CN107525934A - 一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法 - Google Patents

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Abstract

一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其目的是通过生物化学方法直接测定人或动物血液中抗体的氨基酸序列。本方法包括的步骤为：A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；B、将分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段；C、将得到的抗体片段采用SDS‑PAGE电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；D、将分离的抗体片段组分切割成5到60个氨基酸的肽段；E、测定所得到肽段的氨基酸序列；和F、将测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。

Description

一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法。
背景技术
抗体是机体在抗原物质作用下，由B细胞分化所产生的、可与相应抗原特异性结合的一类特殊蛋白质。抗体存在于血液等体液，及B细胞的细胞膜表面，是免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒的武器。
抗体的性质是由抗体的氨基酸序列决定的，因此测定一个抗体的氨基酸序列是研究其化学生物性质的重要内容。
过去的几十年中，为了测定特异性抗体的氨基酸序列，人们把注意力转向产生抗体的B细胞。因为每个特异性的抗体都是由一个特异性的B细胞产生，只要筛选出产生某种特异性抗体的B细胞，便得到一个单一的B细胞培养繁殖的细胞群，就会只产生单一序列的抗体。在克隆化的单一B细胞群中通过分子生物学的手段可以分离产生抗体的mRNA，然后把mRNA反转录成cDNA即可测出抗体的基因编码，由此推断出抗体的氨基酸序列(Chadd HE,Chamow SM(2001).Therapeutic antibody expression technology.Curr.Opin.Biotechnol.12(2):188–94.)。
但是，至今为止无法实现B细胞在体外的培养和繁殖。为了解决这个困难，1975年生物化学家C Kohler和C.Milstein创立了杂交瘤细胞技术，培养出具有无限繁殖能力又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞(hybridoma)(G.&C.Milstein(1975).Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature256(5517):495–7)。采用这种方法能够得到大量的均一的抗体，且抗体的氨基酸序列和特异性一致。目前世界上的单克隆抗体都是由这个方法制备的，抗体序列的测定是基于克隆化的杂交瘤细胞中产生抗体的mRNA 序列推断，或利用杂交瘤细胞产生的单克隆抗体通过蛋白质测序而得到。
然而，杂交瘤技术具有较大的局限性：第一，杂交瘤细胞产生抗体的技术只能应用于少数几种动物，主要为小鼠和大鼠，本领域的技术人员认为杂交瘤技术不能制备人源的抗体，而人源抗体在疾病的诊断和医疗上有极其广泛的应用。第二，杂交瘤技术得到的单克隆抗体往往亲合力较低，能产生高亲合力抗体的细胞可能会在杂交瘤细胞的筛选过程中被淘汏掉。
如果有一种方法能够直接测定血液中与某种抗原结合的特异性抗体的氨基酸序列，人们就能够应用分子生物学技术在体外培养的细胞中(如CHO,HEK293细胞)直接生产出单一序列的抗体。这将会补充目前应用的杂交瘤细胞技术的不足，得到性能更好的或者有新的应用的抗体。
然而，动物和人血液中存在1012～1015不同序列的抗体，这些抗体有着极其相似的三维结构。抗体作为糖蛋白具有复杂的结构，且抗体分子是由四条链组成分子量大于150KD大分子。从血液中分离出针对某个抗原的特异性抗体并测定出这些特异性抗体的氨基酸序列有很大的困难，本领域技术人员公认为不可能实现。
基于上述状况，本发明提供了一种直接测定血液中抗体氨基酸序列的方法。
发明内容
本发明提供了一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法。
在一个实施方案中，公开了一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其包括的步骤为：
A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；
B、将步骤A中分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段，所述抗体片段包括F(ab’)2、Fab或Fc；
C、将步骤B中得到的抗体片段采用一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；
D、将步骤C中分离的每个抗体片段进一步切割成5-60的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，其中所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶切割；
E、测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；
F、将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。
进一步的，所述步骤A中，利用抗原和抗体特异性结合的原理将与特定抗原结合的特异性抗体从血液中分离采用亲和层析法。所述亲和层析法可以是抗原亲和层析，也可以是抗原结构类似物亲和层析。
所述步骤B中采用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或者IDES(SEQIDNO:7)，所述酶切产生的抗体片段，包括F(ab’)2、Fab或Fc，便于将抗体分子分离成更简单的组分。优选的蛋白酶为IDES(SEQ ID NO:7)。
所述步骤C中采用离子交换色谱、反相色谱、一维聚丙烯酰胺电泳和二维聚丙烯酰胺电泳逐步将步骤B中的抗体片段分离成含有至多两个氨基酸序列的抗体片段组分。
所述步骤D中的蛋白酶选自：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、精氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、链霉素蛋白酶E、弹性蛋白酶。选择四到六种不同的蛋白酶酶切步骤C中分离的抗体组分。进一步的所述步骤D中蛋白酶包括胰蛋白酶(trypsin)。
所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成5到40个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用质谱分析方法测定抗体肽段的氨基酸序列。
所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成20到60个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用Edman降解法测定抗体肽段的氨基酸序列。
进一步的，所述测定血液中抗体氨基酸序列的方法还包括在步骤A前采用A蛋白亲和层析柱分离血液或血液组分中IgG抗体。
所述步骤B前还可以包括，去除抗体分子上的化学修饰，如糖基化，例如采用肽N-糖苷酶F酶去除抗体分子上的N-糖基。
所述步骤A中，所述血液可以是进行一些前期处理得到包含抗体的血液制品，所述前期处理方法可以是物理化学手段，如去掉血液中与抗体无关的成分，或富集含抗体的成分。所述血液可以取自经历天然的或人为的免疫过程的动物或人身体。本发明适用于测定脊椎动物血液中抗体的氨基酸序列，所述脊椎动物选自人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、骆驼、猴子或猩猩。
测定的抗体氨基酸序列可以是抗体的全部序列，可以只包括抗体可变 区的序列大约包括220氨基酸，测定的结果可以是一种抗体的序列，也可以是多种抗体的序列。
附图说明和序列表：
根据以下的发明详细描述和附图及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的发明详细描述和附图及序列表构成本申请的一部分。
图1为抗体和抗体片段结构示意图。血液中大多数抗体是由两条重链和两条轻链组成对称结构，可包含由二硫键互连的至少两条重链和两条轻链；Fab指抗体在铰链区重链间二硫键近N端处切断，形成两个相同的单价抗原结合片段，Fc指形成的可结晶片段。
图2抗体片段示意图。
图3为实施例1和实施例2实验所用抗原的SDS-PAGE图。A是非还原的PD-L1，B是还原的PD-L1。
图4为实施例1中凝胶电泳分离的洗脱的PD-L1特异抗体。第一条带是标准蛋白标志物，第二和第三条带是不与PD-L1亲和柱结合的非特异抗体，第四条带是pH8缓冲液清洗的流出物，第五到第九条带是pH3甘氨酸洗脱组分，每个组分收集1毫升，大部分的抗体在第二和第三组分流出。
