BR112021014427A2

BR112021014427A2 - Quantificação e identificação de dímeros em coformulações

Info

Publication number: BR112021014427A2
Application number: BR112021014427-7A
Authority: BR
Inventors: Yuetian Yan; Shunhai Wang
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2021-09-28
Also published as: WO2020154525A1; AU2020212022A1; US20200240998A1; EP3914908A1; US20230070556A1; MX2021008823A; SG11202107588YA; CA3126719A1; IL284829A; CN113348364A; US11536725B2; US11899023B2; KR20210120042A; JP2022518254A

Abstract

quantificação e identificação de dímeros em coformulações. a presente invenção refere-se a métodos e sistema para identificação de espécies de dímero com o uso de cromatografia online e espectrometria de massa de ionização por eletroaspersão. também são fornecidos métodos e sistema para quantificação de espécies de heterodímero com o uso de imunoprecipitação e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "QUAN- TIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE DÍMEROS EM COFORMULA- ÇÕES".

CAMPO

[001] A presente invenção refere-se, de modo geral, a um méto- do e sistema para identificação de espécies de dímero com o uso de cromatografia online e espectrometria de massa de ionização por ele- troaspersão e quantificação de espécies de heterodímero com o uso de imunoprecipitação e cromatografia líquida acoplada à espectrome- tria de massa.

ANTECEDENTES

[002] Os produtos biofarmacêuticos proteicos surgiram como im- portantes fármacos para o tratamento do câncer, doenças autoimunes, infecções e distúrbios cardiometabólicos e representam um dos seg- mentos de produtos de maior crescimento da indústria farmacêutica.

[003] A estratégia de coformular dois ou mais anticorpos mono- clonais terapêuticos (mAbs) e/ou proteínas ativas em um fármaco final ganhou muita popularidade recentemente, oferecendo várias vanta- gens, incluindo eficácia aumentada, eventos adversos globais reduzi- dos e conveniência e adesão do paciente melhoradas. Formular dois mAbs e/ou proteínas ativas diferentes em uma única formulação pode ser problemático e envolve a escolher excipientes e condições que podem representar um compromisso. Além dos desafios para o de- senvolvimento da formulação, os fármacos coformulados também apresentam desafios significativos para a caracterização analítica. Por exemplo, a diferenciação e quantificação de diferentes formas de dí- mero presentes em um fármaco coformulado sob armazenamento normal ou condições de estresse podem ser desafiadoras e muitas vezes não podem ser alcançadas por métodos tradicionais, como cro- matografia por exclusão de tamanho.

[004] Os produtos biofarmacêuticos de proteína, incluindo prepa- rações coformuladas, precisam atender a padrões de pureza muito elevados. Assim, pode ser importante monitorar quaisquer impurezas no fármaco coformulado em diferentes estágios de desenvolvimento, produção, armazenamento e manuseio do fármaco. Os métodos analí- ticos para ensaios de caracterização devem apresentar precisão e re- solução suficientes para detectar e quantificar o produto desejado. A análise direta pode exigir o isolamento do produto em uma quantidade suficientemente grande para o ensaio, o que é indesejável e só foi possível em casos selecionados.

[005] Há uma necessidade há muito sentida na técnica de um método e/ou sistema para caracterizar as preparações coformuladas.

SUMÁRIO

[006] O crescimento no desenvolvimento, fabricação e venda de produtos biofarmacêuticos de proteína levou a uma demanda crescen- te para caracterizar o biofármaco de proteína junto com possíveis im- purezas. O desenvolvimento de preparações coformuladas estáveis representa um desafio adicional, pois requer a determinação da estabi- lidade e degradação das proteínas individuais presentes na mistura de anticorpos. Tal determinação é frequentemente difícil devido ao grande número de proteínas na formulação, formação de espécies de hetero- dímeros, espécies de homodímeros e similaridades entre tais proteí- nas.

[007] Modalidades exemplares divulgadas no presente documen- to satisfazem as demandas acima mencionadas fornecendo métodos e/ou sistema para identificar espécies de dímero e/ou quantificar uma espécie de heterodímero.

[008] Esta divulgação, pelo menos em parte, fornece um método para identificar uma espécie de dímero. Em uma modalidade exempli- ficativa, o método para identificar uma espécie de dímero compreende colocar uma amostra incluindo a espécie de dímero em contato com um sistema cromatográfico com uma resina de cromatografia, lavar a dita resina com o uso de uma fase móvel para fornecer um eluente in- cluindo a espécie de dímero e identificar as espécies de dímero no dito eluente com o uso de um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão.

[009] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender um sistema cromato- gráfico com uma resina de cromatografia por exclusão de tamanho.

[0010] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender acoplar um espectrô- metro de massa de ionização por eletroaspersão a um sistema croma- tográfico com uma resina de cromatografia.

[0011] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender acoplar um espectrô- metro de massa de ionização por eletroaspersão a um sistema croma- tográfico que tem uma resina de cromatografia por exclusão de tama- nho.

[0012] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão que opera sob condições nati- vas.

[0013] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroaspersão.

[0014] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroaspersão que opera sob condições nativas.

[0015] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi-

car uma espécie de dímero pode compreender pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos para acoplar um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão a um sistema cromatográfico com uma resina.

[0016] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos para acoplar um detector de ultraviole- ta ao sistema cromatográfico com uma resina.

[0017] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos para acoplar um detector de ultraviole- ta e um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão a um sistema cromatográfico com uma resina.

[0018] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos para acoplar um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão a um sistema cromatográfico com uma resina de cromatografia por exclusão de tamanho.

[0019] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos para acoplar um detector de ultraviole- ta ao sistema cromatográfico com uma resina de cromatografia por exclusão de tamanho.

[0020] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos para acoplar um detector de ultraviole- ta e um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão a um sistema cromatográfico com uma resina de cromatografia por ex- clusão de tamanho.

[0021] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi-

car uma espécie de dímero pode compreender lavar uma resina com o uso da fase móvel para fornecer um eluente incluindo a espécie de dímero, em que o eluente pode ser introduzido em um detector de ul- travioleta através de pelo menos um divisor com pelo menos três ca- minhos, a uma taxa de fluxo de cerca de 0,2 ml/min a cerca de 0,4 ml/min.

[0022] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender uma fase móvel que compreende um sal volátil.

[0023] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender uma fase móvel que compreende acetato de amônio.

[0024] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender lavar uma resina com a fase móvel com uma taxa de fluxo de cerca de 0,2 ml/min a cerca de 0,4 ml/min.

[0025] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender uma fase móvel com um pH de cerca de 6,8.

[0026] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender uma amostra incluindo a espécie de dímero em uma quantidade de cerca de 10 µg a cerca de 100 µg.

[0027] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender uma espécie de dímero incluindo um anticorpo.

[0028] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender uma espécie de dímero incluindo uma proteína de fusão.

[0029] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi-

car uma espécie de dímero pode compreender um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão com uma taxa de fluxo de cer- ca de 10 nl/min a cerca de 50 nl/min.

[0030] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão com uma voltagem de asper- são de um eletroaspersão de cerca de 0,8 kV a cerca de 1,5 kV.

[0031] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero, em que a espécie de dímero pode ser uma espécie de homodímero.

[0032] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero, em que a espécie de dímero pode ser uma espécie de heterodímero.

[0033] Em um aspecto dessa modalidade, o método para identifi- car uma espécie de dímero pode compreender colocar uma amostra incluindo a espécie de dímero em contato com um sistema cromato- gráfico com uma resina de cromatografia, em que a amostra pode compreender monômeros de proteína.

[0034] Esta divulgação, pelo menos em parte, fornece um sistema que compreende uma coluna cromatográfica que tem uma resina de cromatografia. Em uma modalidade exemplificativa, o sistema com- preende uma coluna cromatográfica que tem uma resina cromatográfi- ca, em que a coluna cromatográfica pode receber uma fase móvel e uma amostra incluindo uma proteína, e um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão.

[0035] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender uma coluna cromatográfica que tem uma resina de cromato- grafia por exclusão de tamanho.

[0036] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão que pode ser acoplado à dita coluna cromatográfica.

[0037] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão que pode ser executado sob condições nativas.

[0038] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroas- persão.

[0039] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender uma coluna cromatográfica que pode ser acoplada a um es- pectrômetro de massa com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos.

[0040] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender uma coluna cromatográfica que pode ser acoplada a detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três cami- nhos.

[0041] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode com- preender uma coluna cromatográfica que pode ser acoplada a um de- tector de ultravioleta e um espectrômetro de massa com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos.

[0042] Em um aspecto dessa modalidade, o sistema pode identifi- car uma espécie de dímero.

[0043] Esta divulgação, pelo menos em parte, fornece um método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que o dito método compreende imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, incubar a amostra com o dito anticorpo , capturar uma amostra precipitada, coletar um fluxo passante, tratar a amostra precipitada com um primeiro composto, tra- tar o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo passante trata-

do para formar uma mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar as espécies de heterodímero na amostra.

[0044] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, em que a primeira proteína pode ser um anticorpo monoclonal.

[0045] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, em que a superfície sólida compreende microesferas magnéticas.

[0046] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, em que a superfície sólida compreende estreptavidi- na.

