CN102687020A - 利用特征肽和质谱对混合物中的单个重组蛋白进行多重定量 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及给复杂基质中选定的多种重组蛋白(比如血清中的重组多克隆抗体或者表达在培养物上清中的重组多克隆抗体)定量的分析方法。

Description

利用特征肽和质谱对混合物中的单个重组蛋白进行多重定量
本申请中提及的所有专利和非专利参考文献均通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明涉及用于给复杂样品中选定的多重重组蛋白，比如血清中的重组多克隆抗体或者培养物上清中表达的重组多克隆抗体定量的分析方法。所述方法涉及通过质谱对肽进行高灵敏度定量。
发明背景
需要对各种复杂蛋白样品，例如人血清或血浆中重组蛋白的定量方法。传统上，这类检测方法采取免疫分析法的形式，比如象ELISA，利用的是抗目标蛋白的特异抗体作为特异和检测试剂。
新方法，尤其是涉及标记了同位素的肽或蛋白内部标准的那些方法，使得质谱可以提供这类定量的肽和蛋白检测法。现有技术对利用内部参照肽通过质谱进行的定量已有很好的描述。但是，在应用到非常复杂的混合物上时，比如完整血浆蛋白消化为肽而产生的那些混合物上时，还存在MS检测法的动态范围和灵敏度的问题。关于动态范围和灵敏度的问题以前是通过将免疫亲和与MS联用于内源生物标记物的定量分析而解决的[1-5]。
本发明将重组多克隆蛋白(比如重组多克隆抗体)从复杂样品(比如血清或血浆)或培养物上清中的亲和纯化和利用内部参照肽经质谱进行的定量结合在一起。本发明通过采用亲和纯化步骤使得灵敏度得以提高。
本发明探讨的另一个问题是分析物的完整性。传统上，基于肽对蛋白进行的定量可能在完整蛋白之外将部分降解的蛋白也计量在内。这在对生物药物进行定量以便制作例如药代动力学谱时尤其是个问题。本发明的优选实施方案中，抗体混合物的量化采用了一个初始的蛋白A纯化步骤。因为蛋白A结合免疫球蛋白的Fc部分并且随后的定量基于来自CDR区的特异标记肽，因此可能的确是完整抗体被定量。
根据本发明的方法使得能够对血清中的抗体进行检测和量化，而不需要象例如ELISA中的特异性抗个体基因型的抗体。而且本发明公开的方法是通用的。只需要鉴定并确认合适的特征肽用于MS定量。要达到更高的灵敏度，有可能采用以抗特征肽的抗体进行的免疫亲和步骤。因为本发明的方法涉及通过质谱检测独特肽，对抗特征肽的抗体没有高特异性，只有高亲和性的要求。
与ELISA相比，根据本发明的方法的另一个优势是质谱分析产生更大的动态范围。
发明概述
本发明涉及药代动力学研究中进行多克隆性表征和高通量分析的方法。
发明涉及样品中一或多个重组蛋白的定量方法，该方法包括的步骤有
i)通过亲和纯化将所述一或多个重组蛋白浓缩以得到第一级分
ii)消化所述第一级分从而将所述重组蛋白中每一个的一或多个特异特征肽释放到第二级分中
iii)给所述第一级分和/或所述第二级分加入所述重组蛋白中每一个的一或多个内部参照肽
iv)任选地，利用偶联了抗特征肽抗体的树脂将所述特征肽和所述内部参照肽浓缩，然后将所述特征肽和所述内部参照肽释放从而得到第三级分；和/或任选地，利用树脂以能够分开样品的化学物将所述特征肽和所述内部参照肽浓缩，从而使目标肽得以浓缩
v)通过质谱分析对所述特征肽进行量化。
所述方法可以用于样品中一或多个蛋白的定量。在优选实施方案中，方法被用于样品中两个或更多个蛋白，比如重组多克隆抗体的定量。所述样品可以是血清或血浆样品、细胞培养物或生物反应器上清或者是处理中的重组多克隆抗体样品。方法可以用于药代动力学研究中确定单个抗体的体内清除率。在另一个实施方案中，方法被用于重组多克隆抗体样品中药物的多克隆性表征。
再一个实施方案中，本发明涉及方法在与制备重组多克隆抗体相关联的定量一或多个重组蛋白中的用途。定量可以在药品和/或药物的上游和/或下游加工过程中进行。
发明的一个关键特点是它旨在建立针对事先选定的特异重组蛋白，而不是将一或多个样品的所有未知成分互相进行比较的定量方法。根据本发明的方法可以用于分析血清样品中的一或多个同源重组蛋白，其中所述血清样品还包含了其他同源蛋白。
本发明的方法能促进对血清中的多克隆抗体组合物中单个抗体进行的分析，以便无需抗独特型抗体就能进行例如药代动力学研究，而不是象在例如基于ELISA的技术中那样需要抗独特型抗体。相应地，在比如药代动力学研究中，可以在给药后确定和/或监测有需要的个体中的重组多克隆抗体浓度。在一个实施方案中，纯化是通过蛋白A或类似的Fc结合分子进行的，随后通过测量优选位于抗体可变结构域之一的肽来进行定量。这样确保了被测量的分析物不是降解产物，因为它依赖于Fc和Fab的同时存在。
定义和缩写
名词“特征肽(signature peptide(s))”是指一或多个不同的肽被选中作为样品中给定蛋白的指示片段/肽(monitor fragment/peptide)。
名词“内部参照肽”是指与特征肽氨基酸序列相同的同位素标记的肽。“内部参照肽”可以是相应特征肽的任何改造形式，其1)被适宜的结合剂识别为与特征肽等同或者生物物理特性表明是化学等同物，和2)它们的差异可以通过质谱来区别，通过直接测量分子量或者通过对片段进行质量测量(例如，通过MS/MS分析)，或者通过另一种同等的方式。
名词“抗体”是指任何物种的任何种类的免疫球蛋白分子，或者由其衍生的任何分子，或者任何其他特异性结合剂，所述结合剂是通过对保守分子支架进行改造从而能够特异结合分析物或监测片段，比如重组蛋白和/或特征肽。
名词“抗肽抗体”被作为“抗特征肽抗体”的同义词使用，它可以是任何类型的抗体(以上广泛意义上)，所述抗体能够与肽结合，比如特征肽和内部参照肽从而从样品或经过处理的样品中富集。总的来说，本文中任何使用抗体之处应理解为可以通过另一种结合剂，比如亲和体或抗体模拟物来实现的目的。在一个实施方案中，抗肽抗体与肽的结合不需要特异性很高-即在一个实施方案中，高亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)更重要。
名词“结合剂(binding agent)”可以是多种不同的分子、生物细胞或聚集物中的任何一种。在本文语境中，在检测前用结合剂结合待检测的分析物以便使之富集，其特异结合方式使得一或多种分析物被结合并富集。蛋白、多肽、肽、核酸(寡核苷酸和多聚核苷酸)、抗体、配体、多糖、微生物、受体、抗生素、测试化合物(特别是通过组合化学产生的那些)均可以各自作为结合剂。
名词“结合”包括任何物理附着或密切关联，可以是永久性或暂时的。一般来说，可逆结合包括促进目的分子和被测量的分析物之间的物理附着的电荷相互作用、氢键、疏水作用、范德华力等方面。
名词“蛋白”是指任何不论长度或翻译后修饰的氨基酸链。蛋白可以以单体或多聚体存在，包含两个或以上的组装的多肽链、蛋白片段、多肽、寡肽或肽。
名词“重组多克隆抗体”是指利用重组技术制备的重组抗体分子的精选组合物。本发明特别涉及对重组多克隆抗体组合物的标准，其中所述抗体是利用通常用于商业生产重组抗体的细胞系表达的，例如以上提及的人或其它哺乳动物细胞系之一。在本发明的语境中，抗体被认为是重组的，如果其编码序列已知，并且是由杂交瘤或永生化B细胞表达的。在本发明的语境中，名词“重组蛋白”包括“重组多克隆抗体”。重组多克隆抗体描述了由不同抗体分子组成的组合物，其能够与相同或不同抗原上的多个不同特异性抗原决定簇结合或反应。多克隆抗体还可以被看作是“单克隆抗体鸡尾酒”。多克隆抗体的变化性位于构成多克隆抗体的各个抗体中所谓的可变区，特别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3区中。可以通过本发明的方法进行表征的多克隆抗体可以是任何来源，例如嵌合的、人源化的或者完全来自人。根据本发明的重组多克隆抗体优选包含至少两个不同抗体群。
名词“多克隆性(polyclonality)”是指这样的事实，即重组多克隆蛋白包含限定数量的蛋白，因此与传统重组蛋白或单克隆抗体相比是多克隆的。这个名词可以用于在基因和蛋白水平描述多克隆性。重组多克隆蛋白的变化性特征在于重组多克隆蛋白中各个成员的氨基酸序列的不同。
名词“组成变化(compositional variability)”是指最终批次之间单个重组蛋白或抗体的实际量的测量变化。
名词“免疫球蛋白”常用作血液或血清中存在的抗体混合物的总称。因此血清来源的多克隆抗体经常被称为免疫球蛋白或γ球蛋白。但是，“免疫球蛋白”还可以用于命名来自其他来源的抗体的混合物，例如重组免疫球蛋白。所有免疫球蛋白不论其特异性，具有共同的四个多肽链结构:两个相同的重链，每个取决于表达状态，可能携带共价附着的寡糖基团；和两个相同的通常未被糖基化的轻链。重链和轻链通过二硫键被连在一起。重链还通过二硫键相互连接。所有四个多肽链均含有分别位于羧基端和氨基端的恒定和可变区。
免疫球蛋白根据其重链成分被分为5个主要的类型:IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。轻链有两个类型K(kappa)和λ(lambda)。每种分子可能含有κ或γ，但不会两者都含有。IgG和IgA还可以进一步划分为由每个类型中氨基酸序列的细微差别造成的亚型。在人体中发现了四个IgG亚型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中也发现了四个IgG亚型:IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。在人中，有三个IgA亚型：IgAl、IgA2和IgA3。亲和体:亲和体分子是小的强亲和力蛋白分子，可以经改造与大量靶蛋白特异结合。
MS是质谱。
MS/MS是串联质谱。
MRM是多反应监测或等同的技术，比如例如SRM(单个/选定反应监测)。
B细胞受体是位于B细胞外表面的跨膜受体蛋白。受体的结合部分由膜结合抗体构成，这些抗体与所有抗体一样，含有独特的随机决定的抗原结合位点。