序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的规则。
SEQ ID NO：1是抗体氨基酸序列拼接方法中举例肽段1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是抗体氨基酸序列拼接方法中举例测定的抗体肽段2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是抗体氨基酸序列拼接方法中举例测定的抗体肽段3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是抗体氨基酸序列拼接方法中举例肽段1、2、3的氨基酸序列拼接的肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是实施例1和实施例2试验所用抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是实施例1中的部分轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是IDES蛋白酶的氨基酸序列。
发明的详细描述：
本发眀中，为了测定血液中抗体的氨基酸序列，我们采取了一种全新的方案。由于问题本身的复杂性，我们的解决方案从多个方面入手，总体思路为：第一，将少量的特异性抗体与其它大量的血液中的抗体分开；第二，釆用产生抗体片段的方法使150KD的结构复杂抗体变成一个小到25KD的抗体片段，大大降低了分离和检测抗体的困难程度；第三，采用PNGase F去除抗体分子的化学修饰；第四，采用多步的生物化学分离手段得到单一或简单抗体组分；第五，采用灵敏的蛋白测序技术可以从微克级的样品中得到完整的抗体序列。
本发明公开了一种直接测定血液中抗体氨基酸序列的方法。本发明根据抗原抗体特异性结合的原理，将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；然后将分离的特异性抗体采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或IDES(SEQIDNO:7)酶切产生抗体片段；随后采用生物化学方法包括一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳将抗体片段分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；分离的每一抗体片段组分进一步切割成5-60个氨基酸的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶；测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；和将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。
本发明的优点包括但不限于：(1)可以直接测定血液样品中抗体的氨基酸序列；(2)只需要血液而不需要人和动物的细胞，样品来源更为广泛。
应该理解，本发明中的描述是可变的，并不局限于特定的实施方式。同时也应该理解，本文中的术语仅是为了描述特定实施方式，而不是用于限制。除另有说明外，本文中所使用的所有的技术和科学术语，与本领域中普通的技术人员目前的理解具有相同的含义。
本发明中，下列术语将按照下列定义使用。下面的定义将有助于理解本发明。
本文中“血液”指由血细胞和血浆组成全血，可以简称“血”。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板三类细胞。血浆(Plasma)是指离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含血细胞的液体成分。血清是指离开血管的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体。血浆与血清的主要区别是血清中少了很多的凝血因子。
血浆中含有90％～91％水、6.5％～8.5％蛋白质和2％左右低分子物质。血浆中的蛋白质分为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原三部分(威廉姆斯血液学(翻译版)(第8版),人民卫生出版社2011年11月出版,考杉斯基(作者),陈竺(译者),陈赛娟(译者),书籍ISBN：9787117148245)，低分子物质中有无机盐等电解质，激素、营养物质、代谢产物等小分子化合物。血浆中白蛋白含量最多，其次是球蛋白和纤维蛋白原，球蛋白中主要为免疫球蛋白。
本文中所使用的术语“免疫球蛋白”指由一个或多个多肽(基本由免疫球蛋白基因编码)组成的蛋白。
本文所称的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。完整“抗体”是至少具有4条多肽链的对称结构，包含由二硫键互连的至少2条重链(H)和2条轻链(L)的糖蛋白。每个重链包含重链可变区和重链恒定区。每个轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区一般可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。在给定的物种中，相同类型(如IgG)不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的序列。可变区位于"Y"的两臂末端(图1所示)。在可变区内有一小部分变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2～3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。
抗体包括完整的免疫球蛋白IgA、IgG、IgE、IgD、IgM及其亚型(医学免疫学,清华大学出版社2013年7月出版，作者马兴铭、丁剑冰)。IgG 抗体能够激活补体，中和多种毒素。IgG持续的时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体，是免疫应答中首先分泌的抗体，它们在与抗原结合后启动补体的级联反应，还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于的吞噬。
本文中“Fab”或“F(ab’)2”为抗体结合片段(fragment of antigen binding)(图2所示)，是指使抗体在铰链区重链间二硫键近N端处切断，形成两个相同的单价抗原结合片段，或者从铰链区酶解，形成的一个可以结合抗原片段。
本文中“Fc”或“Fc区域”为结晶片段(fragment crystallizable)(图2所示)，是指抗体在铰链区重链间二硫键近N端处切断，形成一个可结晶的片段。Fc片段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。
术语“特异性结合”(或“免疫特异性结合”)不是意欲指抗体唯一地结合的其目的靶标。而是，如果抗体对与其目的靶标的亲和力是其对于非靶分子的亲和力的约5倍大的话，那么抗体“特异性结合”。
术语“抗原”(antigen，缩写Ag)为任何可诱发免疫反应的物质。外来分子可经过B细胞上的辨识或经抗原呈现细胞的处理并与结合成复合物再活化，引发连续的免疫反应。
本发明用到的化学物质和蛋白酶
“A蛋白”又称为“金黄色葡萄球菌A蛋白”(Staphylococcal Protein A，简称SPA)是从A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离而得的一种细胞壁蛋白。具有不在抗原结合点与免疫球蛋白结合的性质，能形成蛋白A和抗体复合物，可与大多数类型IgG(IgG3除外)的Fc段结合，可用于免疫分析和IgG的提纯。
“肽N-糖苷酶F”，即PNGase F，是一种酰氨酶，可以在N-连糖蛋白的高甘露糖、杂合和复合寡糖部分最内侧的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和天冬酰氨残基之间进行切割。
蛋白酶：
“胃蛋白酶”(Pepsin)是一种消化性蛋白酶，在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性。例如，胃蛋白酶倾向于剪切氨基 端或羧基端为芳香族氨基酸(诸如苯丙氨酸)和/或亮氨酸的肽键。在免疫学中，胃蛋白酶可用于将抗体的Fc片段(可结晶)和Fab片段(抗原结合)切割开。
“木瓜蛋白酶”(Papain)，又称木瓜酶，是一种低特异性蛋白水解酶，属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。在免疫学中，木瓜蛋白酶可用于将抗体的Fc片段(可结晶)和Fab片段(抗原结合)切割开。
“IDES”为源于S.pyrogenes的IgG降解酶(Immunoglobulin G-degrading enzymeof S.pyrogenes，IDES)，氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，可以将IgG抗体切割成Fc和F(ab)2片段，参见美国专利号US7,666,582B2.
