CN102243218A

CN102243218A - 体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法

Info

Publication number: CN102243218A
Application number: CN2011101238850A
Authority: CN
Inventors: 聂爱英; 张磊; 晏国全; 姚鋆; 张扬; 贺福初; 杨芃原; 陆豪杰
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: CN102243218B

Abstract

一种基于细胞培养和串级质谱的蛋白质组学相对定量方法。在细胞培养过程中加入相同质量增加的重同位素标记的精氨酸或赖氨酸，细胞蛋白提取液按不同比例混合，经过特异性内切酶Lys-N和Arg-C酶解后，直接2D-LC-MS/MS分析，提取串级质谱中具有固定质量增加的b,y碎片离子对的峰强度，做比值后确定相应肽段和蛋白的相对量，该方法克服了一级质谱定量的复杂度增加的问题和同重同位素标签串级质谱定量的低质量端抑制效应，提高了一级质谱信号的灵敏度，同时由于在串级质谱中采用多对b,y碎片离子对进行定量，从而保证了该定量方法的准确性和可靠性。为定量蛋白质组学的研究和发展，提供了一个新的方法和技术平台。

Description

体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及一种体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法。

背景技术

蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的焦点之一，随着研究方法和技术的深入开展，仅能提供蛋白质种类和修饰信息的定性蛋白质组学已经不能满足目前研究工作的需要，有关蛋白质相对量变化的定量蛋白质组学已经迅速成为蛋白质组学研究的一个热点和快速发展的领域。目前，蛋白质组学领域内的定量方法，可以分为，同位素标记和无同位素标记定量；体内标记和体外标记定量；相对定量和绝对定量等多种方法。根据肽段被如何标记和定量，我们将定量蛋白质组学分为：一级质谱质量差异定量和串级质谱同重同位素标签定量两个分类。细胞培养稳定同位素标记（SILAC），O¹⁸-酶解标记定量和化学衍生化定量都属于一级质谱质量差异定量，同重同位素标签蛋白质相对和绝对定量（iTRAQ）和串级质量标记（TMT）都属于串级质谱同重同位素标签定量。基于一级质谱的定量方法随着选用重同位素氨基酸种类的增加也使一级质谱图复杂度随之增加，而且其中的O¹⁸-酶解标记方法和化学衍生化方法由于涉及到化学标记效率和化学副反应问题，降低了标记的效率和鉴定的准确度，增加了定性和定量的难度。相比前者，同重同位素标签的串级质谱定量克服了一级质谱定量中一级谱图复杂度增加的问题，而且由于一级母离子同重只在一级质谱中出现一个峰，大大提高了一级质谱信号的灵敏度，但是由于串级标签离子处于低分子量端，受到低端背景离子的干扰，质谱信号受到很大的抑制，降低了定量的准确度和可靠度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、可靠、操作简单、高效并适应于蛋白质组学研究要求的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法。

本发明提出的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其包括以下步骤：

A、培养基的配制：

（a）、在缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM细胞培养基中加入重同位素标记的精氨酸、正常的赖氨酸、透析牛胎血清、青霉素、链霉素和脯氨酸；

（b）、在另一缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM细胞培养基中加入重同位素标记的赖氨酸、正常的精氨酸、透析牛胎血清、青霉素、链霉素和脯氨酸；

其中，重同位素标记的精氨酸与正常的精氨酸相比，分子质量有所增加，重同位素标记的赖氨酸与正常的赖氨酸相比，分子质量也有所增加，并且二者增加的分子质量相等，重同位素标记的赖氨酸称为重赖氨酸，重同位素标记的精氨酸称为重精氨酸；

B、细胞培养：分别使用上述两种培养基，培养细胞；

C、全蛋白提取：收集传代6代以上的细胞，分别从重赖氨酸标记的细胞和重精氨酸标记的细胞中提取全蛋白；

D、不同比例全蛋白提取物的混合：分别将从重赖氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白和重精氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白按照不同质量比进行混合，前后两种全蛋白的质量比范围为1:10-10:1；

E、蛋白混合物前处理：在碳酸氢铵水溶液中，溶解不同质量比的蛋白混合物，依次加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化，然后加入特异性内切酶Lys-N和Arg-C，进行酶解，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于体积比为20-25%乙腈、75-80% 10-20mM的磷酸二氢钾溶液中，留待分析；

F、蛋白混合物的检测：将上述得到的冻干粉重新溶解的溶液注入强阳离子交换液相色谱进行分离，按峰形收集组分，将每个组分分别冻干后再重新溶解于体积比为0.05-0.1%甲酸的纯水溶液中，将所得到的各组分重溶液通过反相液相色谱与质谱LTQ-Orbitrap联用进行检测，提取串级质谱中具有固定质量增加的b, y碎片离子对的峰强度，做比值后确定相应肽段和蛋白的相对量。