T细胞受体或TCR是在T淋巴细胞(或T细胞)表面发现的分子，它们通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在95%的T细胞中，是由α和β链构成的异二聚体，而5%T细胞中含有由γ和δ链构成的TCRs。
附图描述
图1:显示A992特征肽的峰面积与AQUA肽的比率关系的标准曲线，其中在一系列空白食蟹猴(Cynomolgus monkey)血浆中加入不同浓度的A992。每个样品加入1 pmol的A992 AQUA肽。一式三份确定每个浓度处的比率。以线性回归对数据进行拟合，虚线显示最佳拟合线性回归的95%置信带。
图2:显示A1024特征肽的峰面积与AQUA肽的比率关系的标准曲线，其中在空白食蟹猴血浆集合中加入不同浓度的A1024。每个样品加入1 pmol的A1024 AQUA肽。一式三份确定每个浓度处的比率。以线性回归对数据进行拟合，虚线显示最佳拟合线性回归的95%置信带。
图3:被给予8mg/kg药物前导物的食蟹猴中的A992和A1024的血浆浓度—时间曲线。在给予药物前导物后的0.5到48小时确定A992和A1024的浓度。
图4:0.2μg/ml-100μg/ml范围内的标准曲线，一式三份(一个异常值)。线性曲线显示了加标(spiked)血清样品中抗体浓度与相对反应特征肽/参照肽的关系。同时测量两种抗体。上图代表A992的标准曲线，下图代表A1024的标准曲线。
发明详述
本发明涉及用于给复杂样品中选定的多重重组蛋白，比如血清中的重组多克隆抗体或者细胞或组织培养物上清中表达的重组多克隆抗体定量的分析方法。所述方法涉及通过质谱对肽进行高灵敏度定量。
发明涉及样品中一或多个重组蛋白的定量方法，包括的步骤有:
i)通过亲和纯化将所述一或多个重组蛋白浓缩以得到第一级分
ii)消化所述第一级分从而将所述重组蛋白中每一个的一或多个特异特征肽释放到第二级分中。在消化前，任选对所述第一级分进行还原和/或烷基化。
iii)给所述第一级分和/或所述第二级分加入所述重组蛋白中每一个的一或多个内部参照肽
iv)任选地，利用偶联了抗特征肽的抗体的树脂将所述特征肽和所述内部参照肽浓缩，然后将所述特征肽和所述内部参照肽释放从而得到第三级分；和/或任选地，利用树脂和能够分开样品的化学物将所述特征肽和所述内部参照肽浓缩，从而使目的肽得以浓缩
v)通过质谱分析对所述特征肽进行量化
vi)任选地，用样品中加有浓度已知的相应蛋白的制品重复步骤i)到v)以便获得蛋白标准曲线
vi)将步骤v)中获得的所述特征肽的定量与步骤vi)中获得的蛋白标准曲线进行比较，得到所述样品中所述一或多个重组蛋白的量。在一个实施方案中，该方法得到了所述样品中所述一或多个重组蛋白的绝对定量。
在优选实施方案中，本发明涉及样品中两种或多种重组蛋白的定量方法，包括如上限定的步骤i)—vi)。
如果对特定应用有利，步骤ii)和iii)可以互换。
步骤i)涉及重组蛋白的浓缩(up-concentration)
以上步骤i)可以包括现有技术中描述的浓缩/富集一或多个重组蛋白的任何方法–富集到的级分被称为第一级分。在一个实施方案中，浓缩/富集捕获到完整蛋白，比如诸如完整重组多克隆抗体的完整重组蛋白。
通过亲和层析进行的分离是基于对特定结合分子的亲和力的不同。将结合分子或者复数种结合分子(这些不同选项在下文中统称为结合分子)固定在层析介质上，含有重组蛋白的样品被上样到亲和柱上，上样条件有利于重组蛋白中各个成员与固定的结合分子之间的相互作用。对固定的结合分子没有亲和力的蛋白收集到柱子流过液中，随后在能够抵消结合的条件(例如，低pH、高盐浓度或者高配体浓度)下，将对固定化结合分子有亲和力的蛋白从柱子上洗脱。
浓缩/富集可以利用蛋白A进行。可以将蛋白A固定到支持物上，用于从原始蛋白混合物(比如血清)中纯化总IgG。蛋白A以高亲和力结合人IgG1和IgG2，以及小鼠IgG2a和IgG2b。蛋白A与人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgG1以中等亲和力结合。蛋白A还可以用于纯化来自其他动物，包括猴的抗体。蛋白A的一个重组形式被称为MabSelect SuRe。在一个实施方案中，步骤i)中使用的亲和层析的基质由固定在琼脂糖珠子上的葡萄球菌蛋白A构成。替代品包括蛋白A-SEPHAROSE；固定在琼脂糖上的蛋白；与活化的精氨酸-琼脂糖偶联的蛋白A；以及偶联了磁珠、橡胶珠和琼脂糖珠、聚合物珠、聚苯乙烯珠和PEG珠的蛋白A。
除了蛋白A，以上步骤i)中可以使用其他能够结合免疫球蛋白的蛋白，比如能够结合免疫球蛋白的细菌蛋白，象例如蛋白G、蛋白A/G和蛋白L。就被识别的抗体部分和能够结合的抗体物种和类型而言，这些免疫球蛋白结合蛋白的抗体结合特性各不相同。发明还涉及使用其他免疫球蛋白结合蛋白，比如象链球菌蛋白G、兔抗小鼠IgG免疫球蛋白、在其他物种中产生的抗人IgG免疫球蛋白和抗猴IgG免疫球蛋白。
本发明还涉及在步骤i)中使用其他基于亲和力的纯化方法。这些包括抗体的任何目标分子、Fc受体、Con A(例如来自洋刀豆(Canavalia ensiformis)(Jack bean)的刀豆凝集素A;其识别糖蛋白)、其他类型的凝集素亲和层析、抗抗体可变部分的抗体或者抗抗体恒定部分的抗体(比如抗Fc部分的抗体)。磁珠上的抗体也可以用于步骤i)。另一个实施方案中，步骤i)中使用了循环免疫亲和。
另一个实施方案中，步骤i)包括利用树脂和/或柱子纯化一或多种抗体，所述树脂和/或柱子偶联了被一或多种重组蛋白，比如一或多种重组多克隆抗体识别的一或多种肽或靶抗原。在一个实施方案中，所述一或多种蛋白的纯化可以借助与结合的靶抗原的相互作用来进行。
初始的浓缩步骤，比如步骤i)中通过蛋白A进行的富集，可以批量进行，比如以96孔格式进行或者作为多维LC-MS系统的一部分。替代地，可以离线分批进行。
步骤ii)涉及还原、烷基化和消化
在步骤i)的初始浓缩之后，用选定的蛋白酶消化第一级分以便从每种待量化的蛋白中将一或多种特异性特征肽释放到第二级分中。在一个实施方案中，第一级分在消化前被还原和烷基化。第二级分包含被蛋白酶释放的特征肽和其他肽。所述第一和/或第二级分的还原、烷基化和消化可以通过本领域已知的任何方法进行。例如肽可以利用二硫苏糖醇(DTT)还原，然后用例如4-乙烯基吡啶、碘乙酰胺或碘乙酸进行烷基化。
第一级分(其中有希望测量的一或多种选定的重组蛋白)优选用合适的蛋白酶，比如胰蛋白酶基本完全d消化，或者如果能够以可重复的方式进行部分消化，从而产生肽(包括选定的特征肽)。对于其序列在重组蛋白序列中出现一次的特征肽，理想情况下，这一消化应当产生与第一级分中重组蛋白分子数量相同的特征肽分子。
消化可以首先(用例如脲或盐酸胍)将蛋白样品变性，(用例如二硫苏糖醇或巯基乙醇)还原蛋白中的二硫键，(通过加入碘乙酰胺)将半胱氨酸烷基化，并最终(在除去或者稀释变性剂后)加入选定的蛋白水解酶，比如胰蛋白酶，然后温育以便消化进行。在一个优选实施方案中，变性不会造成蛋白被化学修饰。变性可以利用与MS相容的一或多种去污剂进行。在一个实施方案中，RapiGestTM SF Surfactant(Waters)被用于加强蛋白的酶解消化，并代替脲或盐酸胍作为还原和烷基化过程中的变性剂。
温育后，通过加入化学抑制剂(例如DFP或PMSF)或者通过(经加热或加入变性剂，或者两者)变性、或者通过酸化、或者除去(如果诸如胰蛋白酶的蛋白酶位于固相支持物上)蛋白酶(比如胰蛋白酶)来终止蛋白酶(例如胰蛋白酶)的作用。为了避免之后样品中残余的蛋白水解活性对抗体的破坏，破除蛋白酶活性很重要。
消化可以由任何蛋白酶进行，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、Glu-C、Lys-C、lys-N和Arg-C(蛋白酶的特异性参见下文中的表格)。可以使用一种以上的蛋白酶，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10或10种以上的蛋白酶。
在一个实施方案中，消化可以通过化学降解来进行。
  酶   特异性   最佳pH   平均MW
  胰蛋白酶   Arg和Lys的羧基侧   pH 8.0   23.3kDa
  Asp-N   Asp和Cys的氨基侧   pH 6.0-8.5   24.5kDa
  Glu-C   Glu和Asp的羧基侧   pH 4.0-7.8   29.0kDa
  Lys-C   Lys的羧基侧   pH 8.5   28.0kDa
  Arg-C   Arg的羧基侧   pH 7.5-8.5   26.5kDa
  Lys-N   Lys的氨基侧
  胰凝乳蛋白酶   紧接疏水基团切割
步骤iii)关于内部参照肽
合成了选定特征肽的带有稳定同位素标记的形式，其中保留了其化学结构，但有一或多个原子被同位素取代，这样MS分析能够将标记肽与正常肽(含有各个元素同位素的天然丰度)区分开。这些同位素标记的肽被称为内部参照肽。
在还原、烷基化和消化之前和/或之后，向待定量的所述第一和/或第二级分中加入每个特征肽的标记了稳定同位素的内部参照肽，以便进行随后的绝对量化。因为标记肽是以已知浓度加入的，通过最终MS分析检测到的天然特征肽和标记了的内部参照肽的量之间的比率使得能够计算样品混合液中特征肽的浓度。
至少有三种合适的同位素(13C,l5N,18O)可以购买到合适的高度浓缩(>98atom%)的形式。它们可以用于产生13C-标记的、l5N-标记的或者18O-标记的内部参照肽。
稳定的同位素标记可以通过现有技术中描述的任何方法来引入，比如'回收后(post-harvest)'、通过化学手段或者在活细胞中经代谢引入。这种同位素处理协助了由质谱[6]或者通过MRM进行直接定量。优选地，稳定同位素标记是通过化学合成进行的，产生了包含一个重氨基酸的内部参照肽。
在一个优选实施方案中，内部参照肽中的一个氨基酸被标记。优选地，被标记的氨基酸是赖氨酸或者精氨酸，对于MRM定量要标记的氨基酸应当出现在合适的过渡碎片离子中。内部参照肽优选是已有良好表征的肽的同质制品。
