TWI675917B - 單株抗體的定量方法及套組 - Google Patents

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嶋田崇史
Takashi Shimada
岩本典子
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濱田哲暢
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Abstract

本發明提供一種單株抗體的定量方法，包括：使將測定對象的單株抗體固定於細孔內的多孔質體、與固定有特定的蛋白酶的微粒子接觸，進行單株抗體的選擇性蛋白酶消化的步驟；及對藉由所述消化而獲得的含有來源於所述單株抗體的重鏈或輕鏈的CDR2區的胺基酸的肽斷片進行檢測的步驟。

Description

單株抗體的定量方法及套組
本發明是有關於一種使用質譜分析的單株抗體的定量方法，更具體而言，本發明是有關於所述方法，其包括將含有單株抗體的特異性序列的肽斷片選擇性地消化的步驟、及藉由質譜分析來檢測所得的肽斷片的步驟，且為了進行選擇性消化而使用特定的酵素。
為了開發及投予副作用少且發揮高藥效的藥劑，藥物動態、特別是濃度監測(治療藥物監測(therapeutic drug monitoring，TDM))受到關注。藉由濃度監測，可確認所投予的藥劑是否為適當量、或是否到達病變部位，從而可評價藥劑的有效性，另外適當地調整投予量。另外，對於癌症或自體免疫疾病(Autoimmune disease)等領域中成為主流的分子標靶藥物(molecular targeted drug)的有效性而言，重要的是醫師自身可迅速判斷藥劑是否於病變部位蓄積並發揮藥效。
作為分子標靶藥物，目前抗體醫藥受到關注。抗體醫藥因與以癌症為代表的病灶抗原或標靶分子、生長因子等特異地結合，故作為副作用少且可預計高藥效的醫藥品而受到關注，正對大量的抗體進行臨床研究。抗體於其性質方面顯示出極高的分子特異性，但另一方面，即便為相同種類的癌症，亦常見到僅因其 病灶的部位不同而不發揮藥效的情況、對轉移灶不起效的情況等。另外，亦存在藥價的問題，目前正在討論重要的是藉由適當使用來進行最適化醫療。
因此，測定抗體醫藥的局部存在或濃度而設定最適的給藥量極為重要。另外，為了讓醫師自身可一直把握藥效、可確立積極的治療戰略，亦必須更簡便地進行血中濃度測定及腫瘤組織中濃度測定。進而，為了對所投予的醫藥的藥效進行評價或開發伴隨診斷藥物(companion diagnostic drug)等，亦於抗體濃度的定量方面有大的需求，一直謀求技術革新。
以前，作為用以對抗體等蛋白質進行定量的最普遍的技術，已知酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)，但其耗費時間或成本等，存在大量的課題。另一方面，伴隨著質譜分析技術或資料分析伺服器.軟體的發展，使用質譜分析的蛋白質的定量及結構分析正在飛躍性地擴大其應用範圍。
本發明者等的團體(group)發現了以下方法：藉由抗體等蛋白質的選擇性蛋白酶消化，可獲得最適於使用質譜分析的蛋白質的特異性檢測的肽斷片。該方法中，將成為基質的蛋白質例如抗體、與蛋白酶酵素兩者固定於固相上，藉此實現單株抗體的位置選擇性的蛋白酶消化(專利文獻1及非專利文獻1)。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1：WO 2015/033479號
非專利文獻
非專利文獻1：N.岩本(N.Iwamoto)等人，「藉由限制蛋白酶接近基質來選擇性檢測單株抗體的互補決定區：奈米表面及分子取向限制性蛋白酶解(Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate：nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis)」，分析(Analyst)，2014，139，576
為了藉由質譜分析法對蛋白質簡便地進行檢測．定量，有效率的是具位置選擇性地將測定對象的蛋白質切斷，使該蛋白質中產生特異的肽斷片，減少其他肽斷片的產生量。因此，抗體的情況下，較佳為具位置選擇性地將含有特異性序列的Fab區域、特別是Fab區域的可變區消化，另一方面抑制Fc區域的消化。
所述專利文獻1及非專利文獻1記載的方法為可使用固相-固相反應來進行單株抗體的選擇性蛋白酶消化的劃時代的方法。更具體而言，例如將抗體的C末端側固定於細孔徑約100nm的蛋白G(Protein G)或蛋白A(Protein A)樹脂上，抗體的可變區必定朝溶液側配向。繼而，將蛋白酶固定於粒徑約200nm的微粒子表面上。藉由限制蛋白酶對抗體的接觸，可形成進行可變區 選擇性的抗體分解反應的反應場。
然而，為了實際於臨床上使用所述方法，尚留有進一步進行研究的餘地，為了提供更簡便的定量方法，期望進行關於各抗體的標準化等進一步的整備。
本發明者等發現，為了進行抗體的使用限制性蛋白酶消化的檢測，最有效的是檢測單株抗體的可變區中特別是CDR2區所含的蛋白酶消化斷片。
通常於將蛋白酶消化後的肽斷片供於質譜分析的情形時，研究使用自我消化少、切斷序列的選擇性高的蛋白酶。因此，本領域技術人員於使用市售的蛋白酶的情形時，使用質譜分析級(grade)或序列決定(sequence)級的蛋白酶。例如，已知來源於生物體的天然(native)的胰蛋白酶(trypsin)藉由自我消化而生成顯示出胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)樣的活性的擬胰蛋白酶，故切斷部位的特異性低。因此，作為質譜分析級，市售有將胰蛋白酶的離胺酸(lysine)殘基還原甲基化而提高了對自我消化的抵抗性的蛋白酶。
然而本發明者等發現，於使用所述所謂的高品質的蛋白酶來消化成為測定對象的單株抗體的情形時，有時無法使用所得的肽斷片來進行定量檢測。
本發明者等認為，所述結果暗示了對所得的肽斷片產生因內在化抗體的存在所致的干擾的可能性，為了獲得無此種干擾 的肽斷片而進一步進行了研究。結果令人驚訝地發現，藉由使用特異性較以前使用的結構分析用酵素更低的酵素，可增加切斷點而產生不同序列的肽斷片，結果可取得最適於定量檢測的肽，從而完成了本發明。
即，本發明的態樣包含以下發明。
(1)一種單株抗體的定量方法，包括以下步驟：使將測定對象的單株抗體固定於細孔內的多孔質體、與固定有蛋白酶且平均粒徑大於多孔質體的平均細孔徑的微粒子接觸，進行單株抗體的選擇性蛋白酶消化的步驟；及對藉由所述消化而獲得的含有來源於所述單株抗體的重鏈或輕鏈的CDR2區的胺基酸的肽斷片進行檢測的步驟；並且所述方法的特徵在於：使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶作為所述蛋白酶。