“胰蛋白酶”(Trypsin)是肽链内切酶，是一种丝氨酸蛋白水解酶。它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。
“赖氨酸蛋白酶”又称为胞内蛋白酶Lys-C，能特异水解精氨酸的羧基端，可以产生比胰蛋白酶少的酶解肽段。
“天冬氨酸蛋白酶”(Asp-N,aspartic proteinase)是一类重要的蛋白水解酶，活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。
“葡萄球菌蛋白酶”又称为Glu-C蛋白酶，当在磷酸缓冲液中时，它能在谷氨酸残基和天冬氨酸残基的羧基端断裂肽键；当在碳酸氢铵缓冲液或醋酸缓冲液时，只能断裂谷氨酸残基羧基端的肽键。
“胰凝乳蛋白酶“(chymotrypsin)又称为糜蛋白酶、甲-糜蛋白酶，是一种典型的丝氨酸蛋白酶，属于肽链内切酶，主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。
生物化学方法：
亲和层析是利用共价连接配体的特异的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质。在层析柱中，具有特殊结构的亲和分子配体固定在固相载体的表面，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与目的蛋白质分开。然后选 用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离蛋白质的方法称为亲和层析。
抗原亲和层析又称为免疫亲和层析(Immunoaffinity Chromatography，IAC)是利用抗原与抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。
离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)是利用离子交换原理将带电荷的分子或极性分子进行分离和分析的一项技术，广泛可用于核酸、蛋白质等生物大分子的分离。IEC以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当带电组分生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。
液相色谱有正相和反相之分。如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。
毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(highperformance capillary electrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流为驱动力的新型液相分离技术。
等电聚焦电泳(Isoelectric focusing，IEF)利用特殊的一种缓冲液制造一个pH梯度(常用聚丙烯酰胺凝胶)，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其(pI)的pH处停止，形成一个很窄的区带。在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是随pH值逐渐增大。蛋白质分子具有带电荷的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pI)。位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
一维电泳指普通的琼脂糖或聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳。
二维电泳指二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，该技术结合了等电聚焦技术(IEF)以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据蛋白质的大小进行分 离)。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
血液或血液制品中抗体的分离：
人或其它脊椎动物的血液含有高浓度的免疫球蛋白质。在人和动物的血液中，免疫球蛋白是含量第二高的蛋白质，仅次于白蛋白，在全血中免疫球蛋白的浓度正常情况下每1毫升十至三十毫克。例如人的血液中抗体含量每毫升7～22毫克，兔12～14亳克，羊18～24亳克，牛9～24毫克。一般情况下100毫升血液中含有500～3000毫克的抗体，其中大约百分之七十五为IgG。
未进行自然或人工免疫的血液样品中往往也会存在天然的特异性抗体，但其浓度在血液中可能极低，需要较大量的未进行自然或人工免疫的血液才能采用本发明提供的方法测定特异性抗体的氨基酸序列。
动物或者人可以进行免疫接种，即使动物或者人接触到特定的抗原，在动物和人接触到特定抗原后体内往往会产生浓度较大的针对这种抗原的特异性抗体。动物如果用同样的抗原进行过免疫接种，其特异性抗体的含量会大大提高，尤其是进行反复免疫接种的动物其特异性抗体可能高达免疫球蛋白总量的百分之十。
人与动物有相似的免疫反应。如果一个人与某种抗原反复接触，比如病毒或细菌感染后或者接种疫苗后，血液中特异性抗体浓度会大大提高。使用经历过天然或人工免疫的人或动物的血液作为实验材料可能会降低实验的难度。
分离提纯的血液制品，如血浆、血清或血液中免疫球蛋白组分中抗体浓度更高，可以减少其它组分的干扰，更易于直接测定抗体的氨基酸序列。本发明中，如果用全血作为实验材料，首先添加抗凝剂并去除占血液百分之四十左右的血细胞组分。
通常采用4度低速离心的方式去除血液中的血细胞，得到含有抗体的血液或血液制品。
特异性抗体的分离：
通常人或者动物的血液中存在多种多样的抗体，为了获得特异性抗体，本发明采用生物化学方法从血液中分离抗体，采用的方法包括但不限于抗 原特异性亲和层析试验和结构类似物作为配体的亲和色谱。
为了减少抗体分离步骤的困难，可以利用现代生物化学技术将某一类抗体先分离出来。例如，在一个实施方案中，可以使用A蛋白亲和层析柱将血液或血液组分中IgG抗体提纯出来。IgG抗体占血液中抗体总量的百分之七十五左右，该步骤虽然丢失百分之二十五左右的血液抗体，但得到的抗体具有相似的Fc不变区结构，会降低后面抗体分离步骤的困难。
