaje en peso, a menos que se indique lo contrario. Los reactivos y similares utilizados en los ejemplos experimentales son los siguientes.

- Tripsina (de calidad de secuenciacion, Promega)

- Lisil endopeptidasa (de calidad de espectrometna de masas, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

- Acido 2-morfolinoetansulfonico (MES, DOJINDO LABORATORIES)

- Acido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etansulfonico (HEPES, DOJINDO LABORATORIES)

- Tris(hidroximetil)aminometano (Tris, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

Los reactivos y similares distintos de los listados anteriormente, tales como disolventes organicos, se adquirieron en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

Se emplearon las siguientes disoluciones tampon cuyos valores de pH se ajustaron con un pH-metro preciso.

- Tampon MES: MES-NaOH 25 mM, pH 5,5

- Tampon HEPES: HEPES-NaOH 25 mM, pH 7,0

- Tampon de etanolamina: etanolamina-HCl 1 M, pH 8,0

- Tampon Tris: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0

Preparacion de un cuerpo poroso con anticuerpos inmovilizados

5 Una suspension de esferas de resina porosa que presentag protema G unida a su superficie (Pierce Biotechnology, resina Protein G UltraLink, diametro promedio de partfcula: 100 ^m, diametro de poro: de 50 a 100 nm) de 5 ^l se anadio a 200 ^l de tampon MES, y despues se anadio una disolucion de anticuerpo. Tras esto, la mezcla resultante se agito suavemente a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, de modo que el anticuerpo se inmoviliza mediante su union a la protema G sobre la superficie de las esferas de resina. Despues, las esferas de 10 resina se precipitaron mediante centrifugacion a 4 °C (15000 rpm, 1 min) para retirar el sobrenadante. Tras esto, se repitio dos veces un lavado con tampon Tris y una centrifugacion, y las esferas porosas se suspendieron en tampon Tris (200 ^l). Como disolucion de anticuerpo, se empleo una disolucion de inmunoglobulina (IgG) humana (10 mg/ml, Sigma-Aldrich) o una disolucion de trastuzumab (Herceptin, 20 mg/ml, CHUGAI PHARMACEUTICAL CO., LTD.).

Preparacion de las micropart^culas con proteasa inmovilizada

15 Se emplearon micropartmulas con un tamano de nanometros para la inmovilizacion de la proteasa (TAMAGAWA SEIKI CO., LTD., esferas FG NHS), que se obtuvieron modificando la superficie de micropartmulas que tienen un diametro promedio de partmula de 190 con un espaciador cuyo grupo carboxilo se activa con N-hidroxisuccinimida (vease la siguiente formula qmmica, en la que L representa un sitio de union que se une a la superficie de las

imagen1

micropartmulas), longitud del espaciador: 1 nm).

20 Una suspension en isopropanol de esferas FG de 50 ^l se centrifugo a 4 °C (15000 rpm, 5 min) para precipitar las micropartfculas y retirar el sobrenadante. Despues, las micropartfculas se lavaron con metanol. Una disolucion que contema 50 ^g de proteasa se disolvio en 200 ^l de tampon HEPES, y la disolucion resultante se anadio a las micropartmulas para obtener una suspension en la que las micropartmulas estan suspendidas. En este momento, se realizo la suspension de las micropartmulas mediante un tratamiento ultrasonico durante unos pocos segundos para 25 evitar el aumento en la temperatura de la suspension.

La suspension de micropartmulas se agito a 4 °C durante 30 minutos y despues se centrifugo a 4 °C (15000 rpm, 5 min) para precipitar las micropartmulas y retirar el sobrenadante. Despues se anadieron 200 ^l de tampon de etanolamina para suspender las esferas, y la suspension resultante se agito a 4 °C durante 30 minutos para bloquear los grupos N-hidroxisuccinimida redundantes sobre la superficie de las micropartfculas con etanolamina. 30 Despues, las micropartmulas se precipitaron mediante centrifugacion a 4 °C (15000 rpm, 1 min) para retirar el sobrenadante. Tras esto, se repitio dos veces un lavado con tampon Tris y una centrifugacion, y las micropartfculas se suspendieron en tampon Tris (100 ^l). La concentration de proteasa de la suspension fue de 0,5 ^g/^l.

