CN110714064A - 一种核酸质谱检测标准品、制备方法及其应用 - Google Patents

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张郁
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张盼
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Abstract

本发明公开了一种核酸质谱检测标准品，含有多条至少由一种类型核苷酸合成的单链短核酸，其中单链短核酸为单磷酸脱氧核糖核苷酸dNMP或经过修饰的单磷酸脱氧核糖核苷酸ddNMP。本发明还公开核酸质谱检测标准品的制备方法，选取若干个核苷酸组成序列得到多条单链短核酸；将多条序列信息导入合成仪，进行序列合成，经过纯化后用C18柱浓缩、脱盐、沉淀，得到引物干粉；计算加水量，根据计算结果加水稀释，得到各单链核酸片段浓度；计算混合需要各单链核酸片段体积，将稀释后的单链核酸按计算的体积混合得到核酸质谱检测标准品。对核酸质谱进行调谐、调谐检验和基因分型检验，从而保证从核酸质谱仪安装调试到校验的每个过程都可以进行质控，保证仪器准确可靠。

Description

一种核酸质谱检测标准品、制备方法及其应用
技术领域：
本发明涉及生物质谱检测领域，具体讲是涉及核算质谱检测标准品、制备方法及其应用。
背景技术：
核酸质谱基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z) 与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。
在核酸质谱仪安装完成后或定期检修时，需要对仪器进行调谐和测试，确保仪器的状态符合检测要求，才可以进行真实样本的检测。然而，目前国家标准品库没有用于校准和调试核酸质谱仪的标准品，为针对于核酸质谱的调谐和测试造成困难。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种核酸质谱检测标准品及其制备方法，可以对核酸质谱进行调谐、调谐检验和基因分型检验，从而保证从核酸质谱仪安装调试到校验的每个过程都可以进行质控，保证仪器准确可靠。
本发明的技术解决方案是，提供一种核酸质谱检测标准品，含有多条至少由一种类型核苷酸合成的寡核苷酸。
作为优选，所述寡核苷酸为单磷酸脱氧核糖核苷酸dNMP或经过修饰的单磷酸脱氧核糖核苷酸ddNMP。
作为优选，所述多条寡核苷酸中至少有一条含有单磷酸脱氧核糖核苷酸，或者含有单磷酸脱氧核糖核苷酸及双脱氧核糖核苷酸混合。
作为优选，所述每条寡核苷酸分子量大于等于200Da。
进一步地，所述每条寡核苷酸之间的分子量最小差异为9Da。
本发明还提供另一种技术方案：核酸质谱检测标准品的制备方法，包含如下步骤：
(1)选取若干个核苷酸组成序列得到多条寡核苷酸；
(2)将多条寡核苷酸的序列信息导入合成仪，进行序列合成，经过纯化后用 C18柱浓缩、脱盐、沉淀，得到引物干粉；
(3)计算加水量，根据计算结果加水稀释，得到各寡核苷酸片段浓度；
(4)计算标准品混合物所需各寡核苷酸片段的体积，将稀释后的寡核苷酸按计算的体积混合得到核酸质谱检测标准品。
作为又一优选，所述步骤(2)中合成的寡核苷酸纯化方式为HPLC、PAGE、 RPC或者OPC。
进一步地，所述合成的寡核苷酸加入干扰盐离子，其中盐离子浓度可独立调节。
本发明还公开第三种技术方案，核酸质谱检测标准品的应用，所述核酸质谱检测标准品用于包含进行调谐、调谐检验和基因分型检验。
作为优选，应用核酸质谱检测标准品模拟核酸反应产物，与核酸反应产物同步或独立进行质谱检测，根据分子量大小，进行调谐、调谐检验和基因分型检验。
综上所述，通过本发明提供的核酸质谱标准品、制备方法，可以对核酸质谱进行调谐、调谐检验和基因分型检验，从而保证从核酸质谱仪安装调试到校验的每个过程都可以进行质控，保证仪器准确可靠。
附图说明：
图1DP-3PT标准品质谱峰的图谱；
图2DP-9PT标准品质谱峰的图谱；
图3DP-15PT标准品质谱峰的图谱。
具体实施方式：
下面就具体实施方式对本发明作进一步说明：
实施例1：DP-3PT标准品及制备方法
1.1DP-3PT标准品含有3条单链核酸，其中3条单链核酸片段的名称、分子量、纯度、终浓度和序列信息如下表所示。所有核苷酸均为脱氧核糖核苷三磷酸。
名称 分子量 纯度 浓度 序列
DP-3PT-1 5043.3Da >99.5％ 0.10μM CCATCCACTACAACTAC
DP-3PT-2 8485.6Da >99.5％ 0.15μM CCATCCACTACAACTACATGTGTAACAG
DP-3PT-3 9976.5Da >99.5％ 0.20μM CCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCT
将序列信息导入Dr.Oligo 96合成仪，参数设置2OD，进行序列合成，经过HPLC方式纯化后用C18柱浓缩、脱盐、沉淀，得到引物干粉。
加水量计算：V(微升)＝2*33*20000/分子量，根据计算结果加水稀释。得到各单链核酸片段浓度为50pmol/μL。
混合需要各单链核酸片段体积计算：V(微升)＝500/50*(LN(分子量)-7.82) *9/0.94。将稀释后的3个单链核酸按计算的体积混合得到DP-3PT标准品。得到的DP-3PT是用来进行核酸质谱调谐的标准品。