[0047] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida e capturar uma amostra precipitada, em que a amos- tra precipitada inclui a espécie de heterodímero ligada ao anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida.

[0048] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida e capturar uma amostra precipitada, em que a amos- tra precipitada compreende a espécie de heterodímero ligada ao anti- corpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida.

[0049] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada, ressuspender a amostra precipitada e aquecer a amostra precipitada ressuspensa.

[0050] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante.

[0051] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletando um fluxo passante e tratar a amostra capturada com um primeiro compos- to.

[0052] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar o fluxo passante com um primeiro composto.

[0053] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto.

[0054] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, em que o primeiro composto pode ser um isótopo do segundo composto.

[0055] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto e misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo pas- sante tratado para formar uma mistura.

[0056] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo pas- sante tratado para formar uma mistura e digerir a mistura.

[0057] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo pas- sante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura e deglicosilar a mistura digerida.

[0058] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo pas- sante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espec- trômetro de massa para quantificar a espécie de heterodímero na amostra.

[0059] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo pas- sante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura, deglicosilar a mistura digerida e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar a es- pécie de heterodímero na amostra.

[0060] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender analisar com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um es- pectrômetro de massa para quantificar as espécies de heterodímero na amostra, em que o espectrômetro de massa pode ser um espec- trômetro de massa em tandem.

[0061] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto e adicionar um agente redutor à amostra precipitada tratada.

[0062] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto e adicionar um agente redutor ao fluxo passante tratado.

[0063] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante tratado para formar uma mistura e analisar a mistura com o uso de uma cro- matografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quan- tificar a espécie de heterodímero na amostra.

[0064] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um primeiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar a espécie de heterodímero na amostra.

[0065] Esta divulgação, pelo menos em parte, fornece um método para quantificar uma espécie de dímero. Em uma modalidade exempli- ficativa, o método para quantificar uma espécie de heterodímero com- preende imunoprecipitar as espécies de heterodímero e quantificar as espécies de heterodímero com o uso de um método de marcação com isótopo estável seguido por uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa.

[0066] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi-

car uma espécie de heterodímero pode compreender uma espécie de heterodímero incluindo um anticorpo.

[0067] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero pode compreender uma espécie de heterodímero incluindo uma proteína de fusão.

[0068] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero pode compreender imunoprecipitar a espécie de heterodímero com o uso de um anticorpo em uma superfí- cie sólida.

[0069] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero pode compreender imunoprecipitar a espécie de heterodímero com o uso de um anticorpo em uma superfí- cie sólida, em que o anticorpo pode se ligar a uma proteína do hetero- dímero.

[0070] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero pode compreender o uso de um mé- todo de marcação com isótopo estável com um composto alquilante.

[0071] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero pode compreender o uso de um mé- todo de marcação com isótopo estável com um composto alquilante.

[0072] Em um aspecto dessa modalidade, o método para quantifi- car uma espécie de heterodímero pode compreender realizar a diges- tão, além de usar um método de marcação com isótopo estável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0073] A Figura 1 mostra uma modalidade exemplificativa de um sistema que pode identificar espécies de dímero.

[0074] A Figura 2 mostra uma modalidade exemplificativa do mé- todo usado para quantificar espécies de heterodímero em uma amos- tra de uma preparação coformulada.

[0075] A Figura 3 mostra um método para quantificar a ligação não específica de uma proteína a um anticorpo em uma amostra negativa de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0076] A Figura 4 mostra uma modalidade exemplificativa do mé- todo usado para quantificar espécies de heterodímero em uma amos- tra de uma preparação coformulada.

[0077] A Figura 5 mostra os seis dímeros que podem possivelmen- te estar presentes em uma coformulação que compreende três anti- corpos monoclonais.

[0078] A Figura 6 mostra a identificação de espécies de heterodí- mero em uma coformulação que compreende três anticorpos mono- clonais com o uso de análise de SEC-MS nativa de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0079] A Figura 7 mostra a quantificação de espécies de hetero- dímero em uma coformulação que compreende três anticorpos mono- clonais com o uso de análise de SEC-MS nativa de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0080] A Figura 8 mostra os três dímeros que podem possivelmen- te estar presentes em uma coformulação que compreende um anticor- po monoclonal e uma proteína de fusão.

[0081] A Figura 9 mostra um cromatograma de íons extraídos (XIC) de uma coformulação diferenciada de acordo com uma modali- dade exemplificativa.

[0082] A Figura 10 mostra a determinação da razão entre massa e carga de espécies de dímero de uma coformulação diferenciada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0083] A Figura 11 mostra um fluxo de trabalho de uma estratégia de imunoprecipitação e marcação com isótopo para quantificação de heterodímero de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0084] A Figura 12 mostra as razões entre massa e carga das fra- ções de pull-down e fluxo passante obtidas para a coformulação es-

tressada com branco frio e uma amostra negativa de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0085] A Figura 13 mostra um gráfico para % de heterodímero da proteína de fusão 1 em quatro peptídeos da proteína de fusão 1 en- contrados em amostras estressadas sob diferentes condições, em que a quantificação foi realizada de acordo com uma modalidade exempli- ficativa.

[0086] A Figura 14 mostra um gráfico da razão entre massa e car- ga do peptídeo 1 da proteína de fusão 1 (fragmentos leves e pesados) em amostras estressadas sob diferentes condições, em que a quantifi- cação de um heterodímero que compreende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0087] A Figura 15 mostra um gráfico da razão entre massa e car- ga do peptídeo 2 da proteína de fusão 1 (fragmentos leves e pesados) em amostras estressadas sob diferentes condições, em que a quantifi- cação de um heterodímero que compreende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0088] A Figura 16 mostra um gráfico da razão entre massa e car- ga do peptídeo 3 da proteína de fusão 1 (fragmentos leves e pesados) em amostras estressadas sob diferentes condições, em que a quantifi- cação de um heterodímero que compreende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0089] A Figura 17 mostra um gráfico da razão entre massa e car- ga do peptídeo 4 da proteína de fusão 1 (fragmentos leves e pesados) em amostras estressadas sob diferentes condições, em que a quantifi- cação de um heterodímero que compreende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0090] A Figura 18 mostra os cálculos para converter % de hetero- dímero da proteína de fusão 1 em % de heterodímero, em que a quan- tificação de um heterodímero que compreende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

[0091] A Figura 19 representa um gráfico de % de heterodímero de proteína de fusão 1 nas amostras testadas normalizada para % de heterodímero de proteína de fusão na amostra testada sem diluição, em que a quantificação de um heterodímero que compreende proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificati- va.

[0092] A Figura 20 mostra um gráfico da % de heterodímero da proteína de fusão 1 vs. % de amostra estressada com branco frio na amostra mista para três dos peptídeos usados para quantificar a prote- ína de fusão 1, em que a quantificação de um heterodímero que com- preende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma moda- lidade exemplificativa.

[0093] A Figura 21 mostra a % de heterodímero da proteína de fusão 1 em amostras de preparações coformuladas armazenadas em condições ambientais, em que a quantificação de um heterodímero que compreende a proteína de fusão 1 foi realizada de acordo com uma modalidade exemplificativa.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0094] A identificação e a quantificação de proteínas em produtos biofarmacêuticos proteicos podem ser muito importantes durante a produção e o desenvolvimento de um produto. A análise de impurezas em qualquer produto biofarmacêutico proteico pode ser fundamental para o desenvolvimento de um produto seguro e eficaz. Portanto, um método e/ou fluxo de trabalho robustos para caracterizar as impurezas pode ser benéfico.

[0095] A maioria dos produtos biofarmacêuticos pode compreen- der uma única proteína. Em alguns casos, múltiplas proteínas direcio- nadas a um único alvo ou múltiplos alvos administrados em combina- ção podem melhorar seu diagnóstico ou indicação terapêutica e eficá-

cia. O desenvolvimento de tais preparações coformuladas está se tor- nando cada vez mais popular (Svend Havelund et al., Investigation of the Physico-Chemical Properties that Enable Co-Formulation of Basal Insulin Degludec with Fast-Acting Insulin Aspart, 32 PHARMACEUTICAL RESEARCH 2250–2258 (2015); Sanjay Kalra & Yashdeep Gupta, Injec- table Coformulations in Diabetology, 6 DIABETES THERAPY101–111 (2015); Ryzodeg, EUROPEAN MEDICINES AGENCY - FIND MEDICINE - RA- XONE, https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/ryzodeg (último acesso em 17 de janeiro de 2019)).

[0096] O desenvolvimento de preparações coformuladas, no en- tanto, apresenta alguns desafios, uma vez que requer o estudo das potenciais interações farmacodinâmicas, potenciais interações farma- cocinéticas, potencial para interações toxicológicas, potencial para mudanças nos níveis ou atividade de endógenos e potencial para pre- judicar a eficácia de um dos fármacos (Claudia Mueller, Ulrike Alten- burger & Silke Mohl, Challenges for the pharmaceutical technical deve- lopment of protein coformulations, 70 JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY 666–674 (2017)). A fabricação de uma preparação coformulada estável também pode exigir esforços adicionais para ga- rantir a estabilidade das duas ou mais proteínas em várias etapas da fabricação.