Experimento 1: Determination de la cantidad de anticuerpo inmovilizado sobre el cuerpo poroso

En la preparacion del cuerpo poroso con anticuerpos inmovilizados, la cantidad de suspension de esferas de resina 35 con protema G unida por 100 ^g de IgG se cambio al intervalo de 0 a 20 ^l, y el sobrenadante resultante se analizo mediante electroforesis de sDS-PAGE. Se determino la cantidad aproximada de IgG no unida remanente en el sobrenadante (cantidad residual de anticuerpo) a partir del numero de pixeles por banda en el patron electroforetico resultante. La cantidad residual de anticuerpo tiende a reducirse a medida que aumenta la cantidad de esferas de resina con protema G unida. Cuando la cantidad de esferas de resina con protema G unida era de 10 ^l, la cantidad 40 residual de anticuerpo fue de aproximadamente 3%, a partir de lo cual se confirmo que las especificaciones ofrecidas en el catalogo de las esferas de resina con protema G unida casi se reprodujo (los datos no se muestra).

Experimento 2: Estudio de la proportion cuantitativa entre el anticuerpo y la proteasa

La suspension del cuerpo poroso con IgG inmovilizada (protema G-IgG) y las micropartmulas con proteasa inmovilizada (esferas FG-tripsina) se mezclaron y la mezcla resultante se agito suavemente a 37 °C durante 15

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15

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40

horas para realizar la proteolisis con proteasa. Despues, la resina se precipito mediante centrifugacion a 4 °C (15000 rpm, 5 min) para recuperar la fase lfquida (sobrenadante). El anterior experimento se realizo cambiando la cantidad de micropartmulas con proteasa inmovilizada de modo que la cantidad de proteasa era de 5 |jg (nivel 1), 10 |jg (nivel 2), o 25 jg (nivel 3). En el caso de los niveles 4 a 6, el experimento se realizo de la misma manera, excepto que se empleo directamente un cuerpo poroso sin IgG inmovilizada (resina Protein G UltraLink) en lugar de la suspension del cuerpo poroso con IgG inmovilizada. Ademas, en el caso de los niveles 7 y 8, solo las micropartmulas con proteasa inmovilizada (esferas FG-tripsina) se incubaron a 37 °C durante 15 horas sin emplear un cuerpo poroso.

Los niveles de los anteriores experimentos se muestran en la tabla 2. El peso (jg) mostrado en la tabla 2 representa la cantidad de protema (IgG o tripsina) en una muestra. Los patrones electroforeticos de SDS-PAGE de los sobrenadantes obtenidos se muestran en la figura 4. En la figura 4, el carril mas a la izquierda es un marcador de peso molecular.

Tabla 2

Protema G-IgG (jg) Esferas FG-tripsina (jg)

1

100 5

2

100 10

3

100 25

4

Solo protema G 5

5

Solo protema G 10

6

Solo protema G 25

7

- 5

8

- 10

Espectrometna de masas

Los sobrenadantes de los niveles 1 a 6 se analizaron mediante MALDI-TOFMS (AXIMA Resonance MALDI-QIT TOF MS, SHIMADZU CORPORATION). En primer lugar, se anadio acido trifluoroacetico a 20 jl del sobrenadante de modo que su concentracion final fue de 0,5%, y la mezcla resultante se purifico empleando una punta cargada con resina hidrofoba (Millipore, ZipTip uC18). Despues se realizo la elucion dos veces con 1 jl de un eluyente. El eluato resultante se aplico directamente a una diana de acero inoxidable MALDI y se seco al aire en un banco limpio. Despues de secar al aire, se superpuso una capa de 1 jl de una disolucion de acido 2,5-dihidroxibenzoico 10 mg/ml (DHBA, SHIMADZU GLC Ltd., agua/acetonitrilo = 50/50) para realizar la espectrometna de masas. Se calibro el m/z del aparato con peptido de angiotensina II (m/z = 1046,54, Sigma-Aldrich) y peptido de fragmento de ACTH (m/z = 2465,20, Sigma-Aldrich). Los espectros de MS resultantes se muestran en la figura 5.