在一个实施方案中，然后向一份量好的消化过的样品肽混合液中以固定的量加入一份量好的同位素标记的内部参照肽。这步加样之后，选定肽在样品中将处于两种形式(天然特征肽和同位素标记的内部参照肽)。根据加入的量和液份的已知体积，可以精确地知道同位素标记形式的浓度。替代地，可以在样品消化前加入同位素标记的内部参照肽小份。
在一个实施方案中，挑选同位素标记的内部参照肽浓度，通过分析不同量特征肽制作标准曲线，即标准曲线中所有样品中的同位素标记内部参照肽浓度是一样的，而特征肽浓度是变化的，正如该浓度预期在待分析样品中是变化的。同位素标记的内部参照肽的浓度优选是在预期的测量区域的中部–即同位素标记的内部参照肽的浓度优选大约是不同样品中特征肽的最低和最高测量浓度的平均值。
步骤iv)关于特征肽和内部参照肽的浓缩
特征肽和内部参照肽的集合可以利用树脂进行浓缩，所述树脂偶联了在例如兔中产生的抗特征肽抗体。然后将特征肽集合(这个级分被称为第三级分)释放。替代地，特征肽和参照肽可以利用各种已知分离技术(例如阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、反相、亲水相互作用、大小排阻和其他分离原理)中的任何一种通过分馏得以浓缩。步骤iv)是任选的。
为了应用抗特征肽抗体，用抗特征肽抗体制品(无论是多克隆还是单克隆的，或者任何等同的特异结合剂)进行捕获，从而富集特定特征肽(复杂蛋白样品的蛋白水解消化物中待定量的蛋白中的特定肽片段)和内部参照肽(化学结构相同但包含了稳定的同位素标记)。
步骤iv)中的浓缩步骤可以以96孔格式进行，或者作为多维LC-MS系统的一部分进行。肽的浓缩可以离线进行，将洗脱液浓缩然后上样到C18毛细管柱子上，从这里再洗脱到ESI源中。替代地，可以将由肽浓缩得到的洗脱液直接洗脱到ESI源中。
浓缩可以使用磁珠进行，所述磁珠带有与选定的分离特异性对应的化学物或者偶联了抗特征肽抗体。在另一个实施方案中，可以使用循环免疫亲和—即循环使用抗特征肽抗体树脂。
本发明还涉及使用除抗体以外的肽结合剂，比如RNA适配子(aptamers)、肽适配子、亲和体等来富集特征肽。
利用与特征肽的生物物理特性相匹配的分离技术将肽混合物粗分。分离包括与含有化学性质相同的特征肽和参照肽的级分结合，或者替代地，流过液含有特征肽和参照肽。对于特征肽和参照肽保留在树脂上的情况，可以由适合所选基质和肽的化学性质的洗脱剂将它们洗脱。
替代地，将肽混合液与肽特异性的亲和捕获试剂进行接触。所述亲和捕获试剂优先结合选定的肽，但不能区分标记和未标记的形式(因为预计同位素取代不会影响抗体结合亲和力)。肽特异性亲和捕获可以如下进行。在(用例如磷酸缓冲液进行的)洗涤步骤之后，将结合的肽(用例如10%乙酸，或者水和乙腈的混合液)洗脱以便进行MS分析。如果需要，可以将亲和支持物回收用于另一个样品的制备。对于我们设想的高通量分析应用，将固定化抗体结合循环使用几百，甚至几千次将是有利的。
富集步骤使得来源于例如样品中的低丰度蛋白的例如低丰度肽得以富集和浓缩。在一个实施方案中，该富集过程仅将监测肽(即特征肽和内部参照肽)递送到MS，使得其检测达到绝对MS灵敏度，而不是相对整个样品消化物中存在的可能丰度高得多的许多其他肽的背景下检测监测肽。这种方法在样品及其消化物中存在其他高丰度蛋白和肽的情况下，有效地扩大了检测灵敏度和MS检测器的动态范围。在优选实施方案中，例如当MS方法包括MRM或提取离子色谱图时，富集过程不需要导致只将监测肽递送至MS，而是递送肽混合物(其中监测肽的浓度相比富集过程前的监测肽浓度已有提高)。在一个实施方案中，富集过程导致监测肽浓度提高5到100倍，比如5-10倍，例如10-15倍，比如15-20倍，例如20-25倍，比如25-30倍,例如30-35倍,比如35-40倍，例如40-45倍，比如45-50倍，例如50-55倍，比如55-60倍，例如60-65倍，比如65-70倍，例如70-75倍，比如75-80倍，例如80-85被，比如85-90倍，例如90-95倍，比如95-100倍。
步骤v)关于定量质谱
质谱(MS)分析是蛋白结构研究的重要工具。在气相中对电离的分析物进行质谱测量。根据定义，质谱仪由离子源、测量电离分析物的质量对电荷比率(m/z)的质量分析器以及记录每个m/z值处的离子数量的检测器构成。电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)是最常用的将蛋白或肽挥发和电离用于MS分析的两种技术。ESI将分析物从溶液中电离出来，从而方便与基于液体的(例如色谱和电泳)分离工具偶联。MALDI借助激光脉冲从干燥晶体基质中升华并电离样品。MALDI-MS通常被用于分析较简单的肽混合物，而复杂样品的分析优选集成式液相色谱ESI-MS系统(LC-MS)。质量分析器是该技术的关键，其关键参数是灵敏度、分辨率、质量精确度和由肽片段产生富含信息的离子质谱图谱的能力(MS/MS图谱)。有至少四种基本类型的质量分析器。它们是离子阱、飞行时间(TOF)、四极杆和傅里叶变换离子回旋(Fourier transform ion cyclotron，FT-MS)型分析器。它们的设计和功能迥异，各有优缺点。这些分析器可以单独使用，或者在某些情况中被串联起来以便利用每一种的优点(更多细节参见[8-9])。
在MALDI-和ESI-MS中,分析物的存在量和测量到的信号强度之间的关系很复杂，还没有被完全理解。因此质谱仪本质上是很差的定量设备。蛋白组学领域发展出稳定同位素蛋白标记法来获得定量MS数据。这些方法利用的事实是稳定同位素组成不同的化学属性相同的肽对由于其质量差异可以在质谱仪中被区分，这种肽对的信号强度比率可以准确地表明两种肽的丰度比率。在ESI-MS过程中，肽受到LC-MS操作中共洗脱的其他分析物的离子抑制。因此只有参照肽与特征肽/分析物共洗脱，因此受到的离子抑制程度相同的情况下，定量才是可靠的。利用化学组成相同只是因为引入了同位素而质量不同的参照肽，确保了参照肽和特征肽的共洗脱。这样，利用显示特征肽与参照肽比率和特征肽绝对浓度之间关系的标准曲线可以确定初始样品中相应蛋白的相对丰度。可以通过i)代谢标记,ii)酶法或者iii)化学反应将稳定同位素标签引入蛋白。目前，蛋白或肽以化学方式加同位素标签是最常用的方法(更多细节，参见[8])。在一个实施方案中，可以使用包含一个已有良好定性的纯的重氨基酸(比如例如购自Sigma Aldrich的AQUA肽)的合成肽。
根据本发明公开的方法，所述第二和第三级分中的特征肽通过定量质谱进行量化。一经洗脱到合适的质谱仪中，特征肽(来源于样品的)和参照肽(同位素标记的)被量化，它们的测量丰度比率被用于计算原始样品中特征肽和亲代蛋白的丰度。进行实际定量的一种途径是获得完全谱图，然后提取来自待测量的肽(包括参照肽)的离子流，并通过给峰面积积分将得到的提取离子流作为定量量度。对于该技术，可以使用任何能够对肽进行分析的电喷雾质谱仪。替代并且优选地，可以使用多重反应监测(MRM)。这项技术通常需要三重四极杆()质谱仪或者等同的仪器，虽然其他仪器可以以类似MRM的性能进行试验。
在使用三重四极杆(/线性离子阱)仪器的多重反应监测(MRM)中，四极杆1(Q1)设置给进入碰撞室的不同母离子质量。与所有片段在第三四极杆(Q3)被扫描的产物离子扫描不同，Q3对一或多个不同片段质量设置为常数。这样，得以监测Q1-Q3转换。信号高度特异，因此可以用于检测非常复杂的混合物中的不同蛋白/肽。而且，信号强度通常在5个数量级内都与样品量成比例。因此该项技术保证了在广泛动态范围内的高特异性和灵敏度的多重定量方法。在一个实施方案中，本发明涉及利用三重四极杆仪器等的基于MRM的MS方法的使用。
一般的做法涉及将蛋白(例如用胰蛋白酶)消化成可以在质谱仪中进一步片段化(MS/MS)的肽从而可以基于片段进行识别。所述做法可以与例如电喷雾电离(ESI)一起使用，或者可以在一或多维的色谱分离从而降低了引入质谱仪的肽的复杂性后采用。质谱设置可以是一维LC分离与质谱的组合，比如LC分离组合了极高分辨率的傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)MS。替代的MS设置是在ESI-MS/MS或MALDI-MS/MS之前进行单个LC分离。还可以将两个色谱分离与MS联用，比如ESI-MS/MS或MALDI-MS/MS。第二或第三级分也可以通过基于反相的LC-MS进行分离，利用诸如例如提取离子色谱图或多重反应监测(MRM)的合适MS技术进行定量。其他基于MS的方法，比如基于MALDI-PSD或离子阱的方法也可以用于绝对定量。
在一个实施方案中，经过前述步骤富集的选定肽(包括特征肽和同位素标记的内部参照肽)优选通过电喷雾电离被递送到质谱仪的进样系统。在一个实施方案中，肽在洗脱缓冲液(例如10%乙酸)中被直接引入质谱仪。优选地，将肽上样到反相(例如C-18或等同的)柱子上，利用(例如溶于水的乙腈/三氟乙酸)梯度洗脱到质谱仪的电喷雾源中(即LC/MS)。
质谱仪可以是建立在Orbitrap之上的离子阱、三重四极杆、ESI-TOF、TOF、Q-TOF类型仪器，或者具有合适的质量分辨率和灵敏度的任何其他仪器。优选使用基于三重四极杆的仪器。
计算标记和未标记肽含量之间的比率，即特征肽与内部参照肽进行比较。因为加入的标记肽的量是已知的，由标准曲线即可计算出来自消化样品的特征肽的量。
步骤vi)关于蛋白标准曲线的制作和蛋白的定量
蛋白标准曲线，比如抗体标准曲线(例如，重组多克隆抗体标准曲线)可以由加入到空白样品(比如血清样品)中的浓度已知的相应蛋白(抗体/重组多克隆抗体)来制作。从加样样品中纯化出所述蛋白(抗体/重组多克隆抗体)，用对实际样品一样的程序进行分析，即利用上文中步骤i)到v)，包括向所有样品中加入固定量的参照肽。因此标准曲线显示相对信号(特征肽对参照肽)与特征肽浓度之间的关系。
特征肽的选择
本发明的一个关键特征是它旨在建立针对事先选定的特异重组蛋白，而不是将一或多个样品的所有未知成分互相进行比较的定量方法。