[0097] Durante o armazenamento, transporte e administração, os produtos coformulados finais podem ficar expostos à luz, calor e oxi- gênio e causar agregação (homodímero (ou homodímeros) e/ou hete- rodímero (heterodímeros) de espécies de alto peso molecular), padrão de carga, fragmentação, modificações químicas (por exemplo, oxida- ção, desamidação), etc.

[0098] Um bom desempenho e sensibilidade do método analítico são cruciais para garantir a alta qualidade e a segurança do produto final coformulado. No entanto, a abordagem analítica para o desenvol-

vimento e a avaliação de preparações coformuladas pode ser significa- tivamente desafiadora e complexa em relação à abordagem aplicada para as formulações que compreendem uma única proteína como um ingrediente farmacêutico ativo. Isso pode se tornar um desafio, pois certos métodos padrão usados para uma formulação que compreende uma única proteína podem nem sempre ter capacidade de diferenciar proteínas nas preparações coformuladas.

[0099] Um dos métodos inclui o uso de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para caracterizar agregação e fragmentação bio- moleculares na indústria de biotecnologia (Hong Paule et al., Size- Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates, 35 JOURNAL OF LIQUID CHROMATOGRAPHY AND RELATED TECHNOLOGY 2923-2950 (2012)). A separação de moléculas por SEC depende da interação diferencial de moléculas com uma estrutura porosa controlada em uma fase estacionária. Como a SEC usa condições tampão que preservam a estrutura nativa das proteínas em solução, ela permite a caracterização de biomoléculas sem perturbar sua conformação nativa. Além disso, entre os vários modos de detecção que podem ser acoplados com SEC, a espectro- metria de massa (MS) permite a identificação precisa e exata de com- ponentes individuais em amostras complexas. A combinação de SEC e MS foi relatada anteriormente, incluindo a coleta de picos de SEC seguidos por MS de infusão direta (Başak Kükrer et al., Mass Spec- trometric Analysis of Intact Human Monoclonal Antibody Aggregates Fractionated by Size-Exclusion Chromatography, 27 PHARMACEUTICAL RESEARCH 2197–2204 (2010); François Debaene et al., Innovative Na- tive MS Methodologies for Antibody Drug Conjugate Characterization: High Resolution Native MS and IM-MS for Average DAR and DAR Dis- tribution Assessment, 86 ANALYTICAL CHEMISTRY 10674–10683 (2014)) ou SEC-MS online (Khaja Muneeruddin et al., Characterization of

Small Protein Aggregates and Oligomers Using Size Exclusion Chro- matography with Online Detection by Native eletroaspersão Ionization Mass Spectrometry, 86 ANALYTICAL CHEMISTRY 10692–10699 (2014); C. F. Mcdonagh et al., Engineered antibody-drug conjugates with defi- ned sites and stoichiometries of drug attachment, 19 PROTEIN ENGINE- ERING DESIGN AND SELECTION 299–307 (2006)). No entanto, para ioni- zar diretamente o alto fluxo gerado a partir da separação por SEC são necessárias condições de ionização severas que muitas vezes são incompatíveis com a análise por MS nativa, limitando, assim, a utilida- de do acoplamento dessas tecnologias para a análise de interações não covalentes. Além disso, a sensibilidade do espectrômetro de mas- sa pode sofrer com as altas concentrações de sal usadas em tampões de SEC.

[00100] Além da identificação, a quantificação de heterodímero (ou heterodímeros) formado no produto coformulado também pode gerar desafios, uma vez que a quantidade de heterodímero (ou heterodíme- ros) formado precisa ser avaliada na presença dos monômeros de pro- teína e qualquer homodímero (ou homodímeros) presente.

[00101] Considerando as limitações dos métodos existentes, méto- dos eficazes e eficientes para a identificação e quantificação de espé- cies de dímeros foram desenvolvidos.

[00102] A menos que seja descrito de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo de habili- dade comum na técnica a que esta invenção pertence. Embora quais- quer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento também possam ser usados na prática ou tes- te, métodos e materiais particulares são agora descritos. Todas as pu- blicações mencionadas estão incorporadas ao presente documento a título de referência.

[00103] O termo "um" deve ser entendido como significando "pelo menos um"; e os termos "cerca de" e "aproximadamente" devem ser entendidos para permitir a variação padrão como seria entendido por aqueles versados na técnica; e quando faixas são fornecidas, os pon- tos de extremidade estão incluídos.

[00104] Em algumas modalidades exemplificativas, a divulgação fornece um método para identificar espécies de dímero em uma prepa- ração coformulada.

[00105] Conforme usado no presente documento, uma "preparação coformulada" inclui dois ou mais ingredientes farmacêuticos ativos em uma forma de dosagem única. Essa forma de dosagem pode ser usa- da para tratar, prevenir ou atenuar uma certa condição de doença al- vejando diferentes alvos moleculares e obter uma condição médica geral melhorada do paciente devido a efeitos aditivos e/ou sinérgicos em comparação com o fármaco (ou fármacos) único sozinho (Claudia Mueller, Ulrike Altenburger & Silke Mohl, Challenges for the pharma- ceutical technical development of protein coformulations, 70 JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY 666–674 (2017)). Algumas das van- tagens incluem eficácia aumentada em comparação com um único fármaco, redução geral de evento adverso, melhora de conveniência e adesão do paciente (adesão do paciente aumentada, orientação e educação do paciente simplificadas), redução em custos de cuidados com a saúde (fabricação e compra), processos de abastecimento mais fáceis e novas oportunidades de produto dentro do gerenciamento de ciclo de vida de produtos comercializados existentes.

[00106] Em algumas modalidades exemplificativas, os dois ou mais ingredientes farmacêuticos ativos podem ser proteínas.

[00107] Em algumas modalidades exemplificativas, a preparação coformulada pode compreender pelo menos duas proteínas.

[00108] Em algumas modalidades exemplificativas, a preparação coformulada pode compreender pelo menos três proteínas.

[00109] Conforme usado no presente documento, o termo "proteí- na" inclui qualquer polímero de aminoácido que tenha ligações de amida covalentemente ligadas. As proteínas compreendem uma ou mais cadeias de polímero de aminoácido, de modo geral, conhecidas na técnica como "polipeptídeos". "Polipeptídeo" refere-se a um políme- ro composto por resíduos de aminoácido, variantes estruturas de ocor- rência natural relacionadas e análogos de ocorrência não natural sinté- ticos dos mesmos ligados por meio de ligações de peptídeo, variantes estruturas de ocorrência natural relacionadas e análogos de ocorrência não natural sintéticos das mesmas. "Peptídeos ou polipeptídeos sinté- ticos" refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo de ocorrência não natu- ral. Os peptídeos ou polipeptídeos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, com o uso de um sintetizador de polipeptídeo automati- zado. Vários métodos de síntese de peptídeo de fase sólida são co- nhecidos. Uma proteína pode conter um ou múltiplos polipeptídeos pa- ra formar uma única molécula funcional. Uma proteína pode incluir qualquer uma das proteínas bioterapêuticas, proteínas recombinantes usadas em pesquisa ou terapia, proteínas de captura e outras proteí- nas de fusão Fc de receptor quimérico, proteínas quiméricas, anticor- pos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos huma- nos e anticorpos biespecíficos. Em outro aspecto exemplificativo, uma proteína pode incluir fragmentos de anticorpo, nanocorpos, quimeras de anticorpo recombinante, citocinas, quimiocinas, hormônios peptídi- cos e similares. As proteínas podem ser produzidas com o uso de sis- temas de produção à base de células recombinantes, tal como o sis- tema de baculovírus de inseto, sistemas de levedura (por exemplo, Pichia sp.), sistemas de mamífero (por exemplo, células CHO e deri- vados de CHO como células CHO-K1). Para uma análise que discute proteínas bioterapêuticas e sua produção, consultar Ghaderi et al.,

"Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, im- pact, and challenges of non-human sialylation," (BIOTECHNOL. GE- NET. ENG. REV. 147-175 (2012)). Em algumas modalidades exempli- ficativas, as proteínas compreendem modificações, adutos e outras porções químicas ligadas covalentemente. Essas modificações, adutos e porções químicas incluem, por exemplo, avidina, estreptavidina, bio- tina, glicanos (por exemplo, N-acetilgalactosamina, galactose, ácido neuramínico, N-acetilglicosamina, fucose, manose e outros monossa- carídeos), PEG, poli-histidina, FLAGtag, proteína de ligação a maltose (MBP), proteína de ligação a quitina (CBP), epítopo myc de glutationa- S-transferase (GST), identificações fluorescentes e outros corantes e similares. As proteínas podem ser classificadas com base em compo- sições e solubilidade e pode, assim, incluir proteínas simples, tais co- mo proteínas globulares e proteínas fibrosas; proteínas conjugadas, tais como nucleoproteínas, glicoproteínas, mucoproteínas, cromoprote- ínas, fosfoproteínas, metaloproteínas e lipoproteínas; e proteínas deri- vadas, tais como proteínas derivadas primárias e proteínas derivadas secundárias.

[00110] Em algumas modalidades exemplificativas, a proteína pode ser um anticorpo, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecí- fico, um fragmento de anticorpo, um anticorpo monoclonal ou uma pro- teína de fusão Fc. Em um aspecto, a proteína é uma proteína anti- VEGF. Em um aspecto específico, a proteína VEGF é Aflibercepte.

