CN112444556A - 一种飞行时间核酸质谱参数确定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,包括如下步骤:S1.调谐硬件,用调谐参考品调整飞行时间核酸质谱硬件调谐参数;S2.验证特性,用验证参考品确认飞行时间核酸质谱质谱特性参数;S3.确认识别,用确认参考品验证飞行时间核酸质谱检测符合率;S4.固化参数,将上述步骤中的参数存储和/或固化到飞行时间核酸质谱以便重复使用。本发明涉及一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,能够通过参考品确定和固化质谱仪器的硬件参数、验证参数、确认参数,确定质谱仪器的质荷比、峰高、分辨率、信噪比、基线、检测符合率等测量关键性能,为质谱仪器提供检测结果提供必要的条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,特别是涉及需要参考品调谐和性能确认的质谱仪器。
背景技术
随着基因工程的突起,质谱仪器的不断发展,在基因测序,药物临床和遗传学等方面的广泛运用,对质谱仪器的性能参数提出了更高的要求,飞行时间核酸仪器的原理为,在真空环境中,样品与芯片基质结晶,在激光器的激光发射下,电离出离子使其飞行,在真空室的环境里,根据质荷比,在相同的环境下,质荷比小,较早的到达离子检测器,质荷比大,较晚的到达检测器,使之进行分离,并确定分子量。核酸质谱检测通过检测核苷酸的分子量差异识别核苷酸的类型,对于质谱系统的分子量测量的准确性要求较高,为了更好的校准分子量和验证校准的准确性并将相关的硬件进行固化,以便重复检测。
发明内容
基于参考品调谐、验证和确认质谱仪器的峰高,分辨率和信噪比、基线、检测符合率,提供一种调谐质谱仪器参数的方法。
为了解决上述问题,本发明的目的在于提供一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,这样仪器能够有效检测样本分子量,进而的识别核酸信息。
本发明所采取的技术方案是:一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,包括如下步骤:
S1.调谐硬件,用调谐参考品调整飞行时间核酸质谱硬件调谐参数;
S2.验证特性,用验证参考品确认飞行时间核酸质谱质谱特性参数;
S3.确认识别,用确认参考品验证飞行时间核酸质谱检测符合率;
S4.固化参数,将上述步骤中的参数存储和/或固化到飞行时间核酸质谱以便重复使用。
作为优选,所述所述S1调谐硬件的步骤如下:
S11.选取飞行时间核酸质谱质量范围典型质谱峰,作为调谐特征峰,调谐特征峰至少包含位于质谱范围的3个特征峰;
S12.根据选定特征峰的质荷比及浓度设定,制作相应分子量的寡核苷酸引物序列,并将引物序列制作成调谐参考品;
S13.将调谐参考品放入飞行时间核酸质谱设备,进行质谱检测,通过一元二次方程m=At2+Bt+C拟合曲线,计算质荷比(m/z),获得调谐参考品的质荷比飞行时间基线及硬件调谐参数;
S14.暂存硬件调谐参数。
进一步地,所述步骤S13包括如下步骤:
S131.手动操作质谱仪,并进行质谱检测,利用硬件初始值多次质谱检测获得调谐特征峰的质谱数据,观察包含但不限于延迟时间、峰高、信噪比、分辨率、基线质谱峰原始数据;
S132.调整延迟时间,通过调整数模转换器起始采样的延时时间,使得质荷比与理论值的相对标准差不大于0.1%~10%,优选1%;
S133.将三个质谱峰的已知质荷比及数模转换器的采用时间带入m=At2+Bt+C求解,得到ABC三个初始校准参数;
S134.调整加速电压,使获得多次原始的质谱范围质荷比与理论值差异小于1~10,优选3,如果达不到优选值,可进一步调整S132;
S135.调整激光功率,功率越高,峰高值越大,使调谐特征峰的质谱峰峰高达到硬件最大值的50%-95%之间;
S136.通过调整激光聚焦及聚焦电压调整质谱峰的分辨率;
S137.调整离子检测器增益,使基线高度达到硬件最大值的10%以内,如果质谱峰峰高不满足50%-95%要求,同步调整激光器功率;