(2)如(1)記載的方法，其中具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶為未進行還原甲基化處理的胰蛋白酶。
(3)如(1)或(2)記載的方法，其中所述單株抗體為莫佳娒利單抗(mogamulizumab)。
(4)如(3)記載的方法，其中所述肽斷片為具有序列編號10所示的胺基酸序列的肽。
(5)一種套組，其是用於利用液相層析質譜分析(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometry，LC-MS)的單株抗體的定量檢測，且所述套組包含： 用以固定測定對象的單株抗體的多孔質體；固定有具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶的微粒子；用以使所述多孔質體與所述微粒子接觸而選擇性地消化單株抗體的反應容器；及用以與所述微粒子及多孔質體一併導入至所述反應容器內而進行所述蛋白酶的消化反應的緩衝液。
(6)如(5)記載的套組，其中具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶為未進行還原甲基化處理的胰蛋白酶。
(7)如(5)或(6)記載的套組，其中測定對象為莫佳娒利單抗，且內部標準肽為具有序列編號10所示的胺基酸序列的肽。
(8)一種記錄媒體，其為用於如(1)至(4)中任一項記載的方法中、且記錄有用以執行質譜分析的資料的電腦可讀取的記錄媒體，並且所述資料包含與藉由所述單株抗體的蛋白酶消化所得的肽有關的母離子、碎體離子及對質譜分析計的電極施加的電壓的資料。
(9)一種方法包(method package)，含有如(8)記載的記錄媒體及所述記錄媒體的使用說明書，且是用於利用液相層析質譜分析(LC-MS)的單株抗體的定量檢測。
本發明的方法使用限制性的蛋白酶反應場，故可將抗體的有限區域、特別是CDR2區選擇性地分解並加以回收。CDR2 區為於抗體中最接近表面而露出的部位，故可優先被分解。藉由利用這一情況，可更有效率地進行質譜分析中的單株抗體的檢測。藉由將含有抗體醫藥的CDR2區的胺基酸的肽斷片回收並加以定量，可自生物體試樣直接測定抗體醫藥的濃度。
若使用本發明的方法，則能可靠地進行利用質譜分析的各抗體的定量。另外，若對各抗體提供標準的分析條件，則於臨床上醫師自身可從事檢體的分析而迅速評價所投予的抗體的有效性。
圖1表示莫佳娒利單抗的重鏈及輕鏈的胺基酸序列(序列編號1及序列編號2)、及用於定量用的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)切斷斷片的序列及重鏈或輕鏈的胺基酸序列中的位置。
圖2表示莫佳娒利單抗的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)切斷斷片(序列編號3~序列編號9)的多反應監測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)層析圖。上圖表示莫佳娒利單抗原粉的分析結果，下圖表示於血漿中摻入(spike)有莫佳娒利單抗的樣本的分析結果。縱軸表示波峰強度，橫軸表示保持時間。另外，來源於同一肽的斷片是於同一保持時間檢測，以波峰高度來表示各斷片離子的生成效率之差。
圖3表示使用摻入至血漿中的莫佳娒利單抗的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)切斷斷片(序列編號3~序列編號9)所製作的 校準曲線。
圖4表示用於莫佳娒利單抗的定量用的經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)切斷斷片的序列、以及重鏈及輕鏈的胺基酸序列中的位置。
圖5表示莫佳娒利單抗的經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)切斷斷片(序列編號10~序列編號14)的MRM層析圖。上圖表示莫佳娒利單抗原粉的分析結果，下圖表示於血漿中摻入有莫佳娒利單抗的樣本的分析結果。縱軸表示波峰強度，橫軸表示保持時間。另外，來源於同一肽的斷片是於同一保持時間檢測，以波峰高度來表示各斷片離子的生成效率之差。
圖6表示使用摻入至血漿中的莫佳娒利單抗的經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)切斷斷片(序列編號10~序列編號14)所製作的校準曲線。
圖7表示精密質譜分析中的莫佳娒利單抗標靶肽SYYPDSVK(序列編號10)的結構鑑定結果。
本發明是有關於一種單株抗體的定量方法，其包括以下步驟：使將測定對象的單株抗體固定於細孔內的多孔質體、與固定有蛋白酶且平均粒徑大於多孔質體的平均細孔徑的微粒子接觸，進行單株抗體的選擇性蛋白酶消化的步驟；及對藉由所述消化而獲得的含有來源於所述單株抗體的重鏈或 輕鏈的CDR2區的胺基酸的肽斷片進行檢測的步驟；並且所述方法的特徵在於：使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶作為所述蛋白酶。
本發明的方法意圖維持測定對象的特異性，並且減少分析對象總體。另外，使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶而非以前被認為最適合用於質譜分析的胰蛋白酶來作為蛋白酶，由此可獲得適於檢測的肽斷片。
抗體中，胺基酸置換頻率特別高的區域被稱為「互補決定區(complementarity determining region，CDR)」。本說明書中所謂「CDR2(區)」，除了抗體的一次結構中的特定的連續胺基酸殘基中作為CDR2而規定的區域以外，還包括於抗體的立體結構中與該區域接近、以全體規定抗體的特異性的區域。已知即便是通常被稱為骨架區(framework region，FR)的區域，序列亦視抗體而不同。FR區的序列亦依存於抗體蛋白質的來源、製作步驟等。本領域技術人員可藉由確認目標抗體與其他抗體的胺基酸序列的多重比對(multiple alignment)、以及目標抗體與內在化抗體的交叉反應性等，而決定用以有效率地檢測目標抗體的特異性的含有來源於CDR2區的胺基酸的胺基酸序列，預測、選擇檢測對象的肽斷片。
另外，於本說明書中，所謂「含有來源於CDR2區的胺基酸的胺基酸序列」，是指含有一個以上的來源於目標抗體特有的CDR2區的胺基酸的胺基酸序列，換言之，亦可稱為包含CDR2 區的一部分的胺基酸序列。於使用質譜分析的分析中，只要規定特異性的胺基酸殘基為一個以上，則能可靠地檢測其特異性。另外，所謂「含有來源於CDR2區的胺基酸的胺基酸序列」，並非指含有「來源於CDR2區的胺基酸」的任意的胺基酸序列，而是指該胺基酸序列全體構成目標抗體的胺基酸序列的一部分連續序列。
以下，對本發明的方法加以具體說明。
[質譜分析]