Todas las bandas de los niveles 4 a 6 mostradas en la figura 4 fueron las mismas que las de los niveles 7 y 8. Ademas, todos los picos a m/z = 842, 1045, 2211 y 2283 detectados en el caso de los niveles 4 a 6 mostrados en la figura 5 se derivan de fragmentos producidos por la autolisis de la tripsina. Tal como puede observarse a partir de estos resultados, la protema G no se proteoliza cuando las micropartmulas con proteasa inmovilizada y el cuerpo poroso con protema G unida se ponen en contacto entre sf. Se considera que la razon de esto es que el diametro de poro del cuerpo poroso es menor que el diametro de partmula de las micropartmulas con proteasa inmovilizada y, por tanto, la tripsina inmovilizada sobre la superficie de las micropartmulas no puede acceder a la protema G en los poros.

Tal como se muestra en la figura 5, en el caso de los niveles 1 a 3, los picos distintos de los picos de los fragmentos producidos por la autolisis de la tripsina se detectaron a m/z = 835, 913, 1187, 1287, 1510, 1678 y 1946, y se confirmo que todos derivaban de fragmentos de peptidos producidos por la proteolisis con tripsina de IgG. Este resultado demuestra que la IgG puede proteolizarse selectivamente sin proteolizar la protema G inmovilizada sobre el cuerpo poroso poniendo en contacto entre sf el cuerpo poroso con IgG inmovilizada y las micropartmulas con tripsina inmovilizada.

Tal como puede observarse a partir de la comparacion entre los patrones electroforeticos de los niveles 1 a 3 mostrados en la figura 4, a medida que aumenta la cantidad de tripsina, se reducen las bandas de alto peso molecular, es decir, la reaccion de proteolisis del anticuerpo avanza con mas eficacia. Por otra parte, a medida que aumenta la cantidad de tripsina, la autolisis se hace mas pronunciada. Basandose en estos resultados, se establecio el nivel 2 (proporcion de sustrato:enzima = 10:1) como la condicion patron para estudiar otra condicion que se

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10

15

20

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35

40

45

50

describira a continuacion.

Se advertira que la digestion con proteasa generalmente se realiza en condiciones en las que la proporcion de protema sustrato:proteasa = 100:1 a 20:1. En el metodo segun la presente invencion, la accesibilidad entre la protema sustrato y la proteasa esta ffsicamente limitada por el uso combinado del cuerpo poroso y las micropartmulas y, por tanto, la cantidad de proteasa es mayor que la empleada en la digestion con proteasas general. Por esta razon, se calcula que una proporcion optima de sustrato-enzima sera de aproximadamente 10:1 a 5:1.

Experimento 3: Evaluacion de los peptidos recuperados basandose en el tiempo de proteolisis

La suspension del cuerpo poroso con IgG inmovilizada (cantidad de IgG sobre la fase solida: 100 |jg) y las micropartfculas con proteasa inmovilizada (cantidad de tripsina sobre la fase solida: 10 jg) se mezclaron de modo que se cumple la condicion del nivel 2 seleccionada en el experimento 2, y el tiempo de proteolisis a 37 °C se ajusto a (1) 15 min, (2) 45 min, (3) 90 min, (4) 180 min, (5) 360 min, y (6) 15 hr (durante la noche). La proteolisis con tripsina se realizo de la misma manera que en el experimento 2, excepto por el anterior cambio, y las muestras obtenidas se sometieron a una espectrometna de masas. Los espectros de MS resultantes se muestran en la figura 6.