S138.如果需要更优的质荷比的校准,执行完S134~S137后优选再执行S132~S133步骤可以得到更优的校准参数。
进一步地,所述S135调整激光功率包括如下步骤:
S1351.调整激光聚焦,双离子峰峰高相对单离子峰峰高的比例为25%~50%,如果上述比例偏高,应适当降低激光聚焦程度,如果上述比例小于25%,应适当提高激光聚焦程度,使调谐特征峰的双离子与单离子峰峰高的比值在要求范围之间;
S1352.调整聚焦电压,调整聚焦电压优化特征峰分辨率,通过与S1341相互配合,达到分辨率要求的调整。
进一步地,所述S137包括如下步骤:
S1371.调整离子检测器的增益电压,使基线不超过硬件最大值的5%、10%、15%、20%,如果基线过高微调降低激光功率,如果基线过低,可以提高激光发射器的功率;调整激光功率时峰高须满足S133的要求;
S1372.如果基线满足要求,转入S2,峰高不满足要求,转入S133进行调试。
进一步地,所述步骤S2确认特性包括如下步骤:
S21.选取飞行时间核酸质谱质量范围内典型质谱峰作为检测特征峰,检测特征峰包含但不限于调谐特征峰,性能特征峰,性能特征峰包含不同浓度,不同分子量的用于检测飞行时间核酸质谱的质荷比、分辨率、信噪比、峰面积性能的特征峰;
S22.根据选定检测特征峰的数值,制作相应分子量和相应浓度的寡核苷酸引物序列,并将引物序列制作成验证参考品;
S23.将验证参考品放入飞行时间核酸质谱设备,进行质谱检测,获得确认参考品的核酸质谱检测结果,包含但不限于质荷比、分辨率、信噪比、峰面数值,通过对比检测结果对应的检测阈值线,如果不满足阈值线要求则重新进行S1步骤,如果满足阈值线要求暂存特性参数,进行S3步骤。
进一步地,所述步骤S3包括如下步骤:
S31.选取飞行时间核酸质谱应用试剂盒检测已知样品或质控品作为确认参考品,确认参考品的包含不同浓度、不同质合比的引物序列,验证特性参考品验证参数包含但不限于识别信号类型、等位基因强度、最小信号强度、等位基因分数、引物延伸率、检测分析类型、最大损害阈值、识别置信度、检测结果、检测准确率参数及阈值;
S32.将确认参考品按照仪器使用手册进行操作,统计检测准确率,应符合仪器检测识别率的要求,进入S4步骤,如果不符合检测符合率要求,重复从S1至S3步骤。
1.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述S4还可以包括如下步骤:
S41.将硬件调谐参数存储于核酸质谱设备,硬件参数固化;
S42.将质谱特性参数存储于核酸质谱设备,特性参数固化;
S43.将检测识别参数存储于核酸质谱设备,确认参数固化。
进一步地,重复性或回溯性确认核酸质谱参数时,本方法S1至S4的步骤中,从中选选取至后按顺序进行操作,选取后须执行从选取点至后的步骤。
进一步地,调谐参考品、验证参考品、确认参考品分别独立使用或将其混合作为综合参考品,根据使用目的不同的步骤中选取综合参考品中的特征值和/或阈值。
通过对上述的参数进行确认,使之均可满足要求。
本发明的有益效果是:本发明涉及一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,能够通过参考品确定和固化质谱仪器的硬件参数、验证参数、确认参数,确定质谱仪器的质荷比、峰高、分辨率、信噪比、基线、检测符合率等测量关键性能,为质谱仪器提供检测结果提供必要的条件。
附图说明
图1是离子激发原理图;
图2是离子飞行原理图;
图3本发明一种飞行时间核酸质谱参数确定方法的流程图;
图4是本发明具体实施的调谐质谱图的界面。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,以下将结合附图和实施例,对本发明技术方案的具体实施方式进行更加详细、清楚的说明。然而,以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的,而不是对本发明的限制。