KR20160031550A - 펩티드 단편의 조제 방법 및 그것에 사용되는 펩티드 단편 조제용 킷, 및 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로테아제를 사용하여, 단백질을 절단하고, 펩티드 단편을 조제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 절단 대상의 기질 단백질(25)이 세공(29) 내에 고정화된 다공질체(20)와, 프로테아제(15)가 표면에 고정화된 미립자(10)를 액체 중에서 접촉시키는 스텝을 갖는다. 본 발명에 있어서, 상기 미립자(10)의 평균 입경은, 상기 다공질체(20)의 평균 세공 직경보다 크다. 본 발명의 방법에 따르면, 항체의 기질 단백질(25)을 위치 선택적으로 절단할 수 있다. 상기 방법에 의해 얻어진 펩티드 단편을, 질량 분석법 등에 의해 분석함으로써, 항체의 단백질 검출이나 정량 분석을 행할 수 있다.

Description

펩티드 단편의 조제 방법 및 그것에 사용되는 펩티드 단편 조제용 킷, 및 분석 방법{METHOD FOR PREPARING PEPTIDE FRAGMENTS, KIT FOR PREPARING PEPTIDE FRAGMENTS TO BE USED THEREIN, AND ANALYSIS METHOD}
본 발명은 프로테아제를 사용하여, 항체 등의 단백질을 위치 선택적으로 절단하여, 펩티드 단편을 조제하는 방법 및 그것에 사용되는 펩티드 단편 조제용 킷에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 조제된 펩티드 단편을, 질량 분석법 등에 의해 분석하여, 단백질의 검출이나 정량을 행하는 분석 방법에 관한 것이다.
항체 의약의 수요가 급속도로 확대되고 있어, 임상 현장에 있어서, 혈액 중의 항체 농도를 간편하게 정량하는 것의 중요성이 높아지고 있다. 종전에는, 항체 의약을 투여 후의 혈액 중 농도를 정확하게 측정하는 것은 중요시되지 않았었지만, 트라스투주맙(상품명: Herceptin)의 위암 적용 확대에 수반하는 임상 시험에 있어서, 그 혈액 중 농도와 생존 기간에 유의차가 발견된 이후, 항체 의약의 임상 시험 등에 있어서도, 항체의 혈중 농도를 측정하는 것이 필수로 되어 가고 있다. 예를 들어, 약물 동태 확인 등의 품질 관리나, 후발 의약품의 임상 시험 등에 있어서의 선발 의약품과의 동일성 확인 등에 있어서도, 항체 의약의 동정이나, 그 혈액 중 농도의 정량이 요구되게 되었다.
항원 항체 반응을 사용한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법은, 특이성 및 정량성이 우수하기 때문에, 임상 시험 등에 있어서, 혈액 중의 항원이나 항체의 검출·정량 등에 널리 사용되고 있다. 그러나, ELISA법은, 단일의 단백질(항원 또는 항체)의 검출을 목적으로 한 것으로, 다수의 다른 단백질을 동시에 검출할 수는 없다. ELISA법에 의해 다수의 단백질을 검출하기 위해서는, 검출 대상마다 특이 항체를 제작해서 농도 측정 조건을 설정할 필요가 있어, 막대한 수고와 비용을 필요로 한다. 또한, ELISA법은 항원 항체 반응을 이용하기 때문에, 병용 약이나 대사물과의 교차 반응이 측정 결과에 영향을 미칠 수 있는 점이나, 일부의 항체 의약에서는 보존 검체에의 적용이 곤란하다는 등의 문제점이 알려져 있다.
그로 인해, 다양한 항체에 범용적으로 적용 가능한 분석 방법의 개발이 요망되고 있다. 프로테오믹스의 발전에 수반하여, 질량 분석법에 의해, 단백질을 망라적으로 검출·정량 가능한 기술이 개발되고 있고, 최근에는, 항체 등의 거대 생체 분자의 해석도 가능하게 되었다. 질량 분석에서는, 측정 대상 분자를 이온화할 필요가 있어, 항체 등의 거대 생체 분자를 그대로 질량 분석에 의해 분석하는 것은 곤란한 경우가 많다. 그로 인해, 프로테아제 소화에 의해 단백질을 절단(단편화)하고, 단편화된 펩티드 중에서, 분석 대상의 단백질에 특이적인 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편을 선택하여, 질량 분석 장치에 의해 검출·정량하는 방법이 채용되고 있다. 일반적으로는, 프로테아제에 의한 소화 효율을 향상시키기 위해서, 고농도의 요소나 구아니딘 용액 중에서 기질 단백질을 변성시킨 후, 프로테아제 소화가 행해진다.
항체 등의 단백질을 프로테아제 소화에 의해 단편화해서 질량 분석을 행하는 경우, 검출 대상이 되는 펩티드 단편을 선택적으로 검출하는 것이 중요해진다. 그러나, 다종 다양한 협잡물을 포함하는 생체 시료로부터, 분석 대상의 단백질 유래의 특정한 펩티드 단편을 검출하는 것은 곤란을 수반하는 경우가 있다. 즉, 혈액 등의 생체 시료는, 다종 다양한 협잡물을 함유하기 때문에, 생체 시료에 프로테아제를 첨가하면, 협잡물 유래의 단백질도 프로테아제 소화되어, 방대한 수의 펩티드 단편이 생성된다. 그 중에서 검출 대상(예를 들어 특정한 항체) 유래의 원하는 펩티드 단편을 선택적으로 검출·정량하기 위해서는, 질량 분석에 제공하기 전에, 펩티드 단편의 분리나 농축 등의 조작이 필요해진다. 또한, 검출 대상 이외의 단백질로부터, 검출 대상의 단백질의 펩티드 단편과 공통되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편이 산생되면, 오검출이나 정량성 저하의 원인이 될 수 있다. 따라서, 생체 시료로부터 발생하는 펩티드 단편수의 증가에 수반하여, 검출 대상으로 하는 펩티드 단편의 선택이 보다 곤란해지는 경향이 있다.
이러한 생체 시료의 복잡성을 감안하여, 시료를 액체 크로마토그래피(LC)에 의해 정제한 후, 질량 분석 장치에 제공하는 방법이나, 충돌 유기 해리(CID) 등에 의해 이온 개열을 발생시키는 다단계의 질량 분석, 또는 이들의 조합(다중 반응 모니터링, MRM)에 의해, 생체 시료 등의 복잡 시료 중의 특정한 단백질을 정량하는 방법이 개발되어 있다. 그러나, 시료가 복잡해질수록, 다양한 분리 모드를 조합할 필요가 발생하여, 고정밀도의 실험 장치가 필요해지거나, 분석 조건의 설정에 다대한 시간을 필요로 하는 등의 문제가 있다.
또한, 항체 등의 거대 단백질은, 정제된 시료를 사용한 경우에도, 프로테아제 소화에 의해 다수의 펩티드 단편이 산생되기 때문에, 그 중에서, 검출 대상에 특유의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편을 선택적으로 검출·정량하는 것이 곤란해지는 경향이 있다. 이러한 문제를 감안하여, 분석 대상의 단백질을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하여, 시료 중의 펩티드 단편의 수(종류)를 감소시켜, 분석 정밀도를 높임과 함께, 분석을 간편화하는 방법이 개발되었다. 예를 들어, 특허문헌 1에서는, 항체의 펩신 소화에 의해 F(ab')2 단편을 산생한 후, F(ab')2 단편을 다시 트립신 등의 프로테아제로 소화하여, 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 펩티드 단편을 산생하고, CDR을 포함하는 펩티드 단편을, 질량 분석에 의해 검출·정량하는 방법이 제안되어 있다.
여기서, 항체의 구조에 대해서 설명한다. 모든 항체는, 2개의 중쇄(H쇄)와 2개의 경쇄(L쇄)를 갖고 있다. 1개의 경쇄와 1개의 중쇄가 디술피드 결합으로 묶여서 헤테로다이머를 형성하고, 또한 2개의 헤테로다이머가, 2개의 디술피드(S-S) 결합으로 묶여서 'Y'자형의 헤테로테트라머를 형성하고 있다(도 2 참조). 항체는, 중쇄를 포함하는 1개의 Fc(Fragment, crystallizable) 도메인과, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 2개의 Fab(Fragment, antigen binding) 도메인을 가지며, Fc 도메인과 Fab 도메인은, 힌지부를 개재하여 연결되어 있다.
항체의 Fc 도메인은, 주로, 항체가 항원에 결합한 후의 반응을 야기하는 기능(이펙터 기능)을 담당하고 있고, 동일종 유래의 항체의 대부분은, Fc 도메인의 아미노산 서열이 공통되고 있다. 한편, Fab 도메인은, 선단 부분(N 말단측)이 항원과 결합하는 기능을 갖고 있다. Fab 도메인 중, N 말단측 부분은, 다양한 항원에 결합할 수 있도록, 아미노산 서열에 다채로운 변화가 보인다. 이 영역은, 가변 영역(V 영역)이라 칭해지고, 경쇄의 가변 영역은 VL 영역, 중쇄의 가변 영역은 VH 영역이라 칭해진다. V 영역 이외의 Fab 도메인과 Fc 도메인은, 아미노산 서열의 변화가 적은 영역이며, 정상 영역(C 영역)이라 칭해진다. 경쇄의 정상 영역은 CL 영역, 중쇄의 정상 영역은 CH 영역이라 칭해진다. CH 영역은 또한 CH1 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역의 3가지로 나뉜다. 중쇄의 Fab 도메인은 VH 영역과 CH1 영역을 포함하고, 중쇄의 Fc 도메인은 CH2와 CH3을 포함한다. 힌지부는 CH1과 CH2 사이에 위치한다.
항체의 특이성(즉 항원에의 특이적 결합성)은 V 영역의 아미노산 서열의 조합에 의해 결정된다. 경쇄 및 중쇄 각각은, Fab 도메인의 V 영역 내에, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. CDR은, 초가변 영역이라고도 칭해지며, 항체의 종류마다 아미노산 서열이 다르다. 항체는, 경쇄와 중쇄 각각에 3개의 CDR(합계 6종류의 CDR)을 갖기 때문에, 여러가지 항원에 결합 가능한 다양성이 발생한다. 바꾸어 말하면, CDR은 항체를 특징짓는 영역이며, 항체의 CDR의 아미노산 서열을 특정함으로써, 항체를 동정할 수 있다.