Tal como puede observarse en la figura 6, a medida que aumenta el tiempo de proteolisis, los picos de los fragmentos de peptidos aumentan, es decir, las cantidades de fragmentos de peptidos recuperados aumentan. La tasa de recuperacion de los fragmentos de peptidos es mayor en el caso de tiempo de proteolisis durante la noche (6) que en el caso de 360 min (5). En particular, la acumulacion de fragmentos producidos con facilidad por la proteolisis con proteasa a m/z = 1187, 1510, 1678, etc. tiende a ser mas pronunciada. Sin embargo, estos fragmentos se derivan de la region C del anticuerpo y, por tanto, no contribuyen al analisis de los fragmentos de peptidos que contienen CDR. Por tanto, el tiempo de la proteolisis con proteasa se ajusto a 6 hr para realizar el siguiente estudio.

Experimento 4: Proteolisis con tripsina y espectrometna de masas del trastuzumab

Se preparo un cuerpo poroso con anticuerpo inmovilizado empleando Herceptin en lugar de IgG como anticuerpo, y se sometio a una proteolisis con tripsina bajo la condicion seleccionada en los experimentos 2 y 3, es decir, bajo la condicion en la que la cantidad de micropartmulas con proteasa inmovilizada por 100 jg de la cantidad de anticuerpo sobre la fase solida es de 10 jg y el tiempo de proteolisis es de 6 horas. Despues se realizo la espectrometna de masas y se realizo un analisis de base de datos (servidor Mascot) basandose en el resultado de la espectrometna de masas. Tal como puede observarse en la figura 7, se identifico Herceptin (Estructuras de rayos X de la cadena B de dominios de union al antfgeno de tres variantes del anticuerpo 4d5 anti-P185-Her2 humanizado y comparacion con la formacion de modelos moleculares) con una puntuacion muy alta.

Para confirmar que los fragmentos de peptidos de Herceptin fueron detectados por la espectrometna de masas, se realizo un analisis mas detallado en este experimento. La figura 8 muestra el espectro de masas resultante (MALDI- TOFMS).

Ademas, el sobrenadante resultante despues de la proteolisis se analizo mediante LC-MS (cromatograffa lfquida de resolucion ultraalta de cuadrupolo triplo LCMS-8080-MS, SHIMADZU CORPORATION). La figura 9 muestra el cromatograma de LC-MS resultante, y la figura 10 muestra los espectros de MS resultantes. La medicion de LC-MS se realizo empleando una muestra preparada anadiendo acido formico al sobrenadante hasta una concentracion final de 0,5%, y la LC se realizo con las siguientes condiciones.

Disoluciones de HPLC

- Disolucion A: acido formico al 0,1%, disolucion acuosa/acetonitrilo al 1%

- Disolucion B: acido formico al 0,1%, disolucion de acetonitrilo Columna

- ShimPack ODS XR-ODS II (diametro interno: 2 mm, longitud de columna: 50 mm)

- Temperatura de la columna: 40 °C

- Caudal: 0,4 ml/min

- Cantidad de inyeccion: 20 jl Programa de gradiente

0-2 min: %B = 0

5

10

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20

25

30

35

40

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50

2-10 min: %B = gradiente 0-40

10- 11 min: %B = gradiente 40-98

11- 13 min: %B = 98

13-13,5 min: %B = gradiente 98-0 13,5-15 min: %B = 0

Las secuencias de peptidos subrayadas en la cadena pesada (figura 11(A), SEQ ID NO:1 en el listado de secuencias) y en la cadena ligera (figura 11(B), SEQ ID NO:2 en el listado de secuencias) del trastuzumab fueron detectadas e identificadas mediante la anterior espectrometna de masas. Tal como puede observarse en la figura 11(A), se detectaron la CDR1 (SEQ ID NO:3 en el listado de secuencias), CDR2 (SeQ ID NO:4 en el listado de secuencias) y CDR3 (SEQ ID NO:5 en el listado de secuencias) de la cadena pesada. Ademas, tal como se muestra en la figura FIG. 11(B), se detectaron la CDR1 (SEQ ID NO:6 en el listado de secuencias) y CDR2 (SEQ ID NO:7 en el listado de secuencias) de la cadena ligera. Un fragmento tnptico que contiene la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO:8 en el listado de secuencias) de la cadena ligera tiene una longitud de 4 restos aminoacidos o 37 restos aminoacidos y, por tanto, no resulta adecuado para la espectrometna de masas. Esta es la razon por la cual no pudo identificarse la CDR3 de la cadena ligera. Sin embargo, se considera que puede prepararse un fragmento de peptido que permita detectar la CDR3 de la cadena ligera mediante espectrometna de masas cambiando el tipo de proteasa utilizada. Ademas, en este experimento, se detectaron 5 del total de 6 CDR de las cadena pesada y ligera, aunque la CDR3 de la cadena ligera no pudo detectarse. Por tanto, tal como se muestra en la figura 7, se identifico el trastuzumab mediante un analisis de base de datos.