其只是包含了本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,本领域技术人员对于本发明的各种变化获得的其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明为一种飞行时间核酸质谱的通过测量带电荷离子的飞行时间,确定带电离子的质荷比,检测过程可以分为两个步骤,离子激发和飞行时间检测,离子激发是通过激光照射样本与基质形成的共结晶产生带电离子,调整激光器的能量可以调整带电离子的丰度,从而调整质谱峰的峰高,见图1。离子激发完成后,通过调整引出电场将离子从离子源引出,再通过加速电场是离子有一定初速度,质量重的离子加速后速度较低,质量轻的离子加速后速度较高。离子加速完成后通过聚焦电压聚焦提高分辨率,通过离子在飞行管中飞行,提高不同速度到达检测器的时间差,进而分辨不同离子的质量,见图2。
为了使仪器有最佳的参数,包括质谱峰的位置,已知寡核苷酸引物序列的质荷比,在系统对应的位置出现,并有较好的峰高,同一种离子的数量同时到达检测器产生的峰值,质谱分辨率,二个相邻的峰,对其进行分辨的能力,质谱信噪比,峰与基峰噪音干扰信号的识别。不同的参数影响质谱仪器的质荷比、峰高、信噪比、分辨率、基线等检测结果,通过参考品及合理的方法称为质谱仪器性能的报证。
根据离子飞行的原理,离子质量为(z,离子电荷数,U加速电压,L飞行距离,t飞行时间),离子电荷数z为1,飞行距离L为常数,离子质量与加速电压成正比,与飞行时间成平方成正比,故此飞行时间与离子质量是二次方关系,故此用m=At2+Bt+C来校准飞行时间质谱,而飞行时间与加速电压相关,需要调整加速电压确定飞行时间的基值,从而确定质荷比。
根据飞行时间检测工作原理,制作分子量准确的参考物质或参考品,并按照参数调整方法进行参数调整、确认及验证,并固化质谱仪的参数。
通过实施例,进一步说明核酸质谱参数确定方法。
准备参考品:
质谱仪的质量范围为4000-10000(m/z),参考品按照如下参数选择。
通过核酸合成工艺,分别制作分子量为5043Da,8486Da,9976Da合成引物作为分子量的质量参考,形成调谐参考品,其中9976Da为质量范围大分子量的一端,5043Da为小分子量一端,8486Da为校准中间点。
通过核酸合成工艺,分别制作分子量为4053Da,5043Da,6275Da,7352Da,8265Da,8486Da,9237Da,9253Da,9976Da合成引物作为分子量的质量参考,形成确认参考品。其中5043Da,8486Da,9976Da用于调谐参考品的特征峰,用于重复确认,4053Da、7352Da、9976Day用于质量范围的两端及中间点,确认质量范围内质荷比检测,9237Da、9253Da用于应用性能的测试点,两个分子量相差为16Da,检测16Da时能够有效分辨。
选用核酸质谱试剂盒的质控品作为验证参考品,验证是否能够完成核酸的检测。
硬件调谐实施例:
新质谱检测仪器硬件调谐前,应检查软件、硬件各功能模块是否正常,原始设计硬件参数是否已经设置。
将调谐参考品进行进样,并手动进行质谱检测,因为质谱图中只有3个质谱峰较容易识别,观察最小和最大的两个质谱峰应为5043(m/z),9976(m/z)峰,因为m=At2+Bt+C中的参数ABC为原始参数,并未进行调谐,5043(m/z),9976(m/z)两个峰的显示值并非为5043(m/z),9976(m/z),在观察质谱图最小质谱峰的峰高、分辨率和信噪比信息,用同样的方式选定最大质谱峰,多次手动质谱检测,这两个峰在质谱图中相对位置不变而且重复出现,可以认定最左边的峰为5043Da标准品经过质谱后出现的峰,最右的峰为9976Da标准品经过质谱出现的峰,同时这两个峰之间靠近右边还有一个峰应为8486(m/z)峰。选择多次质谱检测后,通过设定延迟时间参数,使最左边的峰将其质荷比设定为5043(m/z),而且重复再进行质谱,其显示值与参考品的标称值误差小于1%,观察最右面的峰质荷比的显示值是否为9976(m/z),不满足时可以调整加速电压,使其误差小于1%;如果两个峰的显示值均不满足1%,可以再进一步调整延迟时间和加速电压;如果最左边的峰显示值如果仍在1%内,可利用m=At2+Bt+C公式及三个峰的质荷比及时间进行数据拟合确定ABC三个参数,如下表,并将参数进行保存。
A | B | C |
2.16665e-005 | 0.52511 | 3234.01434 |