[00111] O termo "anticorpo", conforme usado no presente docu- mento, inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, assim como mul- tímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada com- preende uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pe-

sada.

A região constante de cadeia pesada compreende três domí- nios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve.

A região constan- te de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser, ainda, subdivididas em regiões de hipervariabilidade, de- nominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), in- tercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regi- ões de framework (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e qua- tro FRs dispostas a partir da terminação amino até a terminação car- bóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades exemplificativas, as FRs do anticorpo anti- big-ET-1 (ou porção de ligação a antígeno do mesmo) podem ser idên- ticas às sequências de linhagem germinativa humanas ou podem ser modificadas natural ou artificialmente.

Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

O termo "anticorpo", conforme usado no pre- sente documento, também inclui fragmentos de ligação a antígeno de moléculas de anticorpo completas.

Os termos "porção de ligação a an- tígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação a antígeno" de um an- ticorpo e similares, conforme usado no presente documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimati- camente obtenível, sintética ou geneticamente modificada que se ligue especificamente a um antígeno para formar um complexo.

Os frag- mentos de ligação a antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas com o uso de quaisquer técnicas padrão, tal como digestão proteolítica ou técnicas de modificação genética recombinantes que envolvem a manipulação e expressão de DNA que codifica domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpo.

Tal DNA é conhecido e/ou está facilmente disponível junto a, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou com o uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma confi- guração adequada, ou introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.

[00112] Conforme usado no presente documento, um "fragmento de anticorpo" inclui uma porção de um anticorpo intacto, tal como, por exemplo, a região de ligação a antígeno ou variável de um anticorpo. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limita- ção, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fc, um fragmento scFv, um fragmento Fv, um diacorpo dsFv, um fragmento dAb, um fragmento Fd’, um fragmento Fd e uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada, assim co- mo triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Os fragmentos Fv são a combinação das re- giões variáveis das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, e as proteínas ScFv são moléculas de polipeptídeo de cadeia única recom- binantes em que regiões variáveis de cadeia leve e pesada de imuno- globulina estão conectadas por um ligante de peptídeo. Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por vários meios. Por exemplo, um fragmento de anticorpo pode ser produzido enzimática ou quimicamen- te por fragmentação de um anticorpo intacto e/ou pode ser produzido recombinantemente a partir de um gene que codifica a sequência de anticorpo parcial. Alternativa ou adicionalmente, um fragmento de anti- corpo pode ser produzido de modo total ou parcialmente sintético. Um fragmento de anticorpo pode, opcionalmente, compreender um frag- mento de anticorpo de cadeia única. Alternativa ou adicionalmente, um fragmento de anticorpo pode compreender múltiplas cadeias que estão ligadas em conjunto, por exemplo, por ligações de dissulfeto. Um fra- gmento de anticorpo pode, opcionalmente, compreender um complexo multimolecular.

[00113] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado no pre- sente documento, não está limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Um anticorpo monoclonal pode ser deri- vado de um único clone, incluindo qualquer clone de eucariótico, pro- cariótico ou de fago, por quaisquer meios disponíveis ou conhecidos na técnica. Os anticorpos monoclonais úteis com a presente divulga- ção podem ser preparados com o uso de uma ampla variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo o uso de hibridoma, recombi- nante e tecnologias de apresentação em fago, ou uma combinação dos mesmos.

[00114] O termo "proteínas de fusão Fc", conforme usado no pre- sente documento, inclui parte ou todas as duas ou mais proteínas, uma das quais é uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não estão fundidas em seu estado natural. A preparação de prote- ínas de fusão que compreendem certos polipeptídeos heterólogos fun- didos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (inclu- indo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL EUA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; e Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", em Current Protocols in Immunology, Supemento 4, páginas 10.19.1-10.19.11, 1992. "Proteínas de fusão Fc de receptor" compreendem um ou mais dentre um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma porção química Fc, que, em algumas modalidades, compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalida- des, a proteína de fusão Fc contém duas ou mais cadeias de receptor distintas que se ligam a um único ou mais de um ligante. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma captura, tal como, por exemplo, uma IL-1 de captura (por exemplo, Rilonacepte, que contém a região de ligação a ligante RAcP de IL-1 fundida à região extracelular de IL-1R1 fundida a Fc de hIgG1; consultar a Patente nº U.S. 6.927.004, que está incorporada ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade), ou uma captura de VEGF (por exemplo, Aflibercepte, que con- tém o domínio de Ig 2 do receptor de VEGF Flt1 fundido ao domínio de Ig 3 do receptor de VEGF Flk1 fundido a Fc de hIgG1; por exemplo, SEQ ID NO:1; consultar as Patentes nº U.S. 7.087.411 e 7.279.159, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[00115] Em algumas modalidades exemplificativas, a preparação coformulada pode compreender espécies de dímero. Em um aspecto, a preparação coformulada pode compreender espécies de homodíme- ro. Em algumas outras modalidades exemplificativas específicas, a preparação coformulada pode compreender espécies de heterodíme- ro. Em outro aspecto, a preparação coformulada pode compreender espécies de homodímero e espécies de heterodímero.

[00116] Em algumas modalidades exemplificativas, a preparação coformulada pode compreender espécies de dímero, como uma impu- reza.

[00117] Conforme usado no presente documento, o termo "impure- za" pode incluir qualquer proteína indesejável presente no produto bio- farmacêutico de proteína. A impureza pode incluir impurezas relacio- nadas a processo e produto. A impureza pode ser, ainda, de estrutura conhecida, parcialmente caracterizada ou não identificada. As impure- zas relacionadas a processo podem ser derivadas do processo de fa- bricação e podem incluir as três categorias principais: derivadas de substrato celular, derivadas de cultura celular e derivadas a jusante.

As impurezas derivadas de substrato celular incluem, porém sem limi- tação, proteínas derivadas do organismo hospedeiro e ácido nucleico (DNA genômico, vetor ou total da célula hospedeira). As impurezas derivadas de cultura celular incluem, porém sem limitação, indutores, antibióticos, soro e outros componentes de meio. As impurezas deri- vadas a jusante incluem, porém sem limitação, enzimas, reagentes de processamento químico e bioquímico (por exemplo, brometo de ciano- gênio, guanidina, agentes oxidantes e redutores), sais inorgânicos (por exemplo, íon de metais pesados, arsênico, não metálico), solventes, carreadores, ligantes (por exemplo, anticorpos monoclonais) e outros produtos lixiviáveis. As impurezas relacionadas a produto (por exem- plo, precursores, certos produtos de degradação) podem ser variantes moleculares que surgem durante a fabricação e/ou armazenamento que não têm propriedades comparáveis àquelas do produto desejado em relação à atividade, à eficácia e à segurança. Tais variantes podem precisar de esforço considerável em isolamento e caracterização a fim de identificar o tipo de modificação (ou modificações). As impurezas relacionadas a produto podem incluir formas truncadas, formas modifi- cadas e agregados. As formas truncadas são formadas por enzimas hidrolíticas ou produtos químicos que catalisam a clivagem de ligações de peptídeo. As formas modificadas incluem, porém sem limitação, formas conjugadas desamidadas; isomerizadas, ligadas a S-S com mal pareamento, oxidadas ou alteradas (por exemplo, glicosilação, fosforilação). As formas modificadas podem também incluir qualquer forma de modificação pós-traducional. Os agregados incluem dímeros e múltiplos mais altos do produto desejado. (Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH agosto de 1999, EUA Dept. of Health and Humans Ser- vices).

[00118] Conforme usado no presente documento, o termo geral

"modificações pós-traducionais" ou "PTMs" refere-se a modificações covalentes pelas quais polipeptídeos passam, durante (modificação cotraducional) ou após (modificação pós-traducional) sua síntese ri- bossômica.

PTMs são, de modo geral, introduzidas por enzimas espe- cíficas ou caminhos específicos.

Muitas ocorrem no sítio de uma se- quência de proteína característica específica (sequência de assinatu- ra) dentro da cadeia principal de proteína.