进一步的，由于抗体分子一般含有糖基，用酶或者化学反应去除抗体肽链上的糖基将有助于将复杂抗体混合物分离成简单组分。例如，用PNGase F可以去除抗体上的N-糖基。因为抗体上的N-糖基修饰往往包含多种不同的化学结构，这将增加本步骤中将复杂抗体混合物分离成多个简单组分的困难，而去除抗体的糖基化修饰将降低抗体通过生物化学技术进行分离的困难。
进一步的，根据抗原抗体特异性结合的原理，采用抗原亲和层析将特异性抗体从血液抗体中分离出来。抗原或抗原结构相似物通过共价键或者非共键价结合力连到固体或者胶状体的表面。当溶液态中的抗体与固定在载体表面上的抗原接触时，特异性抗体由于抗原抗体之间的亲合作用从溶液中分离出来。
吸附在介质表面而分离出来的特异性抗体一般需要洗脱回到溶液状态，可以通过pH或蛋白变性剂改变抗体和抗原相互作用，或改变抗原与介质表面的联接，从而将吸附在介质表面的抗体洗脱到溶液中。采用蛋白质酶或者化学反应断开抗体的肽键也可以将抗体的部分或全部从固体或者胶体介质表面洗脫下来。
一般情况下，通过与抗原亲合结合而分离出来的特异性抗体仍然包括很多种不同的氨基酸序列，这种复杂抗体混合物很难直接进行抗体氨基酸序列测定。为了测定出单一抗体的氨基酸序列，通过抗原亲和层析得到的特异性抗体混合物需要用一种或多种生物化学方法进一步分离成不同的包含不超过5个不同序列抗体的简单组分。
IgG抗体的分子量在150KD左右，生物化学方法分离比较困难，抗体的特异性是由抗体的可变区氨基酸序列决定的，测定出抗体Fab、F(ab’)2片段的氨基酸序列就可以达到本发明的目的。且Fab抗体片段 的分子量在50kD左右，分子量从150kD降低到50kD会显著减少分离的困难。将复杂抗体混合物用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、IDES等蛋白酶酶切可以得到抗体Fab、F(ab’)2片段，再将抗体片段分离成抗体简单组分。
如果一个特异性抗体组分包括几种不同的抗体，用本发明方法仍然有可能测定其中一种或多种抗体的序列。但随着每个组分中抗体数目的增加，其拼接的难度迅速增加，而且可能的拼接错误也可能增加。
将特异性抗体片段的混合物进一步分离的方法，包括但不限于离子交换色谱、正向液相色谱、反向液相色谱、亲和色谱、等电聚焦电泳、一维聚丙烯酰胺电泳、二维聚丙烯酰胺电泳。具体分离程序应该根据抗体混合物的复杂程度和抗体的物理化学性质决定。
SDS－PAGE是本发明中将抗体片段分离的主要方法之一，在大多数情况下，经过离子交换色谱和反向色谱连续分离后，得到的抗体片段组分中仍有一些组分含有多个抗体片段，但经过SDS-PAGE一般可以完全分离。
在某些情况下，由于抗体片段的分子量相差太小，一维的SDS－PAGE不能将不同的抗体片段分开，这时就需要用二维电泳根据其等电点和分子量的差异进行分离。
本发明中采用离子交换色谱、反向液相色谱、一维聚丙烯酰胺电泳、二维聚丙烯酰胺电泳逐步分离IDES酶切后的抗体片段。
在理想情况下，分离后的每个组分只包括一种抗体序列。但由于技术的限制，某些组分会仍然包括几种抗体。这种包括几种抗体的简单组分仍然可以用于抗体序列测定。
将特异性抗体片段裂解为更小的肽段：
由于抗体的分子很大，一般不能直接测定出其全部氨基酸序列。在本发明中，抗体或抗体片段通过生物，化学或物理方法裂解成分子量较小的多肽。
用生物方法将抗体或抗体片段裂解是通过多种蛋白酶进行酶切反应。胰蛋白酶是最常用的蛋白酶。除胰蛋白酶外，胃蛋白酶(Pepsin)、木瓜蛋白酶(papain)、赖氨酸蛋白酶(Lys-C)、天冬氨酸蛋白酶(ANP-N)、谷氨酸蛋白酶(Glu-C)、胰凝乳蛋白酶，都能用于本发明的步骤D。一般 来说，至少需要三种或以上的酶切才能提供足够的肽段覆盖全部抗体序列。在实际应用中，为了保证所测出的抗体序列的准确性，进行四至六种不同的酶切反应才能够将抗体的序列覆盖3至4倍，以达到超过百分之九十九以上的准确度。虽然使用更多种不同的酶切反应可能进一步提高序列覆盖率和准确性，但需要的抗体样品量也会大大增加。
用生物的酶切反应把抗体裂解有很多优点，如反应条件温和，需要的样品少，副反应小，产率高。因此，生物方法是把抗体裂解成肽段的首选方法。但是，化学裂解和物理裂解也可以用于本发明。化学裂解用强酸如盐酸，强碱如氢氧化钠进行水解，或利用特殊化学试剂切断肽键，比如溴化氰(CNBr)可以与抗体分子中的甲硫氨酸反应使肽链断裂。物理方法，比如激光和微波，也可以使抗体分子的肽链断裂。
由于液质联用(LC-MS)和Edman降解是测定肽段氨基酸序列的两种主要方法，因此本裂解步骤所产生的肽段长度应当适合目前的测序技术。在目前的LC-MS技术条件上，肽段长度在5至40氨基酸之间最容易测定出完整的氨基酸序列，EDMAN降解肽段长度在20至60氨基酸之间，太长或太短往往会增加肽段测序的困难。在实验中，无论是生物，化学或物理裂解方法都需要控制好实验条件使反应产生的大部分抗体肽段的长度在合适的范围内。
从这里可以清楚地看到将抗体用不同方法裂解产生高度重叠的抗体片段序列的重要性。产生高度重叠的抗体片段序列能大大减轻抗体完整序列拼接的困难，提高结果的准确率。一般情况下，用四至六种不用的抗体裂解方法才能保证三倍的序列覆盖率。而三倍以上的序列覆盖率是准确测定出一个抗体完整序列的最低要求。
除了必须用不同的方法将抗体裂解为大量的高度重叠的肽段以外，控制实验条件得到长度合适的肽段也非常重要。在理想的情况下，大约百分之七十左右的肽段长度应该在5-60氨基酸之间有助于减少肽段测序和完整序列拼接的困难。
选择的蛋白酶包括胰蛋白酶(trypsin)等。
抗体裂解肽段的氨基酸序列的测定：
分解后的肽段可采用色谱质谱联用法测定肽段氨基酸序列。色谱质谱 联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，本发明中使用液质联用(LC-MS)，液质联用色谱可以分析测定大分子的质量，也可以测定多肽序列。目前的多种质谱仪器都有二级质谱(MS/MS)的功能，能给出多肽的部分序列信息。通过把很多相互重叠部分多肽序列信息拼在一起，可以得到整个抗体的序列信息。