调整激光功率,观察质谱峰的峰值是否在硬件数模转换器的最大幅值的50%-95%,如果不满足可以通过调整激光器的发射功率的设置参数,使两个峰的峰值满足。
调整离子放大器的放大倍数,观察质谱峰基线是否在小于25(数模转换器为8位时,最大值为256,数模转换器位数不同可做相应比例的转换)以内,如果不满足可能通过调整离子放大器增益的设置参数。
调整聚焦电压,观察5043(m/z)峰的分辨率是否在800以上,如果低于800,则调整聚焦电压设置参数,使5043峰的分辨率满足要求。
取验证参考品,核酸质谱检测,观察5043(m/z),8486(m/z),9976(m/z)质荷比附近的三个峰,确认其质荷比满足优选3的要求;观察质谱图中9237(m/z)、9253(m/z)质荷比附近的2个质谱峰,确认仪器能够有效分辨相差16Da的峰;观察4053、7352、9976附近的三个峰的峰高、分辨率和信噪比符合要求,验证满足质谱仪器质量范围。
调整激光位置及激光聚焦电压,观察质谱图中三个峰的分辨率;
通过调整激光器激发功率,监测已知峰高在128-243(数模转换器为8位时,最大值为256,数模转换器位数不同可做相应比例的转换)之间。
通过以上参数的调谐,再对峰高,分辨率和信噪比全部进行确认,综合需要参数达到要求,将参数进行保存。
使用确认参考品,进行点样和质谱飞行,质谱仪能够识别信号类型、等位基因强度、最小信号强度、等位基因分数、引物延伸率、检测分析类型、最大损害阈值、识别置信度、基因型、检测准确率参数或/和阈值是否满足确认性能要求,这些参数因为不同应用有不同的参数数据,应根据自己的应用进行设定,这里不做假设或限定,如果满足性能要求调谐参数完成,如果不满足可从S1步骤开始,依次重复进行调谐、验证、确认直到满足确认性能要求。
经过调谐后,各硬件参数见表1,调谐结果符合要求见表2。
项目 | 数值 |
激光功率 | 258 |
延时时间 | 4250ns |
聚焦电压 | 2320V |
检测器增益电压 | 2490V |
表1调谐参数表
表2质谱调谐结果。
Claims (10)
1.一种飞行时间核酸质谱参数确定方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.调谐硬件,用调谐参考品调整飞行时间核酸质谱硬件调谐参数;
S2.验证特性,用验证参考品验证飞行时间核酸质谱质谱特性参数;
S3.确认识别,用确认参考品确认飞行时间核酸质谱检测符合率;
S4.固化参数,将上述步骤中的参数存储和/或固化到飞行时间核酸质谱以便重复使用。
2.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述S1调谐硬件的步骤如下:
S11.选取飞行时间核酸质谱质量范围典型质谱峰,作为调谐特征峰,调谐特征峰至少包含位于质谱范围的3个特征峰;
S12.根据选定特征峰的质荷比及浓度设定,制作相应分子量的寡核苷酸引物序列,并将引物序列制作成调谐参考品;
S13.将调谐参考品放入飞行时间核酸质谱设备,进行质谱检测,通过一元二次方程m=At2+Bt+C拟合曲线,计算质荷比(m/z),获得调谐参考品的质荷比飞行时间基线及硬件调谐参数;
S14.暂存硬件调谐参数。
3.根据权利要求2所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述步骤S13包括如下步骤:
S131.手动操作质谱仪,并进行质谱检测,利用硬件初始值多次质谱检测获得调谐特征峰的质谱数据,观察包含但不限于延迟时间、峰高、信噪比、分辨率、基线质谱峰原始数据;
S132.调整延迟时间,通过调整数模转换器起始采样的延时时间,使得质荷比与理论值的相对标准差不大于0.1%~10%,优选1%;
S133.将三个质谱峰的已知质荷比及数模转换器的采用时间带入m=At2+Bt+C求解,得到ABC三个初始校准参数;
S134.调整加速电压,使获得多次原始的质谱范围质荷比与理论值差异小于1~10,优选3,如果达不到优选值,可进一步调整S132;
S135.调整激光功率,功率越高,峰高值越大,使调谐特征峰的质谱峰峰高达到硬件最大值的50%-95%之间;