Diversas centenas de PTMs foram registradas, e essas modificações influenciam invariavelmente algum aspecto de uma estrutura ou função da proteína (Walsh, G. "Proteins" (2014) segunda edição, publicada por Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853). As várias modificações pós-traducionais in- cluem, porém sem limitação, clivagem, extensões N-terminais, degra- dação de proteína, acilação da terminação N, biotinilação (acilação de resíduos de lisina com uma biotina), amidação da terminação C, glico- silação, iodinação, ligação covalente de grupos protéticos, acetilação (a adição de um grupo acetila, usualmente na terminação N da proteí- na), alquilação (a adição de um grupo alquila (por exemplo, metila, eti- la, propila) usualmente em resíduos de lisina ou arginina), metilação, adenilação, ADP-ribosilação, ligações cruzadas covalentes dentro ou entre cadeias de polipeptídeo, sulfonação, prenilação, modificações dependentes de Vitamina C (hidroxilações de prolina e lisina e amida- ção de terminação carbóxi), modificação dependente de Vitamina K, em que a Vitamina K é um cofator na carboxilação de resíduos de áci- do glutâmico que resulta na formação de um γ-carboxiglutamato (um resíduo glu), glutamilação (ligação covalente de resíduos de ácido glu- tâmico), glicilação (resíduos de glicina de ligação covalente), glicosila- ção (adição de um grupo glicosila a asparagina, hidroxilisina, serina ou treonina, que resulta em uma glicoproteína), isoprenilação (adição de um grupo isoprenoide, tal como farnesol e geranilgeraniol), lipoilação (ligação de uma funcionalidade de lipoato), fosfopanteteinilação (adi-

ção de uma porção química 4′-fosfopanteteinila de coenzima A, como em ácido graxo, policetídeo, peptídeo não ribossômico e biossíntese de leucina), fosforilação (adição de um grupo fosfato, usualmente a serina, tirosina, treonina ou histidina) e sulfatação (adição de um grupo sulfato, usualmente a um resíduo de tirosina). As modificações pós- traducionais que alteram a natureza química de aminoácidos incluem, porém sem limitação, citrulinação (a conversão de arginina em citrulina por deiminação) e desamidação (a conversão de glutamina em ácido glutâmico ou asparagina em ácido aspártico). As modificações pós- traducionais que envolvem alterações estruturais incluem, porém sem limitação, formação de pontes de dissulfeto (ligação covalente de dois aminoácidos cisteína) e clivagem proteolítica (clivagem de uma proteí- na em uma ligação de peptídeo). Certas modificações pós-traducionais envolvem a adição de outras proteínas ou peptídeos, tal como ISGui- lação (ligação covalente à proteína ISG15 (Gene Estimulado por Inter- feron)), SUMOilação (ligação covalente à proteína SUMO (Modificador pequeno relacionado à Ubiquitina)) e ubiquitinação (ligação covalente à proteína ubiquitina). Consultar European Bioinformatics Institute Pro- tein Information ResourceSIB Swiss Institute of Bioinformatics, EURO- PEAN BIOINFORMATICS INSTITUTE DRS - DROSOMYCIN PRECURSOR - DRO- SOPHILA MELANOGASTER (FRUIT FLY) - DRS GENE & PROTEIN, http://www.uniprot.org/docs/ptmlist (último acesso em 15 de janeiro de 2019) para um vocabulário controlado mais detalhado de PTMs cura- das por UniProt.

[00119] Em algumas modalidades exemplificativas, espécies de dí- mero podem ser identificadas colocando-se uma amostra incluindo a espécie de dímero em contato com um sistema cromatográfico.

[00120] Conforme usado no presente documento, o termo "croma- tografia" refere-se a um processo em que uma mistura química porta- da por um líquido ou gás pode ser separada em componentes como resultado distribuição diferencial das entidades químicas conforme flu- em em torno ou sobre uma fase líquida ou sólida estacionária. Os exemplos não limitantes de cromatografia incluem cromatografia de fase reversa (RP), cromatografia de troca iônica (IEX), cromatografia de modo misto e cromatografia de fase normal (NP).

[00121] Conforme usado no presente documento, o termo "Croma- tografia de Modo Misto (MMC)" ou "cromatografia multimodal" inclui um método cromatográfico em que solutos interagem com a fase esta- cionária através de mais de um modo ou mecanismo de interação. A MMC pode ser usada como uma ferramenta alternativa ou comple- mentar à cromatografia de fase reversa tradicional (RP), cromatografia de troca iônica (IEX) e cromatografia de fase normal (NP). Diferente da cromatografia de RP, NP e IEX, em que interação hidrofóbica, intera- ção hidrofílica e interação iônica, respectivamente, são os modos de interação dominantes, a cromatografia de modo misto pode usar uma combinação de dois ou mais desses modos de interação. O meio de cromatografia de modo misto pode fornecer seletividade exclusiva que não pode ser reproduzida por cromatografia de modo único. A croma- tografia de modo misto pode também fornecer economias de custo po- tenciais e flexibilidade de operação em comparação com os métodos baseados em afinidade.

[00122] Em algumas modalidades exemplificativas, a cromatografia pode ser cromatografia por exclusão de tamanho.

[00123] Conforme usado no presente documento, os termos "resina de cromatografia SEC" ou "meio de cromatografia SEC" são usados de forma intercambiável e podem incluir qualquer tipo de fase sólida usada em SEC que separe a impureza do produto desejado (por exemplo, um contaminante de homodímero para um produto de anti- corpo biespecífico). O volume da resina, o comprimento e o diâmetro da coluna a ser usada assim como a capacidade dinâmica e a taxa de fluxo podem depender em diversos parâmetros, tal como o volume de fluido a ser tratado, a concentração de proteína no fluido a ser subme- tido ao processo.

[00124] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para identificar espécies de dímero pode compreender colocar uma amostra incluindo o produto biofarmacêutico de proteína em contato com um sistema cromatográfico com o uso de uma fase móvel para fornecer um eluente incluindo a espécie de dímero; e identificar a proteína no dito eluente com o uso de um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão.

[00125] Conforme usado no presente documento, o termo "espec- trômetro de massa" inclui um dispositivo que pode identificar espécies moleculares específicas e medir suas massas exatas. O termo desti- na-se a incluir qualquer detector molecular em que um polipeptídeo ou peptídeo pode ser eluído para detecção e/ou caracterização. Um es- pectrômetro de massa pode incluir três partes principais: a fonte de íons, o analisador de massa e o detector. O papel da fonte de íons é criar íons de fase gasosa. Átomos de analito, moléculas ou aglomera- ções podem ser transferidos para a fase gasosa e ionizados concomi- tantemente (como em ionização por eletroaspersão). A escolha da fon- te de íons depende fortemente da aplicação.

[00126] Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa pode ser um espectrômetro de massa por eletroaspersão.

[00127] Conforme usado no presente documento, o termo "ioniza- ção por eletroaspersão" ou "ESI" refere-se ao processo de ionização por aspersão em que cátions ou ânions em solução são transferidos para a fase gasosa por meio de formação e dessolvatação à pressão atmosférica de uma corrente de gotículas altamente carregadas que resulta de aplicar uma diferença de potencial entre a ponta da agulha de eletroaspersão contendo a solução e um contraeletrodo. Há, de modo geral, três etapas principais na produção de íons de fase gasosa a partir de íons de eletrólito em solução. Há: (a) produção de gotículas carregadas na ponta de infusão de ES; (b) encolhimento de gotículas carregadas por evaporação de solvente e desintegrações de gotículas repetidas que levam a pequenas gotículas altamente carregadas que podem produzir íons de fase gasosa; e (c) o mecanismo pelo qual os íons de fase gasosa são produzidos a partir de gotículas muito peque- nas e altamente carregadas. Os estágios (a)–(c), de modo geral, ocor- rem na região de pressão atmosférica do aparelho.

[00128] Conforme usado no presente documento, o termo "configu- ração de infusão por eletroaspersão" refere-se a um sistema de ioni- zação por eletroaspersão que é compatível com um espectrômetro de massa usado para análise de massa de proteína. Em ionização por eletroaspersão, uma agulha de eletroaspersão tem seu orifício posici- onado próximo ao orifício de entrada de um espectrômetro. Uma amostra, contendo a proteína de interesse, pode ser bombeada atra- vés da agulha de seringa. Um potencial elétrico entre o orifício de agu- lha de seringa e um orifício que leva ao analisador de massa forma uma aspersão ("eletroaspersão") da solução. O eletroaspersão pode ser executado à pressão atmosférica e fornece gotículas altamente carregadas da solução. A configuração de infusão por eletroaspersão pode incluir um emissor de eletroaspersão, gás de nebulização e/ou uma fonte de alimentação de ESI. A configuração pode ser opcional- mente automatizada para executar aspiração de amostra, dispensação de amostra, entrega de amostra e/ou para aspergir a amostra.

[00129] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroaspersão.

[00130] O termo "nanoeletroaspersão" ou "nanoaspersão", confor- me usado no presente documento, refere-se à ionização por eletroas-

persão a uma taxa de fluxo de solvente muito baixa, tipicamente cen- tenas de nanolitros por minuto de solução de amostra ou menos, fre- quentemente sem o uso de uma entrega de solvente externa. A confi- guração de infusão por eletroaspersão que forma uma nanoeletroas- persão pode usar um emissor de nanoeletroaspersão estático ou um emissor de nanoeletroaspersão dinâmico. Um emissor de nanoeletro- aspersão estático realiza uma análise contínua de volumes de solução de amostra (analito) pequenos durante um período de tempo prolon- gado. Um emissor de nanoeletroaspersão dinâmico usa uma coluna capilar e um sistema de entrega de solvente para realizar separações cromatográficas em misturas antes da análise pelo espectrômetro de massa.

[00131] Conforme usado no presente documento, o termo "analisa- dor de massa" inclui um dispositivo que pode separar espécies, ou se- ja, átomos, moléculas ou aglomerações, de acordo com sua massa. Os exemplos não limitantes de analisadores de massa que poderiam ser usados para sequenciamento rápido de proteína são tempo de voo (TOF), setor magnético/elétrico, filtro de massa de quadrupolo (Q), captura de íons de quadrupolo (QIT), orbitrap, ressonância de cíclotron de íons de transformada de Fourier (FTICR) e também a técnica de espectrometria de massa de acelerador (AMS).

