CN105242050A - 一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法 - Google Patents

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方后琴
沈赟
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Abstract

本发明涉及一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，首先将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，进行还原和烷基化；对两组烷基化的蛋白序列中赖氨酸残基上的ε-氨基进行化学保护；将经化学保护后的两组蛋白质的N端氨基进行同重标记；同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况。与现有技术相比，本发明方法标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。

Description

一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质分子的分析方法，尤其是涉及一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，涉及与生物质谱相关的系统生物学、蛋白质组学等技术领域。
背景技术
近两三年来，商业化的高质量分辨、高质量测量精度质谱仪有了飞跃式发展，也就是轨道阱质谱仪的出现。轨道阱质谱仪跟傅里叶变换离子回旋共振质谱仪分辨率和精度相当；但价格相对便宜，质谱采集速度更快、解离效率更高。该质谱仪的相对普及为分子量相对较大的整体蛋白的质谱及串级质谱分析提供了坚实的基础。在整体蛋白定量标记方面，基于SILAC的体内标记和基于TMT的体外标记，由于靶向氨基酸的非完全标记(如重的赖氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非选择性标记(如苏氨酸的TMT标记)，其应用范围受到了比较大的限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)标记由于其试剂易得，标记效率高，在多肽定量方面已得到了广泛的研究和应用；我国科学家在这个定量技术方面也做出了巨大的贡献，发展了多种不同形式的二甲基标记；其中中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士和张丽华研究员课题组发展的N端同重二甲基标记和复旦大学杨芃原教授和陆豪杰教授课题组发展的赖氨酸残基上的氨基的胍化保护组合起来可直接应用于蛋白的定量标记，有较好的前景。
在整体蛋白质数据库新算法和引擎发展方面，公布号为CN103389335A的中国专利公布了一种鉴定生物大分子的分析装置和方法。公布号为CN104359967A的中国专利公布了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法。上述专利中公布了同位素轮廓指纹比对算法(isotopicenvelopefingerprinting，iEF)，直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节省相应的时间；根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对理想及非理想实验数据进行很好的区分，保证蛋白鉴定的可信度；以已知理论同位素轮廓信息为参考对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法成功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，在单个标准蛋白(泛素、肌红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌)的定性鉴定中，表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势；一方面基于同位素轮廓及其中每个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对；另一方面，搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出，可以用来直接计算相对定量比。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种标记效率高、副反应少、准确度高的不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，包括以下步骤：
(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，统一用二硫苏糖醇进行还原和碘乙酰胺进行烷基化；
(2)对两组烷基化的蛋白序列中赖氨酸残基上的ε-氨基进行化学保护；
(3)将经化学保护后的两组蛋白质的N端氨基进行同重标记，分别标记为-N(CH2D)2和-N(13CH3)2，其质量差异为0.00584Da；
(4)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
(5)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。
优选地，步骤(2)中，用O-甲基异尿素对两组烷基化的蛋白质序列中赖氨酸残基上的ε-氨基进行胍化保护。进行胍化保护的方法为：在pH为11，65℃条件下，用O-甲基异尿素与蛋白质反应15分钟后用10％(v/v)三氟乙酸溶液淬灭。所述的O-甲基异尿素为2mol/L，溶于100mM碳酸氢钠溶液中。本发明的方法同样适用于蛋白质序列中赖氨酸残基上的ε-氨基其他化学保护。
优选地，步骤(3)中，一组蛋白质用甲醛和氘代氰基硼氢化钠标记，另一组蛋白质用13C标记甲醛和氰基硼氢化钠标记；反应过程和条件如下：保护后的蛋白重新溶解在乙酸钠缓冲溶液后，加入4％(v/v)甲醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液，室温反应1小时后，用4％(v/v)的氨水淬灭。所述的乙酸钠缓冲溶液为100mmol/L，pH为5-6。本发明的方法同样适用于蛋白质序列N端氨基的任何同重标记。
步骤(4)所述的等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
步骤(5)中对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术，优选使用背景技术中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，同时也可以使用其他数据库。
与现有技术相比，本发明的解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算同重标记的N端碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。本发明的定量方法对整体蛋白质序列N端氨基酸氨基的同重标记和其高分辨串级质谱N端碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。
附图说明
图1为基于蛋白质N端氨基同重二甲基标记的定量示意图。
图2为蛋白质分子赖氨酸ε-氨基胍化保护和N端氨基同重二甲基标记示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，采用如图1所示的整体流程，包括以下步骤：
(1)两种不同生理或病理条件的整体蛋白(以控制组与疾病组为例)先统一用二硫苏糖醇进行还原和碘乙酰胺进行烷基化；
(2)上述两组烷基化的蛋白统一用O-甲基异尿素(2M，100mM碳酸氢钠溶液)对蛋白序列中赖氨酸残基上的ε-氨基进行胍化(用2MNaOH调节pH到11，65℃)，反应15分钟后用10％(v/v)三氟乙酸溶液淬灭；
(3)保护后的两组蛋白质分别用甲醛和氘代氰基硼氢化钠、13C标记甲醛和氰基硼氢化钠对蛋白分子的N端氨基进行同重标记(如图2所示)；也就是分别标记为-N(CH2D)2和-N(13CH3)2,其质量差异为0.00584Da。反应过程和条件如下：保护后的蛋白重新溶解在乙酸钠缓冲溶液(100mM,pH5-6)后，加入刚刚配制的4％甲醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液。室温反应1小时后，反应用4％的氨水淬灭；
(4)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
(5)ProteinGoggle对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况。上调或下调倍数最大的蛋白即与该疾病发生、发展相关的蛋白。
上述解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算同重标记的N端碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。对整体蛋白质序列N端氨基酸氨基的同重标记和其高分辨串级质谱N端碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，统一用二硫苏糖醇进行还原和碘乙酰胺进行烷基化；
(2)对两组烷基化的蛋白序列中赖氨酸残基上的ε-氨基进行化学保护；
(3)将经化学保护后的两组蛋白质的N端氨基进行同重标记，分别标记为-N(CH2D)2和-N(13CH3)2，其质量差异为0.00584Da；
(4)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
(5)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中，用O-甲基异尿素对两组烷基化的蛋白质序列中赖氨酸残基上的ε-氨基进行胍化保护。
3.根据权利要求2所述的一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，进行胍化保护的方法为：在pH11，65℃条件下，用O-甲基异尿素与蛋白质反应15分钟后用10％(v/v)三氟乙酸溶液淬灭。
4.根据权利要求2所述的一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，所述的O-甲基异尿素为2mol/L，溶于100mM碳酸氢钠溶液中。
5.根据权利要求1所述的一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，步骤(3)中，一组蛋白质用甲醛和氘代氰基硼氢化钠标记，另一组蛋白质用13C标记甲醛和氰基硼氢化钠标记；
反应过程和条件如下：保护后的蛋白重新溶解在乙酸钠缓冲溶液后，加入4％(v/v)甲醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液，室温反应1小时后，用4％(v/v)的氨水淬灭。
6.根据权利要求5所述的一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，所述的乙酸钠缓冲溶液为100mmol/L，pH为5-6。
7.根据权利要求1所述的一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，其特征在于，步骤(4)所述的等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
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