利用重组蛋白的已知序列，选择其内部的一或多个肽片段作为“特征肽”。尽管用希望的酶切割产生的任何肽都是可能的选择，一组设计用于肽的挑选的标准可以限定好的特征肽，所述肽优选可以以高产量化学合成，可以在合适的质谱仪中定量检测，并且在用作抗原时可以激发抗体。在一个实施方案中，以下标准中的一或多个可以用于特征肽的挑选:
a)蛋白含有可以用希望的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)切割得到的序列。应用通用软件可以由蛋白序列容易地计算出所有的候选胰蛋白酶解肽。
b)所述肽优选是中等疏水性的，并且可溶于酶解和亲和层析使用的常规溶剂，但其疏水性应当足够使它维持在脱盐使用的C-18或等同的柱子上。
c)所述肽优选可以通过电喷雾(ESI)或者另一类型的电离而被很好地电离。这个特性可以通过软件估计或者通过试验确定，即对该蛋白的消化物进行MS分析看检测到相对丰度最高的是哪个肽。如果使用的是基于MRM的分析，另一个标准是在MRM中有好的转换。
d)如果使用的是抗特征肽抗体，肽优选在用于培养抗特征肽抗体的物种内是免疫原性的。通常亲水性的、经二级结构预测软件预测包含弯曲、不含有糖基化位点以及10-20个氨基酸(比如10-15个氨基酸)长的肽有更好的免疫原性。
e)如果是为PK建立的检测方法，肽优选与靶生物体(比如人靶生物体)中的任何其他蛋白没有明显的同源性(例如通过BLAST序列对比程序确定的)。这个特点将会减少来自靶蛋白之外的蛋白的肽干扰抗体捕获步骤。还应当试验测试是否存在干扰肽。
f)肽优选不含有化学反应性残基(色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)或者化学不稳定的序列(Asp-Gly、N端Gln、N端Asn)。
g)优选肽是化学稳定的。
h)优选肽不会凝集，和/或优选在试验过程中不粘着到一或多个不希望的表面上。
根据这些标准，可以容易地对来自靶蛋白的所有可能肽进行评价，并挑选最好地平衡方法的要求的一或多个肽。
优选地，基于试验数据，例如肽图谱分析数据来挑选肽。
抗肽抗体的生成
为了将动物免疫以生产抗肽抗体，将肽与载体蛋白(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)，与人蛋白没有同源性)偶联，通过能够有效产生抗肽抗体的已知实验方案之一用于免疫动物。为了方便起见，用于免疫和抗体纯化的肽优选除特征肽(这里缩写为特征)序列还含有其他C端残基,例如:n端-特征(SIGNATURE)-lys-gly-ser-gly-cys-c端。这样得到的延长的特征肽可以与载体KLH方便地偶联，所述KLH已与异型双功能试剂进行了反应，因此载体上附着了多个SH-反应基团。在用肽(现在作为载体蛋白上的半抗原)进行的常规免疫中，将产生多克隆抗血清，含有针对所述肽、载体和其他非特异性表位的抗体。替代地，本领域有许多已知方法用于将含有或不含有延伸或修饰的肽与载体偶联以便生产抗体，可以使用这些方法中的任何一种。
类似地，还有生产抗肽抗体的已知方法是通过用连接载体的肽免疫动物之外的手段进行的。可以使用任何替代方法，只要能够产生对特征肽合适的特异性可逆结合剂。
然后在含有紧密结合的肽的柱子上经过亲和纯化从这个抗血清中制备特异性抗肽抗体。这种柱子可以通过将小份延长的特征肽与巯基反应性固相支持物(比如商业生产的硫丙基Sepharose)进行反应而容易地制备。可以将粗抗血清加样到该柱子上，然后洗涤并最后与10%乙酸(或其他低pH、高pH或高离液剂浓度的洗脱缓冲液)接触来特异洗脱抗肽抗体。将这些抗体从洗脱缓冲液中中和或分离出来(为了防止变性)，柱子被再生到生理条件以便需要时上样更多的抗血清。
肽特异性抗体最后被固定在柱子、珠子或其他表面上作为肽特异性亲和捕获试剂。在优选实施方案中，抗肽抗体按照生产商的使用说明被固定在商业生产的源于蛋白A的POROS层析介质(Applied Biosystems)上，并通过与庚二亚氨酸二甲酯共价交联共价固定在该支持物上。得到的固相介质可以从肽混合物中特异结合特征肽，在洗涤步骤后，在温和的洗脱条件下(例如10%乙酸)释放监测肽。将柱子调回中性pH，然后再生用于另一个样品，这个过程在本领域已知可以重复几百次。
本发明还涉及与一个以上不同抗特征肽抗体，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上不同抗特征肽抗体偶联的树脂或柱子。
待分析的重组蛋白
本发明涉及用于给样品中选定重组蛋白定量的分析方法。在优选实施方案中，本发明涉及用于给样品(即复杂介质中)选定的多个重组蛋白定量的分析方法。选定的多个重组蛋白在一个实施方案中是指2个或以上选定的重组蛋白，比如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或100以上选定的重组蛋白。
选定的多个重组蛋白可以包含多克隆重组抗体，或者由其组成。
本发明的重组多克隆蛋白在一个实施方案中希望涵盖蛋白组合物，所述蛋白组合物包含天然变化的不同的但是同源的蛋白分子，是指在优选实施方案中，变体核酸库包含天然的多样性。因此，每个蛋白分子与组合物中的其他分子是同源的，但也含有一或多段的可变多肽序列，其特征在于多克隆蛋白中各个成员之间氨基酸序列的不同。构成可变多肽序列的氨基酸序列的不同可能只有一个氨基酸那么少。优选地，氨基酸序列的不同包含了一个以上氨基酸。
通常，多克隆抗体或TcR的天然可变性被认为位于多肽链的所谓可变区或V区。本发明的一个方面中，多克隆蛋白的各个成员包含长度约80-120个氨基酸的可变区。可变区可能包含高变结构域，例如互补决定区(CDR)。
在天然TcRs中，每个可变区有4个CDRs。天然抗体中，重链有3个CDRs，轻链有3个CDRs。
在本发明的再一个方面，多克隆蛋白各个成员的可变区包含至少一个高变结构域，长度在1-26个氨基酸，优选长度在4-16个氨基酸。这个高变结构域对应CDR3区。对于抗体，每个可变区优选由三个高变结构域构成。它们可以对应CDRl、CDR2和CDR3。对于TcRs，每个可变区优选由四个高变结构域构成。它们可以对应CDRl、CDR2、CDR3和CDR4。高变结构域可以单独构成本发明的重组多克隆蛋白的可变区内的可变序列。
在本发明的语境中，多肽序列的可变性(多克隆性)还可以理解为用于描述各个抗体分子之间位于抗体多肽链的所谓恒定区或C区的不同，例如象在含有两个或以上不同抗体同种型的抗体混合物的情况中，所述同种型是比如人同种型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM、IgD和IgE；或者小鼠同种型IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA。因此，重组多克隆抗体可能包含这样的抗体分子，所述抗体分子特征在于各个抗体分子之间位于可变区(V区)或恒定区(C区)或者这两者中的序列差异。优选地，抗体是相同的同种型，这样将极大地简化后续的纯化。还可能将例如同种型IgGl、IgG2和IgG4的抗体组合起来，因为它们可以利用蛋白A亲和层析一起纯化。在优选实施方案中，构成多克隆抗体的所有抗体含有相同的恒定区以便进一步促进纯化。更优选地，抗体含有相同的重链恒定区。轻链恒定区在不同抗体之间也可以是相同的。另一个实施方案中，恒定区中可以有可变性。
目标重组多克隆蛋白的组合物包含限定的蛋白子集，所述蛋白子集通过某共有特征限定，比如针对所需靶分子的共同的结合活性，例如在抗所需靶抗原的多克隆抗体的情况中。一般来说，多克隆蛋白组合物含有至少2、3、4、5、10、20、50或100个独特的变体成员，比如2-5，2-8或者2-10个独特成员。重组多克隆蛋白组合物中需要的独特成员的数量可能取决于目标物的复杂性。对于抗体，靶抗原的复杂性将影响到重组多克隆抗体组合物中需要的独特变体成员的数量。对于小的或者不太复杂的目标物，例如小蛋白，包含2或3到100个独特变体成员的多克隆抗体组合物可能是足够的，优选变体数量不超过90、或者甚至80或70。许多情况中，独特变体的数量不超过60或50，优选变体数量在2-40的范围内，比如2-30。
在哺乳动物中，有多种已知的天然多克隆蛋白的例子，或者在血液中自由循环，比如抗体或免疫球蛋白分子；或者存在于细胞表面，比如T细胞受体和B细胞受体。这些天然多克隆蛋白的多样性，在某些哺乳动物中是通过编码这些蛋白的可变区的基因的基因重组而实现的。还知道抗体可以通过体细胞突变来提高多样性。对于由两个独立基因区段编码的蛋白，例如抗体可变重链和可变轻链，TcRa链和β链或者TcRδ链和y链，文库中的每个载体应含有一对这样的可变区编码序列。
蛋白多样性还可以人工产生，例如通过合成或突变形成。所述突变可以是编码单个蛋白的核酸序列中的随机突变或点突变，从而产生该单个蛋白的多克隆群体。在本发明的优选实施方案中，重组多克隆蛋白是重组多克隆抗体或抗体片段。本发明的另一个优选实施方案中，重组多克隆蛋白是重组多克隆TcR或TcR片段。
本发明的重组多克隆蛋白因此还可以由不同同种型或更优选地由不同亚型构成。免疫球蛋白的多克隆性可以发生在免疫球蛋白分子的恒定部分或者可变结构域，或者恒定部分和可变结构域都有。
在所谓的恒定区、特别是抗体重链的恒定区中的多克隆性在抗体的治疗性应用方面有意义。各种免疫球蛋白同种型有不同的生物学功能，当抗体被用于治疗时，可能希望将同种型进行组合，因为免疫球蛋白的不同同种型可以参与天然免疫反应的不同方面。
步骤iii)中使用的一或多种内部参照肽可以是含有与重组蛋白(比如重组多克隆抗体和/或TcR)内的序列相同的序列的任何肽。内部参照肽可以与所述重组多克隆抗体内任何区域的序列具有相同序列，比如恒定区、可变区、轻链、重链、框架、高变结构域、互补决定区(CDR)，比如CDR1、CDR2和CDR3内的序列。内部参照肽可以是来自这些不同区域的内部参照肽的任意组合。