本发明方法中，步骤A中所述重/正常精氨酸、重/正常赖氨酸和脯氨酸的终浓度分别为80-90、140-150和195-205 μg/ml。

本发明方法中，步骤D中所述从重赖氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白和从重精氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白混合时按照的不同质量比可选取为1:10、1:5、1:1和5:1。

本发明方法中，步骤E中所述样品前处理的条件为：在25-100mM，100-500ul碳酸氢铵水溶液中，分别溶解不同质量比的蛋白混合物300-800ug，依次加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺，使其终浓度分别为9-10mM和50-55mM，还原烷基化之后，冰丙酮沉淀得到蛋白，再重溶于25-100mM，pH=9-9.5的碳酸氢铵水溶液中，然后加入特异性内切酶Lys-N进行酶解，酶解条件为：蛋白质和酶的质量比为85:1，37℃条件下反应12-15小时，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于25-100mM，pH=7-8的碳酸氢铵水溶液中，加入特异性内切酶Arg-C进行酶解，酶解条件为：蛋白质和酶的质量比为200:1，37℃条件下反应16-18小时，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于体积比为20-25%乙腈、75-80%的10-20mM磷酸二氢钾溶液中，待分析。

本发明方法中，步骤F中所述强阳离子交换液相色谱的分析条件为：使用Poly SULFOETHYL A柱子，柱子规格为：内径1-5mm、柱长100-300mm、填料粒径3-5μm、填料孔径80-200Å；流动相A为：体积比为20-25%乙腈、75-80% 10-20mM磷酸二氢钾溶液，流动相B为：体积比为20-25%乙腈、75-80% 300-350mM氯化钾和10-20mM磷酸二氢钾的溶液；洗脱条件为：起始流动相B浓度为0-5%，洗脱梯度为0.5-1%流动相B每分钟，流速保持150-250μl/min；紫外检测波长为214nm；

本发明方法中，步骤F中所述反相液相色谱的分析条件为：使用Captrap Peptide柱子，柱子规格为：内径0.075-0.1mm、柱长100-250mm、填料粒径1-3μm、填料孔径60-90Å；流动相A为：体积比为0.05-0.1%甲酸的纯水溶液；流动相B为：体积比为0.05-0.1%甲酸的纯乙腈溶液；洗脱条件为：起始流动相B浓度为0-5%，洗脱梯度为0.5-1%流动相B每分钟，流速保持200-600nl/min；

其中所述质谱LTQ-Orbitrap的分析条件为：喷雾电压为1.5-3.5kV；质量扫描范围为m/z 400-2000；Orbitrap一级质谱分辨率为60,000-100,000（m/z=400）；4-10个连续的LTQ-MS/MS扫描；归一化碰撞能量为30-40%；q值为0.25。

本发明提出的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，是基于细胞培养和串级质谱定量，对肽段和蛋白进行相对定量的新方法。该方法中一级母离子同重只在一级质谱中出现一个峰，大大提高了一级质谱信号的灵敏度，并且克服了一级质谱定量中一级谱图复杂度增加的问题，同时由于在串级质谱中采用全质量范围内多对b, y碎片离子对进行定量，从而克服了同重同位素标签串级质谱定量的低质量端抑制效应，也保证了该定量方法的准确度和可靠度。为定量蛋白质组学的发展，提供了一个新的研究方法和技术平台。

附图说明

图1为本定量方法流程图。其中K⁰为正常赖氨酸，K⁶为6Da质量增加的重同位素标记的赖氨酸，Y为非赖氨酸。R⁰为正常精氨酸，R⁶为6Da质量增加的重同位素标记的精氨酸，X为非精氨酸。

图2为1:1混合的海拉细胞全蛋白提取物中肽段K^*LVIITAGAR(K^*=¹³C₆-Lysine)和KLVIITAGAR^# (R^#=¹³C₆-Arginine)（m/z=683.86,z=2）的一级质谱图（A）和串级质谱图（B），其中横坐标为质核比，纵坐标为相对离子强度。在一级质谱图（A）中两条肽段的母离子质量相同，显示为一个峰。在串级质谱图（B）中出现多对b, y碎片离子对，峰强度做比值后平均值为1.03。

图3为本方法的动态范围示意图，其中横坐标为肽段，纵坐标为比例。海拉细胞蛋白样品中五条肽段在不同理论比例5:1、1:1、1:5和1:10混合时得到的实际比例和动态范围。