Tal como puede observarse de lo anterior, puesto que los fragmentos de peptidos preparados mediante el metodo segun la presente invencion son fragmentos de peptidos obtenidos mediante una proteolisis con proteasas selectiva de sitio del anticuerpo, el anticuerpo puede identificarse mediante una medicion con espectrometna de masas sin tener que ajustar unas condiciones de medicion complicadas.

Experimento 5: Estudio de una proteolisis con proteasas mixta

Para estudiar la aplicabilidad de la proteolisis con proteasas mixta a un sistema segun la presente invencion, el experimento de proteolisis con proteasas se realizo empleando tripsina y lisil endopeptidasa (Lys-C) en combinacion.

Un anticuerpo (IgG o Herceptin) se sometio a una proteolisis con proteasas de la misma manera que en cada uno de los anteriores ejemplos experimentales agitando un cuerpo poroso con anticuerpo inmovilizado que presenta 100 |jg del anticuerpo inmovilizado sobre la protema G unido a el, y micropartfculas que presentan 10 jg de proteasa inmovilizada sobre ellas, a 37 °C durante 6 horas. El experimento se realizo para ambos casos en que se utilizo IgG como anticuerpo y en que se empleo Herceptin como anticuerpo, bajo la condicion en la que la proporcion (proporcion en peso) entre la tripsina y la lisil endopeptidasa fue ajustada a (1) 10:0, (2) 9:1, (3) 8:2, y (4) 0:10. El sobrenadante resultante despues de la proteolisis y el componente inmovilizado sobre la superficie del cuerpo poroso se analizaron mediante electroforesis de SDS-PAGE. Los patrones electroforeticos resultantes se muestran en la figura 12. En la figura 12, el carril mas a la izquierda es un marcador de peso molecular.

Los sobrenadantes despues de la proteolisis de los niveles 1 a 4 obtenidos cuando Herceptin se emplea como anticuerpo se sometieron a una espectrometna de masas de la misma forma en el anterior experimento 2. Los espectros de MS resultantes se muestran en la figura 13. Ademas, se realizo un analisis de base de datos por el servidor Mascot de la misma manera que en el experimento 4 basandose en el resultado de la espectrometna de masas. El resultado del analisis de la base de datos del nivel 1 (tripsina al 100%) fue el mismo que el obtenido en el anterior experimento 4 (figuras 7 y 8). Los resultados del analisis de la base de datos de los niveles 2 a 4 fueron los siguientes (los datos no se muestran).

Nivel 2: Tripsina:lisil endopeptidasa = 90:10

Mezcla:

- gi |442924 Masa: 23708 Puntuacion: 117 Esperado: 4,9e-007 Coincidencias: 13, Estructuras de rayos X de la cadena B de dominios de union al antfgeno de tres variantes del anticuerpo 4d5 anti-P185-Her2 humanizado y comparacion con la formacion de modelos moleculares

- gi |184747 Masa: 36012 Puntuacion: 64 Esperado: 0,11 Coincidencias: 10, region constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma-1 [Homo sapiens]

Nivel 3: Tripsina:lisil endopeptidasa = 80:20

Mezcla:

- gi |442924 Masa: 23708 Puntuacion: 115 Esperado: 7,8e-007 Coincidencias: 13,

5

10

15

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30

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50

Estructuras de rayos X de la cadena B de dominios de union al antigeno de tres variantes del anticuerpo 4d5 anti- P185-Her2 humanizado y comparacion con la formacion de modelos moleculares