為了藉由質譜分析來檢測抗體，首先必須自生物體試樣中提取抗體，並溶解於適當的溶劑中。另外，對於抗體而言，直接進行分析時分子大，故藉由蛋白酶分解為肽，其後藉由液相層析加以分離後進行質譜分析。適於分析的肽的分子量為約1000Da~3000Da左右。
若對抗體分子進行蛋白酶分解，則生成遠遠超過200條的肽斷片。另外，於將生物體試樣所含的抗體作為測定對象的情形時，成為巨大的樣本集(sample set)。為了自所述巨大且複雜的樣本中僅對目標特異性序列進行分析、定量，必須於質譜分析步驟之前進行分離能力高及再現性良好的液相層析。
[抗體]
本發明的方法中的測定對象為單株抗體。單株抗體的重鏈及輕鏈分別包含恆定區(constant region)與可變區。恆定區具有在來源於同一種類的抗體的大部分中共同的胺基酸序列。另一方 面，可變區中，互補決定區(CDR)各存在3個(CDR1、CDR2、CDR3)。該些區規定的立體結構和與抗原的特異性結合相關，由此形成抗體-抗原複合體。
對抗體進行立體結構分析的結果確認到，和與抗原的特異性結合相關的CDR區大體上位於抗體分子的外側。其中，CDR2區位於最外側，最適合作為本發明的限制性蛋白酶消化的標靶。對於臨床上使用的抗體而言，其所有胺基酸序列及CDR的序列已揭示。另外，本領域技術人員可根據抗體的胺基酸序列資訊來確定其CDR區。
本發明的方法中可成為測定對象的單株抗體並無限定，例如可列舉：莫佳娒利單抗、帕尼單抗(panitumumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、戈利木單抗(golimumab)、易普利單抗(ipilimumab)等人源抗體；妥珠單抗(tocilizumab)、奧馬佐單抗(Omalizumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、吉姆單抗(gemtuzumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、艾庫組單抗(eculizumab)等人源化抗體；西妥昔單抗(cetuximab)、英夫利昔單抗(infliximab)、巴利昔單抗(basiliximab)等嵌合抗體(chimeric antibody)等。另外，單株抗體的分子徑為約14.5nm。
根據本發明的方法，可具位置選擇性地對單株抗體的特別是CDR2區進行蛋白酶消化，藉由利用質譜分析來檢測所得的 CDR2區的肽斷片，可進行抗體的鑑定或定量檢測。因無論抗體的種類如何均可應用，故本發明的方法不限定於所述例示的抗體，亦可應用於新開發出的單株抗體等。
[多孔質體]
本發明的方法中使用的多孔質體只要具有大量的細孔，則其材料並無特別限定，可使用活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂珠、金屬粒子等。該些材料中，較佳為可與抗體發生部位特異性結合者。
細孔的形狀並無特別限定。另外，亦可使用如多孔質膜般形成有貫穿多孔質體的細孔的形狀。多孔質體的細孔的大小並無特別限定，於將抗體固定時，較佳為以需選擇性地消化的部位位於細孔的表層附近的方式考慮抗體的分子徑等而決定。多孔質體的平均細孔徑D2例如是於10nm~200nm左右的範圍、且小於微粒子的平均粒徑D1的範圍內適當設定。例如，多孔質體的平均細孔徑D2較佳為20nm~200nm左右，更佳為30nm~150nm、40nm~120nm、50nm~100nm的範圍，尤其進而較佳為約100nm。
於本發明中，可較佳地使用在多孔質體的細孔內固定有與抗體發生部位特異性相互作用的結合子(linker)分子的多孔質體。結合子分子可較佳地使用與抗體的Fc區域發生部位特異性結合的蛋白A(Protein A)或蛋白G(Protein G)等。藉由使用在細孔內固定有該些結合子分子的多孔質體，而將抗體的Fc區域固定 於細孔內，Fab區域位於細孔的表層附近。如此，藉由控制細孔內的抗體的配向，可利用蛋白酶進行Fab區域、特別是CDR2的位置選擇性消化。
結合子分子的大小是以抗體的選擇性切斷部位位於細孔的表層附近的方式選擇。結合子分子與抗體結合的狀態的分子尺寸較佳為多孔質體的細孔徑的0.5倍~1.5倍左右，更佳為0.6倍~1.2倍左右，進而佳為0.7倍~1.1倍左右，尤佳為0.8倍~1倍左右。再者，於未在多孔質體內固定結合子分子而使抗體於細孔內直接結合的情形時，較佳為抗體的分子徑與多孔質體的細孔徑滿足所述關係。
本發明中可較佳地使用的多孔質體並無特別限定，例如可列舉：蛋白G超結合(Protein G Ultralink)樹脂(皮爾斯(Pierce)公司製造)、托約帕(Toyopearl)(托索(TOSO)公司製造)等。例如已知於蛋白G超結合(Protein G Ultralink)樹脂中，結合於樹脂上的蛋白G(Protein G)的95%位於細孔內。
[對多孔質體的抗體的固定]
將抗體固定於多孔質體的細孔內的方法並無特別限定，可根據抗體與多孔質體或結合子分子的特性等而採用適當的方法。例如於將抗體固定於在細孔內固定有蛋白A(Protein A)或蛋白G(Protein G)的多孔質體的情形時，藉由將多孔質體的懸浮液與含有抗體的溶液混合，可容易地將抗體固定於細孔內。
多孔質體與抗體之量比可根據目的而適當設定。例如於 進行抗體的定量分析的情形時，理想的是將試樣中的抗體的大致總量固定於多孔質體上。因此，較佳為以多孔質體的量相對於試樣中的抗體的推定含量而成為過剩的方式設定量比。
[微粒子]
本發明的方法中，微粒子是以如下目的使用：於其表面上固定蛋白酶，控制蛋白酶對多孔質體的細孔內固定的抗體的接近(access)。因此，對於微粒子而言，將其平均粒徑D1設定為大於多孔質體的平均細孔徑D2，以使其不進入至多孔質體的細孔深處。
微粒子的形狀並無特別限定，就使蛋白酶對多孔質體的細孔的接近均勻化的觀點而言，較佳為球狀的微粒子。另外，微粒子較佳為平均粒徑均勻。
微粒子的平均粒徑D1較佳為50nm~500nm的範圍，更佳為多孔質體的平均細孔徑D2的1.2倍以上，進而佳為1.5倍以上，尤佳為1.8倍以上、例如約2倍。於多孔質體的平均細孔徑為30nm~150nm左右的情形時，微粒子的平均粒徑D1較佳為100nm以上，更佳為150nm以上。於多孔質體的平均細孔徑為50nm~100nm左右的情形時，微粒子的平均粒徑較佳為120nm以上，更佳為150nm以上，尤佳為170nm以上。就提高蛋白酶的消化效率的觀點而言，微粒子的平均粒徑D1的上限較佳為500nm以下，進而佳為300nm以下。
關於微粒子，只要可將所述蛋白酶固定於表面上，則其材質並無特別限定，可適當使用金屬或樹脂等。另外，亦可使用 金屬表面經樹脂被覆的材質、或樹脂表面經金屬被覆的材質等。