[00132] Em algumas modalidades exemplificativas, a espectrome- tria de massa pode ser realizada sob condições nativas.

[00133] Conforme usado no presente documento, o termo "condi- ções nativas" ou "MS nativa" ou "ESI-MS nativa" pode incluir uma es- pectrometria de massa de desempenho sob condições que preservam as interações não covalentes em um analito. Para análise detalhada sobre MS nativa, faz-se referência à análise: Elisabetta Boeri Erba & Carlo Petosa, The emerging role of native mass spectrometry in cha- racterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes,

24 PROTEIN SCIENCE1176–1192 (2015). Algumas das distinções entre ESI nativa e ESI regular são ilustradas na tabela 1 (Hao Zhang et al., Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein comple- xes, 587 FEBS Letters 1012–1020 (2013)). TABELA 1. ESI Nativa ESI Regular Solução de Solução aquosa Solução orgânica parcial Amostra água, acetato de amônio água, ácido fórmico, ace- tonitrila/Metanol (pH 1-2) Condição 10-50 nl/min 10-50 nl/min de Asper- Voltagem de aspersão Voltagem de aspersão são 0,8-1,5 kV 0,8-1,5 kV Temperaturas 20-30 °C Temperaturas 20-30 °C Tratamento Dessalinização Offline Dessalinização Onli- por sal ne/Offline com RP-HPLC Concentra- 1-10 µM (complexo) <1 µM (subunidade) ções de Proteína Informações Peso molecular de com- Peso molecular de uma de saída plexo e subunidade de única subunidade proteína Interações não covalentes Estequiometria Estrutura

[00134] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa pode ser um espectrômetro de massa em tandem.

[00135] Conforme usado no presente documento, o termo "espec- trometria de massa em tandem" inclui uma técnica em que informa- ções estruturas sobre moléculas da amostra são obtidas com o uso de múltiplos estágios de seleção de massa e separação de massa. Um pré-requisito é que as moléculas da amostra possam ser transferidas para fase gasosa e ionizadas intactas e que possam ser induzidas a se desfazerem de alguma forma previsível e controlável após a primei-

ra etapa de seleção de massa. MS/MS multiestágio, ou MSn, pode ser realizada primeiramente selecionando-se e isolando-se um íon precur- sor (MS2), fragmentando-se o mesmo, isolando-se um íon de fragmen- to principal (MS3), fragmentando-se o mesmo, isolando-se um frag- mento secundário (MS4) e assim por diante contanto que possam ser obtidas informações significativas ou o sinal de íon de fragmento seja detectável. MS em tandem pode ser realizada com sucesso com uma ampla variedade de combinações de analisador. Quais analisadores combinar para uma certa aplicação é determinado por muitos fatores diferentes, tal como sensibilidade, seletividade e velocidade, mas tam- bém tamanho, custo e disponibilidade. As duas categorias principais de métodos de MS em tandem são tandem em espaço e tandem em tempo, mas há também híbridos em que analisadores em tandem em tempo são acoplados em espaço ou com analisadores em tandem em espaço. Um espectrômetro de massa em tandem em espaço compre- ende uma fonte de íons, um dispositivo de ativação de precursor e pe- lo menos dois analisadores de massa sem captura. As funções de se- paração m/z específicas podem ser projetadas de modo que em uma seção do instrumento íons sejam selecionados, dissociados em uma região intermediária, e os íons de produto sejam, então, transmitidos para outro analisador para separação m/z e aquisição de dados. Em espectrômetro de massa em tandem em tempo, os íons produzidos na fonte de íons podem ser capturados, isolados, fragmentados e sepa- rados m/z no mesmo dispositivo físico.

[00136] Os peptídeos identificados pelo espectrômetro de massa podem ser usados como representativos substitutos da proteína intac- ta e suas modificações pós-traducionais. Podem ser usados para ca- racterização de proteína correlacionando-se dados de MS/MS experi- mentais e teóricos, os últimos gerados a partir de peptídeos possíveis em um banco de dados de sequências de proteínas. A caracterização pode incluir, porém sem limitação, sequenciar aminoácidos dos frag- mentos de proteína, determinar o sequenciamento de proteína, deter- minar o sequenciamento de novo de proteína, localizar modificações pós-traducionais ou identificar modificações pós-traducionais ou análi- se de comparabilidade ou combinações dos mesmos.

[00137] Conforme usado no presente documento, o termo "banco de dados" refere-se a ferramentas de bioinformática que fornecem a possibilidade de buscar nos espectros de MS-MS não interpretados todas as sequências possíveis no banco (ou bancos) de dados. Os exemplos não limitantes de tais ferramentas são Mascot (http://www.matrixscience.com), Spectrum Mill (http://www.chem.agilent.com), PLGS (http://www.waters.com), PEAKS (http://www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx (http://www.phenyx-ms.com), Sorcerer (http://www.sagenresearch.com), OMSSA (http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem (http://www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (http://www. http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (https://www.proteinmetrics.com/products/byonic) ou Sequest (http://fields.scripps.edu/sequest).

[00138] Em algumas modalidades exemplificativas, a divulgação fornece um método para quantificar uma espécie de heterodímero.

[00139] Em algumas modalidades, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma pri- meira proteína e uma segunda proteína pode compreender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida. O anticorpo específico para a primeira proteína pode ser prepa- rado com o uso de qualquer um dos métodos conhecidos na literatura.

[00140] Conforme usado no presente documento, o termo "superfí-

cie sólida" pode incluir qualquer superfície com capacidade para se ligar a um anticorpo de interesse. Em algumas modalidades para uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda prote- ína, o anticorpo de interesse pode ser um anticorpo específico para a primeira proteína. Os exemplos não limitantes de superfície sólida po- dem incluir resinas de afinidade, microesferas magnéticas e placas revestidas com uma resina imobilizada, tal como, avidina, estreptavidi- na ou NeutrAvidin.

[00141] Em algumas modalidades, o método para quantificar uma espécie de heterodímero pode compreender imunoprecipitar as espé- cies de heterodímero. A imunoprecipitação pode ser realizada com o uso de um anticorpo imobilizado em uma superfície sólida, em que o anticorpo pode se ligar a um dentre muitos ingredientes farmacêuticos ativos na preparação coformulada e em que os ingredientes farmacêu- ticos ativos podem ser proteínas.

[00142] Em algumas modalidades, a amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode ser incubada com um anticorpo imobilizado específico para a primeira proteína em uma su- perfície sólida. O tempo de incubação pode variar de vários minutos a várias horas.

[00143] Em algumas modalidades, a amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína incubada com um anticorpo imobilizado específico para a primeira proteína em uma superfície sóli- da pode passar por pull down.

[00144] Em algumas modalidades, a amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína incubada com um anticorpo imobilizado específico para a primeira proteína em uma superfície sóli- da pode ser centrifugada. Em algumas modalidades específicas, a centrifugação pode produzir uma amostra precipitada e um fluxo pas- sante ou sobrenadante.

[00145] Em algumas modalidades, a amostra precipitada e o fluxo passante podem ser reduzidos com o uso de um agente redutor.

[00146] Conforme usado no presente documento, o termo "reduzir" refere-se à redução de pontes de dissulfeto em uma proteína. Os exemplos não limitantes dos agentes redutores usados para reduzir a proteína são ditiotreitol (DTT), ß-mercaptoetanol, reagente de Ellman, cloridrato de hidroxilamina, cianoboroidreto de sódio, cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP-HCl) ou combinações dos mesmos.

[00147] Em algumas modalidades, a amostra precipitada e/ou o flu- xo passante podem ser tratados com o uso de um composto ou com- postos. Em algumas modalidades específicas, o tratamento pode in- cluir alquilação. Em algumas outras modalidades exemplificativas es- pecíficas, o tratamento pode incluir alquilação de grupo sulfidrila em uma proteína.

[00148] Conforme usado no presente documento, o termo "tratar" ou "marcar isotipicamente" pode se referir a marcação química de uma proteína. Os exemplos não selecionados dos métodos para marcação química de uma proteína incluem etiquetas isobáricas para quantifica- ção relativa e absoluta (iTRAQ) com o uso de reagentes, tal como 4- plex ,6-plex e 8-plex; demetilação redutiva de aminas, carbamilação de 18 aminas, marcação com O na terminação C da proteína ou qualquer grupo amina ou sulfidrila da proteína para marcar aminas ou grupo sul- fidrila.

[00149] Em algumas modalidades, a amostra precipitada e/ou o flu- xo passante podem ser tratados com o uso de dois compostos distin- tos, em que os dois compostos são isótopos.

[00150] Em algumas modalidades, a amostra precipitada e pelo menos uma porção do fluxo passante podem ser misturadas após tra- tar e marcar isotopicamente os mesmos.

[00151] Em algumas modalidades, a mistura da amostra precipitada tratada ou marcada isotopicamente e pelo menos uma porção do fluxo passante tratado ou marcado isotopicamente pode ser digerida.

[00152] Conforme usado no presente documento, o termo "diges- tão" refere-se à hidrólise de uma ou mais ligações de peptídeo de uma proteína. Há diversas abordagens para executar a digestão de uma proteína em uma amostra com o uso de um agente hidrolisante ade- quado, por exemplo, digestão enzimática ou digestão não enzimática.