图4为通过一级质谱质量差异进行定量的肽段的一级质谱图，其中横坐标为质核比，纵坐标为相对离子强度。

图5为通过串级质谱碎片离子对定量的蛋白和通过一级质谱质量差异定量的蛋白的比值分布图，其中横坐标为蛋白个数，纵坐标为蛋白比值。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明提出的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法的进一步说明。

实施例 1 体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法

1)培养基的配制：

a、在缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM细胞培养基中加入重同位素标记的精氨酸，使其终浓度为84μg/ml，重同位素标记的精氨酸比正常的精氨酸分子质量增加6Da；正常的赖氨酸，使其终浓度为146μg/ml；10%透析牛胎血清；青霉素和链霉素，使其终浓度均为100units/ml；脯氨酸，使其终浓度为200 μg/ml，以防止重同位素标记的精氨酸向脯氨酸的转变；

b、在另一缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM细胞培养基中加入重同位素标记的赖氨酸，使其终浓度为146μg/ml，重同位素标记的赖氨酸比正常的赖氨酸分子质量增加6Da ；正常的精氨酸，使其终浓度为84μg/ml；10%透析牛胎血清；青霉素和链霉素，使其终浓度均为100 units/ml 的；脯氨酸，使其终浓度为200μg/ml，于上述实验条件保持一致。

2）细胞培养：分别使用上述两种培养基，在37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养细胞。

3）全蛋白提取：收集传代6代以上的细胞，加入7M尿素，2M硫脲和蛋白酶抑制剂进行全蛋白超声提取，Bradford法测定蛋白浓度。

4）不同比例的全蛋白混合：分别将从重赖氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白和从重精氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白按照1:1、1:5、1:10和5:1的不同质量比进行混合。

5）蛋白混合物前处理：在25mM，300ul碳酸氢铵水溶液中，分别溶解不同质量比的蛋白混合物400ug，依次加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺，使其终浓度分别为10mM和55mM，还原烷基化之后，冰丙酮沉淀得到蛋白，再重溶于25mM，pH=9.5的碳酸氢铵水溶液中，然后加入特异性内切酶Lys-N进行酶解，酶解条件为：蛋白质和酶的质量比为85:1，37℃条件下反应14小时，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于25mM，pH=7.6的碳酸氢铵水溶液中，加入特异性内切酶Arg-C进行酶解，酶解条件为：蛋白质和酶的质量比为200:1，37℃条件下反应18小时，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于体积比为25%乙腈，75%10mM的磷酸二氢钾溶液中，待分析。

6）蛋白混合物的分析：将步骤5得到的冻干粉重溶液进行强阳离子交换液相色谱分离，按峰形收集组分，将每个组分分别冻干后再重新溶解于体积比为0.1%甲酸的纯水溶液中，所得冻干粉溶液通过反相液相色谱与质谱LTQ-Orbitrap联用进行检测，

a、强阳离子交换液相色谱分析条件为：使用Poly SULFOETHYL A柱子，柱子规格为：内径2.1mm、柱长100mm、填料粒径5μm、填料孔径200Å；流动相A为体积比为25%乙腈，75% 10mM磷酸二氢钾溶液、流动相B为体积比为25%乙腈，75% 350mM 氯化钾和10mM磷酸二氢钾的溶液；洗脱条件为：起始流动相B浓度为0%，洗脱梯度为0.5%流动相B每分钟；流速保持200μl/min；紫外检测波长为214nm；

b、反相液相色谱的分析条件为：使用Captrap Peptide柱子，柱子规格为：内径0.1mm、柱长150mm、填料粒径3μm、填料孔径80Å；流动相A为：体积比为0.1%甲酸的纯水溶液；流动相B为：体积比为0.1%甲酸的纯乙腈溶液；洗脱条件为：起始流动相B浓度为0%，洗脱梯度为0.5%流动相B每分钟，流速保持500nl/min；

c、质谱LTQ-Orbitrap的分析条件为：喷雾电压为2.0kV；质量扫描范围为m/z 400-1600；Orbitrap一级质谱分辨率为60,000（m/z=400）；8个连续的LTQ-MS/MS扫描；归一化碰撞能量为35%；q值为0.25。

7）进行质谱数据分析，提取串级质谱中具有固定质量增加的成对信号峰的强度，做比值后确定相应肽段和蛋白的相对量，如附图2所示。一级质谱图中具有质量增加的成对信号峰强度也可以做比值后，从一级质谱水平上给出一些肽段和蛋白的定量信息，如附图4所示。

实施例 2 体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法的动态测试范围

选取5:1、1:1、1:5和1:10四个不同的比例，对海拉细胞的全蛋白提取物进行混合，其它条件不变，重复上述实验步骤，选取5条不同的肽段，通过串级碎片离子对定量得到相应肽段的比值和总的动态测试范围，如附图3所示，结果表明该方法有比较好的动态测试范围，只有在较高浓度时，比值偏差会大一些，适用于蛋白质组学定量分析。