關於微粒子的種類，較佳為可分散或懸浮於水性介質中、且可藉由應用磁場而容易自分散液或懸浮液中回收的磁性微粒子。另外，就不易引起凝聚的方面而言，更佳為其表面經有機聚合物被覆的磁性微粒子。磁性微粒子的基材可列舉氧化鐵(磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γ-Fe2O3))、肥粒鐵(Fe/M)3O4等強磁性合金。肥粒鐵(Fe/M)3O4中，M是指可與鐵離子一併使用而形成磁性金屬氧化物的金屬離子，典型而言可使用Co2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+等。另外，被覆磁性微粒子的有機聚合物可列舉聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(polyglycidyl methacrylate，聚GMA)、GMA與苯乙烯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)、聚丙烯酸甲酯(polymethyl acrylate，PMA)等。經有機聚合物被覆的磁性奈米珠的具體例可列舉FG珠、SG珠、磁粒(Adembeads)、奈米磁粒(nanomag)等。市售品例如可較佳地使用多摩川精機股份有限公司製造的FG珠(FG beads)(肥粒鐵粒子經聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(聚GMA)被覆而成的粒徑約200nm的聚合物磁性微粒子)。
為了抑制非特異性的蛋白質的吸附以及為了選擇性地固定蛋白酶，所述微粒子較佳為經可與蛋白酶結合的間隔子(spacer)分子修飾。藉由經由間隔子分子來固定蛋白酶，而抑制蛋白酶自微粒子表面脫離，可提高蛋白酶消化的位置選擇性。另外，藉由調整間隔子的分子尺寸，亦可使蛋白酶選擇性地接近於 抗體的所需位置，提高位置選擇性。
間隔子較佳為可與蛋白酶結合，且不會使蛋白酶失活。就控制微粒子表面上固定的蛋白酶的接近範圍的觀點而言，間隔子較佳為分子徑小。間隔子的分子徑較佳為5nm以下，更佳為3nm以下，進而佳為2nm以下。另外，間隔子的分子量較佳為2000以下，更佳為1500以下，進而佳為1000以下。
能以所述分子徑固定蛋白酶的間隔子分子較佳為非蛋白質，較佳為於末端具有胺基、羧基、酯基、環氧基、甲苯磺醯基(tosyl group)、羥基、硫醇基、醛基、馬來醯亞胺基、琥珀醯亞胺基、疊氮基、生物素(biotin)、抗生物素(avidin)、螯合物等官能基的分子。例如對於胰蛋白酶的固定而言，較佳為具有經活化的酯基的間隔子分子。另外，間隔子分子中，所述官能基以外的間隔臂(spacer arm)部分可使用聚乙二醇及其衍生物、聚丙二醇及其衍生物、聚丙烯醯胺及其衍生物、聚乙烯亞胺及其衍生物、聚(環氧乙烷)及其衍生物、聚(伸乙基對苯二甲酸)及其衍生物等親水性分子。
另外，經此種間隔子分子進行了表面修飾的微粒子亦有市售，只要利用該些市售品即可。例如以具有經N-羥基琥珀醯亞胺活化的酯基(活性酯基)的間隔子分子修飾的微粒子是作為商品名「FG珠NHS(FG beads NHS)」(多摩川精機股份有限公司)而市售。FG珠NHS(FG beads NHS)的粒徑為約200nm±20nm，是作為微粒子而言非常均質者。
[蛋白酶]
本發明的方法中，使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶作為固定於微粒子上的蛋白酶。
胰蛋白酶的基質特異性高，另外於切斷後的肽的C末端存在Lys或Arg，故可使肽的電荷量及電荷局部存在均質，適於製作用以進行質譜分析的試樣。另外，胰蛋白酶的分子徑小(約3.8nm)，且活性部位存在於分子的內部。因此，活性部位可接近抗體的區域受到限制，可提高蛋白酶消化的位置選擇性。
本發明者等發現，藉由使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶而非通常使用的質譜分析級的胰蛋白酶，可獲得最適於各抗體的定量檢測的肽斷片。
本發明的方法中使用的蛋白酶例如可使用：已知藉由自我消化而顯示出胰凝乳蛋白酶樣的活性的來源於生物體的天然的胰蛋白酶。將胰蛋白酶的離胺酸殘基還原甲基化而提高了對自我消化的抵抗性的蛋白酶已作為質譜分析級的胰蛋白酶而市售，但本發明中使用的胰蛋白酶較佳為未進行此種離胺酸殘基的還原甲基化處理的胰蛋白酶。
例如胰蛋白酶金(Trypsin Gold)(普洛麥格(Promega)公司製造)為重組胰蛋白酶(recombinant trypsin)，於甲苯磺醯苯丙胺醯氯甲酮(Tosylphenylalanyl chloromethyl ketone，TPCK)處理後實施了還原甲基化反應。另一方面，經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)(西格瑪(Sigma)公司製造)雖然藉 由對自牛提煉的胰蛋白酶進行TPCK處理而降低了胰凝乳蛋白酶活性，但為未實施還原二甲基化反應的蛋白酶。
本發明的方法藉由使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶，可使用質譜分析級的胰蛋白酶的消化無法獲得的肽斷片，來對使用不具有胰凝乳蛋白酶活性的胰蛋白酶、例如質譜分析級的胰蛋白酶的情形時無法定量檢測的單株抗體進行定量檢測。
作為「具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶」，設想使用如上所述般顯示出胰凝乳蛋白酶樣的活性的胰蛋白酶，作為其他實施形態，亦可使用胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的混合物。於該情形時，胰蛋白酶例如可使用普洛麥格(Promega)公司的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)，胰凝乳蛋白酶例如可使用西格瑪(Sigma)公司的經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)。胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶之比率較佳為以蛋白酶活性(U)計為9：1~1：1之比率使用。
本發明的方法中可尤其較佳地使用的蛋白酶例如可列舉經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)(西格瑪(Sigma)公司製造)等。
[對微粒子的蛋白酶的固定]