[00153] Conforme usado no presente documento, o termo "agente hidrolisante" refere-se a qualquer um ou combinação de um grande número de agentes diferentes que podem realizar digestão de uma proteína. Os exemplos não limitantes de agentes hidrolisantes que po- dem executar digestão enzimática incluem tripsina, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Glu-C, protease de membrana externa T (OmpT), enzima degradadora de imunoglobulina de Streptococcus pyogenes (IdeS), quimotripsina, pepsina, termolina, papaína, pronase e protease de Aspergillus Saitoi. Os exemplos não limitantes de agentes hidrolisantes que podem executar digestão não enzimática incluem o uso de alta temperatura, micro-ondas, ultrassom, alta pressão, infravermelho, solventes (os exemplos não limitantes são etanol e acetonitrila), digestão por enzima imobilizada (IMER), enzimas imobilizadas em partícula magnética e enzimas imobilizadas em chip. Para uma análise recente que discute as técnicas disponíveis para di- gestão de proteína, consultar Switazar et al., "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (J. Proteome Research 2013, 12, 1067-1077). Um ou uma combinação de agentes hidrolisantes pode clivar ligações de peptídeo em uma proteí- na ou polipeptídeo, de uma maneira específica para sequência, geran- do uma coleção previsível de peptídeos mais curtos.

[00154] Em algumas modalidades, na digestão da mistura da amos- tra precipitada tratada ou marcada isotopicamente e pelo menos uma porção do fluxo passante tratado ou marcado isotopicamente pode ser analisada com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um es- pectrômetro de massa. Uma tal modalidade exemplificativa é repre- sentada na Figura 2. A Figura 2 mostra uma modalidade exemplificati- va para um método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína – mAb1 e uma segunda proteína – proteína de fusão 1 em uma preparação coformu- lada, em que o dito método compreende imobilizar um anticorpo espe- cífico para a primeira proteína (anticorpo anti-mAb1) em uma superfí- cie sólida, incubar a amostra com o dito anticorpo, capturar uma amos- tra precipitada por pull down do heterodímero de mAb1 e proteína de fusão 1, monômero de mAb1 e dímero de mAb1, coletar um fluxo pas- sante que compreende monômero de proteína de fusão 1 e dímero de proteína de fusão 1, tratar a amostra precipitada com um primeiro composto – iodoacetamida não marcada (IAA), tratar o fluxo passante com um segundo composto – iodoacetamida marcada (IAA), misturar a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante trata- do para formar uma mistura, digerir a dita mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar a espécie de heterodímero na amostra. Du- rante a quantificação das espécies de heterodímero com o uso de uma modalidade exemplificativa, a ligação não específica da segunda pro- teína na incubação da amostra com o dito anticorpo. Tal ligação não específica poderia levar à superestimação da quantidade do heterodí- mero. Portanto, uma amostra negativa pode ser preparada e a quanti- dade da segunda proteína ligada não especificamente pode ser obtida. Um exemplo de tal possibilidade é mostrado na Figura 3.

[00155] Em algumas modalidades exemplificativas, a amostra nega- tiva pode compreender monômeros e homodímeros de uma primeira proteína e uma segunda proteína, sem a presença de uma espécie de heterodímero.

[00156] A Figura 3 mostra uma modalidade exemplificativa para preparar uma amostra negativa. A mesma compreender usar uma amostra que compreende monômeros e homodímeros de uma primei- ra proteína (mAb1) e uma segunda proteína (proteína de fusão 1). Es- sa quantidade de segunda proteína ligada não especificamente ao an- ticorpo pode ser quantificada com o uso de um método que compre- ende imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína (anti- corpo anti-mAb1) em uma superfície sólida, incubar a amostra com o dito anticorpo, capturar uma amostra precipitada por pull down da pro- teína de fusão 1 ligada não especificamente, monômero de mAb1 e dímero de mAb1, coletar um fluxo passante que compreende monô- mero e dímero de proteína de fusão 1, tratar a amostra precipitada com um primeiro composto – iodoacetamida não marcada (IAA), tratar o fluxo passante com um segundo composto – iodoacetamida marca- da (IAA), misturar a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante tratado para formar uma mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar as espécies de heterodímero na amostra.

MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS

[00157] As modalidades divulgadas no presente documento forne- cem métodos e sistema para a identificação e/ou quantificação de es- pécies de dímero.

[00158] Em algumas modalidades exemplificativas, esta divulgação fornece um método para identificação de uma espécie de dímero que compreende colocar uma amostra incluindo a espécie de dímero em contato com um sistema cromatográfico com uma resina de cromato- grafia, lavar a dita resina com o uso de uma fase móvel para fornecer um eluente incluindo a espécie de dímero e identificar as espécies de dímero no dito eluente com o uso de um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão.

[00159] Em algumas modalidades exemplificativas, a espécie de dímero pode ser uma espécie de homodímero.

[00160] Em algumas modalidades exemplificativas, a espécie de dímero pode ser uma espécie de heterodímero.

[00161] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode incluir cromatográfica de fase reversa tradicional (RP), cromatografia de troca iônica (IEX) ou cromatografia de fase normal (NP).

[00162] Em algumas modalidades exemplificativas, a resina croma- tográfica pode ser selecionada dentre resina de cromatografia por afi- nidade, resina de troca de ânions, resina de troca de cátions, resina de afinidade, resina de cromatografia de modo misto, resina de cromato- grafia por interação hidrofóbica ou resina de cromatografia por exclu- são de tamanho. Em uma modalidade exemplificativa específica, a re- sina cromatográfica pode ser resina de cromatografia por exclusão de tamanho.

[00163] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroaspersão.

[00164] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser acoplado online a um sistema cromatográfico com uma resina de cromatografia.

[00165] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser executado sob condições nativas.

[00166] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode ser acoplado ao espectrômetro de massa de ioniza- ção por eletroaspersão com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos.

[00167] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode ser acoplado a um detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos.

[00168] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode ser acoplado ao espectrômetro de massa de ioniza- ção por eletroaspersão e um detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos.

[00169] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode ser acoplado a um espectrômetro de massa de ioni- zação por eletroaspersão e um detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos, em que o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão é um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroaspersão.

[00170] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode ser acoplado a um espectrômetro de massa de ioni- zação por eletroaspersão e um detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos, em que o espectrômetro de massa pode ser espectrômetro de massa de ionização por eletroas- persão operando sob condições nativas.

[00171] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema cro- matográfico pode ser acoplado a um espectrômetro de massa de ioni- zação por eletroaspersão e um detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos, em que o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroaspersão sob condições nativas.

[00172] Em algumas modalidades exemplificativas, o eluente inclu- indo a proteína ou complexo de antígeno-anticorpo ou conjugado de anticorpo-fármaco da lavagem da resina pode ser introduzido em um detector de ultravioleta através de pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos a uma taxa de fluxo de cerca de 0,2 ml/min a cerca de 0,4 ml/min.

[00173] Em algumas modalidades exemplificativas, a fase móvel para lavagem pode ter uma taxa de fluxo de cerca de 0,2 ml/min a cer- ca de 0,4 ml/min.

[00174] Em algumas modalidades exemplificativas, a fase móvel pode compreender um sal volátil. Em algumas modalidades específi- cas, a fase móvel pode compreender acetato de amônio, bicarbonato de amônio ou formato de amônio ou combinações dos mesmos.

[00175] Em algumas modalidades exemplificativas, a fase móvel pode ser compatível com o espectrômetro de massa.

[00176] Em algumas modalidades exemplificativas, a amostra pode compreender cerca de 10 µg a cerca de 100 µg da espécie de dímero.

[00177] Em algumas modalidades exemplificativas, a taxa de fluxo no espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser cerca de 10 nl/min a cerca de 50 nl/min.

[00178] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ter uma voltagem de aspersão de cerca de 0,8 kV a cerca de 1,5 kV.

[00179] Em algumas modalidades exemplificativas, a identificação pode incluir sequenciamento de proteína, sequenciamento de novo de proteína, identificar modificações pós-traducionais ou análise de com- parabilidade ou combinações dos mesmos.

[00180] Em algumas modalidades exemplificativas, a amostra pode também compreender monômero de proteínas.

[00181] Em algumas modalidades exemplificativas, o dímero pode compreender uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que a primeira proteína e a segunda proteína podem ser um anticorpo te- rapêutico, um anticorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo poli- clonal, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo, uma pro- teína de fusão ou combinações dos mesmos. Em um aspecto, o frag-

mento de anticorpo pode incluir um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2, um fragmento scFv, um fragmento Fv, um diacorpo dsFv, um fragmento dAb, um fragmento Fd’, um fragmento Fd e uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada, triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de frag- mentos de anticorpo.

[00182] Em algumas modalidades exemplificativas, a espécie de dímero pode ser uma impureza relacionada a produto presente em uma preparação coformulada.

[00183] Em algumas modalidades exemplificativas, o dímero pode compreender uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que a primeira proteína e a segunda proteína podem ter um pI na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 9,0. Em um aspecto, a proteína pode ter um pI de cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1 cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6.6, cerca de 6.7, cerca de 6.8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1 cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1 cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9 ou cerca de 9,0.