- gi |184747 Masa: 36012 Puntuacion: 54 Esperado: 1,1 Coincidencias: 9, region constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma-1 [Homo sapiens]

Nivel 4: lisil endopeptidasa al 100%

- gi |184747 Masa: 36012 Puntuacion: 71 Esperado: 0,021 Coincidencias: 8, region constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma-1 [Homo sapiens]

En los casos de los niveles 2 y 3 en los que se emplearon la tripsina y la lisil endopeptidasa en combinacion, el resultado del analisis muestra que se detecto la region constante de un anticuerpo procedente de humano, asf como la region de union al antfgeno de Herceptin. En el caso del nivel 4, en el que se empleo la lisil endopeptidasa sola, el resultado del analisis muestra que no se detecto Herceptin y que solo se detecto predominantemente la region constante de un anticuerpo.

Tal como puede observarse a partir de los patrones electroforeticos mostrados en la figura 12, existe una tendencia de que, a medida que aumenta la proporcion de lisil endopeptidasa, tambien aumenta el numero de fragmentos de peptidos en el sobrenadante y las areas de las bandas, es decir, aumenta la eficacia de la proteolisis y la tasa de recuperacion de peptidos. Ademas, tal como se muestra en la figura 13, los tipos o las cantidades de fragmentos de peptidos detectados aumentan a medida que aumenta la proporcion de lisil endopeptidasa. Sin embargo, la mayona de los fragmentos de peptidos recien detectados en el caso de los niveles 2 a 4 proceden del dominio Fc de Herceptin, de lo cual se descubrio que la selectividad de sitio de la proteolisis con proteasas (es decir, la propiedad de proteolizar selectivamente el dominio Fab) se reduce.

Tal como puede observarse a partir de estos resultados, a medida que aumenta la cantidad de lisil endopeptidasa utilizada, aumenta la eficacia de proteolisis del anticuerpo, pero se reduce la selectividad de sitio de la proteolisis con proteasas y, por tanto, se reduce la cantidad de produccion relativa de fragmentos de peptidos a partir de la region V a medida que aumenta la cantidad de produccion de fragmentos de peptidos a partir de la region constante, de modo que la precision de la deteccion y la identificacion del anticuerpo tiende a reducirse. Por tanto, desde el punto de vista de proteolizar de modo selectivo de sitio la region Fab del anticuerpo y de detectar espedficamente CDR mediante el metodo segun la presente invencion, la tripsina se emplea preferiblemente por sf sola. Cuando la tripsina y la lisil endopeptidasa se emplean en combinacion, la cantidad de lisil endopeptidasa mezclada es preferiblemente de 10% o menor.

Debe advertirse que no se realizo la proteolisis selectiva de sitio en el caso del nivel 4 empleando lisil endopeptidasa por sf sola, mientras que las CDR fueron detectadas con eficacia mediante el analisis de la base de datos en el caso del nivel 1 (experimento 4) empleando solo tripsina, a partir de lo cual se descubrio que la region V del dominio Fab fue sometida a una proteolisis con proteasa selectiva. Puede decirse que los anteriores resultados demuestran que cuando la protema sustrato es un anticuerpo, el acceso esterico de la proteasa al anticuerpo fue controlado de modo apropiado aplicando la presente invencion utilizando tripsina, de modo que puede lograr la proteolisis con proteasas selectiva de sitio.

Ademas, este experimento demuestra que cuando la tripsina y la lisil endopeptidasa se emplean en combinacion, cada una de las proteasas no pierde su funcion y puede proteolizar la protema sustrato inmovilizada en los poros. Un anticuerpo tiene una region V en el extremo de su molecula y, por tanto, cuando la cantidad de lisil endopeptidasa usada aumenta, la selectividad de sitio tiende a reducirse. Sin embargo, se ha sugerido que, en el caso en que se emplee otra protema como sustrato, existe la posibilidad de que la selectividad de sitio o la eficacia de la proteolisis mejore empleando una combinacion de proteasas.