將蛋白酶固定於微粒子的表面上的方法並無特別限定，可根據蛋白酶及微粒子(或修飾微粒子表面的間隔子分子)的特性等而採用適當的方法，例如於將蛋白酶固定於經間隔子修飾的微粒 子表面上的情形時，藉由將微粒子的懸浮液與含有蛋白酶的溶液混合，可將蛋白酶固定於微粒子表面上。較佳為經由所述間隔子分子的官能基的微粒子與蛋白酶的胺偶合(amine coupling)法。例如可利用N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)將修飾於微粒子表面上的羧基酯化而製成活化酯基，並使蛋白酶的胺基與其結合。該偶合反應中，可於1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDAC)、N,N'-二環己基碳二醯亞胺(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、雙(2,6-二異丙基苯基)碳二醯亞胺(bis(2,6-diisopropylphenyl)carbodiimide，DIPC)等碳二醯亞胺縮合劑的存在下進行反應。另外，亦可使用戊二醛、二官能性琥珀醯亞胺、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS3)、磺醯氯、馬來醯亞胺、吡啶二硫醚等交聯劑，使蛋白酶的胺基與修飾於微粒子表面上的胺基結合。
經由間隔子分子的官能基的微粒子與蛋白酶的偶合法可藉由在微粒子的懸浮液中添加蛋白酶溶液、並於一定條件下混合攪拌的簡便操作來進行。
較佳為於微粒子表面上固定蛋白酶後，使微粒子表面的未與蛋白酶結合的活性部分鈍化。
[蛋白酶消化]
藉由使固定有抗體的多孔質體、與表面上固定有蛋白酶的微粒子接觸，抗體經蛋白酶消化，產生肽斷片。接觸較佳為於液體 中進行。此處所謂「液體」，是指基質(固相)及酵素(固相)於液相中接觸，另外是指適於蛋白酶消化反應的水性介質。
本發明中的蛋白酶消化的條件並無特別限定，可適當地採用與通常的蛋白酶消化相同的條件。例如較佳為於經調整至蛋白酶的最適pH值附近的緩衝溶液中，以通常37℃左右的溫度培養(incubate)4小時~20小時左右。
固定有抗體的多孔質體、與表面上固定有蛋白酶的微粒子之混合量比亦無特別限制，只要以成為與抗體的量相對應的蛋白酶量的方式設定即可。本發明中，因多孔質體與微粒子的組合，抗體與蛋白酶的接近受到物理限制，故較佳為與通常的蛋白酶消化相比而增多蛋白酶量。例如較佳為抗體：蛋白酶=30：1~3：1左右，更佳為15：1~4：1左右，進而佳為10：1~5：1左右。
本發明的方法中，直接於將抗體固定於多孔質體上的狀態下進行蛋白酶消化。藉由蛋白酶消化而產生的肽斷片存在於液相內，故不進行抗體的溶出或改質操作便可具位置選擇性地獲得目標肽斷片。根據本發明的方法，可利用與現有方法相比更簡便的操作且具位置選擇性地進行肽斷片的回收。
繼而，對藉由蛋白酶消化所得的目標肽斷片進行檢測。為了進行檢測，較佳為將多孔質體及微粒子去除。該去除可藉由對蛋白酶消化後的樣本進行過濾、離心分離、磁性分離、透析等操作而達成。例如藉由使用聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)製的過濾膜(低結合性親水性PVDF(Low-binding hydrophilic PVDF)，孔徑0.2μm，密理博(Millipore)公司製造)進行過濾，可簡便地去除多孔質體及微粒子。
[液相層析質譜分析(LC-MS)]
藉由LC-MS對含有所述獲得的肽斷片的試樣進行分析，藉此可進行抗體的鑑定或定量。
為了更可靠地分離肽斷片、提高分析精度等，藉由液相層析(LC)將供於質譜分析之前的試樣分離．濃縮。於藉由LC進行試樣的分離的情形時，亦可將來自LC的溶出液直接電離而供於質譜分析。亦可藉由將LC與串聯質譜分析組合的LC/MS/MS或LC/MSn來進行分析。另外，亦可將來自LC的溶出液一次性分取後供於質譜分析。LC的管柱並無特別限定，可適當地選擇使用通常可用於肽的分析的C30、C18、C8、C4等疏水管柱或親水性親和層析法用的載體等。
質譜分析可確定胺基酸序列，故可判別肽斷片是否為來源於抗體等特定蛋白質的肽斷片。另外，可根據波峰強度來確定試樣中的肽斷片的濃度。於分析時，視需要亦可進行脫鹽、可溶化、提取、濃縮、乾燥等處理後，將試樣用於分析。
質譜分析中的電離法並無特別限定，可採用電子電離(Electron ionization，EI)法、化學電離(Chemical Ionization，CI)法、電場解吸(Field Desorption，FD)法、快速原子撞擊(Fast Atom Bombardment，FAB)法、基質輔助雷射脫附游離(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)法、電噴 灑游離(Electrospray ionization，ESI)法等。經電離的試樣的分析方法亦無特別限定，可根據電離法而適當決定磁場偏向型、四極(Q)型、離子阱(Ion Trap，IT)型、飛行時間(Time Of Flight，TOF)型、傅立葉轉換離子回旋共振(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance，FT-ICR)型等。另外，亦可使用三重四極型質譜分析裝置等來進行MS/MS分析或MS3以上的多階段質譜分析。
適於實施本發明的方法的質譜分析裝置並無限定，例如可列舉：LCMS-8030、LCMS-8040及LCMS-8050(均為島津製作所公司製造)等液相層析-三重四極型質譜分析裝置，LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF(均為島津製作所公司製造)等分析精密質量的結構分析用質譜分析裝置。
若於抗體檢測到含有特異的CDR2區的胺基酸序列的肽斷片，則可進行目標抗體的鑑定．定量。為了根據質譜分析結果來鑑定抗體，亦可使用現有的資料庫(data base)。另外，亦可藉由多階段的質譜分析等來確定肽斷片的胺基酸序列，藉此鑑定抗體。
再者，於根據檢測結果進行抗體的鑑定或定量的情形時，檢測對象的肽較佳為胺基酸殘基數為5~30左右，更佳為胺基酸殘基數為7~25左右。
於對抗體的濃度進行定量的情形時，可根據檢測到的肽斷片離子(多階段MS的情形時為藉由母離子的裂解所得的碎體離子)的波峰面積或波峰強度來算出抗體的量。例如藉由預先求 出的校準曲線(校正曲線)與波峰面積的關聯、或來源於添加至試樣中的內部標準的波峰面積與來源於試樣的波峰面積的關聯等，算出試樣中的肽斷片的濃度，根據肽斷片濃度而算出抗體的量或濃度。
於質譜分析中，藉由在繼蛋白酶消化之後進行例如利用陽離子交換樹脂(WCX及MCX)的純化，可進行抗體醫藥的特異的肽的高感度分析。
[含有CDR2區的胺基酸的肽]
本發明的方法中的檢測對象的肽斷片具有如下胺基酸序列，該胺基酸序列含有來源於抗體醫藥等單株抗體的重鏈或輕鏈的CDR2區的胺基酸。
對於意圖用作抗體醫藥的單株抗體而言，其胺基酸序列資訊等已公開，可獲取重鏈及輕鏈的胺基酸序列、Fab區域及Fc區域、CDR區、二硫鍵(disulfide bond)等資訊。另外，根據本發明的方法，因抗體與蛋白酶的接觸有限，故藉由選擇性蛋白酶消化所得的肽的種類亦有限。因此，本領域技術人員可預測藉由特定的蛋白酶所消化的肽斷片的胺基酸序列。