步骤iii)中使用的一或多个内部参照肽可以是具有与重组蛋白中的序列相同的序列的任何肽，所述重组蛋白是比如用于治疗和/或预防人类疾病的重组多克隆抗体。重组多克隆抗体可能有多种治疗应用–即涉及来源于血浆的免疫球蛋白的置换、传染性疾病的预防或治疗，以及癌症的治疗。
在一个实施方案中，待分析的重组蛋白可以是以下的一或多个:
a)用于治疗和/或预防一或多种传染性疾病的重组多克隆抗体
b)用于治疗和/或预防一或多种细菌感染的重组多克隆抗体
c)用于治疗和/或预防一或多种病毒感染的重组多克隆抗体
d)用于治疗和/或预防一或多种形式的癌的重组多克隆抗体
e)用于治疗和/或预防一或多种淀粉样蛋白相关性疾病(例如阿尔茨海默氏病)的重组多克隆抗体
f)Sym001—由25种不同重组多克隆抗食蟹猴D(RhD)抗体组成的重组多克隆抗体(WO 2006/007850)。
g)Sym002—由重组多克隆抗牛痘病毒抗体组成的，用于代替现有的抗牛痘超免疫免疫球蛋白(VIG)(WO 2007/065433)。
h)Sym003–针对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的候选重组多克隆产物(WO2008/106980和WO 2007/101441)。
i)Sym004是针对表皮生长因子受体(一种人类癌抗原)的候选重组多克隆抗体产物(WO 2008/104183)。
j)针对人类癌抗原的候选重组多克隆抗体产物。
j)开发用于抗细菌病原体的重组多克隆抗体。
k)针对传染性疾病靶物质的重组多克隆抗体。
本发明的方法还涉及样品中一或多种重组蛋白的量化，所述样品包含一或多种不同抗体，比如抗蛇毒素的抗体。
待分析的样品
按照本发明的方法进行分析的样品可以是包含一或多种重组蛋白的任何样品。在一个实施方案中，样品是血清或血浆，比如人血清或血浆，其包含一或多种重组蛋白，比如一或多种重组多克隆抗体。发明可用于来自单一来源的样品的分析，或者为了评价群体中特定蛋白的水平，可以用于分析来自目标群体的样品集合。
本发明另一方面是对在细胞培养上清液或生物反应器中表达的一或多种参照重组蛋白的定量分析。在优选实施方案中，发明涉及一或多种重组抗体的定量，比如在细胞培养上清液或细胞培养生物反应器中表达的一或多种重组多克隆抗体。
多克隆蛋白可以来源于从例如多克隆细胞培养上清液获得的细胞培养物上清。通过例如蛋白A亲和纯化、免疫沉淀或凝胶过滤可以从上清液中纯化或富集多克隆蛋白。但是这些纯化前步骤不是重组多克隆蛋白表征的一部分，因为它们不一定能对组合物中的不同同源蛋白进行任何分离。优选地，接受本发明的表征过程的样品经过了至少一个纯化步骤。
组成多克隆蛋白的各种不同的同源蛋白可以用单个多克隆细胞培养物在培养过程中不同时间点获取的样品进行定量，从而监测各个多克隆蛋白成员在整个生产操作中的相对比例来评价它在培养过程中的组成变化。替代地，多克隆蛋白中含有的不同同源蛋白可以用从不同生产操作获得的样品进行定量，从而监测不同批次中的组成变化来评价批次间的一致性。
在一个实施方案中，通过本发明的方法进行表征的样品包含限定的不同同源蛋白子集，含有不同可变区蛋白，特别是不同重组蛋白。一般来说，多克隆蛋白的各个成员已被某共同特点限定，比如在例如抗体的情况中，是对所需目标物的共有的结合活性。通常，通过本发明的表征平台进行分析的多克隆蛋白组合物包含至少2、3、4、5、10或20种不同的变体成员(不同同源蛋白)。因此多克隆蛋白组合物一般包含(至少)2种不同同源蛋白，比如(至少)3、(至少)4、(至少)5、(至少)6、(至少)7、(至少)8、(至少)9、(至少)10、(至少)11、(至少)12、(至少)13、(至少)14、(至少)15、(至少)16、(至少)17、(至少)18、(至少)19、(至少)20、(至少)21、(至少)22、(至少)23、(至少)24或(至少)25种不同同源蛋白，比如2-30种不同同源蛋白，例如2-5、6-10、11-15、16-20、21-25或者26-30种不同同源蛋白。某些情况中，多克隆蛋白组合物可能包含数量更多的不同变体成员，比如至少50或100种不同同源蛋白。在一个实施方案中，单个变体成员不会构成多克隆蛋白组合物中各成员总数量的75%以上，比如不超过最终多克隆组合物中各成员总数的50%，或者例如不超过25%或者比如不超过10%，或者例如不超过1%。
本发明的优选实施方案中，包含具有不同可变区的不同同源蛋白的样品是多克隆抗体。所述多克隆抗体可以由一或多种不同抗体亚型或同种型构成，比如人同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或者小鼠同种型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA。
本发明还涉及对重组多克隆抗体组合物中一群不同抗体种进行表征的方法。所述方法对定量分析有用，可以用于例如分析批次间的一致性以及评估生产操作过程中的组成稳定性和确定某指定批次是否符合预先限定的出厂标准。另一个实施方案中，本发明可用于给多克隆细胞库挑选克隆–即挑选在生产过程中产生所需抗体组合物的克隆。
发明还提供了检测重组多克隆抗体组合物中抗体群之间的差异(variance)的方法。
在一个实施方案中，重组多克隆抗体组合物得自单个多克隆细胞培养物在培养过程中的不同时间点。在第二个实施方案中，重组多克隆抗体组合物得自不同多克隆细胞培养物在特定时间点。在第三个实施方案中，通过比较重组多克隆抗体组合物中存在的至少3种、比如至少5种或至少10种抗体的相对比例来检测差异。
本发明的方法还可以应用于例如药物代谢动力学研究中同时分析血清中构成重组多克隆抗体组合物/产物的各个抗体从个体(比如人)的体内清除。在一个实施方案中，至少两种重组蛋白，比如至少两种重组多克隆抗体被给予了所述个体。
发明还涉及药物/产品中多克隆性的表征。对于工艺过程的开发和药物表征，本发明的方法提供了可以以合理的通量，比如高通量进行的抗体相对浓度和绝对浓度的确定。在另一个实施方案中，发明涉及过程样品中一或多种重组抗体的定量。
为了鉴定和定量重组多克隆组合物/产物中的各个抗体，所有抗体的可变区必须含有独特的特征肽，所述特征肽能够被相同的蛋白酶或蛋白酶组合释放。
在一个实施方案中，待分析的重组蛋白包含一或多种重组B细胞受体。
在另一实施方案中，待分析的重组蛋白包含一或多种重组T细胞受体。
通过本发明公开的方法进行分析的样品可以是来源于个体的样品，比如血清或血浆。所述个体可以是人或动物，包括实验室/测试动物。动物可以是兔、仓鼠、小鼠、啮齿动物、大鼠、猴、奶牛、猪、马、驴、鸡、鱼或任何其他用于试验测试的动物。=.
待分析的样品可以从一或多个个体获得，所述个体选自人、男性、妇女、绝经后的妇女、怀孕妇女、哺乳妇女、婴儿、儿童或成人。所述个体，比如人可以是任何年龄的，比如从新生儿到120岁，例如0-6个月，比如6-12个月，例如1-5岁，比如5-10岁，例如10-15岁，比如15-20岁，例如20-25岁，比如25-30岁，例如30-35岁，比如35-40岁，例如40-45岁，比如45-50岁，例如50-60岁，比如60-70岁，例如70-80岁，比如80-90岁，例如90-100岁，比如100-110岁，例如110-120岁。个体可以是任何种族，比如白种人、黑人、东亚人、蒙古人种的人、衣索比亚人种的人、尼格罗人种的人、美洲印第安人或者马来人种的人。
所述人或动物可以是健康的或者患有一或多种疾病。可以给所述人或动物诊断和/或治疗一或多种疾病。在一个实施方案中，所述个体从遗传学上易患一或多种疾病。
生产重组多克隆抗体的方法
本发明还涉及生产重组多克隆抗体的方法，所述方法包括的一个步骤中使用了本发明用于定量样品中重组蛋白的方法。相应地，可以从多克隆抗体集合中挑选能够通过所述方法进行定量的多克隆抗体。
实施例
实施例1
本实施例描述了重组多克隆抗体组合物的多重定量，所述组合物由两种抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体A992和A1024(WO 2008/104183)的1:1混合物构成。本实施例显示了在食蟹猴中的临床前药代动力学(PK)测量值，此处在给予药物前导物后对血浆中的各个抗体A992和A1024进行了测量。
将一个剂量的药物前导物(18mg)，即9mg A992和9mg A1024给予单只食蟹猴后，对采集的样品测量血浆中的PK特性。这些PK样品与含有空白食蟹猴血浆集合的样品一起分析，所述空白食蟹猴血浆集合来自加标不同浓度药物前导物的三个受试对象。分析由两部分组成:
·通过蛋白A亲和层析将A992和A1024浓缩。
·利用AQUA肽(Sigma)进行液相色谱-质谱(LC-MS)。
通过蛋白A亲和层析进行的浓缩
含有25μl汇合的来自三个受试对象的空白食蟹猴血浆的样品加标了以下浓度的药物前导物:0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml。加入PBS pH 7.2(Gibco)至总体积100μl。向PBS pH 7.2(Gibco)中加入25μl血浆制备到总体积100μl的PK样品。样品加样到96孔蛋白A HP MultiTrap板(GE Healthcare)中。步骤6中用型号5804R的Eppendorf离心除去孔中的液体，除此之外所有步骤中均用Univac manifold(Whatman)通过抽空除去液体。采用以下方案:
制备柠檬酸盐磷酸盐缓冲液:
柠檬酸0.1M:
19.21g柠檬酸(Sigma)溶于水中，加水至1000ml，在1L容量瓶中制备。
Na2HPO4,200mM:
53.61g Na2HPO4·7*H2O(Merck)溶于水，加水至1000ml，在1L容量瓶中制备。
柠檬酸盐磷酸盐pH 6.5(储液A):
136ml 0.1M柠檬酸和364ml 0.2M Na2HPO4,(Merck)加水至900ml。加水至1000ml。
柠檬酸盐磷酸盐pH 3.5(储液B):
359ml 0.1M柠檬酸+141ml 0.2M Na2HPO4加水至900ml。加水至1000ml。
柠檬酸盐磷酸盐pH 5,25:
567ml柠檬酸盐磷酸盐储液A+433ml柠檬酸盐磷酸盐储液B。