Tal como puede observarse a partir de los anteriores ejemplos experimentales, segun la presente invencion, puede obtenerse una muestra de fragmentos de peptidos sometiendo una protema, tal como un anticuerpo, a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio por medio de un metodo simple, y la muestra de fragmentos de peptidos obtenida resulta adecuada para la identificacion o la deteccion de la protema mediante espectrometna de masas.

Descripcion de los signos de referencia

10: micropartmula

11: espaciador

15: proteasa

20: cuerpo poroso

21: molecula conectora

25: protema sustrato

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. - Un metodo para preparar fragmentos de peptidos, que comprende:

   una etapa de inmovilizacion del sustrato, para inmovilizar una protema sustrato que se va proteolizar en los poros de un cuerpo poroso; y

   una etapa de proteolisis, para proteolizar la protema sustrato con una proteasa poniendo en contacto entre sf el cuerpo poroso que presenta la protema sustrato inmovilizada sobre el y micropartmulas que presentan la proteasa inmovilizada sobre su superficie, en un lfquido, en el que

   el diametro promedio de partmula de las micropartmulas es mayor que el diametro promedio de poro del cuerpo poroso.
2. 2. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun la reivindicacion 1, en el que en la etapa de inmovilizacion del sustrato, una region predeterminada de la protema sustrato se inmoviliza sobre el cuerpo poroso, y una region de la protema sustrato diferente de la region predeterminada se somete a una proteolisis con proteasas selectiva de sitio.
3. 3. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun la reivindicacion 1 o 2, en el que una molecula conectora capaz de una interaccion espedfica de sitio con la protema sustrato se inmoviliza en los poros del cuerpo poroso, y en la etapa de inmovilizacion del sustrato, la protema sustrato se inmoviliza en los poros del cuerpo porosa a traves de la molecula conectora.
4. 4. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun la reivindicacion 3, en el que despues de la etapa de inmovilizacion del sustrato, una molecula en la que la molecula conectora se une a la protema sustrato tiene un tamano de 0,5 veces a 1,5 veces el diametro de poro del cuerpo poroso.
5. 5. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la superficie de las micropartmulas se modifica con una molecula espaciadora capaz de unirse con la proteasa, y la proteasa se inmoviliza sobre la superficie de las micropartmulas a traves de la molecula espaciadora.
6. 6. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la protema sustrato es un anticuerpo.
7. 7. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun la reivindicacion 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. 8. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun la reivindicacion 6 o 7, en el que en la etapa de inmovilizacion del sustrato, un dominio Fc del anticuerpo se inmoviliza sobre el cuerpo poroso, y en la etapa de proteolisis, un dominio Fab del anticuerpo es proteolizado de modo selectivo de sitio por la proteasa.
9. 9. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteasa es tripsina.
10. 10. - El metodo para preparar fragmentos de peptidos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el diametro promedio de poro del cuerpo poroso es de 30 a 150 nm, y el diametro promedio de partmula de las micropartmulas es de 100 nm o mayor.
11. 11. - Un kit para preparar fragmentos de peptidos para su uso en el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho kit:

    un cuerpo poroso que tiene poros capaces de inmovilizar una protema sustrato, y micropartmulas capaces de inmovilizar una proteasa sobre su superficie, en el que

    el diametro promedio de partmula de las micropartmulas es mayor que el diametro de poro del cuerpo poroso.
12. 12. - El kit para preparar fragmentos de peptidos segun la reivindicacion 11, en el que las micropartmulas se proporcionan en un estado en el que la proteasa esta inmovilizada sobre su superficie.
13. 13. - Un metodo de analisis, que comprende la preparacion de fragmentos de peptidos segun un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y el analisis mediante una espectrometna de masas.
14. 14. - El metodo de analisis segun la reivindicacion 13, en el que los fragmentos de peptidos que se van a analizar contienen al menos una parte de una secuencia de aminoacidos de una region determinante de la complementariedad de un anticuerpo.