전술한 바와 같이, 항체의 Fab 도메인과 Fc 도메인은 힌지부를 개재해서 연결된다. 프로테아제의 일종인 파파인은, 이 힌지부를 절단하기 때문에, 항체의 파파인 소화에 의해, 2개의 Fab 도메인과 1개의 Fc 도메인이 산생된다. 또한, 프로테아제의 일종인 펩신은, 힌지부의 2개의 디술피드 결합의 Fc 도메인측(C 말단측)을 절단하기 때문에, 펩신 소화에 의해, 2개의 Fab 도메인이 결합한 F(ab')2 도메인과, 다수의 Fc 도메인 프래그먼트가 산생된다.
상기 특허문헌 1의 방법에서는, 펩신 소화 또는 파파인 소화에 의해 Fab 도메인 또는 F(ab')2 도메인을 산생시키고, Fab 도메인 또는 F(ab')2 도메인을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하고 있다. 이 방법에 의해, 프로테아제 소화에 의해 산생되는 펩티드의 수를 저감하여, CDR을 포함하는 펩티드를 효율적으로 산생할 수 있기 때문에, 질량 분석법에 의한 항체의 검출·정량이 간편화된다. 또한, 특허문헌 2에서는, 펩신이나 파파인과 특정한 이온을 병용함으로써, 이들 프로테아제에 의한 소화 효율이 향상되는 것이 보고되어 있다.
항체의 Fab 도메인의 정제를 목적으로 하여, 프로테아제를 최적화한 정제용 킷 등도 시판되고 있다. 그러나, 상기 특허문헌 1의 방법은, Fab 도메인 또는 F(ab')2 도메인을 정제한 후, 또한 프로테아제 처리를 행할 필요가 있기 때문에, 질량 분석에 제공하는 시료의 조제에 다대한 시간과 비용을 필요로 하여, 간편한 방법이라고는 말하기 어렵다. 또한, 프로테아제 소화(단편화)는 소화 대상이 되는 기질 단백의 종류에 따라, 그 소화 효율이 다르기 때문에, 질량 분석에 제공하기 위한 펩티드 단편 시료의 조제를 간편화하기 위해서는, 소화 효율의 향상이 중요해진다.
최근 들어, 프로테아제 소화의 고효율화 방법으로서, 나노 입자 등의 미소 환경(마이크로리액터) 속에서, 프로테아제 소화를 행하는 방법이 주목받고 있다. 예를 들어, 비특허문헌 1에서는, 나일론의 다공질막의 세공 내에 트립신을 고정화하고, 이 다공질막에 알부민 용액을 통과시킴으로써, 알부민의 트립신 소화를 고효율화한 예가 보고되고 있다. 비특허문헌 2에서는, 세공 내에 트립신을 고정한 메소 다공 실리카를 사용함으로써, 분자량이 작은 단백질을 선택적으로 트립신 소화 할 수 있음이 보고되어 있다. 이들 방법은 모두, 다공질체의 세공 내에 프로테아제를 고정화하고, 고상 표면의 프로테아제와 액상 내의 기질 단백질을 반응시키는 것이다. 이와 같이, 미소 환경 속에서 프로테아제를 고상으로 고정함으로써 소화 효율이 향상되는 것은, 고상과 액상의 계면이라고 하는 국소적·미세적인 환경 속에서 단백질이 변성을 일으키기 쉬운 점이나, 용해도나 삼차원 구조의 요동폭 등이 섭동을 받음으로써, 기질 단백질과 프로테아제의 접촉 기회가 증대하여, 반응 확률이 향상되는 데에 기인한다고 생각되었다.
WO 2008/079914호 국제 공개 팸플릿 일본 특허 공개 제2011-130749호 공보
Fei Xu et. al., Anal. Chem., 2010, 82, 10045-10051. Qianhao Min et. al., Chem. Commun., 2010, 46(33), 6144-6146.
상기 비특허문헌 2의 방법은, 분자량이 적은 단백질을 선택적으로 프로테아제 소화할 수는 있지만, 항체와 같은 거대 단백질의 선택적 소화에는 적용할 수 없다. 또한, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2에 개시되어 있는 바와 같은 마이크로 리액터에 의해, 위치 선택적으로 프로테아제 소화를 행하는 방법은 개발되지 않았다.
상기한 바와 같이 질량 분석법에 의해, 단백질을 간편하게 검출·정량하기 위해서는, 분석 대상의 단백질을 위치 선택적으로 절단하고, 검출 대상의 단백질에 특이적인 펩티드 단편을 효율적으로 산생시키고, 그 이외의 펩티드 단편의 산생량을 작게 할 것이 요구된다. 예를 들어, 항체를 검출 및 정량 분석하기 위해서는, Fab 도메인, 특히 Fab 도메인의 V 영역을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하여, Fc 도메인의 프로테아제 소화를 억제할 필요가 있다.
본 발명자들이 예의 검토한 결과, 항체 등의 기질 단백질과 프로테아제의 양쪽을 고상으로 고정함으로써, 기질 단백질의 위치 선택적인 프로테아제 소화를 실현할 수 있음을 알아내고, 본 발명에 이르렀다.
본 발명은 단백질을 프로테아제에 의해 소화하는 펩티드 단편의 조제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 절단 대상의 기질 단백질이 세공 내에 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 미립자를 액체 중에서 접촉시키는 스텝(소화 스텝)을 갖는다. 기질 단백질이 세공 내에 고정화된 다공질체는, 절단 대상의 기질 단백질을 다공질체의 세공 내에 고정화하는 스텝(기질 고정 스텝)에 의해 얻어진다. 본 발명에 있어서, 미립자의 입경은, 다공질체의 평균 세공 직경보다 큰 것이 바람직하다.
미립자의 입경이 다공질체의 평균 세공 직경보다 큰 경우, 미립자 표면에 고정화된 프로테아제는, 다공질체의 세공의 표층 부근(다공질체와 액상의 계면 부근)에는 액세스할 수 있지만, 세공의 깊숙한 위치에는 액세스할 수 없다. 이와 같이, 프로테아제의 액세스 가능 영역이 물리적(공간적)으로 제한되어 있기 때문에, 프로테아제는, 다공질체의 세공 내에 고정화된 기질 단백질의 특정한 부위에 선택적으로 액세스한다. 그로 인해, 기질 단백질의 위치 선택적인 프로테아제 소화(단편화)가 가능하게 된다.
본 발명에 있어서, 기질 단백질의 소정의 영역이, 다공질체에 고정화되는 것이 바람직하다. 해당 형태에서는, 다공질체에 고정화된 영역은 세공의 깊숙한 곳에 위치하고, 고정화된 영역과 다른 영역이 세공의 표층 부근에 위치한다. 기질 단백질의 선택적 절단 부위와 다른 영역, 즉 프로테아제 소화되지 않는 것이 바람직한 영역이 다공질체에 고정화되면, 세공의 표층 부근에 위치하는 기질 단백질의 선택적 절단 부위에, 미립자 표면에 고정화된 프로테아제가 액세스하여, 프로테아제 소화가 행해진다. 그로 인해, 기질 단백질의 원하는 부위를 위치 선택적으로 프로테아제 소화할 수 있다.
다공질체의 세공 내에는, 기질 단백질과 부위 특이적으로 상호 작용하는 링커 분자가 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 기질 단백질은 링커 분자를 통해서 다공질체의 세공 내에 고정화되는 것이 바람직하다. 기질 단백질이 항체인 경우의 링커 분자로서는, 예를 들어 protein G나 protein A 등을 들 수 있다. 이들 링커 분자는, 항체의 Fc 영역과 부위 특이적으로 결합하기 때문에, 항체의 Fc 영역이 다공질체에 고정화되고, Fab 영역은 세공의 표층 부근에 위치한다. 해당 형태에 따르면, 항체의 Fab 영역을 선택적으로 프로테아제 소화할 수 있다.
다공질체의 세공 내에 링커 분자가 고정화되는 경우, 링커 분자와 기질 단백질이 결합한 상태의 분자 사이즈가, 다공질체의 평균 세공 직경의 0.5배 내지 1.5배 정도인 것이 바람직하다. 이와 같이 분자 사이즈를 조정함으로써, 미립자 표면에 고정화된 프로테아제와, 기질 단백질의 선택적 절단 부위의 액세스 확률을 높여서, 프로테아제 소화의 위치 선택성을 향상시킬 수 있다.
또한, 미립자의 표면은, 프로테아제와 결합 가능한 스페이서 분자로 수식되어 있고, 프로테아제가 그 스페이서 분자를 통해서 미립자의 표면에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서 분자를 통해서 프로테아제를 고정화함으로써, 미립자 표면으로부터의 프로테아제의 탈리가 억제되어, 프로테아제 소화의 위치 선택성이 높아진다. 또한, 스페이서의 분자 사이즈를 조정함으로써, 기질 단백질의 원하는 위치에 프로테아제를 선택적으로 액세스시켜, 위치 선택성을 높일 수도 있다.
본 발명에 있어서, 미립자 표면에 고정화되는 프로테아제로서는, 트립신, 또는 트립신과 다른 프로테아제의 병용계가 바람직하다. 기질 단백질이 항체인 경우, 트립신을 단독으로 사용하거나, 또는 병용계인 경우에는 전체 프로테아제 중 트립신의 양이 90% 이상인 것이 바람직하다. 특히, 기질 단백질이 항체인 경우, 트립신을 사용함으로써 Fab 도메인이 선택적으로 프로테아제 소화되어, Fc 도메인의 프로테아제 소화가 억제되는 경향이 있다.
다공질체의 평균 세공 직경은, 30 내지 150㎚ 정도가 바람직하고, 미립자의 평균 입경은 100㎚ 이상이 바람직하다. 특히, 기질 단백질이 항체인 경우, 평균 세공계 및 평균 입경이 상기 범위이면, Fab 영역을 보다 확실하게 위치 선택적으로 절단할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 펩티드 단편 조제용 킷에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 단편 조제용 킷은, 단백질을 고정화 가능한 세공을 갖는 다공질체와, 프로테아제를 표면에 고정화 가능한 미립자를 포함한다. 미립자는, 표면에 프로테아제가 고정화된 상태에서 제공되어도 된다. 이 킷의 다공질체와 시료(예를 들어 혈액 등의 검체)를 접촉시킴으로써, 시료 중의 목적 물질(항체 등의 기질 단백질)을 다공질체의 세공 내에 고정화할 수 있다. 기질 단백질을 고정화한 후의 다공질체를, 프로테아제가 표면에 고정화된 미립자와 액체 중에서 접촉시킴으로써, 기질 단백질이 위치 선택적으로 프로테아제 소화된다.