蛋白A亲和纯化程序:
步骤1:蛋白A HP MultiTrap板的制备
通过上下摇动培养板使储存液悬浮，移去密封膜，按照说明书抽空储存液。
步骤2:平衡
每孔加入300μl PBS pH 7.2。
步骤3:药物前导物的结合
每孔中加入100μl加标样品或PK样品，将培养板在Eppendorf舒适型恒温混匀器(thermomixer comfort)中于室温下800rpm温育4分钟。
步骤4:洗涤1
a)每孔加入250μl PBS pH 7.2并抽空。
b)每孔加入250μl PBS pH 7.2并抽空。
步骤5:洗涤2
a)每孔加入250μl柠檬酸盐磷酸盐洗涤缓冲液pH 5.25并抽空。
b)每孔加入250μl柠檬酸盐磷酸盐洗涤缓冲液pH 5.25并抽空。
步骤6:药物前导物的洗脱
将蛋白A HP MultiTrap培养板置于96孔收集板(GE Healthcare)上。
a)每孔加入200μl柠檬酸盐磷酸盐洗脱缓冲液pH 3.5，于70xg离心。
b)每孔加入200μl柠檬酸盐磷酸盐洗脱缓冲液pH 3.5，于70xg离心。
用于LC-MS的样品的制备
经蛋白A亲和层析浓缩后，制备含有内源Ig和药物前导物的样品用于LC-MS分析。在该步骤中，向样品加入AQUA肽。AQUA肽是与来自A992和A1024的独特特征肽相同的合成肽，但它们含有一个稳定的同位素标记的氨基酸，从而使得能够利用MS分析将这些肽与特征肽区分开来。带标记氨基酸含有98atom%13C和15N，因此质量与A992和A1024的天然特征肽相比增加了。表1列出了被选中用于绝对定量的AQUA肽。
表1:用于绝对定量的特征肽。显示了肽在电喷雾电离(ESI)过程中被电离时形成的带有一个(MH+)、两个(MH2+)和三个(MH3+)电荷的肽的质量比电荷(m/z)值。
Figure BDA00001750404600241
表2:用于绝对定量的
Figure BDA00001750404600242
肽。显示了肽在ESI过程中被电离时形成的带有一个(MH+)、两个(MH2+)和三个(MH3+)电荷的肽的质量比电荷(m/z)值。粗体并带有下划线的赖氨酸(K)和精氨酸(R)是AQUA肽中的标记氨基酸。
Figure BDA00001750404600243
采用以下程序来制备用于LC-MS的样品:
从蛋白A HP MultiTrap板洗脱下来的免疫球蛋白(Ig)用800μl冰冷丙酮(Merck)沉淀。样品随后溶解于9μl 1% Rapigest SF表面活性剂(Waters)中，并在Eppendorf Thermomixer Comfort中于100°C加热5分钟，800rpm搅拌。给样品加入50mM NH4HCO3、1mM CaCl2至终体积90μl，样品在EppendorfThermomixer Comfort中于100°C加热5分钟，800rpm搅拌。之后，样品用0.1M二硫苏糖醇(DTT)(Sigma)还原，用0.25M碘乙酰胺(Sigma)烷基化，用胰蛋白酶(Worthington)按照1:20(w/w)的酶对Ig比率于37°C消化16小时。加入三氟乙酸(TFA)(Fluka)至终浓度1%(v/v)来终止消化，样品于37°C温育30分钟。加入10μl溶于0.1%(v/v)甲酸(FA)(Fluka)的A992和A1024AQUA(Sigma)肽的1∶1混合液，其浓度为2pmol总AQUA/μl，即样品中每种AQUA肽的总量为10pmol。样品在Eppendorf minispin plus离心机中于14100rcf离心10分钟，转移到HPLC瓶(Dionex)中。
通过LC-MS进行的定量
利用Zorbax 300SB-C18柱子(2.1x150mm;Agilent)和RSLC系统Ultimate 3000(Dionex)通过反相LC来分离肽。溶剂是溶剂A:含有0.1%(v/v)FA(Fluka)的水；溶剂B:含有0.1%(v/v)FA(Fluka)的乙腈，流速为200μl/分钟。样品上样时为5%溶剂B，用15%-40%的溶剂B梯度洗脱30分钟。柱子在80%溶剂B中清洗20分钟，用5%溶剂B重新平衡14.7分钟。
质谱
肽在microQTOF仪器(Bruker)上进行分析。对于样品的分析，以表3中的参数在m/z范围400-3000内进行数据采集。
表3:在microQTOF仪器上进行MS方法的参数
Figure BDA00001750404600251
Figure BDA00001750404600261
在每次操作的开始，包括一个校准时段，其中经转流阀注射20μl ESI调谐标液(Agilent)。生成MH3+和MH2+带电状态的特征肽和AQUA肽的m/z值的提取离子色谱图(EIC)，提取m/z宽度设为0.02。由EICs中检测到的特定特征肽和AQUA肽化合物的面积(表4)确定特征肽和AQUA肽之间的比率。
表4:利用EICs确定特征肽和AQUA肽的峰面积。A992的m/z值是MH3+形式的离子的。对A1024，使用了MH3+和MH2+形式的离子的前两个同位素。
Figure BDA00001750404600262
结果
A992和A1024在EICs中的特征肽相比AQUA肽的峰面积比率可以通过标准曲线建立与药物前导物浓度的相关性。本试验中，由A1024和A992构成的药物前导物以8个浓度(0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml)被加标到来自三只食蟹猴的血浆集合中以便制作标准曲线。对每种抗体，这些浓度对应0、2.5、5、10、25、50、75和100μg/ml(图1和图2)。
标准曲线显示有可能在A992和A1024特征肽对AQUA肽的比率与食蟹猴血浆中加标的药物前导物的浓度之间建立相关性。结果另外显示了在每种抗体10到100μg/ml的范围内，可以确定A992和A1024的特征肽对AQUA肽的比率。加标<10μg/ml A992或A1024的样品中没有检测到A992或A1024的特征肽峰。
图1和图2中的标准曲线被用于确定样品中的A992和A1024的浓度，所述样品来自在食蟹猴中进行的药物前导物的临床前PK研究。给予8mg/g药物前导物后，确定了0、0.5、1、4、8、24、48小时和第9、16、23、30、37和44天这些取样点处，A992和A1024特征肽与AQUA肽的峰面积比率。A992和A1024的药代动力学曲线如图3所示。
给予单剂量8mg/kg药物前导物后，确定样品中从0.5到48小时的时间点的A992和A1024浓度。可以观察到这两种抗体遵循相同的降解模式。
实施例2
本实施例描述了重组抗体组合物的多重定量，所述组合物由两种抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体A992和A1024(WO 2008/104183)的1:1混合物构成。抗体被加标到供体血清集合中，同时测量。共制成两条标准曲线，每种抗体一条。
样品
两种抗体各以100μg/ml加标到血清中。然后样品在血清中稀释以产生用于制作标准曲线的样品。使用的血清是来自10个健康供体的集合。标5显示了制备标准曲线使用的浓度。
表5:制作标准曲线使用的样品。浓度表示在1份样品/每孔中每种抗体的浓度。
Figure BDA00001750404600271
样品制备
如实施例1所述在96孔蛋白A培养板上对总IgG进行纯化，但培养板在200μl 0.5M GndHCl/0.1M甘氨酸pH 3.0中进行洗脱。每个标准曲线点分析了三个33μl液份。对洗脱物进行蒸发，然后每孔加入50μl 50mM碳酸氢铵重新溶解。蛋白经DTT还原(56°C,1h)，并在室温下经IAA烷基化1小时。
将样品转移到深孔培养板，每孔加入15pmol每种AQUA肽，样品用50mM碳酸氢铵稀释。
样品在4%磷酸中1:1稀释，在Waters Oasis MCX离子交换板上纯化。
板用每孔30μl溶于ACN/MeOH的30%NH4OH洗脱。
对板进行蒸发，加入30μl 0.1%甲酸。
LC-MS设置
样品中的抗体浓度利用LC-MS和对来自两个抗体CDR区的选定肽的多重反应监测进行了定量。
样品使用以下进行分析:
质谱仪:Agilent 6400 Triple Quad LC/MS(QQQ)
HPLC:Agilent 1200系列
柱子:Waters Acquity UPLC BEH300 C18 1.7μm,2.1x50mm柱
流速:300μl/分钟
溶剂A:0.1%甲酸
溶剂B:99.9%ACN,0.1%甲酸
注射体积:30μl
MS1:Unit
MS2:Widest
每个样品取30μl注射到LC-MS系统中，使用了表6所示梯度。
表6:将肽洗脱到MS使用的梯度:
为了定量，选择了两个肽并定制为AQUATM肽，即含有重同位素标记的氨基酸。本试验中选择的两个肽是:
  峰   名称   序列   pI   ACN洗脱%
  4   1024HC8   ATLTVDK   6,99   22,5
  5   992HC1   EVQLQQPGSELVRPGASVK   7,03   32
结果
共制成两条标准曲线，每种抗体一条，如图4所示。测量值一式三份，显示出良好的重复性，标准曲线进行了非线性拟合。两个曲线对每种抗体而言的范围都是0.2μg/ml-100μg/ml。两种抗体是同时测量。
缩写
Figure BDA00001750404600291
参考文献
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Claims (137)

1.样品中一或多种重组蛋白的定量方法，所述方法包括以下步骤:
i)通过亲和纯化将所述一或多种重组蛋白浓缩以得到第一级分
ii)消化所述第一级分从而将所述重组蛋白中每一种的一或多个特异性特征肽释放到第二级分中
iii)给所述第一级分和/或所述第二级分加入所述每一特征肽的一或多个内部参照肽
iv)通过质谱分析对所述特征肽进行定量。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤
i)用加标了浓度已知的相应蛋白制品的样品重复权利要求1中的步骤i)-iv)，以得到蛋白标准曲线，和
ii)将权利要求1的步骤iv)中得到的所述特征肽的定量与步骤i)中获得的蛋白标准曲线进行比较，并得到所述样品中所述一或多种重组蛋白的定量。
3.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在权利要求1中步骤ii)的消化之前进行的还原和/或烷基化步骤。
4.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括利用树脂以化学物质将所述特征肽和所述内部参照肽进行浓缩的步骤，所述化学物质能够将样品分级分离从而使目标肽得以浓缩。
5.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括利用偶联了抗特征肽抗体的树脂将所述特征肽和所述内部参照肽浓缩，然后将所述特征肽和所述内部参照肽释放从而得到第三级分的步骤。
6.权利要求1所述的方法，其中权利要求1中步骤i)中的亲和纯化包括与一或多种免疫球蛋白结合蛋白结合。
7.权利要求1所述的方法，其中权利要求1中步骤i)中的亲和纯化包括与一或多种细菌性免疫球蛋白结合蛋白结合。
8.权利要求6所述的方法，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
9.权利要求8所述的方法，其中所述人免疫球蛋白是人IgG1、人IgG2、人IgM、人IgA或人IgE。
10.权利要求6所述的方法，其中所述免疫球蛋白是小鼠、兔、山羊、猪、奶牛、骆驼、犬、猫、鸡、鱼或猴免疫球蛋白。
11.权利要求10所述的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白是小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3或小鼠IgG1。
12.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白A结合。
13.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白G结合。
14.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白A/G结合。
15.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白L结合。
16.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与抗多克隆抗体恒定区的抗体结合。
17.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与Fc受体结合。
18.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与Con A结合。
19.权利要求1所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与抗体的靶结合。
20.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用胰蛋白酶进行的。
21.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用胰凝乳蛋白酶进行的。
22.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Asp-N进行的。
23.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Glu-C进行的。
24.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Lys-C进行的。
25.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用lys-N进行的。
26.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Arg-C进行的。
27.权利要求1所述的方法，其中消化基本上进行完全。
28.权利要求3所述的方法，其中还原是用二硫苏糖醇(DTT)进行的。
29.权利要求3所述的方法，其中还原是用巯基乙醇进行的。
30.权利要求3所述的方法，其中烷基化是用4-乙烯吡啶进行的。
31.权利要求3所述的方法，其中烷基化是用碘乙酰胺进行的。
32.权利要求3所述的方法，其中烷基化是用碘乙酰胺和/或碘乙酸进行的。
33.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽标记了13C。
34.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽标记了15N。
35.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽标记了18O。
36.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是通过合成后标记方法制备的。
37.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是通过化学合成制备的。
38.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是在活细胞内通过代谢引入而制备的。
39.权利要求38所述的方法，其中所述细胞是微生物的组成部分。
40.权利要求38所述的方法，其中所述细胞是培养中的哺乳动物细胞。
41.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是在体外制备的。
42.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括用氘代乙酸根标记伯胺基团。
43.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括n-末端特异试剂。
44.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括肽羧基基团的全甲基酯化。
45.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括在切割过程中给胰蛋白酶解肽C端添加双18O标记。
46.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括N端肽标记法。
47.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括NIT(N-末端同位素编码的标记法)。
48.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括C-末端肽标记法。
49.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括与N末端和C末端肽标记法不同的标记法。
50.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括基于氨基酸的标记法。
51.权利要求1所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括给每个肽中的一个氨基酸进行基于氨基酸的标记。
52.权利要求4所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是来源于多克隆血清的抗体。
53.权利要求4所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是单克隆抗体。
54.权利要求1所述的方法，其中所述内部参照肽具有与重组多克隆抗体和/或TcR内的序列相同的序列。
55.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的恒定区内。
56.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的可变区内。
57.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的轻链内。
58.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的重链内。
59.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的框架区内。
60.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的高变结构域内。
61.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的互补决定区(CDR)内。
62.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的CDR1内。
63.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的CDR2内。
64.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的CDR3内。
65.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于离子交换的分离方法进行浓缩。
66.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于反相的分离方法进行浓缩。