因此，亦可藉由本發明的方法一併同時進行預測的多種肽斷片的檢測，進行抗體的檢測.定量。然而，為了更簡便地測定，另外為了縮短測定所必需的時間及削減成本，較佳為對各抗體預先選擇最適的肽斷片。若已知最適的肽斷片，則可決定僅適於該肽斷片的檢測的質譜分析條件，可提供此種資訊。
因此，本發明的方法的一實施形態包括：選擇適於各單株抗體的定量的含有CDR2區的胺基酸的肽斷片。另外，本發明的其他實施形態提供一種包括以下步驟的方法：對以適於各單株抗體的定量的形式而選擇的含有CDR2區的胺基酸的肽斷片進行檢測。
例如，使用本發明的方法以質譜分析級的胰蛋白酶、例如胰蛋白酶金(Trypsin Gold)(普洛麥格(Promega)公司製造)將莫佳娒利單抗消化的情形時所得的肽中，預測為適於質譜分析的肽為序列編號3~序列編號9所示的肽。然而，於本發明者等進行的試驗中，該些肽於血清試樣中可能因內在化抗體的干擾而無法進行依存於濃度的定量檢測。
FSGVPDR(序列編號3)
FTISR(序列編號4)
FSGSGSGTDFTLK(序列編號5)
NSLYLQMNSLR(序列編號6)
HSDGNFAFGYWGQGTLVTVSSASTK(序列編號7)
GLEWVATISSASTYSYYPDSVK(序列編號8)
NIVHINGDTYLEWYLQPKGQSPQLLIYK(序列編號9)
相對於此，於使用經TPCK處理的胰蛋白酶(Trypsin TPCK-treated)(西格瑪(Sigma)公司製造)作為蛋白酶的情形時所得的肽中，預測為適於質譜分析的肽為序列編號10~序列編號14所示的肽。對該些肽實際進行檢測，結果肽SYYPDSVK(序列 編號10)可獲得良好的結果。
SYYPDSVK(序列編號10)
GMSWVR(序列編號11)
ISRVEAEDVGVY(序列編號12)
YLQKPGQSPQLLIYK(序列編號13)
NIVHINGDTYLEW(序列編號14)
因此，於成為測定對象的單株抗體為莫佳娒利單抗的情形時，較佳為選擇具有序列編號10所示的胺基酸序列的肽作為檢測對象。於該情形時，例如能以表1所記載的條件作為指標，藉由三重四極型質譜分析裝置(例如LCMS-8050，島津製作所)的多重反應監測來進行檢測。
[套組]
本發明是有關於一種套組，其是用於所述利用高效液相層析質譜分析(LC-MS)的單株抗體的定量檢測，並且所述套組包含：用以固定測定對象的單株抗體的多孔質體；固定有具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶的微 粒子；用以使所述多孔質體與所述微粒子接觸而選擇性地消化單株抗體的反應容器；及用以與所述微粒子及多孔質體一併導入至所述反應容器內中而進行所述蛋白酶的消化反應的緩衝液。
利用質譜分析的測定可進行非常高精度的分析，但另一方面，製備適當的樣本及設定適當的分析條件非常重要。例如為了於臨床上更簡便地獲得準確的檢查結果，本發明提供一種可用於實施所述方法的套組。
本發明的套組所含的多孔質體及微粒子如上文所述。關於反應容器，只要為可使固定於多孔質體上的單株抗體、與固定於微粒子上的蛋白酶於液相中接觸的容器，則可為任意容器，並無特別限定，若考慮到用於製備質譜分析時檢測的樣本，則較佳為設定為微型管(microtube)或板(plate)。考慮到以反應為目的而進行的利用渦旋攪拌器(vortex)或旋轉器(rotator)的混合、反應後用以將肽與多孔質體及微粒子分離的過濾等反應步驟，本領域技術人員可設想適當的反應容器。
本發明的套組所含的緩衝液是用於與所述微粒子及多孔質體一併導入至所述反應容器內而進行所述蛋白酶的消化反應者，且提供適於蛋白酶消化的反應條件。反應條件可根據所選擇的蛋白酶等而適當決定，緩衝液的組成亦可適當決定。
另外，本發明的套組可包含用以於蛋白酶消化反應後將 所述多孔質體及所述微粒子去除並將消化反應的產物與所述緩衝液一併提取的過濾膜。其原因在於，為了將藉由蛋白酶消化所得的目標肽斷片供於質譜分析，必須將多孔質體及微粒子去除。
過濾膜較佳為於不施加壓力或離心力的條件下使緩衝液及藉由蛋白酶消化所生成的肽幾乎不透過而作為「反應容器底」發揮功能，且於離心分離等操作時作為可使緩衝液及肽透過的「濾器」而發揮功能。
為了使緩衝液及肽可透過過濾膜而施加的離心分離條件並無限定，例如較佳為3,000g~10,000g的範圍。本發明的套組中可較佳地使用的過濾膜例如可列舉聚偏二氟乙烯(PVDF)製的過濾膜(弱結合性親水性PVDF(Low-binding hydrophilic PVDF)，孔徑0.2μm，密理博(Millipore)公司製造)。
於套組為用以對多個檢體同時進行處理的套組的情形時，例如可使用過濾膜為PVDF製且殼體(housing)材料為聚丙烯腈樹脂、例如巴萊克斯(Barex)(註冊商標)(三井精化(Mitsui Fine Chemicals)股份有限公司製造)的套組。
另外，本發明的套組中可包含說明書，該說明書記載有套組的使用方法、及/或用以檢測單株抗體的質譜分析條件。
另外，本發明的套組可包含一個以上的內部標準肽。藉由與檢體同時、或分別於相同的條件下分析內部標準肽，而提供更可靠的分析結果。內部標準肽是設定為含有測定對象的單株抗體的特異性胺基酸序列、且藉由本發明的套組所含的蛋白酶的消 化而產生的肽。內部標準肽中，亦可含有經穩定同位素胺基酸標記的肽，於該情形時，質譜分析定量條件與不含同位素的肽相比而不同，故較佳為一併記載內部標準用定量條件。
例如於測定對象為莫佳娒利單抗的情形時，內部標準肽可含有具有序列編號10的胺基酸序列的肽。
藉由使用本發明的套組，可更簡便地進行以單株抗體的鑑定.定量為目的之肽斷片製備的操作，亦可容易地實現裝置的自動化。尤其若以將蛋白酶固定於微粒子表面上的狀態作為套組的構成要素而提供，則可進一步簡化肽斷片製備的操作。
[記錄媒體及方法包]
另外，本發明提供一種記錄媒體及方法包，所述記錄媒體為用於本發明的方法、且記錄有用以執行質譜分析的資料的電腦可讀取的記錄媒體，且所述資料包含與藉由所述單株抗體的蛋白酶消化所得的肽有關的母離子、碎體離子及對質譜分析計的電極施加的電壓的資料，所述方法包含有所述記錄媒體，且是用於利用液相層析質譜分析(LC-MS)的單株抗體的定量檢測。
本說明書中，所謂「方法包」，是指以可讀取的形態含有對特定測定對象的液相層析質譜分析的分析條件，且可單獨流通。藉由將方法包所含的資料輸入(import)至LC-MS中，能以詳細研究末尾所得的最適測定條件進行分析。方法包中亦可含有所述記錄媒體的使用說明書。
如上文所述，利用質譜分析的測定可進行非常高精度的 分析，但另一方面，分析條件視目標離子而完全不同，故設定適當的分析條件非常重要，但非常困難，且設定條件需要大量的時間。藉由預先準備此種條件，可提高實際進行質譜分析的用戶(user)的便利性。迄今為止，本申請人為了讓用戶可更簡便地進行例如農藥或動物醫藥品的質譜分析，已提供了用以進行該些農藥或動物醫藥品的LC-MS分析的方法包。因此，本發明亦提供一種用以對試樣中的單株抗體進行LC-MS的鑑定.定量的方法包。