상기 방법에 의해 얻어진 펩티드 단편을 질량 분석 등에 의해 분석함으로써, 기질 단백질의 검출(동정)이나 정량을 행할 수 있다. 본 발명에서는, 기질 단백질이 위치 선택적으로 프로테아제 소화되고 있기 때문에, 측정 시료 중에 포함되는 펩티드 단편의 종류를 대폭으로 적게 할 수 있다. 그로 인해, 질량 분석의 조건 설정을 간략화할 수 있어, 분석 정밀도의 향상도 기대할 수 있다.
예를 들어, 기질 단백질이 항체인 경우, 본 발명의 방법에 따르면, 상보 결정 영역을 포함하는 Fab 영역의 위치 선택적인 프로테아제 소화가 가능하기 때문에, 항체의 상보성 결정 영역의 적어도 일부의 서열을 포함하는 펩티드 단편을 검출 대상으로 할 수 있다. 상보성 결정 영역은 각 항체에 특이적인 아미노산 서열을 갖고 있기 때문에, 상보 결정 영역의 서열을 포함하는 펩티드 단편의 분석에 의해, 항체의 검출이나 정량을 행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 간편한 방법으로, 항체 등의 단백질을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하여, 펩티드 단편을 얻을 수 있다. 본 발명의 방법을 항체에 적용한 경우, 항체의 Fc 영역의 소화가 억제되고, CDR을 포함하는 Fab 영역이 선택적으로 프로테아제 소화되어, 항체의 동정에 중요한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편의 시료 중의 농도가 높아진다.
본 발명의 방법에 의해, 측정 시료 중에 포함되는 펩티드의 종류를 대폭으로 적게 할 수 있기 때문에, 질량 분석의 조건 설정을 간략화할 수 있어, 분석 정밀도의 향상도 기대할 수 있다. 얻어진 펩티드 단편을 분석함으로써, 혈액 중의 항체 의약 농도의 정량도 가능하다. 그로 인해, 본 발명의 방법은, 전임상이나 임상 시험에 있어서의 항체 의약의 농도 측정 시스템의 전처리 방법으로서도 응용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은, 항체 의약에 한정하지 않고, 많은 단백질에 적용이 가능하며, 의약 산업적인 응용 확대에 더하여, 생체 분자의 상호 작용 해석을 비롯한 기초 연구 분야 등에의 응용도 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 위치 선택적 절단의 원리를 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 항체의 구조를 설명하기 위한 모식도이다.
도 3은 펩티드 단편 조제용 킷의 일 형태를 나타내는 모식도이다.
도 4는 프로테아제의 양비 검토 실험의 전기 영동상이다.
도 5는 프로테아제의 양비 검토 실험의 질량 분석(MALDI-TOFMS) 스펙트럼이다.
도 6은 소화 시간 검토 실험의 질량 분석(MALDI-TOFMS) 스펙트럼이다.
도 7은 트라스투주맙의 트립신 소화 단편의 질량 분석 결과에 기초하는 데이터베이스 해석 결과이다.
도 8은 트라스투주맙의 트립신 소화 단편의 질량 분석(MALDI-TOFMS) 스펙트럼이다.
도 9는 트라스투주맙의 트립신 소화 단편의 LS-MS 측정의 크로마토그램이다.
도 10은 트라스투주맙의 트립신 소화 단편의 질량 분석(LS-MS) 스펙트럼이다.
도 11은 트라스투주맙의 중쇄(A) 및 경쇄(B)의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 도면 중 밑줄은, 본 실험의 질량 분석에 의해 동정된 펩티드 단편을 나타내고 있다.
도 12는 혼합 프로테아제 소화 검토 실험의 전기 영동상이다.
도 13은 혼합 프로테아제 소화 검토 실험의 질량 분석(MALDI-TOFMS) 스펙트럼이다.
본 발명의 펩티드 단편의 조제 방법에서는, 절단 대상의 기질 단백질이, 다공질체의 세공 내에 고정화되고, 기질 단백질이 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 미립자가 액체 중에서 접촉되게 된다. 도 1은, 본 발명에 있어서의 프로테아제 소화의 원리를 설명하기 위한 개념도이다.
미립자(10)(평균 입경 D1)의 표면에는, 프로테아제(15)가 고정화되어 있다. 다공질체(20)는, 다수의 세공(29)(평균 세공 직경 D2)을 갖고, 세공 내에 기질 단백질(25)이 고정화되어 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법에서는, 프로테아제(15) 및 기질 단백질(25) 양쪽이 미소 영역에서 고상으로 고정되어 있고, 고상끼리의 접촉에 의해, 프로테아제 소화가 행해진다.
미립자(10)의 평균 입경 D1은, 다공질체(20)의 평균 세공 직경 D2보다 크다. 그로 인해, 미립자(10)는 세공(29)의 표층 부근에는 액세스할 수 있지만, 세공(29)의 깊숙한 곳에는 액세스할 수 없다. 이에 수반하여 미립자(10) 표면에 고정화된 프로테아제(15)도, 세공(29)의 깊숙한 곳에는 액세스할 수 없다. 도 1에 있어서, 세공(29) 부근의 점선은, 프로테아제(15)를 액세스할 수 있는 영역의 경계를 나타내고 있다.
이와 같이, 세공(29) 내의 기질 단백질(25)에의 프로테아제(15)의 액세스가 위치 특이적으로 제한되어, 기질 단백질의 액상측(도 1에 있어서 'Y'자의 부분)으로의 상대적인 액세스 확률이 높아진다. 이에 의해, 기질 단백질(25)을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하여, 펩티드 단편을 얻을 수 있다.
[기질 단백질]
기질 단백질(25)은, 분석 대상으로 되는 단백질이다. 기질 단백질의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 위치 선택적인 절단을 행하는 관점에서, 프로테아제(15)보다 분자 직경이 큰 것이 바람직하다. 또한, 기질 단백질은 단백질의 복합체여도 된다. 분자 직경은, X선이나 NMR 등에 의한 구조 해석에 기초하여 결정된 수치를 각종 문헌이나 데이터베이스 등으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 항체의 분자 직경은 약 15㎚이다. 또한, X선 작은각 산란 등에 의해 분자 직경을 구할 수도 있고, 분자량으로부터 개산으로 구할 수도 있다. 참고예로서, 한외 여과막의 분리 특성을 조사할 때 마커 분자로서 사용되는 단백질의 분자량과 분자 직경을 표 1에 나타낸다.
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기질 단백질(25)은, 다공질체(20)의 세공(29) 내에 부위 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 기질 단백질(25)이 부위 특이적으로 결합함으로써, 그 결합 부위 이외의 부위가 선택적으로 프로테아제 소화된다. 예를 들어 C 말단이나 N 말단 등에 His 태그(6개 정도의 연속되는 히스티딘 잔기를 포함하는 태그 펩티드)나 비오틴화 펩티드 등의 태그 서열을 붙인 단백질이나, 특정한 기질과 특이적으로 결합하는 효소 등도, 부위 특이적으로 결합하는 단백질로서 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 다공질체의 세공 내에, 부위 특이적으로 결합 가능한 기질 단백질로서, 항체가 특히 바람직하게 사용된다. 항체의 Fc 도메인을 다공질체(20)에 고정화하면, Fab 도메인을 선택적으로 프로테아제 소화할 수 있다. 항체의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 모노클로널 항체가 바람직하다. 모노클로널 항체로서는, 예를 들어 파니투무맙(벡티빅스), 오파투무맙(아르제라), 골리무맙(심포니), 이피리무맙(어보이) 등의 인간 항체; 토실리주맙(악템라), 트라스투주맙(허셉틴), 베바시주맙(아바스틴), 오말리주맙(졸레어), 메폴리주맙(보사트리아), 겜투주맙 오조가마이신(마일로타그), 팔리비주맙(시나지스), 라니비주맙(루센티스), 서톨리주맙(심지아), 오크렐리주맙, 모가물리주맙(포텔리지오), 에쿨리주맙(솔리리스) 등의 인간화 항체; 리툭시맙(리툭산), 세툭시맙(얼비툭스), 인플릭시맙(레미케이드), 바실리시맙(시뮬렉트) 등의 키메라 항체 등을 들 수 있다. 이들은, 항체 의약(분자 표적 치료약)으로서 사용되는 것으로, 임상 시험 등에 있어서, 혈액 중의 항체 농도의 정량이 필요해진다.
나중에 실시예에서 설명하는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 모노클로널 항체의 Fab 도메인을 위치 선택적으로 프로테아제 소화할 수 있어, 얻어진 펩티드 단편의 질량 분석에 의해, 항체의 동정이나 정량을 행할 수 있다. 본 발명의 분석 방법은, 항체의 가변 영역 유래의 펩티드 단편을 검출함으로써, 항체의 동정(검출)이나 정량을 행하는 것이며, 항체 유래의 펩티드 단편을 직접 측정하는 방법이다. 그로 인해, 본 발명의 분석 방법은, 항원 등의 특이적 결합 물질을 필요로 하지 않고, 항체의 종류에 관계없이 적용 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법은, 상기 예시의 항체에 한정되지 않고, 신규로 개발된 모노클로널 항체 등에도 적용할 수 있다.
[다공질체]
다공질체(20)는, 다수의 세공(29)을 갖는 것이면, 그 재료는 특별히 한정되지 않는다. 도 1에서는, 반구 형상의 세공이 도시되어 있지만, 세공의 형상은 특별히 한정되지 않는다. 또한, 다공질막과 같이, 다공질체를 관통하는 세공이 형성된 것을 사용할 수도 있다.
다공질체(20)로서는, 활성탄, 다공질막, 다공질 수지 비즈, 금속 입자 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서도, 상기 기질 단백질을 선택적으로 결합할 수 있는 것이 바람직하고, 기질 단백질을 부위 특이적으로 결합 가능한 것이 특히 바람직하다. 예를 들어, 특정한 단백질 등의 정제에 사용되는 어피니티 칼럼 담체 비즈는, 이러한 요건을 충족시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는, 다공질체(20)의 세공(29) 내에, 기질 단백질(25)과 부위 특이적으로 상호 작용하는 링커 분자(21)가 고정화된 것이 바람직하게 사용된다. 기질 단백질과 링커 분자의 상호 작용으로서는, 화학 결합, 수소 결합, 이온 결합, 착체 형성, 소수적 상호 작용, 반데발스 상호 작용, 정전적 상호 작용, 입체 선택적 상호 작용 등을 들 수 있다.