67.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于亲水相互作用的分离方法进行浓缩。
68.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于疏水相互作用的分离方法进行浓缩。
69.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于大小排阻的分离方法进行浓缩。
70.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在兔中产生的。
71.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在鸡中产生的。
72.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在山羊中产生的。
73.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在绵羊中产生的。
74.权利要求5所述的方法，其中所述方法按批次进行。
75.权利要求5所述的方法，其中所述方法是以96孔形式进行。
76.权利要求5所述的方法，其中所述方法是作为多维LC-MS系统的一部分进行的。
77.权利要求5所述的方法，其中所述方法是离线进行的。
78.权利要求5所述的方法，其中所述方法包括，所述特征肽和参照肽被直接洗脱到所述离子源中。
79.权利要求5所述的方法，其中所述方法包括，所述特征肽和参照肽被直接洗脱到ESI源中。
80.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括通过ESI进行电离。
81.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括通过MALDI进行电离。
82.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括二维或多维色谱的分级分离。
83.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括多维色谱。
84.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括一维LC分离。
85.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括二维或多维LC分离。
86.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)、Q-TOF或三重四极杆的方法。
87.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS/MS。
88.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-ESI-MS/MS。
89.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括LC-MALDI-MS/MS。
90.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于多重反应监测(MRM)的方法。
91.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括提取的离子色谱图。
92.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于离子阱的方法。
93.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于ESI-三重四极杆的方法。
94.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于Orbitrap的方法。
95.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于ESI-TOF的方法。
96.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括基于ESI-Q-TOF的方法。
97.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含两种或以上的重组多克隆抗体。
98.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含两种或以上的嵌合多克隆抗体。
99.权利要求98所述的方法，其中所述两种或以上的亲和多克隆抗体包含人部分和小鼠部分。
100.权利要求99所述的方法，其中所述人部分是多克隆抗体的恒定区。
101.权利要求99所述的方法，其中所述人部分是多克隆抗体的可变区。
102.权利要求99所述的方法，其中所述小鼠部分是多克隆抗体的恒定区。
103.权利要求99所述的方法，其中所述小鼠部分是多克隆抗体的可变区。
104.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含一或多种同源物。
105.权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清样品。
106.权利要求1所述的方法，其中所述样品是血浆样品。
107.权利要求1所述的方法，其中所述样品是细胞培养物上清。
108.权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物反应器上清。
109.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上传染性疾病的重组多克隆抗体。
110.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上细菌感染的重组多克隆抗体。
111.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上病毒感染的重组多克隆抗体。
112.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上癌症形式的重组多克隆抗体。
113.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含由不同重组多克隆抗体组成的重组多克隆抗体。
114.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含重组多克隆抗体，所述重组多克隆抗体由不同重组多克隆抗食蟹猴D(RhD)抗体组成，比如Sym001。
115.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含重组多克隆抗牛痘病毒抗体来代替现有的抗牛痘高免疫免疫球蛋白(VIG)，比如Sym002。
116.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对抗呼吸道合胞病毒的重组多克隆抗体，比如Sym003。
117.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对人类癌抗原的重组多克隆抗体。
118.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对人EGFR的重组多克隆抗体。
119.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对细菌性病原体的重组多克隆抗体。
120.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对病毒性病原体的重组多克隆抗体。
121.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对传染性疾病目标的重组多克隆抗体。
122.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含一或多种重组B细胞受体。
123.权利要求1所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含一或多种重组T细胞受体。
124.权利要求1-123中任一项所述方法在给样品中一或多种重组蛋白定量的用途。
125.权利要求124所述的用途，其中所述方法被用于确定血清中构成重组多克隆抗体组合物的各个抗体从个体内的清除。
126.权利要求124所述的方法，其中所述方法被用于个体的药物代谢动力学研究。
127.权利要求125或126所述的用途，其中所述个体是人。
128.权利要求125或126所述的用途，其中所述个体是啮齿动物。
129.权利要求125或126所述的用途，其中所述个体是猴。
130.权利要求124所述的用途，其中所述方法被用于表征原料药(drugsubstance)的多克隆性。
131.权利要求124所述的用途，其中所述方法被用于表征药物制剂(drug product)的多克隆性。
132.权利要求124所述的用途，其中所述方法被用于给过程中样品的一或多种重组抗体定量。
133.权利要求1所述的方法与重组多克隆抗体的制备有关的用途。
134.权利要求1所述的方法与在原料药生产的上游或下游制备重组多克隆抗体有关的用途。
135.权利要求1所述的方法与在药物制剂生产的上游或下游制备重组多克隆抗体有关的用途。
136.权利要求1所述的方法在挑选用于多克隆细胞库的克隆中的用途。
137.权利要求1所述的方法，其中待定量的重组蛋白的数量是两种或以上。
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