即，本發明提供一種記錄媒體，其是用於以下方法：使將測定對象的單株抗體固定於細孔內的多孔質體、與固定有具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶的微粒子接觸而進行單株抗體的選擇性蛋白酶消化，藉由液相層析質譜分析(LC-MS)對所得的肽斷片進行分析，藉此進行所述單株抗體的檢測的方法，且所述記錄媒體為記錄有用以執行所述質譜分析的資料的電腦可讀取的記錄媒體，並且所述資料並無限定，例如對於藉由所述單株抗體的蛋白酶消化所得的具有含有CDR2區的胺基酸的胺基酸序列的肽而言，至少包含母離子、碎體離子及對質譜分析計的電極例如三重四極的各四極(第1四極、第2四極、第3四極)施加的電壓的資料。所述記錄媒體中，亦可包含預想保持時間等進一步的資料。另外，所述預想保持時間、電壓資料等為視所使用的設備及測定條件等而變動的數值，較佳為對應於設備來提供。另外，本領域技術人員應理解，較佳為對視條件而變動的數值亦一併提供其變動幅度。
記錄媒體可為任意形態，並無特別限定。例如可列舉能以磁性、光學方式記錄資訊的碟或記憶體。
更具體而言，所述方法包中例如可含有以下資訊及軟功能。
．經最適化※的母離子m/z值
．經最適化的碎體離子m/z值
．經最適化的Q1預偏(pre bias)電壓值
．經最適化的Q2碰撞能量(collision energy)電壓值
．經最適化的Q3預偏(pre bias)電壓值
．目標離子的預想保持時間及質譜分析時間
．定量值換算式
．分析結果報告輸出功能
※：對各條件項目進行實測，選取離子強度最高、及最具再現性的m/z值，將其作為最適值。
另外，本發明提供一種方法包，其含有所述記錄媒體，且是用於利用液相層析質譜分析(LC-MS)的單株抗體的檢測。方法包中亦可含有所述記錄媒體的使用說明書。
所述記錄媒體或方法包的例子可列舉僅包含限定於特定單株抗體的資訊的記錄媒體或方法包。因此，於單株抗體為例如莫佳娒利單抗的情形時，可提供記載有適於其分析的條件的記錄媒體或方法包。於該情形時，記錄媒體所含的資料例如可設定為與對具有序列編號10的胺基酸序列的肽進行分析的條件有關的 資料。
方法包可記載多種質譜分析裝置中共同的資料，或者亦可記載適於特定的質譜分析裝置的分析的各種資料。
記錄媒體或方法包可與所述本發明的套組一併提供，或與套組分別提供。
實施例
藉由以下的實施例對本發明加以更具體說明，但本發明不受實施例的限定。
[蛋白酶的固定]
藉由以下步驟於微粒子上固定蛋白酶。
1.FG珠清洗
對200mg的FG珠NHS(多摩川精機公司製造)進行離心分離(15,000g×5分鐘，4℃)，將保存用上清異丙醇去除。上清亦含有未沈澱的浮游物，要小心去除。
2.酵素準備
將1mg的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)(普洛麥格(Promega)公司製造)或5mg的胰蛋白酶TPCK(Trypsin TPCK)(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司製造)開封，溶解於經冷卻至4℃的25mM HEPES-NaOH(pH值為7.0)中。溶解後，取至50ml離心管(centrifuge tube)中，於冰上靜置。使用25mM HEPES-NaOH(pH值為7.0)將酵素預洗1次，儘可能回收。最終緩衝液量成為25ml左右。
3.FG珠清洗
分別添加10ml的經冰浴冷卻的甲醇，於經冰浴冷卻的超音波清洗機中，確認到FG珠的懸浮後進行離心分離(15,000g×5分鐘，4℃)，將上清甲醇去除。
4.酵素固定反應
於200mg的FG珠的沈澱中添加胰蛋白酶金(Trypsin Gold)或胰蛋白酶TPCK(Trypsin TPCK)溶液。使用經冰浴冷卻的超音波清洗機確認到FG珠的懸浮後，以保持懸浮的最低限度的速度連續30分鐘進行渦旋攪拌。
反應30分鐘後，進行離心分離(15,000g×5分鐘，4℃)，將上清去除。回收上清，藉由二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)分析進行偶合效率確認試驗。
5.活性基封阻(block)
於200mg的FG珠的沈澱中分別添加25ml的1M 2-胺基乙醇鹽酸鹽(pH值為8.0)，使用經冰浴冷卻的超音波清洗機確認到FG珠的懸浮後，以保持懸浮的最低限度的速度連續進行渦旋攪拌。反應30分鐘而封阻後，進行離心分離，去除上清。
6.酵素珠清洗
於200mg的FG珠的沈澱中分別添加25ml的25mM HEPES-NaOH、50mM的NaCl(pH值為7.0)，使用經冰浴冷卻的超音波清洗機確認到FG珠的懸浮後，以保持懸浮的最低限度的速度連續進行渦旋攪拌。清洗5分鐘後，進行離心分離，去除上清。
7.保存
以蛋白酶最終濃度成為0.5μg/μL的方式添加25mM Tris-HCl(pH值為8.0)，使用經冰浴冷卻的超音波清洗機確認到FG珠的懸浮後，分別以500μl分注。其後於-80℃下保存。
[蛋白酶消化]
血漿試樣中的單株抗體的蛋白酶消化是藉由以下步驟來實施。
1.自血漿的單株抗體的回收
取20μl血漿，以180μl的PBS+0.1%正辛基-β-D-硫代糖苷(同仁化學)稀釋。
於其中添加40μl的蛋白G超結合(Protein G Ultralink)樹脂(皮爾斯(Pierce)公司製造)的50%懸浮液。於室溫下利用渦旋攪拌器或旋轉攪拌器使其緩緩旋轉1小時~2小時，藉此使血漿中的抗體分子與樹脂結合。藉由離心分離使樹脂沈澱，去掉上清。
添加200μl的PBS+0.1%正辛基-β-D-硫代糖苷清洗3次，藉此將與樹脂非特異地結合的血漿中蛋白質清洗。繼而，以200μl的PBS清洗1次，去除界面活性劑。
2.蛋白酶反應
於蛋白G超結合(Protein G Ultralink)樹脂殘留的管中，添加200μl的25mMTris-HCl(pH值為8.0)。繼而，於其中添加80μl的所述製備的固定有胰蛋白酶(胰蛋白酶金(Trypsin Gold)或胰蛋白酶TPCK(Trypsin TPCK))的珠，設置於旋轉器中，於37℃ 下緩慢旋轉6小時。
反應後，利用0.2μm的低結合性親水性PVDF膜(密理博(Millipore)公司製造)進行過濾，將蛋白G(Protein G)樹脂與固定有胰蛋白酶的珠一併去除，回收反應溶液。
[質譜分析]
於市售的血漿(西格瑪(Sigma)公司製造)中摻入抗體醫藥，對藉由蛋白酶消化所得的肽進行檢測。使用莫佳娒利單抗(醫藥品名：伯特利吉奧(Poteligeo)，協和醱酵麒麟(Kyowa Hakko Kirin))作為單株抗體。質譜分析的條件如下。
<HPLC條件(尼科塞拉(Nexera)LC30A液相層析系統)>