링커 분자는, 아미노기, 카르복실기, 에폭시기 등의 관능기; 비오틴, 디곡시게닌 등의 표지 화합물; 아비딘, 스트렙토아비딘 프로틴 A, 프로틴 G, 면역 글로불린 등의 단백질; 각종 리간드; 효소의 기질 화합물; 실리카; 금속 킬레이트 등에서, 기질 단백질의 종류나 결합 부위에 따라서, 최적의 것을 적절하게 선택할 수 있다.
기질 단백질(25)이 항체인 경우, 링커 분자(21)로서는, 프로틴 G나 프로틴 A 등이 바람직하게 사용된다. 프로틴 A나 프로틴 G는, 항체의 Fc 도메인과 부위 특이적으로 결합한다. 세공(29) 내에 프로틴 A나 프로틴 G 등의 링커 분자(21)가 고정화된 다공질체(20)를 사용함으로써, 세공 내에, 항체(기질 단백질(25))의 Fc 도메인이 부위 특이적으로 고정화되어, Fab 도메인이 액상측(세공의 표층 부근)에 위치한다. 이와 같이, 세공 내에서 항체를 일정 방향으로 고정화함으로써, 세공 내에서의 항체의 배향이 제어되어, 프로테아제에 의한 Fab 도메인의 위치 선택적 소화가 가능하게 된다.
또한, 세공 내에 기질 단백질을 고정화하여, 고상과 액상의 계면이라고 하는 미세한 환경에 존재시킴으로써, 기질 단백질은 변성을 일으키기 쉬워, 분자의 요동이 섭동을 받아, 프로테아제의 어택을 받을 확률이 향상된다. 또한, 본 발명에서는, 프로테아제가 입자에 고정화됨으로써, 입체적으로 안정되어, 자기 소화가 발생하기 어려운 환경으로 되기 때문에, 프로테아제의 안정성이 증가한다고 생각된다. 그로 인해, 본 발명의 방법에 따르면, 위치 선택적인 프로테아제 소화가 가능해지는 것에 더해, 프로테아제의 고활성을 유지할 수 있다.
다공질체(20)의 세공(29)의 크기는 특별히 한정되지 않는다. 세공의 크기는, 기질 단백질(25)을 고정화했을 때, 세공(29)의 표층 부근에 기질 단백질의 선단 부분, 즉 선택적 소화되어야 할 부위가 위치하도록, 기질 단백질의 분자 직경 등을 고려해서 결정하는 것이 바람직하다. 다공질체(20)의 평균 세공 직경 D2는, 예를 들어 10㎚ 내지 500㎚ 정도의 범위이고, 또한 미립자(10)의 평균 입경 D1보다 작은 범위에서 적절하게 설정된다. 다공질체(20)의 평균 세공 직경 D2는, 예를 들어 20㎚ 내지 200㎚ 정도가 바람직하고, 30㎚ 내지 150㎚ 정도가 보다 바람직하다. 특히 기질 단백질(25)이 항체인 경우에, Fc 도메인을 세공 내에 고정화하고, Fab 도메인을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하기 위해서는, 다공질체의 세공 직경은, 30㎚ 내지 150㎚가 바람직하고, 40㎚ 내지 120㎚가 보다 바람직하고, 50㎚ 내지 100㎚가 더욱 바람직하다.
링커 분자의 크기는, 세공이나 기질 단백질의 크기를 고려하여, 기질 단백질의 선택적 절단 부위가, 세공의 표층 부근에 위치하도록 선택된다. 링커 분자와 기질 단백질이 결합한 상태의 분자 사이즈는, 다공질체의 세공 직경의 0.5배 내지 1.5배 정도가 바람직하고, 0.6배 내지 1.2배 정도가 보다 바람직하고, 0.7배 내지 1.1배 정도가 더욱 바람직하고, 0.8배 내지 1배 정도가 특히 바람직하다. 또한, 다공질체(20)에 링커 분자가 고정되어 있지 않고, 다공질체의 세공 내에 기질 단백질이 직접 결합되어 있는 경우에는, 기질 단백질의 분자 직경과 다공질체의 세공 직경이, 상기 관계를 만족하는 것이 바람직하다.
[기질 단백질의 고정화]
기질 단백질(25)을, 다공질체(20)의 세공(29) 내에 고정화하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 기질 단백질과 다공질체(또는 다공질체에 고정화된 링커 분자)의 특성 등에 따라서 적절한 방법을 채용할 수 있다. 예를 들어, 세공 내에 protein A나 protein G가 고정화된 다공질체에 항체를 고정화하는 경우에는, 다공질체의 현탁액과 항체를 포함하는 용액을 혼합함으로써, 세공 내에 항체를 용이하게 고정화할 수 있다.
다공질체와 기질 단백질의 양비는, 목적에 따라서 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들어, 기질 단백질의 정량 분석을 행하는 경우, 시료 중의 기질 단백질의 거의 전량이 다공질체에 고정화될 것이 요망된다. 그로 인해, 시료 중의 기질 단백질의 추정 함유량에 대하여, 다공질체의 양이 과잉이 되도록 양비를 설정하는 것이 바람직하다.
[프로테아제]
프로테아제(15)는, 기질 단백질의 아미노산 서열을 인식하여, 특정한 서열의 특정한 결합을 선택적으로 절단한다. 본 발명에 있어서는, 프로테아제(15)가, 다공질체(20)의 세공(29) 내에 고정화된 기질 단백질(25)을, 특정한 아미노산 서열 부위에서 절단하여, 펩티드 단편이 얻어진다.
프로테아제로서는, 트립신(염기성 아미노산 잔기(Arg 및 Lys)의 C 말단측에서 펩티드를 절단함), 리실 엔도펩티다아제(Lys 잔기의 C 말단측에서 펩티드를 절단함), 아르기닌 엔도펩티다아제(Arg 잔기의 C 말단측에서 펩티드를 절단함), 키모트립신(방향족 아미노산 잔기(Phe, Tyr 및 Trp)의 C 말단측에서 펩티드를 절단함), V8 프로테아제(Glu 잔기의 C 말단측에서 펩티드를 절단함), 펩신, 파파인 등을 들 수 있다. 또한, 프로테아제는 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
프로테아제 소화 후의 기질 단백질의 펩티드 단편을 측정 자료로서 질량 분석에 제공하는 경우에는, 자기 소화가 적고, 절단 서열의 선택성이 높은 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 시판되고 있는 프로테아제를 사용하는 경우, 질량 분석 그레이드나 서열 결정(시퀀스) 그레이드의 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 생체 유래의 네이티브의 트립신은, 자기 소화에 의해 키모트립신 모양의 활성을 나타내는 의사 트립신을 생성하기 때문에, 절단 부위의 특이성이 낮다고 알려져 있다. 그로 인해, 질량 분석 그레이드로서, 트립신의 리신 잔기를 환원 메틸화해서 자기 소화에 대한 저항성을 높인 것이 시판되고 있다.
기질 단백질의 프로테아제 소화의 위치 선택성을 높이기 위해서는, 프로테아제가 기질 단백질에 액세스할 수 있는 영역을 한정하는 것이 중요하다. 그로 인해, 프로테아제의 분자 직경은, 기질 단백질의 분자 직경보다 작은 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 프로테아제의 분자 직경은, 10㎚ 이하가 바람직하고, 8㎚ 이하가 보다 바람직하고, 6㎚ 이하가 더욱 바람직하고, 5㎚ 이하가 특히 바람직하다. 또한, 트립신이나 리실 엔도펩티다아제 등, 분자량이 30kDa 정도인 단백질의 분자 직경은 4㎚ 정도이다(앞에서 게재한 표 1 참조).
상기 프로테아제 중에서도, 본 발명에 있어서는, 트립신이 특히 바람직하게 사용된다. 상술한 바와 같이, 트립신은 분자 직경이 작고, 또한 활성 부위가 분자의 내부에 존재하고 있다. 그로 인해, 활성 부위가 기질 단백질에 액세스할 수 있는 영역이 제한되어, 프로테아제 소화의 위치 선택성을 높일 수 있다. 특히, 기질 단백질이 항체인 경우에는, 프로테아제로서 트립신을 사용하는 것이 바람직하다.
프로테옴 해석 연구에 있어서, 펩티드 단편의 회수율을 향상시키는 기술로서, 트립신과 리실 엔도펩티다아제에 의한 혼합 소화가 최근에 착안되고 있다(J. Proteome Res., 2012, 11(11), 5145-5156). 이것은, 트립신이 입체 구조의 외측으로부터 단계적으로 분해 반응을 진행시키는 특징을 갖는 데 반해, 리실 엔도펩티다아제는, 주로 항체의 힌지 영역을 최초로 절단하는 것에 기인한다고 생각된다. 이에 비해, 항체의 힌지 영역의 절단을 억제하여, Fab 도메인(보다 바람직하게는 Fab 도메인의 V 영역)을 선택적으로 절단하기 위해, 본 발명에서는, 트립신을 단독으로 사용하거나, 리실 엔도펩티다아제 등을 병용하는 경우에도, 전체 프로테아제 중의 트립신의 양을 90% 이상으로 하는 것이 바람직하다.
[미립자]
미립자(10)는, 그 표면에 프로테아제(15)를 고정하여, 다공질체(20)의 세공(29) 내에 고정화된 기질 단백질(25)에의 프로테아제의 액세스를 제어할 목적으로 사용된다. 그로 인해, 미립자(10)는, 다공질체(20)의 세공(29)의 깊숙한 곳까지 들어가지 못하도록, 그 평균 입경 D1이, 다공질체(20)의 평균 세공 직경 D2보다 큰 것이 바람직하다. 미립자(10)의 평균 입경 D1은, 다공질체(20)의 평균 세공 직경 D2의 1.2배 이상이 보다 바람직하고, 1.5배 이상이 더욱 바람직하고, 1.8배 이상이 특히 바람직하다.
미립자(10)의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 다공질체(20)의 세공(29)에의 프로테아제의 액세스를 균일화하는 관점에서, 구상의 미립자가 바람직하다. 또한, 미립자(10)는, 평균 입경이 균일한 것이 바람직하다.
다공질체(20)의 평균 세공 직경이 30 내지 150㎚ 정도인 경우, 미립자(10)의 평균 입경 D1은 100㎚ 이상이 바람직하고, 150㎚ 이상이 보다 바람직하다. 기질 단백질(25)이 항체이며, 다공질체(20)의 평균 세공 직경이 50㎚ 내지 100㎚ 정도인 경우, 미립자(10)의 평균 입경은, 120㎚ 이상이 바람직하고, 150㎚ 이상이 보다 바람직하고, 170㎚ 이상이 특히 바람직하다. 미립자(10)의 평균 입경 D1의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 프로테아제에 의한 소화 효율을 높이는 관점에서, 1㎛ 이하가 바람직하고, 500㎚ 이하가 보다 바람직하고, 300㎚ 이하가 더욱 바람직하다.