实施例 3 体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法的准确性

以比例1:1混合得到的定量结果为例，如附图5所示，通过一级质谱质量差异得到的蛋白定量比值分布就比较分散，出现一些过大或者过小的点，而通过串级质谱中碎片离子对得到的蛋白定量比值分布比较集中，分散在一个较窄的范围之内，该结果表明，体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法保证了定量的准确性和可靠性。

上述实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案。任何不脱离本发明精神和范围的技术方案均应涵盖在本发明的专利申请范围当中。

Claims

1.一种体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于具体步骤：

A、培养基的配制：

（b）、在另一缺乏精氨酸和赖氨酸的 DMEM 细胞培养基中加入重同位素标记的赖氨酸、正常的精氨酸、透析牛胎血清、青霉素、链霉素和脯氨酸；

B、细胞培养：分别使用上述两种培养基，培养细胞；

D、不同比例全蛋白提取物的混合：分别将从重赖氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白和从重精氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白按照不同质量比进行混合，所述质量比的范围为1:10-10:1；

E、蛋白混合物前处理：在碳酸氢铵水溶液中，溶解不同质量比的蛋白混合物，依次加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化，然后加入特异性内切酶Lys-N和Arg-C进行酶解，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于体积比为20-25%乙腈、75-80% 10-20mM磷酸二氢钾溶液，留待分析；

F、蛋白混合物的检测：将上述得到的冻干粉重溶液注入强阳离子交换液相色谱进行分离，按峰形收集组分，将每个组分分别冻干后再重新溶解于体积比为0.05-0.1%甲酸的纯水溶液中，将所得到的各组分重溶液通过反相液相色谱与质谱LTQ-Orbitrap联用进行检测，提取串级质谱中具有固定质量增加的b, y碎片离子对的峰强度，做比值后确定相应肽段和蛋白的相对量。

2.根据权利要求1所述的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于所述细胞培养基的配制中重/正常精氨酸、重/正常赖氨酸和脯氨酸的终浓度分别为80-90、140-150和195-205μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于所述从重赖氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白和从重精氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白混合时按照的不同质量比为1:1、1:5、1:10和5:1。

4.根据权利要求1或2所述的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于所述样品前处理的条件为：在25-100mM，100-500ul碳酸氢铵水溶液中，分别溶解不同质量比的蛋白混合物300-800ug，依次加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺，使其终浓度分别为9-10mM和50-55mM，还原烷基化之后，冰丙酮沉淀得到蛋白，再重溶于25-100mM，pH=9-9.5的碳酸氢铵水溶液中，然后加入特异性内切酶Lys-N进行酶解，酶解条件为：蛋白质和酶的质量比为85:1，37℃条件下反应12-15小时，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于25-100mM，pH=7-8的碳酸氢铵水溶液中，加入特异性内切酶Arg-C进行酶解，酶解条件为：蛋白质和酶的质量比为200:1，37℃条件下反应16-18小时，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于体积比为20-25%乙腈、75-80%的10-20mM磷酸二氢钾溶液中。

5.根据权利要求1或2所述的体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：

所述强阳离子交换液相色谱的分析条件为：使用Poly SULFOETHYL A柱子，柱子规格为：内径1-5mm、柱长100-300mm、填料粒径3-5μm、填料孔径80-200Å；流动相A为：体积比为20-25%乙腈、75-80% 10-20mM磷酸二氢钾溶液，流动相B为：体积比为20-25%乙腈、75-80% 300-350mM氯化钾和10-20mM磷酸二氢钾的溶液；洗脱条件为：起始流动相B浓度为0-5%，洗脱梯度为0.5-1%流动相B每分钟，流速保持150-250μl/min；紫外检测波长为214nm；

所述反相液相色谱的分析条件为：使用Captrap Peptide柱子，柱子规格为：内径0.075-0.1mm、柱长100-250mm、填料粒径1-3μm、填料孔径60-90Å；流动相A为：体积比为0.05-0.1%甲酸的纯水溶液；流动相B为：体积比为0.05-0.1%甲酸的纯乙腈溶液；洗脱条件为：起始流动相B浓度为0-5%，洗脱梯度为0.5-1%流动相B每分钟，流速保持200-600nl/min；

所述质谱LTQ-Orbitrap的分析条件为：喷雾电压为1.5-3.5kV；质量扫描范围为m/z 400-2000；Orbitrap一级质谱分辨率为60,000-100,000（m/z=400）；4-10个连续的LTQ-MS/MS扫描；归一化碰撞能量为30-40%；q值为0.25。