色质联用质谱(LC-MS)适用本发明的抗体序列测定。在色质联用质谱分析中，酶切形成的多肽通过液压色谱分开后直接进入质谱进行测序。这样即使一个样品中含有上万个不同的多肽也可以测定出多肽的序列。这比把一个个多肽用液相色谱分开再分别测出每个肽段序列会节省很多时间。
也可以采用化学测序方法如Edman降解法测定本抗体的氨基酸序列。在化学测序法中，抗体裂解后先用液相色谱分离各个不同的多肽。每个多肽分别用Edman测序仪器进行测序。与LC-MS方法相比，化学方法可以直接区别抗体中的Leu和Ile这两个氨基酸。因此，两种方法可能同时需要。
测定的抗体氨基酸序列的拼接：
无论是液质联用方法还是Edman降解法，所测得的只是大量的肽段的氨基酸序列。这些抗体随机裂解所形成的肽段序列需要拼接成完整的抗体序列。这种拼接往往依赖于测定出肽段序列的重叠。例如，一个抗体中由两个胰蛋白酶酶切产生的肽段，其氨基酸序列巳经测出，分別为:
肽段1：YFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSK(SEQ ID NO:1)和
肽段2：TPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHK(SEQ ID NO:2)。
这此信息不能告诉我们这两个肽段在抗体中是否连在一起。而从胰乳蛋白酶的酶切产物中得到了与肽段1和肽段2都有部分重叠的肽段3：ENSKTPQNSADCTY(SEQ ID NO:3)，这就证明了肽段1和2是两个相连结的肽段。这样整个区域51个氨基酸序列(SEQ ID NO:4)就可以确定。由此类推，整个抗体的序列就可以从大量抗体片段的序列中拼接出来。
在本步骤中，使用生物信息学的方法和技术可以提高抗体序列拼接的速度和质量。
由于抗体的特异性是由抗体可变区序列决定的，在很多情况下，只需要测定抗体可变的序列即可完全达到应用的目的。在这类情况下，抗体的 完整序列是指抗体可变区的完整序列。对于IgG抗体来说，可变区序列只有约220个氨基酸。而IgG抗体总长度在660个氨基酸左右。因此，如果一项应用仅仅需要测定抗体可变区的完整序列，其实施本发明的难度也可能会降低很多。
具体实施方式：
本发明的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本发明表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本发明的权利要求范围内。
实施例1
制备人源蛋白质PD-L1蛋白
程序死亡蛋白1(PD1，Programmed death1)为一种调控机体免疫反应的Ⅰ型跨膜糖蛋白，程序死亡蛋白配体1(PD-L1，Programmed death 1ligand)为PD1蛋白的配体。我们克隆了人源PD-L1细胞外部分基因，构建表达载体，并使人源PD-L1细胞外部分在大肠杆菌中表达。表达的人源PD－L1蛋白质(人源的PD－L1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)主要在大肠杆菌的包涵体中。4℃，5000rmp离心收集表达后的大肠杆菌，将大肠杆菌用超声仪裂解并高速离心，获得包涵体，将收集的包涵体用8M的尿素溶解，用逐步透析法将蛋白复性。将复性后的蛋白用离子交换树脂进行纯化，得到有活性且纯度大于95％的PD－L1蛋白质。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳结果如图3所示，PD-L1的分子量大于27Kda。
本实施例纯化的高活性的PD-L1蛋白可进一步用作抗原免疫接种动物以产生特异的抗PD-L1抗体。除此以外，表达的高纯度的PD-L1蛋白也可进一步用作亲合层析柱的活性基团。
实施例2
制备人源蛋白PD-L1抗原亲和层析柱
我们通过化学反应将实施例1中表达纯化的PD－L1蛋白连在活化的琼脂糖胶体表面，由此得到PD－L1抗原亲合层析柱。制备过程如下：第一步， 将表达纯化的PD-L1蛋白用赛默飞世尔(THERMO)公司的SULFO-NHS-BIOTIN试剂盒联接上生物素基团；第二步，把联接生物素基团的PD-L1蛋白联上STREPTAVIDIN柱子(通用电气公司生产的HITRAPSTREPTAVIDIN HP柱子)。
实施例3
免疫兔子获得抗人源蛋白PD-L1抗体
采用实施例1纯化的高活性和高纯度PD－L1蛋白质免疫接种大白兔。经过约三个月的多次免疫后，酶联免疫吸附测定(Elisa)实验证实兔血液中已含有高量的抗PD－L1抗体。收集兔血液，低温离心去除血细胞得到含PD－L1抗体的血浆。收集血液的量大约每只动物40mL，冷冻干燥后用于下一步实验。
实施例4
从兔血液制品中分离IgG抗体
蛋白A凝胶从美国吉诺泰(REPLIGEN)公司购买CaptivA(CA-PRI-0100)，填入通用公司XK16空色谱柱。色谱柱直径16mm，填充高度为20cm。每毫升蛋白A凝胶可吸附20至40mg的IgG抗体，该蛋白A亲合层析柱可吸附400至800mg IgG，兔血液中IgG含量一般在10mg/mL。每只免疫兔的40mL血液中共含IgG约400毫克,因此该蛋白A亲合柱可以将样品中的绝大多数IgG抗体分离出来。
具体操作流程如下：首先将冷冻干燥的PD－L1免疫的兔血液样品溶于200毫升25mM的TRIS缓冲液，pH8；将溶液在4℃以5000g离心20min，将上清转至另一干净试管中，然后将溶液以1mL/min流速上样；上样完成后用pH8TRIS缓冲液以1mL/min流速洗色谱柱；然后用100mM pH2.5的甘氨基酸溶液洗脱IgG抗体并收集10个洗脱组分，每个洗脱组分20mL。经SDS－PAGE证实，90％以上的抗体在第二和第三洗脱组分流出(图4)。将这两个组分共40mL含IgG抗体溶液合并在一起进行透析，透析用25mM TRIS pH8缓冲液，在4℃透析12小时。透析后的IgG抗体溶液置于4℃冰箱中。
实施例5
抗原亲和层析分离与PD-L1抗原特异性结合的抗体
将实施例4中得到的40mL浓度约10mg/mL的IgG抗体溶液通过实施例2中制备得到的PD－L1亲合层析柱；上柱速度为1mL/min；上柱结束 后，用40mL 25mM pH8TRIS缓冲液以同样速度洗色谱柱；然后用100mM的甘氨基酸溶液(pH2.5)进行洗脱，并收集洗脱组分。每个洗脱组分3mL，共收集10个洗脱组分。经SDS－PAGE跑胶证实90％以上抗体在洗脱组分2和3流出，合并这两个组分并使用1M pH8TRIS缓冲液调节pH至8。由此得到约12mL抗体溶液，其抗体浓度约0.5mg/mL。