미립자(10)는, 상기 프로테아제를 표면에 고정화할 수 있는 것이면, 그 재질은 특별히 한정되지 않고, 금속이나 수지 등이 적절하게 사용된다. 또한, 금속 표면을 수지로 피복한 것이나, 수지 표면을 금속으로 피복한 것 등을 사용할 수도 있다.
미립자(10)는, 표면에의 비특이적인 단백질의 흡착이 억제되어, 프로테아제를 선택적으로 고정화할 수 있는 것이 바람직하며, 예를 들어 도 1에 도시한 바와 같이, 미립자의 표면이, 프로테아제와 특이적으로 결합하는 스페이서(11)로 수식된 미립자가 적절하게 사용된다. 스페이서는, 프로테아제와 결합 가능하고, 또한 프로테아제를 실활시키지 않는 것이 바람직하다.
또한, 미립자(10) 표면에 고정화된 프로테아제(15)의 액세스 범위를 제어하는 관점에서, 스페이서(11)는 분자 직경이 작은 것이 바람직하다. 스페이서의 분자 직경은, 5㎚ 이하가 바람직하고, 3㎚ 이하가 보다 바람직하고, 2㎚ 이하가 더욱 바람직하다. 또한, 스페이서의 분자량은 2000 이하가 바람직하고, 1500 이하가 보다 바람직하고, 1000 이하가 더욱 바람직하고, 800 이하가 특히 바람직하다. 상기 분자 직경으로, 프로테아제를 고정화할 수 있는 스페이서 분자는, 비단백질이 바람직하고, 아미노기, 아미드기, 에스테르기, 에폭시기, 카르복실기, 비오틴, 아비딘, 킬레이트 등의 관능기를 갖는 분자가 바람직하다. 예를 들어, 트립신의 고정에는, 에스테르기를 갖는 스페이서가 바람직하게 사용된다. 또한, 프로테아제의 고정화 효율을 높이기 위해서, 에스테르기가 활성화된 분자도 스페이서로서 바람직하게 사용된다.
본 발명에서는, 스페이서 분자로 수식된 미립자의 시판품을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 어피니티 정제용 미립자로서, 에스테르기가 N-히드록시숙신이미드로 활성화된 스페이서 분자로 수식된 미립자가, 상품명 「FG beads NHS」로서 시판되고 있다.
[프로테아제 고정화 미립자의 조제]
프로테아제(15)를 미립자(10)의 표면에 고정화하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 프로테아제와 미립자(또는 미립자 표면을 수식하는 스페이서 분자)의 특성 등에 따라서 적당한 방법을 채용할 수 있다. 예를 들어, 트립신을 스페이서 수식된 미립자 표면에 고정화하는 경우에는, 미립자의 현탁액과 트립신을 포함하는 용액을 혼합함으로써, 미립자 표면에 프로테아제를 고정화할 수 있다.
미립자 표면에 프로테아제를 고정화한 후에, 미립자 표면의 프로테아제와 미결합의 활성 부분을 불활성화시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 미립자 표면에 프로테아제가 고정화되어 있지 않은 스페이서 분자가 존재하면, 미결합의 스페이서 분자가, 시료 중의 협잡물 등과 결합하여, 프로테아제 소화에 악영향을 미치거나, 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편이 미립자에 고정화되는 등의 문제를 발생시키는 경우가 있다. 프로테아제를 고정화한 후에, 미결합의 스페이서를 블록함으로써, 이러한 문제가 억제된다. 프로테아제와 미결합의 활성 부분을 불활성화하는 방법으로서는, 화학 수식이 바람직하다. 예를 들어, 활성화 에스테르기는, 아민과의 반응에 의해 아미드 결합을 형성해서 불활성화된다.
[프로테아제 소화]
기질 단백질(25)이 고정화된 다공질체(20)와, 프로테아제(15)가 표면에 고정화된 미립자(10)를 액체 중에서 접촉시킴으로써, 기질 단백질이 프로테아제 소화되어, 펩티드 단편이 산생된다.
본 발명에 있어서의 프로테아제 소화의 조건은 특별히 한정되지 않고, 일반적인 프로테아제 소화와 마찬가지 조건을 적절하게 채용할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 적정 pH근방으로 조정된 완충 용액 속에서, 통상 37℃ 정도의 온도에서, 4시간 내지 20시간 정도 인큐베이트하는 것이 바람직하다.
기질 단백질이 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 미립자의 혼합량비도 특별히 제한되지 않고, 기질 단백질의 양에 따른 프로테아제양으로 되도록 설정하면 된다. 또한, 일반적인 프로테아제 소화 조건은, 기질 : 프로테아제 = 100 : 1 내지 20 : 1(중량비) 정도이다. 이에 비해, 본 발명에서는, 다공질체와 미립자의 조합에 의해, 기질 단백질과 프로테아제의 액세스가 물리적으로 제한되기 때문에, 일반적인 프로테아제 소화에 비해, 프로테아제양을 많게 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 기질 단백질 : 프로테아제 = 30 : 1 내지 3 : 1 정도가 바람직하고, 15 : 1 내지 4 : 1 정도가 보다 바람직하고, 10 : 1 내지 5 : 1 정도가 더욱 바람직하다.
일반적으로, 혈액 등의 생체 시료 중의 항체를 선택적으로 프로테아제 소화하는 경우, 먼저 protein G 등이 고정화된 입자와 시료를 혼합하여, 입자에 항체를 고정화시켜서, 협잡물을 제거한 후, 입자로부터 항체를 용출시키고, 용출 후의 항체를 요소나 구아니딘으로 변성하여, 프로테아제 소화를 행할 필요가 있다. 이에 비해, 본 발명의 방법에서는, 다공질체에 항체를 고정화시킨 상태 그대로 프로테아제 소화가 행해진다. 또한, 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편은 액상 내에 존재하기 때문에, 항체의 용출이나 변성 조작을 행하지 않고, 위치 선택적으로 Fab 도메인의 펩티드 단편이 얻어진다. 이와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 종래법에 비해 간편한 조작으로, 또한 위치 선택적으로 펩티드 단편의 회수를 행할 수 있다.
[펩티드 단편 조제용 킷]
미리 준비된 펩티드 단편 조제용 킷을 사용하여, 본 발명에 따른 펩티드 단편의 조제를 행할 수도 있다. 본 발명의 펩티드 단편 조제용 킷은, 기질 단백질을 고정화 가능한 세공을 갖는 다공질체와, 프로테아제를 표면에 고정화 가능한 미립자를 포함한다. 킷은, 또한 프로테아제를 포함하고 있어도 된다. 또한, 프로테아제가 표면에 고정화된 상태 미립자가 제공되어도 된다.
도 3은, 본 발명의 펩티드 단편 조제 킷의 일 실시 형태를 도시하는 도면이다. 도 3에 있어서, 프로테아제를 표면에 고정화 가능한 미립자(110)는, 현탁액(131)으로서 제공된다. 킷은, 또한 프로테아제를 포함하고 있어도 된다. 또한, 미립자(110)가, 프로테아제가 표면에 고정화된 상태에서 제공되어도 된다. 스핀 칼럼(132)은, 내용기(135)와 외용기(136)를 포함하고, 이들은 착탈 가능한 형상으로 형성되어 있다. 내용기(135)의 저부에, 기질 단백질을 고정화 가능한 세공을 갖는 다공질막(120)이 배치되어 있다. 다공질막(120)은, 상압에서는 액체를 투과하지 않을 정도의 세공 직경을 갖고 있다.
이 스핀 칼럼을 사용하여, 펩티드 단편의 조제를 행하는 경우, 먼저, 기질 단백질을 포함하는 시료(예를 들어, 혈액 등의 검체)를 스핀 칼럼의 내용기(135) 안에 넣고, 시료와 다공질막을 접촉시킨다. 시료와 다공질막을 균일하게 접촉시키기 위해, 필요에 따라서 용기를 진탕해도 된다. 이 조작에 의해, 다공질막(120)의 세공 내에, 항체 등의 기질 단백질이 고정화된다.
기질 단백질을 다공질막에 고정화한 후의 시료 액체는, 내용기(135)로부터 배출하는 것이 바람직하다. 피펫팅 등의 조작에 의해, 내용기의 개구부로부터 액체를 배출해도 되고, 원심 분리 등에 의해 다공질막을 통해서 내용기의 저부로부터 액체를 배출해도 된다. 그 후, 필요에 따라서, 적절한 용액에 의해 세정이 행해진다.
기질 단백질이 다공질막(120)에 고정화된 내용기(135) 안에, 프로테아제가 표면에 고정화된 미립자(110)가 더해진다. 전술한 바와 같이, 프로테아제는 미리 미립자에 고정화된 상태에서 제공되어도 되고, 사용 직전에 미립자 표면에 프로테아제를 고정화해서 사용할 수도 있다.
프로테아제 소화 조건의 최적화 등을 목적으로, 필요에 따라서 버퍼 등의 용액을 더 첨가해도 된다. 내용기 안의 다공질막(120)에 고정화된 기질 단백질은, 미립자(110) 표면에 고정화된 프로테아제에 의해 소화된다. 프로테아제 소화의 조건은, 전술한 바와 같이 적절하게 설정될 수 있다. 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편은, 액상 내로 이동한다.
프로테아제 소화 후의 액상을 회수함으로써, 기질 단백질이 위치 선택적으로 절단된 펩티드 단편이 얻어진다. 액상의 회수 방법은 특별히 한정되지 않지만, 원심 분리로부터, 다공질막을 통해서, 내용기(135)의 저부로부터, 외용기(136) 안으로 회수하는 방법이 간편하다. 그 후, 다공질막의 세공 내에 유지된 펩티드 단편의 용출 등을 목적으로 하여, 세정이나 용출 등의 조작 등이 행해져도 된다.
이와 같이, 킷을 사용함으로써, 본 발명에 따른 펩티드 단편 조제의 조작을 보다 간편하게 할 수 있어, 장치에 의한 자동화도 용이하게 이룰 수 있다. 특히, 트립신 등은, 미립자 표면에 고정화된 상태에서도 활성을 유지할 수 있기 때문에, 프로테아제가 미립자 표면에 고정화된 상태에서 킷의 구성 요소로서 제공되면, 펩티드 단편 조제의 조작을 더 간략화할 수 있다.