使用DP-3PT标准品进行质谱检测调谐步骤为：将DP-3PT标准品加入到384 孔板中，使用DP-TOF核酸质谱仪进行芯片点样、基质共结晶和质谱飞行的步骤得到3个质谱峰的图谱，如附图1。
实施例2：DP-9PT标准品及制备方法
2.1DP-9PT标准品的9条单链核酸片段的名称、分子量、纯度、终浓度和序列信息如下表所示。所有核苷酸均为脱氧核糖核苷三磷酸。
Figure BDA0002099672370000031
Figure BDA0002099672370000041
将序列信息导入Dr.Oligo 96合成仪，参数设置2OD，进行序列合成，经过HPLC方式纯化后用C18柱浓缩、脱盐、沉淀，得到引物干粉。
加水量计算：V(微升)＝2*33*20000/分子量，根据计算结果加水稀释。得到各单链核酸片段浓度为50pmol/μL。
混合需要各单链核酸片段体积计算：V(微升)＝500/50*(LN(分子量)-7.82) *9/0.94。将稀释后的9个单链核酸按计算的体积混合得到DP-9PT标准品。得到的DP-9PT是用来检验核酸质谱调谐结果准确性的标准品。
使用DP-9PT来检验核酸质谱调谐结果准确性步骤为：将DP-9PT标准品加入到384孔板中，使用DP-TOF核酸质谱仪进行芯片点样、基质共结晶和质谱飞行的步骤得到9个质谱峰的图谱，如附图2。
实施例3：DP-15PT标准品及制备方法
DP-15PT标准品的15条单链核酸片段的名称、分子量、纯度、终浓度和序列信息如下表所示。
其中，DP-15PT-2、DP-15PT-3、DP-15PT-4、DP-15PT-5、DP-15PT-7、 DP-15PT-8、DP-15PT-9、DP-15PT-10、DP-15PT-12、DP-15PT-13、DP-15PT-14、 DP-15PT-15的最后一个核苷酸为双脱氧核糖核苷三磷酸，其余为脱氧核糖核苷三磷酸。
Figure BDA0002099672370000042
将序列信息导入Dr.Oligo 96合成仪，参数设置2OD，进行序列合成，经过HPLC方式纯化后用C18柱浓缩、脱盐、沉淀，得到引物干粉。
加水量计算：V(微升)＝2*33*20000/分子量，根据计算结果加水稀释。得到各单链核酸片段浓度为50pmol/μL。
混合需要各单链核酸片段体积计算：V(微升)＝500/50*(LN(分子量)-7.82) *9/0.94。将稀释后的15个单链核酸按计算的体积混合得到DP-9PT标准品。得到的DP-15PT可以对核酸质谱基因分型结果进行检验，从而保证核酸质谱基因分型准确性。
使用DP-15PT对核酸质谱基因分型结果进行检验步骤：将DP-15PT标准品加入到384孔板中，使用DP-TOF核酸质谱仪进行芯片点样、基质共结晶和质谱飞行的步骤得到15个质谱峰的图谱，如附图3。
本发明具有以下优点：
上述核酸质谱标准品制备方法得到的核酸质谱标准品可以对核酸质谱进行调谐、调谐检验和基因分型检验，从而保证从核酸质谱仪安装调试到校验的每个过程都可以进行质控，保证仪器准确可靠。
以上仅就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。凡是利用本发明说明书所做的等效结构或等效流程变换，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸质谱检测标准品，其特征在于，含有多条至少由一种类型核苷酸合成的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种核酸质谱检测标准品，其特征在于，所述寡核苷酸为单磷酸脱氧核糖核苷酸dNMP或经过修饰的单磷酸脱氧核糖核苷酸ddNMP。
3.根据权利要求1所述的一种核酸质谱检测标准品，其特征在于，所述多条寡核苷酸中至少有一条含有单磷酸脱氧核糖核苷酸，或者含有单磷酸脱氧核糖核苷酸及双脱氧核糖核苷酸混合。
4.根据权利要求1所述的一种核酸质谱检测标准品，其特征在于，所述每条寡核苷酸分子量大于等于200Da。
5.根据权利要求1所述的一种核酸质谱检测标准品，其特征在于，所述每条寡核苷酸之间的分子量最小差异为9Da。
6.一种权利要求1-5所述的核酸质谱检测标准品的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)选取若干个核苷酸组成序列得到多条寡核苷酸；
(2)将多条寡核苷酸的序列信息导入合成仪，进行序列合成，经过纯化后用C18柱浓缩、脱盐、沉淀，得到引物干粉；
(3)计算加水量，根据计算结果加水稀释，得到各寡核苷酸片段浓度；
(4)计算标准品混合物所需各寡核苷酸片段的体积，将稀释后的寡核苷酸按计算的体积混合得到核酸质谱检测标准品。
7.根据权利要求6所述的核酸质谱检测标准品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中合成的寡核苷酸纯化方式为HPLC、PAGE、RPC或者OPC。
8.根据权利要求1所述的一种核酸质谱检测标准品，其特征在于，所述合成的寡核苷酸加入干扰盐离子，其中盐离子浓度可独立调节。
9.一种核酸质谱检测标准品的应用，其特征在于，所述核酸质谱检测标准品用于包含进行调谐、调谐检验和基因分型检验。
10.根据权利要求9所述核酸质谱检测标准品的应用，其特征在于，应用核酸质谱检测标准品模拟核酸反应产物，与核酸反应产物同步或独立进行质谱检测，根据分子量大小，进行调谐、调谐检验和基因分型检验。
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