溶劑A：0.1%甲酸，溶劑B：0.1%甲酸+乙腈
流速：0.5ml/分鐘
梯度時間：1%B(1.5分鐘)、1%-40%B梯度(5分鐘)、95%B(5分鐘)、1%B(5分鐘)
管柱：L-管柱(L-column)2 ODS，2×50mm(化學物質評價研究機構)
管柱溫度：50℃
<MS介面條件(LCMS-8050(島津製作所))>
霧化氣體(nebulizer gas)：3L/分鐘
加熱氣體(heating gas)：10L/分鐘
乾燥氣體(drying gas)：10L/分鐘
介面溫度：300℃
DL溫度：250℃
熱塊溫度：400℃
[胰蛋白酶金(Trypsin Gold)的消化斷片的檢測]
圖1中示出莫佳娒利單抗的重鏈及輕鏈的胺基酸序列(序列編號1及序列編號2)、及用於定量用的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)的切斷斷片的序列(序列編號3~序列編號9)及重鏈或輕鏈的胺基酸序列中的位置。
將根據所述分析條件將莫佳娒利單抗的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)切斷斷片(序列編號3~序列編號9)描繪於MRM層析圖中的結果示於圖2中。如圖2所示，於對莫佳娒利單抗原粉直接進行分析的情形(上圖)時，觀察到與添加量相對應的波峰，而於血漿中摻入有莫佳娒利單抗的樣本(下圖)中，可檢測到的波峰減少。
根據血漿中摻入的胰蛋白酶金(Trypsin Gold)切斷斷片(序列編號3~序列編號9)中檢測到的波峰來製作校準曲線，將結果示於圖3中。如由圖3的結果所表明，於使用胰蛋白酶金(Trypsin Gold)作為蛋白酶的情形時，無法製作與摻入至血漿中的肽斷片的量相對應的校準曲線，判明該些肽斷片均不適於依存於濃度的定量檢測。
[胰蛋白酶TPCK(TrypsinTPCK)的消化斷片的檢測]
圖4表示用於莫佳娒利單抗的定量用的胰蛋白酶TPCK (TrypsinTPCK)切斷斷片的序列(序列編號10~序列編號14)、以及重鏈及輕鏈的胺基酸序列中的位置。將以與上文所述相同的條件對莫佳娒利單抗的胰蛋白酶TPCK(TrypsinTPCK)切斷斷片(序列編號10~序列編號14)進行分析的結果示於圖5中。根據圖5的結果，於對莫佳娒利單抗原粉直接進行分析的情形(上圖)、及於血漿中摻入有莫佳娒利單抗的情形(下圖)時，均確認到來源於5種肽斷片的波峰。
使用摻入至血漿中的胰蛋白酶TPCK(TrypsinTPCK)切斷斷片(序列編號10~序列編號14)來製作校準曲線，結果如圖6所示，肽SYYPDSVK(序列編號10)可獲得適於定量檢測的校準曲線，判明其最適於莫佳娒利單抗的定量。
繼而，選擇肽SYYPDSVK(序列編號10)作為精密質譜分析的莫佳娒利單抗標靶肽，利用精密質譜分析進行結構鑑定，將結果示於圖7中。由圖7的結果確認到，可鑑定出如根據肽序列所預測般的結構。
對所檢測的肽SYYPDSVK(序列編號10)進行結構科學分析，結果確認到其來源於Fv區，於由蛋白資料庫(Protein Data Bank)所得的人免疫球蛋白(human immunogloblin)分子的立體結構中位於最外側。
[產業上之可利用性]
藉由本發明的方法，使用特定的蛋白酶將抗體選擇性地消化，並對所得的肽斷片進行質譜分析，藉此可對試樣中的抗體 進行定量。本發明的方法操作簡便，且可確保再現性或定量性。
目前對於抗體醫藥而言，已上市40種，進而臨床前試驗有300種左右，於包括動物試驗的所有臨床試驗中有2,000種以上，若亦包括研究階段或種子(seeds)則可謂超過5,000種。本發明對此種多種多樣的抗體醫藥可提供通用性極高的分析方法，可有助於加快今後的抗體醫藥開發。
將本說明書中引用的所有出版物、專利及專利申請案直接以參考的方式併入至本說明書中。
<110> 島津製作所股份有限公司(SHIMADZU CORPORATION)；國立癌症研究中心(NATIONAL CANCER CENTER)
<120> 單株抗體的定量方法、套組、記錄媒體及方法包
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<213> 人工序列
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<223> 莫佳娒利單抗的重鏈
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<223> 莫佳娒利單抗用於定量用的胰蛋白酶金的切斷斷片的序列
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Claims (5)

  1. 一種單株抗體的定量方法，包括以下步驟：使將測定對象的單株抗體固定於細孔內的多孔質體、與固定有蛋白酶且平均粒徑大於多孔質體的平均細孔徑的微粒子接觸，進行單株抗體的選擇性蛋白酶消化的步驟；及對藉由所述消化而獲得的含有來源於所述單株抗體的重鏈或輕鏈的互補決定區2區的胺基酸的肽斷片進行檢測的步驟；並且所述單株抗體的定量方法的特徵在於：使用具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶作為所述蛋白酶，其中所述單株抗體為莫佳娒利單抗。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體的定量方法，其中具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶為未進行還原甲基化處理的胰蛋白酶。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體的定量方法，其中所述肽斷片為具有序列編號10所示的胺基酸序列的肽。
  4. 一種套組，其是用於利用液相層析質譜分析(LC-MS)的單株抗體的定量檢測，並且所述套組包含：用以固定測定對象的單株抗體的多孔質體；固定有具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶的微粒子；用以使所述多孔質體與所述微粒子接觸而將單株抗體選擇性地消化的反應容器；及用以與所述微粒子及多孔質體一併導入至所述反應容器內而進行所述蛋白酶的消化反應的緩衝液，其中測定對象為莫佳娒利單抗，且內部標準肽為具有序列編號10所示的胺基酸序列的肽。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的套組，其中具有胰蛋白酶活性及胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶為未進行還原甲基化處理的胰蛋白酶。
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