[분석]
상기에서 얻어진 펩티드 단편을 포함하는 시료를, 크로마토그래피나 질량 분석에 의해 분석함으로써, 기질 단백질의 동정이나 정량을 행할 수 있다. 본 발명에서는, 기질 단백질이 위치 선택적으로 프로테아제 처리되기 때문에, 시료 중에 포함되는 펩티드 단편의 종류가 감소되어 있다. 그로 인해, 질량 분석 등에 의한 분석 조건의 설정을 용이하게 이룰 수 있다. 분석 시에 있어서는, 필요에 따라서, 탈염, 가용화, 추출, 농축, 건조 등의 처리를 행한 후, 시료를 분석에 사용해도 된다.
프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편으로부터, 기질 단백질의 동정이나 정량을 행하기 위해서는, 질량 분석이 적합하다. 질량 분석은, 아미노산 서열을 결정 가능하기 때문에, 펩티드 단편이 항체 등의 특정한 단백질에서 유래하는 펩티드 단편인지 여부를 판별 가능하다. 또한, 피크 강도에 기초하여 시료 중의 펩티드 단편의 농도를 결정할 수 있다.
질량 분석에 있어서의 이온화법은 특별히 한정되지 않고, 전자 이온화(EI)법, 화학 이온화(CI)법, 전계 탈리(FD)법, 고속 원자 충돌(FAB)법, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화(MALDI)법, 일렉트로 스프레이 이온화(ESI)법 등을 채용할 수 있다. 이온화된 시료의 분석 방법도 특별히 한정되지 않고, 자장 편향형, 사중극(Q)형, 이온 트랩(IT)형, 비행 시간(TOF)형, 푸리에 변환 이온 싸이클로트론 공명(FT-ICR)형 등을, 이온화법에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 또한, 삼련 사중극형 질량 분석 장치 등을 사용하여, MS/MS 분석, 또는 MS3 이상의 다단계 질량 분석을 행할 수도 있다.
펩티드 단편의 분리를 보다 확실하게, 분석 정밀도를 높이는 등의 목적으로, 질량 분석에 제공하기 전의 시료를, 액체 크로마토그래프(LC)나, 고상 추출(SPE) 등에 의해, 분리·농축해도 된다. LC에 의해 시료의 분리를 행하는 경우, 질량 분석의 전단으로서 LC를 구비하는 LC/MS를 사용하여, LC로부터의 용출액을 직접 이온화하여 질량 분석에 제공해도 된다. LC와 이중 질량 분석을 조합한 LC/MS/MS나 LC/MSn에 의해 분석을 행할 수도 있다. 또한, LC로부터의 용출액을 한번 분취하고 나서, 질량 분석에 제공해도 된다. LC의 칼럼이나 SPE의 담체는 특별히 한정되지 않고, 펩티드의 분석에 일반적으로 사용되는 C30, C18, C8, C4 등의 소수 칼럼이나, 친수성 어피니티 크로마토그래피용 담체 등을 적절하게 선택해서 사용할 수 있다.
질량 분석 결과에 기초하여, 항체 등의 단백질을 동정하기 위해, 기존의 데이터베이스를 사용할 수도 있다. 본 발명에서는, 항체 등의 기질 단백질이 위치 특이적으로 프로테아제 소화된 펩티드 단편이 사용되기 때문에, 데이터베이스 검색에 의한 히트율이나 데이터의 정확도가 높아진다. 또한, 다단계의 질량 분석 등에 의해, 펩티드 단편의 아미노산 서열을 특정함으로써, 기질 단백질을 동정할 수도 있다. 예를 들어, 기질 단백질이 항체인 경우, 항체에 특이적인 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 일부의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편의 산 서열을 결정하면, 항체를 동정할 수 있다.
또한, CDR의 서열을 포함하는 특정한 펩티드 단편의 검출 결과에 기초하여, 항체의 검출이나 정량을 행하는 경우, 검출 대상의 펩티드는, 아미노산 잔기수가 5 내지 30 정도가 바람직하고, 7 내지 25 정도가 보다 바람직하다. 아미노산 잔기수가 과도하게 작으면, 협잡물이나 동일 단백질의 다른 부위에서 유래하는 펩티드 단편과의 구별이 되기 어려워, 오검출 등의 원인이 될 수 있다. 또한, 아미노산 잔기수가 과도하게 크면, 이온화가 곤란해지는 등의 이유에 의해, 검출이 곤란해지거나, 정량성이 저하하는 경우가 있다.
기질 단백질의 농도를 정량하는 경우, 검출된 펩티드 단편 이온(다단계 MS의 경우에는, 펩티드 단편 이온의 개열에 의해 얻어진 개열 이온)의 피크 면적이나 피크 강도에 기초하여, 기질 단백질의 양을 산출할 수 있다. 예를 들어, 미리 구해진 검량선(교정 곡선)과 피크 면적의 관련지음이나, 시료 내에 첨가된 내부 표준 유래로 하는 피크 면적과 시료 유래의 피크 면적의 관련지음 등에 의해, 시료 중의 펩티드 단편의 농도가 산출되고, 펩티드 단편 농도에 기초하여, 기질 단백질의 양이나 농도가 산출된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 기질 단백질과 프로테아제의 양쪽을 고상으로 고정하고, 양자의 액세스를 물리적으로 제어함으로써, 기질 단백질의 특정한 부위를 위치 선택적으로 프로테아제 소화할 수 있다. 얻어진 펩티드 단편은, 질량 분석법 등의 기지의 방법에 의해 분석 가능하고, 복잡한 공정을 거치지 않고, 시료 중의 단백질의 동정이나 정량을 행할 수 있다.
본 발명의 방법은, 특히, 항체의 검출이나 정량에 적합하며, Fab 영역을 선택적으로 프로테아제 소화하고, 얻어진 펩티드 단편 시료의 질량 분석에 의해, 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편의 서열이나 양을 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은, 조작이 간편하고, 또한 재현성이나 정량성을 확보할 수 있음과 함께, 자동화도 이룰 수 있기 때문에, 약물 동태의 해석, 항원 항체 반응을 사용한 상호 작용의 해석, 각종 상호 작용 해석, 면역 침강 단백질의 동정 등의 기초 연구에도 적용할 수 있다. 그 외에, 항체 의약 등의 생체 분자 의약의 서열 해석, 품질 보증, 후발 의약품의 동일성 확인 등에의 응용도 기대할 수 있다.
실시예
이하에서는, 본 발명의 방법에 의해, 인간 면역글로블린 G(IgG) 및 트라스투주맙(상품명: Herceptin)을 프로테아제 소화하고, 얻어진 펩티드 단편 시료를 질량 분석에 제공한 실험예를 나타낸다. 또한, 본 발명은 이하의 예에 한정되는 것은 아니다.
이하에 있어서, %의 기재는, 특별한 언급이 없는 한 중량%를 나타낸다. 본 실험예에서 사용한 시약 등은 하기와 같다.
트립신(시퀀스 그레이드, promega)
리실 엔도펩티다아제(질량 분석 그레이드, 와코쥰야꾸고교)
2-모르폴리노에탄술폰산(MES, 도진가가꾸)
2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES, 도진가가꾸)
트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris, 와코쥰야꾸고교)
상기 이외의 유기 용매 등, 특별히 기재되지 않은 것은, 와코쥰야꾸고교로부터 입수하였다.
또한, 각 버퍼는, 정밀 pH미터를 사용해서 pH를 조정한 이하의 완충액을 사용하였다.
MES 버퍼: 25mM MES-NaOH, pH5.5
HEPES 버퍼: 25mM HEPES-NaOH, pH7.0
에탄올아민 버퍼: 1M ethanolamine-HCl, pH8.0
Tris 버퍼: 25mM Tris-HCl, pH8.0
<항체 고정화 다공질체의 제작>
MES 버퍼 200㎕ 속에, 다공질 비즈의 표면에 Protein G를 결합한 수지 비즈의 현탁액(Pierce Biotechnology, Protein G UltraLink resin, 평균 입경: 100㎛, 세공 직경: 50 내지 100㎚)을 5㎕ 첨가하고, 거기에 항체 용액을 첨가한 후, 실온에서 약 1시간 천천히 교반하고, 수지 비즈 표면의 Protein G에 항체를 결합시켜서 고정화하였다. 그 후, 4℃에서 원심 분리(15000rpm, 1분)하여 수지 비즈를 침강시키고, 상청을 제거한 후, Tris 버퍼에 의한 세정과 원심을 2회 반복하여, Tris 버퍼(200㎕) 안에 다공질 비즈를 현탁시켰다. 또한, 상기 항체 용액으로서는, 인간 면역 글로불린(IgG) 용액(10㎎/㎖, Sigma-Aldrich) 및 트라스투주맙(Herceptin, 20㎎/㎖, 중외 제약) 용액을 사용하였다.
<프로테아제 고정화 미립자의 조제>
평균 입경 190㎚의 미립자의 표면이, 카르복시기가 N-히드록시숙신이미드로 활성화된 스페이서(하기 화학식(L은 미립자 표면에의 결합 부위) 참조, 스페이서 길이 1㎚)로 수식된 프로테아제 고정화용 나노 미립자(다마가와세이끼, FG beads NHS)를 사용하였다.
Figure pct00002
FG beads의 이소프로판올 현탁액 50㎕를, 4℃에서 원심 분리(15000rpm, 5분)해서 미립자를 침강시켜서, 상청을 제거한 후, 메탄올로 세정하였다. 50㎍의 프로테아제를 포함하는 용액을 200㎕의 HEPES 버퍼에 용해한 것을, 상기 미립자에 더하여, 미립자를 현탁시켰다. 또한, 현탁 시에 있어서는, 현탁액의 온도가 상승하지 않도록, 수초의 초음파 처리를 행하였다.
이 미립자의 현탁액을, 4℃에서 30분 교반하고, 4℃에서 원심 분리(15000rpm, 5분)해서 미립자를 침강시키고, 상청을 제거한 후, 에탄올아민 버퍼 200㎕를 첨가하여 비즈를 현탁시켜서, 4℃에서 30분 교반하여, 미립자 표면의 잉여의 N-히드록시숙신이미드기를 에탄올아민에 의해 차단하였다. 그 후, 4℃에서 원심 분리(15000rpm, 5분)해서 미립자를 침강시키고, 상청을 제거한 후, Tris 버퍼에 의한 세정과 원심을 2회 반복하여, Tris 버퍼(100㎕) 속에 현탁시켰다. 이 현탁액 중의 프로테아제 농도는, 0.5㎍/㎕이다.