实施例6
去糖基化处理
将实施例5中得到的12mL浓度约0.5mg/mL的IgG抗体溶液加入6000U PNGase F酶(New England Biolabs)，反应在37℃恒温箱中进行12小时，pH8，由此得到的样品为去糖基化的抗体或抗体片段。
实施例7
产生抗体片段
将实施例6中去糖基化处理后的PD－L1抗体混合物用蛋白酶切成抗体片段。三种不同的酶广泛用于产生Fab、或F(ab’)2抗体片段：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、和IDES(SEQ IDNO:7)。
胃蛋白酶：
胃蛋白酶由SIGMA生产并销售。根据SDS－PAGE的结果，从PD－L1亲合层析柱上洗脱的蛋白约6mg，加入6ug的胃蛋白酶，0.1％甲酸1mL，反应在37℃恒温箱中进行一小时，然后加入2mL，pH8.0的1M碳酸氢氨(NH4HCO3)，通过25KD超滤膜(美国Spectra Lab公司生产)去除小于25KD肽段。经跑胶检测，胃蛋白酶反应完全，抗体全部切成F(ab’)2，胶上已看不见全长的抗体。经过凝胶过滤层析步骤，溶液中的样品为纯度大于90％的F(ab’)2抗体片段。
木瓜蛋白酶：
木瓜蛋白酶由SIGMA公司生产并销售。根据SDS－PAGE的结果，从PD－L1亲合层析柱上洗脱的蛋白约6mg，加入木瓜蛋白酶10-100ug，Tris 100mM pH7，反应在37℃恒温箱中进行一小时，然后加入1mL蛋白A凝胶并在室温下低速摇动一小时；然后通过过滤去除凝胶。经跑胶检测，抗体全部 切成Fab和Fc片段，胶上已看不见全长的抗体。经过蛋白A步骤，Fc片段完全吸附在蛋白A胶上，留在溶液中的样品为纯度大于90％的Fab抗体片段。
IDES酶：
IDES酶由苏州普泰生物技术有限公司生产并销售。根据SDS－PAGE的结果，从PD－L1亲合层析柱上洗脱的蛋白约6mg，加入6000U的IDES酶，反应在37℃恒温箱中进行一小时，然后加入1mL蛋白A凝胶并在室温下低速摇动一小时；然后通过过滤去除凝胶。经跑胶检测，IDES反应完全，抗体全部切成Fab2和Fc片段，胶上已看不见全长的抗体。经过蛋白A步骤，Fc片段完全吸附在蛋白A胶上，留在溶液中的样品为纯度大于99％的F(ab’)2抗体片段。
实施例8
抗体片段的精细分离
强阳离子液相色谱分离：
采用安捷伦1100HPLC体系和TOSOH的TSK-GEL SP-5PW色谱柱，色谱柱的尺寸为7.5mm×7.5cm。一次上样量大约300μg抗体片段，分离采用0至0.5M NaCl(0.1％甲酸,pH4)梯度洗脱，HPLC流速为1mL/min，用组分收集器每分钟收集一个组分。收集完成后，取约20μl样品跑胶以确定含有抗体的组分。将含有抗体的组分用透析法脱盐，透析的缓冲液为0.1％的甲酸pH4。
反向液相色谱分离
采用安捷伦1100HPLC系统，分离柱用SIGMA公司的kromasil 300A C8，尺寸为150mm×46mm。孔径300A，颗粒大小16微米；液相A为2％乙睛、0.1％三氟乙酸(TFA)、97.9％水；液相B为90％乙聙、0.1％TFA、9.9％水；色谱流速为1mL/min，整个分离时间120min。自动收集洗脱组分，每个组分为1mL。分离完成后用SDS－PAGE确定含有抗体片段的组分。
SDS-PAGE分离
采用美国HOEFER公司的SE600电泳系统，该系统分离胶的尺寸达24cm而且可以控制温度，这对分离分子量相近的抗体片段非常重要。采用18×24cm的SDS－PAGE，跑胶缓冲液用Tris-Glycine,跑胶电流为25mA，时间约8小时。用考马斯蓝进行染色。
二维电泳分离
采用通用(GE)的二维电泳系统进行抗体片段的分离。其第一维是等电点聚焦电泳，即根据抗体片段的等电点的差异将其分离。实验中采用GE生产的IPG胶条，长度18cm，PH6－11，大约150μg样品上样，聚焦电流为50UA，电压逐步增加，最高电压8000V，整个跑胶时间约18个小时；第二维分离是釆用SDS－PAGE，分离胶浓度为12％，胶的尺寸为25×19cm，厚度1mm，跑胶电流恒定在25mA，整个跑胶时间约6小时。完成后将胶用考马斯蓝染色。
本实施例中，首先将洗脱下的PD-L1抗体用强阳离子交换液相色谱进行分离，收集十个组分；SDS-PAGE电泳跑胶表明抗体主要集中在其中三个组分中；将上述三个组分用C4反相液相色谱进行分离，一共得到三十个组分；经SDS－PAGE电泳和考马斯蓝染色发现其中八个组分有明显的抗体存在。
随后用二维电泳分离上面的八个样品，一共得到十四个眀显的胶点。抗体测序专注于十个含量最高的胶点，二维电泳重复五次，这样得到五个同样的抗体二维胶点。
实施例9
精细分离后抗体片段酶切
通过实施例8的多步分离，特异性抗体片段分离成只含一到两个抗体片段的多个组分。进一步的，将每个抗体片段组分进行大约十种以上的不同酶酶切以产生高度重叠的抗体肽段。通过控制酶切反应的条件，酶切反应产生的肽段长度大部分在4至60氨基酸的范围内，这样的肽段适合于用质谱或化学方法测序。
为了叙述的方便，各种酶切反应中所用的抗体片段统称为抗体样品。在大多数情况下，这些抗体样品只含一种抗体序列，但也可能包含两种甚至两种以上非常相近序列的抗体。在物理形态上，这些样品可以是包含抗体溶液，也可以是SDS－PAGE产生的含抗体蛋白的胶带或2D胶点。酶切反应缓冲液A为1M碳酸氢氨(NH4HCO3)，pH8.0。缓冲液B为1％甲酸，pH3。
胰蛋白酶(trypsin)溶液酶切
大约20μg样品加1μg胰蛋白酶；加入缓冲液A至100mM；混合均匀， 然后放置于37℃恒温水浴中；2小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
赖氨酸蛋白酶(Lys－C)溶液酶切
大约20μg样品加1μg Lys-C；加入缓冲液A至100mM；混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；2小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
谷氨酸蛋白酶(Glu-C)溶液酶切