S136.通过调整激光聚焦及聚焦电压调整质谱峰的分辨率;
S137.调整离子检测器增益,使基线高度达到硬件最大值的10%以内,如果质谱峰峰高不满足50%-95%要求,同步调整激光器功率;
S138.如果需要更优的质荷比的校准,执行完S134~S137后优选再执行S132~S133步骤可以得到更优的校准参数。
4.根据权利要求3所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述S135调整激光功率包括如下步骤:
S1351.调整激光聚焦,双离子峰峰高相对单离子峰峰高的比例为25%~50%,如果上述比例偏高,应适当降低激光聚焦程度,如果上述比例小于25%,应适当提高激光聚焦程度,使调谐特征峰的双离子与单离子峰峰高的比值在要求范围之间;
S1352.调整聚焦电压,调整聚焦电压优化特征峰分辨率,通过与S1341相互配合,达到分辨率要求的调整。
5.根据权利要求3所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述S137包括如下步骤:
S1371.调整离子检测器的增益电压,使基线不超过硬件最大值的5%、10%、15%、20%,如果基线过高微调降低激光功率,如果基线过低,可以提高激光发射器的功率;调整激光功率时峰高须满足S133的要求;
S1372.如果基线满足要求,转入S2,峰高不满足要求,转入S133进行调试。
6.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述步骤S2确认特性包括如下步骤:
S21.选取飞行时间核酸质谱质量范围内典型质谱峰作为检测特征峰,检测特征峰包含但不限于调谐特征峰,性能特征峰,性能特征峰包含不同浓度,不同分子量的用于检测飞行时间核酸质谱的质荷比、分辨率、信噪比、峰面积性能的特征峰;
S22.根据选定检测特征峰的数值,制作相应分子量和相应浓度的寡核苷酸引物序列,并将引物序列制作成确认参考品;
S23.将验证参考品放入飞行时间核酸质谱设备,进行质谱检测,获得验证参考品的核酸质谱检测结果,包含但不限于质荷比、分辨率、信噪比、峰面数值,通过对比检测结果对应的检测阈值线,如果不满足阈值线要求则重新进行S1步骤,如果满足阈值线要求暂存特性参数,进行S3步骤。
7.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述步骤S3包括如下步骤:
S31.选取飞行时间核酸质谱应用试剂盒检测已知样品或质控品作为确认参考品,确认参考品的包含不同浓度、不同质合比的引物序列,确认特性参考品确认参数包含但不限于识别信号类型、等位基因强度、最小信号强度、等位基因分数、引物延伸率、检测分析类型、最大损害阈值、识别置信度、基因型、检测准确率参数或/和阈值;
S32.将确认参考品按照仪器使用手册进行操作,统计检测准确率,应符合仪器检测识别率的要求,进入S4步骤,如果不符合检测符合率要求,重复从S1至S3步骤。
8.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,所述S4还可以包括如下步骤:
S41.将硬件调谐参数存储于核酸质谱设备,硬件参数固化;
S42.将质谱特性参数存储于核酸质谱设备,特性参数固化;
S43.将检测识别参数存储于核酸质谱设备,确认参数固化。
9.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,重复性或回溯性确认核酸质谱参数时,本方法S1至S4的步骤中,从中选选取至后按顺序进行操作,选取后须执行从选取点至后的步骤。
10.根据权利要求1所述的一种飞行时间核算质谱参数确定方法,其特征在于,调谐参考品、验证参考品、确认参考品分别独立使用或将其混合作为综合参考品,根据使用目的不同的步骤中选取综合参考品中的特征值和/或阈值。
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2020
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