[실험 1: 다공질체에의 항체 고정화량의 확인]
항체 고정화 다공질체의 제작에 있어서, 100㎍의 IgG에 대한 Protein G 결합 수지 비즈 현탁액의 양을 0 내지 20㎕의 범위에서 변화시키고, 상청액을 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석하여, 전기 영동상 밴드 픽셀수로부터, 상청 내에 남은 미결합 IgG의 개산량(항체 잔량)을 구하였다. Protein G 결합 수지 비즈양의 증가에 수반하여, 항체 잔량이 저감되는 경향이 보이고, Protein G 결합 수지 비즈양이 10㎕인 경우의 항체 잔량은 약 3%이고, Protein G 결합 수지 비즈의 카탈로그 스펙을 거의 재현하고 있음을 확인할 수 있었다(데이터 도시하지 않음).
[실험 2: 항체와 프로테아제의 양비의 검토]
IgG 고정화 다공질체 현탁액(Protein G-IgG)과 프로테아제 고정화 미립자(FG beads-Tripsin)를 혼합하여, 37℃에서 15시간 천천히 교반하면서, 프로테아제 소화를 행하였다. 그 후, 4℃에서 원심 분리(15000rpm, 5분)해서 수지를 침강시켜서, 액상(상청)을 회수하였다. 프로테아제의 양이, 5㎍(수준 1), 10㎍(수준 2), 25㎍(수준 3)으로 되도록, 프로테아제 고정화 미립자의 양을 변화시켜서 상기 실험을 행하였다. 수준 4 내지 6에서는, IgG 고정화 다공질체 현탁액 대신에, IgG가 고정화되지 않은 다공질체(Protein G UltraLink resin)를 그대로 사용해서 마찬가지 실험을 행하였다. 또한, 수준 7, 8에서는, 다공질체를 사용하지 않고, 프로테아제 고정화 미립자(FG beads-Tripsin)만을 37℃에서 15시간 인큐베이트하였다.
상기 각 실험의 수준을 표 2에 나타낸다. 표 2에 있어서의 중량(㎍)은 시료 중의 단백질(IgG 또는 트립신)의 양이다. 얻어진 상청의 SDS-PAGE 전기 영동상을 도 4에 도시한다. 도 4에 있어서, 좌측 단부의 레인은 분자량 마커이다.
Figure pct00003
(질량 분석)
상기 수준 1 내지 6의 상청을, MALDI-TOFMS(시마즈세이사꾸쇼, AXIMA Resonance MALDI-QIT TOF MS)에 의해 분석하였다. 먼저, 상청 20㎕에, 최종 농도가 0.5%로 되도록 트리플루오로아세트산을 첨가하여, 소수성 수지 충전 칩(Millipore, ZipTip uC18)을 사용해서 정제를 행한 후, 1㎕로 2회의 용출을 행하였다. 용출액은 직접 MALDI 스테인리스 타깃 위에 어플라이하여, 클린 벤치 내에서 풍건시켰다. 풍건 후, 10㎎/㎖의 2,5-디히드록시 벤조산 용액(DHBA, 시마즈 GLC, 물/아세토니트릴=50/50)을 1㎕ 중층하여, 질량 분석을 행하였다. 또한, 장치의 m/z는, Angiotensin II peptide(m/z=1046.54, Sigma-Aldrich)와 ACTH fragment peptide(m/z=2465.20, Sigma-Aldrich)를 사용해서 행하였다. MS 스펙트럼을 도 5에 도시한다.
도 4의 수준 4 내지 6의 밴드는, 모두 수준 7, 8의 밴드와 동일하였다. 또한, 도 5의 수준 4 내지 6에서 검출된 m/z=842, 1045, 2211, 2283의 피크는, 모두 트립신의 자기 소화 단편이다. 이 결과로부터, 프로테아제 고정화 미립자와 Protein G 다공질체를 접촉시켜도, Protein G는 소화되지 않음을 알 수 있다. 이것은, 다공질체의 세공 직경이, 프로테아제 고정화 미립자의 입경보다 작기 때문에, 미립자 표면에 고정화된 트립신이, 세공 내의 Protein G에 액세스할 수 없는 데에 기인한다고 생각된다.
도 5의 수준 1 내지 3에서는, 트립신의 자기 소화 단편 이외에, m/z=835, 913, 1187, 1287, 1510, 1678, 1946의 피크가 검출되고, 이들은 모두 IgG의 트립신 소화 펩티드 단편인 것이 확인되었다. 이 결과로부터, IgG를 고정화한 다공질체와, 트립신을 고정화한 미립자를 접촉시킴으로써, 다공질체의 Protein G를 소화하지 않고, IgG를 선택적으로 소화할 수 있음이 나타났다.
도 4의 수준 1 내지 3을 대비하면, 트립신양의 증가에 수반하여, 고분자측의 밴드가 감소되어 있어, 항체의 소화 반응이 잘 진행되었음을 알 수 있다. 한편, 트립신양의 증가에 수반해서 자기 소화도 현저해졌다. 이들 결과를 근거로 해서, 수준 2(기질 : 효소 비율 = 10 : 1)를 표준 조건으로 설정하고, 이후의 조건 검토를 행하였다.
또한, 일반적인 프로테아제 소화 조건은, 기질 단백질 : 프로테아제 = 100 : 1 내지 20 : 1이다. 본 방법에서는, 다공질체와 미립자의 조합에 의해, 기질 단백질과 프로테아제의 액세스가 물리적으로 제한되고 있기 때문에, 일반적인 프로테아제 소화에 비해, 프로테아제양이 많아져서, 최적의 기질 효소 비율은 10 : 1 내지 5 : 1 정도라고 추측된다.
[실험 3: 소화 시간에 대한 회수 펩티드의 평가]
상기 실험 2의 수준 2의 조건, 즉 IgG 고정화 다공질체 현탁액(IgG 고상량 100㎍)과 프로테아제 고정화 미립자(트립신 고상량 10㎍)를 혼합하고, 37℃에서의 소화 시간을, (1) 15분, (2) 45분, (3) 90분, (4) 180분, (5) 360분, (6) 15시간(밤샘, O/N)으로 하였다. 그 이외에는, 상기 실험 2와 마찬가지로 하여, 트립신 소화를 행하고, 얻어진 시료의 질량 분석을 행하였다. MS 스펙트럼을 도 6에 나타낸다.
도 6에 도시한 바와 같이, 소화 시간의 증가에 수반하여, 펩티드 단편의 피크가 증대되고, 펩티드 단편의 회수량이 증가되었음을 알 수 있다. (5) 360분과 (6) 밤샘를 비교하면, 밤샘쪽이 회수율은 높고, 특히 m/z=1187, 1510, 1678 등의 프로테아제 소화를 받기 쉬운 단편의 집적이 보다 현저해지는 경향이 보였다. 그러나, 이들 단편은, 항체의 C 영역에서 유래하는 단편이고, CDR을 포함하는 펩티드 단편의 분석에는 기여하지 않는 것이다. 그로 인해, 프로테아제 소화 시간을 6시간으로 설정하고, 이후의 검토를 행하였다.
[실험 4: 트라스투주맙의 트립신 소화 및 질량 분석]
항체로서 IgG 대신에 Herceptin을 사용해서 항체 고정화 다공질체를 제작하고, 상기 실험 2, 3에서 선택한 조건, 즉 항체 고상량 100㎍에 대한 프로테아제 고정 미립자량: 10㎍, 소화 시간: 6시간의 조건에서 트립신 소화를 행하고, 질량 분석을 행하여, 질량 분석 결과에 기초하여, 데이터베이스(Mascot server) 해석을 행하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, Herceptin(Chain B, X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized Anti-P185-Her2 Antibody 4d5 And Comparison With Molecular Modeling)이 매우 높은 스코어로 동정되어 있음을 알 수 있다.
본 실험에 있어서, Herceptin의 펩티드 단편이 질량 분석에 의해 검출되었음을 확인하기 위해, 보다 상세한 분석을 행하였다. 도 8은 질량 분석(MALDI-TOFMS) 스펙트럼을 나타낸다.
또한, LC-MS(시마즈세이사꾸쇼, LCMS-8080 Triple-quadrupole ultra high-performance liquid chromatography-MS)에 의해, 소화 후의 상청의 분석을 행하였다. LC-MS의 크로마토그램을 도 9에, MS 스펙트럼을 도 10에 도시한다. 또한, LC-MS의 측정 시에 있어서는, 최종 농도가 0.5%로 되도록 상청에 포름산을 첨가한 것을 시료로서 사용하고, LC 조건은 이하와 같이 하였다.
<HPLC 용액>
용액 A: 0.1% 포름산, 1% 아세토니트릴/수용액
용액 B: 0.1% 포름산, 아세토니트릴 용액
<칼럼>
ShimPack ODS XR-ODS II(내경 2㎜, 칼럼 길이 50㎜)
칼럼 온도: 40℃
유속: 0.4㎖/분
인젝션양: 20㎕
<구배 프로그램>
0-2분 : %B=0
2-10분 : %B=0-40 구배
10-11분 : %B=40-98 구배
11-13분 : %B=98
13-13.5분 : %B=98-0 구배
13.5-15분 : %B=0
트라스투주맙의 중쇄(도 11의 (A), 서열표의 서열 번호 1) 및 경쇄(도 11의 (B), 서열표의 서열 번호 2)에 있어서, 상기 질량 분석으로 검출·동정된 펩티드 서열 부분을 밑줄로 나타내고 있다. 도 11의 (A)에 도시한 바와 같이, 중쇄의 CDR1(서열표의 서열 번호 3), CDR2(서열표의 서열 번호 4), CDR3(서열표의 서열 번호 5) 모두가 검출되었음을 알 수 있다. 또한, 도 11의 (B)에 도시한 바와 같이, 경쇄로는, CDR1(서열표의 서열 번호 6) 및 CDR2(서열표의 서열 번호 7)가 검출되었다. 경쇄의 CDR3(서열표의 서열 번호 8)은 이 서열을 포함하는 트립신 소화 단편의 길이가, 4 아미노산 잔기 또는 37 아미노산 잔기이고, 질량 분석에 적합한 단편을 얻지 못하였기 때문에, 동정할 수 없었지만, 프로테아제의 종류를 변경하면, 질량 분석에 의해 경쇄의 CDR3을 검출 가능한 펩티드 단편을 조제할 수 있다고 생각된다. 또한, 본 실험에서는, 경쇄의 CDR3을 검출할 수 없었지만, 중쇄와 경쇄의 합계 6개의 CDR 중 5개가 검출되었기 때문에, 도 7에 도시한 바와 같이, 데이터베이스 해석에 의해 트라스투주맙이 동정되었다.