大约20μg样品加1μg Glu-C；加入缓冲液A至100mM；混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；2小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
天冬氨酸蛋白酶(Asp-N)溶液酶切
大约20μg样品加1μg Asp-N；加入缓冲液A至100mM。混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；2小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
精氨酸蛋白酶(Arg－C)溶液酶切
大约20μg样品加1μg Arg-C；加入缓冲液A至100mM；混合，然后放置于37℃恒温水浴中；2小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)溶液酶切
大约20μg样品加0.5μg胰凝蛋白酶(ROCHE,1418467)；加入缓冲液A至100mM；混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；1小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
胃蛋白酶(pepsin)溶液酶切
大约20μg样品加0.1μg胃蛋白酶；加入缓冲液B；混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；1小时后停止反应。样品可以直接用于LCMS测序。
蛋白酶K(protease K)溶液酶切
大约20μg样品加0.1μg胰凝蛋白酶；加入缓冲液A至100mM；混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；1小时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
弹性蛋白酶(Elastase)溶液酶切
大约20μg样品加0.5μg弹性蛋白酶；加入缓冲液A至100mM；混合均匀，然后放置于37℃恒温水浴中；1时后加入甲酸至0.1％。样品可以直接用于LCMS测序。
胰蛋白酶(Trypsin)胶带酶切
将包含抗体片段的SDS－PAGE的胶带用50％甲醇100mM碳酸氢氨溶液脱色至完全透明。用干净的小刀片将胶带切成边长小于1mm的小颗粒；真空干燥脱水；然后加入眱蛋白酶约lμg，再加入100mM碳酸氢氨pH8溶液使溶液能完全被胶粒吸收；酶切反应在37℃恒温箱中进行两小时，然后加入50μL 1％的甲酸溶液停止反应；再加入150μL乙腈，震荡十分钟，并在13000rpm高速离心十分钟，然后将上清转移到一个干净的试管中；重复以上抽提步骤三次。将得到的不含胶粒的溶液在真空离心干燥机中浓缩成最终体积为10μL。由此得到的样品可直接上样进行LCMS肽段测序。
胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)胶带酶切
将包含抗体片段的SDS－PAGE的胶带用50％甲醇100mM碳酸氢氨溶液脱色至完全透明。用干净的小刀片将胶带切成边长小于1mm的小颗粒。真空干燥脱水；然后加入胰凝乳蛋白酶约lμg，再加入100mM碳酸氢氨pH8溶液使溶液能完全被胶粒吸收；酶切反应在37℃恒温箱中进行两小时，然后加入50μL 0.1％的甲酸溶液停止反应；再加入150μL乙腈，震荡十分钟，并在13000rpm高速离心十分钟，然后将上清转移到一个干净的试管中；重复以上抽提步骤三次。将得到的不含胶粒的溶液在真空离心干燥机中浓缩成最终体积为10μL。由此得到的样品可直接上样进行LCMS肽段测序。
本实施例中，精细分离的PD-L1抗体片段采用上述蛋白酶溶液或者胶条进行酶切，酶切后的产物直接用于氨基酸序列的测定。
实施例10
抗体肽段氨基酸序列的测定
将实施例9中得到的酶切产物肽段利用LCMS技术进行测序。测序过程中，酶切后得到的大量抗体肽段由HPLC进行高分辨地分离；然后直接进入质谱仪器中，经质谱仪的离子源活化后首先测定其肽段的质量电荷之比；然后肽段在质谱内部通过电磁波激发和离开碰撞断裂为很多含不同数目氨 基酸的肽段碎片；通过成梯度分布的肽段碎片的质量测定和全长肽段的质量测定可以确定肽段的氨基酸序列。
抗体测序采用安捷伦1100系列HPLC和THERMO公司的LTQ线性离子肼质谱进行。为了提高检测的灵敏度，釆用内径为75μm的毛细管分离柱，分离柱材料为SIGMA公司生产的DISCOVERY－BIO C18，颗粒大小为3μm，柱长10cm，上样量约10μg；洗脱液A为01％三氟乙酸(TFA)和水，洗脱液B为0.1％TFA，90％乙腈和水。整个梯度洗脱时间为三小时。质谱设置为数据依赖采集模式(Data-Dependent-Acquisition)每个一级质谱后有十个二级质谱。
根据质谱数据获取肽段序列，通过数据库检索，或从头测序，即根据二级质谱来确定肽段的氨基酸序列。大约60％以上的抗体序列通过数据库检索得到，我们使用两种商业化的计算机软件进行质谱数据分析，一个是英国Matrix Science公司的Mascot软件，一个是加拿大BSI公的PEAKS软件。
实施例11
抗体序列拼接
实施例10中，液质联用方法所测得的是大量的肽段的氨基酸序列，这些抗体随机裂解所形成的肽段序列需要拼接成完整的抗体序列，序列拼接往往依赖于测定的肽段序列的重叠。例如，实施例10中,得到两个胰蛋白酶酶切产生的肽段，其氨基酸序列由Mascot和PEAKS软件检索测出，分別为:
肽段1(SEQ ID NO:1)YFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSK
肽段2(SEQ ID NO:2)TPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHK
这此信息不能告诉我们这两个肽段在抗体中是否连在一起。而从胰乳蛋白酶的酶切产物中得到了第3个肽段：
肽段3(SEQ ID NO:3)
ENSKTPQNSADCTY
它与肽段1和肽段2都有部分重叠的肽段这就证明了肽段1和2是两个相连接的肽段。这样整个区域51个氨基酸序列(SEQ ID NO:4)就可以确定出来。
肽段4：(SEQ ID NO:4)
YFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHK
由此类推，整个抗体的序列就可以从大量抗体片段的序列中拼接出来，测定的免疫兔的抗人源的PD－L1蛋白质抗体的部分轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
实施例12.
测定人免疫球蛋白中抗人源PD－L1抗体的序列
本实施例采用注射用人免疫球蛋白作为抗体的来源。注射用人免疫球蛋白由健康人血浆制备而成，复溶后含蛋白质50g/L，其中人免疫球蛋白含量95％，其余主要为微量的白蛋白。本实施例中，将10g复溶后人免疫球蛋白通过PD－L1抗原亲合层析柱，随后采用pH2.0的甘氨酸溶液洗脱与PD－L1抗原结合的特异性抗体。获得的特异性抗体采用木瓜蛋白酶(Papain酶)酶切，去掉抗体的不变区Fc部分得到Fab抗体片段，酶切方法与实施例7中描述相同。
采用实施例8中描述的强阳离子交换液相色谱分离法分离酶切后的抗体片段，洗脱下特异性抗体，共收集十个组分。SDS-PAGE电泳跑胶结果表明特异性抗体主要集中在其中6个组分中。
随后采用反相液相色谱法将其中的三个组分进行分离，一共得到60个组分；SDS－PAGE跑胶后用考马斯亮蓝(commassie)进行染色，发现其中26个组分有明显的抗体存在；接下来采用二维电泳分离其中的八个样品，一共得到约50个眀显的抗体胶点。抗体测序只专注于20个含量最高的胶点。二维电泳重复多次，这样用来测序的抗体有5～8个胶点样品。
随后采用胰蛋白酶(trypsin)，胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)，赖氨酸蛋白酶(Lys-C)，天冬胺酸蛋白酶(Asp-N)，谷氨酸蛋白酶(Glu－C)等分别将每一种胶点或回收的抗体片段溶液用多种不同的酶进行酶切。
测定的部分片段，以及拼接以后的片段，和测定的较长的抗体片段。类似实施例11.
得到的酶切产物用液相色谱—质谱联用进行分析。LC用75μm内径80mm长的反相C18液相色谱，质谱为Thermo的LTQ质谱仪。得到的质谱 数据用生物信息学方法进行分析。

Claims (16)

1.一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其包括的步骤为：
A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；
B、将步骤A中分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段，所述抗体片段包括F(ab’)2、Fab或Fc；
C、将步骤B中得到的抗体片段采用一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；
D、将步骤C中分离的每个抗体片段组分进一步切割成5-60个氨基酸的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，其中所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶；
E、测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；
F、将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤A中采用亲和层析法将与特定抗原结合的特异性抗体从血液中分离。
3.根据权利要求2所述的方法，亲和层析法中抗原作为亲和层析的配体。
4.根据权利要求2所述的方法，亲和层析法中抗原结构类似物作为亲和层析的配体。
5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤B中采用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或者IDES(SEQ ID NO:7)。
6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤B中采用的蛋白酶是IDES(SEQ ID NO:7)。
7.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中采用离子交换色谱、反相色谱、一维聚丙烯酰胺电泳和二维聚丙烯酰胺电泳逐步将步骤B中的抗体片段分离成含有至多两个氨基酸序列的抗体片段组分。
8.根据权利要求1所述的方法，所述步骤D中蛋白酶选自：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、精氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、链霉素蛋白酶E、弹性蛋白酶。
9.根据权利要求1所述的方法，所述步骤D中选择四到六种不同的蛋白酶酶切步骤C中分离的抗体片段组分。
10.根据权利要求9所述的方法，所述步骤D中选择的蛋白酶包括胰蛋白酶(trypsin)。
11.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成5到40个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用质谱分析方法测定抗体肽段的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成20到60个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用Edman降解法测定抗体肽段的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述步骤A前采用A蛋白亲和层析柱分离血液或血液组分中IgG抗体。
14.根据权利要求1所述的方法，所述方法中所述步骤B前还包括采用肽N-糖苷酶F酶去除抗体分子上的N-糖基。
15.根据1至14任一权利要求所述的方法，所述血液取自脊椎动物。
16.根据权利要求15所述的方法，所述脊椎动物选自：人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、骆驼、猴子或猩猩。
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