이상과 같이, 본 발명의 방법에 의해 조제된 펩티드 단편은, 항체가 위치 특이적으로 프로테아제 소화된 것이기 때문에, 복잡한 측정 조건의 설정을 필요로 하지 않는 질량 분석 측정에 의해, 항체를 동정할 수 있음을 알 수 있다.
[실험 5: 혼합 프로테아제 소화의 검토]
이하에서는, 본 발명의 계에 있어서의 혼합 프로테아제 소화의 적용 가능성을 검토하기 위해, 트립신과 리실 엔도펩티다아제(Lys-C)의 병용계로, 프로테아제 소화 실험을 행하였다.
상기 각 실험예와 마찬가지로, 항체(IgG 또는 Herceptin) 100㎍을 다공질체의 Protein G에 고정화한 항체 고정화 다공질체와, 10㎍의 프로테아제를 고정화한 미립자를, 37℃에서 6시간 교반하여, 항체의 프로테아제 소화를 행하였다. 항체로서 IgG를 사용한 경우 및 Herceptin을 사용한 경우의 각각에 대해서, 트립신과 리실 엔도펩티다아제의 비(중량비)를 (1) 10 : 0, (2) 9 : 1, (3) 8 : 2, (4) 0 : 10으로 하여 실험을 행하고, 소화 후의 상청액 및 다공질체 표면의 고정화 성분의 각각을, SDS-PAGE 전기 영동으로 분석하였다. 전기 영동상을 도 12에 나타낸다. 도 12에 있어서, 좌측 단부의 레인은 분자량 마커이다.
항체로서 Herceptin을 사용한 경우의 상기 수준 1 내지 4의 소화 후의 상청을, 상기 실험 2와 마찬가지로 하여, 질량 분석을 행하였다. MS 스펙트럼을 도 13에 나타낸다. 또한, 질량 분석 결과에 기초하여, 실험 4와 마찬가지로 Mascot server에 의한 데이터베이스 해석을 행하였다. 또한, 수준 1(트립신 100%)은 상기 실험 4(도 7 및 도 8)와 동일하다. 수준 2 내지 4의 데이터베이스 해석 결과는 이하와 같았다(데이터 도시하지 않음).
<수준 2: 트립신 : 리실 엔도펩티다아제 = 90 : 10>
Mixture
gi|442924 Mass : 23708 Score : 117 Expect : 4.9e-007 Matches : 13
Chain B, X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains
From Three Variants Of Humanized Anti-P185-Her2 Antibody 4d5 And Comparison With Molecular Modeling
gi|184747 Mass : 36012 Score : 64 Expect : 0.11 Matches : 10
immunoglobulin ga㎜a-1 heavy chain constant region [Homo sapiens]
<수준 3: 트립신 : 리실 엔도펩티다아제 = 80 : 20>
Mixture
gi|442924 Mass : 23708 Score : 115 Expect : 7.8e-007 Matches : 13
Chain B, X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains
From Three Variants Of Humanized Anti-P185-Her2 Antibody 4d5 And Comparison With Molecular Modeling
gi|184747 Mass : 36012 Score : 54 Expect : 1.1 Matches : 9
immunoglobulin ga㎜a-1 heavy chain constant region [Homo sapiens]
<수준 4: 리실 엔도펩티다아제 100%>
gi|184747 Mass : 36012 Score : 71 Expect : 0.021 Matches : 8
immunoglobulin ga㎜a-1 heavy chain constant region [Homo sapiens]
트립신과 리실 엔도펩티다아제를 병용한 수준 2, 3에서는, 해석 결과로서, Herceptin의 항원 결합 영역에 더하여, 인간 유래 항체의 정상 영역이 나타나 있었다. 또한, 리실 엔도펩티다아제만을 사용한 수준 4에서는, Herceptin이 포함되지 않고, 항체의 정상 영역만이 우위하게 검출되었다는 해석 결과가 나타났다.
도 12의 전기 영동상에서는, 리실 엔도펩티다아제 비율의 상승에 수반하여, 상청의 펩티드 단편의 수가 증가하여, 밴드 면적도 증가하는 경향이 있고, 소화 효율 및 펩티드 회수율이 증대하였음을 알 수 있다. 또한, 도 13에서도, 리실 엔도펩티다아제의 비율의 상승에 수반하여, 검출되는 펩티드 단편의 종류나 양이 증가하였다. 그러나, 수준 2 내지 4에서 새롭게 검출된 펩티드 단편은, Herceptin의 Fc 도메인 유래의 것이 많아, 프로테아제 소화의 위치 선택성(Fab 도메인을 선택적으로 소화하는 특성)이 저하되었음을 알 수 있다.
이들 결과로부터, 리실 엔도펩티다아제의 사용량이 증대됨에 따라서, 항체의 소화 효율은 향상되기는 하지만, 프로테아제 소화의 위치 선택성이 저하되고, 정상 영역의 펩티드 단편의 산생량이 증대에 수반하여, V 영역의 펩티드 단편의 상대적인 산생량이 감소하기 때문에, 항체의 검출·동정 정밀도가 저하되는 경향을 알 수 있다. 그로 인해, 본 발명의 방법에 의해, 항체의 Fab 영역의 위치 선택적인 절단을 행하고, CDR의 특이적 검출을 행하는 관점에 있어서는, 트립신을 단독으로 사용하는 것이 바람직하고, 트립신과 리실 엔도펩티다아제를 병용하는 경우에는, 리실 엔도펩티다아제의 혼합량을 10% 이하로 하는 것이 바람직하다고 할 수 있다.
또한, 리실 엔도펩티다아제만을 사용한 수준 4에서는, 부위 특이적인 소화가 행해지지 않은 데 반해, 트립신만을 사용한 수준 1(실험 4)에서는 데이터베이스 해석에 의해 CDR이 효율적으로 검출된 점에서, Fab 도메인의 V 영역이 선택적으로 프로테아제 소화되었음을 알 수 있다. 이상의 결과에 따르면, 기질 단백질이 항체인 경우에, 트립신을 사용해서 본 발명을 적용하면, 항체에 대한 프로테아제의 입체적인 액세스가 적절하게 제어되어, 위치 선택적인 프로테아제 소화가 가능함이 나타났다고 할 수 있다.
또한, 본 실험에 의해, 트립신과 리실 엔도펩티다아제를 병용한 경우에, 각프로테아제가 그 기능을 상실하지 않고, 세공 내에 고정화된 기질 단백질을 절단할 수 있음이 나타났다. 항체는, V 영역이 분자의 선단에 존재하기 때문에, 리실 엔도펩티다아제의 사용량이 증가하면 위치 특이성이 저하되는 경향이 있지만, 기질로서 다른 단백질을 사용하는 경우에는, 프로테아제의 병용계에 의해, 위치 선택성이나 소화 효율의 향상이 도모될 가능성이 시사되었다.
이상, 각 실험예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따르면, 항체 등의 단백질을 간편한 방법으로 위치 선택적으로 프로테아제 소화해서 펩티드 단편 시료가 얻어지고, 얻어진 펩티드 단편 시료가 질량 분석에 의한 단백질의 동정이나 검출에 적합함을 알 수 있다.
10 : 미립자
11 : 스페이서
15 : 프로테아제
20 : 다공질체
21 : 링커 분자
25 : 기질 단백질
29 : 세공
110 : 미립자
120 : 다공질막
131 : 미립자 현탁액
132 : 스핀 칼럼
135 : 내용기
136 : 외용기
SEQUENCE LISTING <110> SHIMADZU CORPORATION <120> method for preparing peptide fragment, peptide fragment preparation kit therefor and analysis method <130> WO13P062SZ <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 3 Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 4 Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 5 Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 6 Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 7 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab (genetical recombination) <400> 8 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 1 5 10 15 Lys Val Glu Ile 20

Claims (14)

  1. 절단 대상의 기질 단백질을, 다공질체의 세공 내에 고정화하는 기질 고정 스텝; 및
    기질 단백질이 고정화된 상기 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 미립자를 액체 중에서 접촉시켜서, 상기 기질 단백질의 프로테아제 소화를 행하는 소화 스텝을 갖고,
    상기 미립자의 평균 입경이, 상기 다공질체의 평균 세공 직경보다 큰 것을 특징으로 하는 펩티드 단편의 조제 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기질 고정 스텝에 있어서, 상기 기질 단백질의 소정의 영역이, 상기 다공질체에 고정화되고, 상기 소정의 영역과 다른 영역이 위치 선택적으로 프로테아제 소화되는 펩티드 단편의 조제 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 다공질체의 세공 내에, 상기 기질 단백질과 부위 특이적으로 상호 작용하는 링커 분자가 고정화되어 있고,
    상기 기질 고정 스텝에 있어서, 상기 기질 단백질이 상기 링커 분자를 통해서 상기 다공질체의 세공 내에 고정화되는 펩티드 단편의 조제 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 기질 고정 스텝 후에, 상기 링커 분자와 상기 기질 단백질이 결합한 상태의 분자 사이즈가, 상기 다공질체의 세공 직경의 0.5배 내지 1.5배인 펩티드 단편의 조제 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미립자의 표면이, 상기 프로테아제와 결합 가능한 스페이서 분자로 수식되어 있고, 상기 프로테아제가 상기 스페이서 분자를 통해서 상기 미립자의 표면에 고정화되어 있는 펩티드 단편의 조제 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기질 단백질이 항체인 펩티드 단편의 조제 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로널 항체인 펩티드 단편의 조제 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 기질 고정 스텝에 있어서, 상기 항체의 Fc 도메인이 상기 다공질체에 고정화되고,
    상기 소화 스텝에 있어서, 상기 항체의 Fab 도메인이 상기 프로테아제에 의해 위치 선택적으로 절단되는 펩티드 단편의 조제 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테아제가 트립신인 펩티드 단편의 조제 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다공질체의 평균 세공 직경이 30 내지 150㎚이고, 상기 미립자의 평균 입경이 100㎚ 이상인 펩티드 단편의 조제 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 펩티드 단편 조제용 킷이며,
    기질 단백질을 고정화 가능한 세공을 갖는 다공질체와, 프로테아제를 표면에 고정화 가능한 미립자를 포함하고,
    상기 미립자의 평균 입경이, 상기 다공질체의 세공 직경보다 큰 것을 특징으로 하는 펩티드 단편 조제용 킷.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 미립자는, 표면에 프로테아제가 고정화된 상태에서 제공되는 펩티드 단편 조제용 킷.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 조제된 펩티드 단편을, 질량 분석법에 의해 분석하는 분석 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    분석 대상의 펩티드 단편이, 항체의 상보성 결정 영역의 적어도 일부의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편인 분석 방법.
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