[00184] Entende-se que os métodos não são limitados a qualquer um dentre a proteína, impureza e coluna mencionadas anteriormente e que os métodos para identificar ou quantificar podem ser conduzidos por quaisquer meios adequados.

[00185] Em algumas modalidades exemplificativas, esta divulgação fornece um sistema que compreende uma coluna cromatográfica 100 que tem uma resina de cromatografia, em que a coluna cromatográfica pode receber uma fase móvel e uma amostra incluindo uma proteína e um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110 (Consultar a Figura 1).

[00186] Em algumas modalidades exemplificativas, a coluna croma- tográfica 100 pode ter uma resina selecionada dentre resina de croma- tografia por interação hidrofóbica, resina de troca de ânions, resina de troca de ânions, resina de cromatografia por afinidade, resina de cro- matografia por exclusão de tamanho, uma resina de modo misto ou combinações das mesmas.

[00187] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110 pode ser acoplado à dita coluna cromatográfica 100.

[00188] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110 pode ser executado sob condições nativas.

[00189] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110 pode ser um espectrô- metro de massa de ionização por nanoeletroaspersão.

[00190] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110 pode ser um espectrô- metro de massa de ionização por nanoeletroaspersão executado sob condições nativas.

[00191] Em algumas modalidades exemplificativas, a coluna croma- tográfica 100 pode ser acoplada ao espectrômetro de massa de ioni- zação por eletroaspersão 100 com o uso de um divisor com pelo me- nos três caminhos 120.

[00192] Em algumas modalidades exemplificativas, a coluna croma- tográfica 100 pode ser acoplada a um detector de ultravioleta 130 com o uso de a divisor com pelo menos três caminhos 120.

[00193] Em algumas modalidades exemplificativas, a coluna croma- tográfica 100 pode ser acoplada a um detector de ultravioleta 130 e o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110 com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos 120.

[00194] Em algumas modalidades exemplificativas, o divisor de três vias 120 pode ser dividido desproporcionalmente para permitir um flu- xo da coluna cromatográfica 100 para um detector de ultravioleta 130 e o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão 110.

[00195] Em algumas modalidades exemplificativas, o sistema pode identificar uma espécie de dímero.

[00196] Uma modalidade exemplificativa do sistema é exibida na Figura 1. Um divisor com pelo menos três caminhos pós-coluna é usa- do para possibilitar detecção dupla por UV/MS. A fração de volume baixa pode ser direcionada ao MS enquanto a fração de volume alta é transferida para o detector de UV. A detecção compartilha quase os mesmos tempos de retenção. As frações do detector de UV podem ser coletadas para recuperação de amostra.

[00197] Entende-se que o sistema não é limitado a qualquer um dentre a proteína, coluna de cromatografia, espectrômetro de massa, conjugado de anticorpo-fármaco, complexo de antígeno-anticorpo mencionados anteriormente.

[00198] Esta divulgação, pelo menos em parte, fornece um método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que o dito método compreende imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, incubar a amostra com o dito anticorpo , capturar uma amostra precipitada, coletar um fluxo passante, tratar a amostra precipitada com um primeiro composto, tra- tar o fluxo passante com um segundo composto, misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo passante trata- do para formar uma mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar as espécies de heterodímero na amostra.

[00199] Em algumas modalidades exemplificativas, a primeira pro- teína pode ser um anticorpo, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico, um fragmento de anticorpo, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo monoclonal de proteína de fusão Fc. Em algumas modalidades exemplificativas, a primeira proteína pode ser um anti- corpo monoclonal.

[00200] Em algumas modalidades exemplificativas, a segunda pro- teína pode ser um anticorpo, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico, um fragmento de anticorpo, um anticorpo monoclonal ou uma proteína de fusão Fc. Em algumas modalidades exemplificati- vas, a primeira proteína pode ser uma proteína de fusão Fc.

[00201] Em algumas modalidades, a amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender, ainda, espécies selecionadas dentre espécies de homodímero de primeira proteína, espécies de homodímero de primeira proteína, espécies de heterodímero de primeira proteína e segunda proteína ou combina- ções das mesmas.

[00202] Em algumas modalidades, a amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compreender, ainda, pelo menos uma ou mais proteínas.

[00203] Em algumas modalidades, a superfície sólida pode ser se- lecionada dentre resinas de afinidade, microesferas magnéticas e pla- cas revestidas. Os exemplos não limitantes de resinas de afinidade incluem microesferas de agarose de proteína A, microesferas de aga- rose de proteína G, microesferas de sefarose de proteína A e microes- feras de sefarose de proteína G.

[00204] Em algumas modalidades, as microesferas magnéticas po- dem ter uma monocamada de estreptavidina recombinante covalente- mente acoplada à superfície.

[00205] Em algumas modalidades, o anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, e a amostra pode ser in- cubada por vários minutos a várias horas.

[00206] Em algumas modalidades, a amostra precipitada pode ser obtida por centrifugação. Em algumas modalidades específicas, o fluxo passante pode ser obtido coletando-se o sobrenadante.

[00207] Em algumas modalidades, a amostra precipitada pode ser ressuspensa aquecendo-se a amostra precipitada ressuspensa.

[00208] Em algumas modalidades, a amostra precipitada pode ser ressuspensa aquecendo-se a amostra precipitada ressuspensa.

[00209] Em algumas modalidades, a amostra precipitada pode pas- sar por eluição.

[00210] Em algumas modalidades, a amostra precipitada e o fluxo passante podem ser reduzidos com o uso de um agente redutor. Em algumas modalidades específicas, o agente redutor pode ser ditiotrei- tol.

[00211] Em algumas modalidades, o tratamento pode incluir alqui- lação.

[00212] Em algumas modalidades, o primeiro composto e o segun- do composto podem ser isótopos.

[00213] Em algumas modalidades exemplificativas, a pelo menos uma porção do fluxo passante tratado pode incluir cerca de 10% do fluxo passante tratado. Em um aspecto, a pelo menos uma porção do fluxo passante tratado pode ser cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cer- ca de 90%, cerca de 95%, cerca de ou 100%.

[00214] Em algumas modalidades, o primeiro composto e o segun- do composto podem ser iodoacetamida marcada e iodoacetamida não marcada, respectivamente. Em algumas outras modalidades exempli- ficativas, o primeiro composto e o segundo composto podem ser iodo- acetamida não marcada e iodoacetamida marcada, respectivamente.

[00215] Em algumas modalidades, a mistura pode ser digerida an- tes de analisar a mesma com o uso da cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massa. Em um aspecto, a mistura pode ser dige- rida com o uso de um agente hidrolisante selecionado dentre tripsina, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Glu-C, protease de membrana externa T (OmpT), enzima degradante de imu- noglobulina de Streptococcus pyogenes (IdeS), quimotripsina, pepsina, termolisina, papaína, pronase e protease de Aspergillus Saitoi.

[00216] Em algumas modalidades, a mistura pode ser digerida com o uso de tripsina.

[00217] Em algumas modalidades, a mistura pode ser deglicosilada antes de analisar a mesma com o uso da cromatografia líquida aco- plada ao espectrômetro de massa.

[00218] Um exemplo de uma modalidade exemplificativa é repre- sentado na Figura 4. Conforme mostrado na Figura 4, a mistura pode ser digerida e, então, dividida na metade. Uma metade pode ser anali- sada com o uso da cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massa, e a outra metade pode ser deglicosilada e analisada com o uso da cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massa.

[00219] Em algumas modalidades, a cromatografia líquida pode ser cromatografia de fase reversa (RP), cromatografia de troca iônica (IEX), cromatografia de modo misto e cromatografia de fase normal (NP).

[00220] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa pode ser um espectrômetro de massa em tandem.

[00221] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa pode ser um espectrômetro de massa por eletroaspersão.

[00222] Em algumas modalidades exemplificativas, o espectrômetro de massa pode ser um espectrômetro de massa por nanoeletroasper- são.

[00223] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri- meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, mistu- rar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo passante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura e deglico- silar a mistura digerida.

[00224] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri- meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, mistu- rar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo passante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um es- pectrômetro de massa para quantificar a espécie de heterodímero na amostra.

[00225] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre-

ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri- meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, mistu- rar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo passante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura, deglicosi- lar a mistura digerida e analisar a mistura com o uso de uma cromato- grafia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar a espécie de heterodímero na amostra.

[00226] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender analisar com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar as espécies de heterodímero na amostra, em que o espectrômetro de massa pode ser um espec- trômetro de massa em tandem.

[00227] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri- meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto e adi- cionar um agente redutor à amostra precipitada.

[00228] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri-

meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto e adi- cionar um agente redutor ao fluxo passante.

[00229] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri- meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, mistu- rar a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante tratado para formar uma mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa pa- ra quantificar a espécie de heterodímero na amostra.

[00230] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que com- preende uma primeira proteína e uma segunda proteína pode compre- ender imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida, capturar uma amostra precipitada e coletar um fluxo passante e tratar a amostra precipitada capturada com um pri- meiro composto e o fluxo passante com um segundo composto, mistu- rar a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante tratado para formar uma mistura, digerir a mistura e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar a espécie de heterodímero na amostra.

[00231] Em algumas modalidades exemplificativas, o método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra pode com- preender uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que a amostra pode ser estressada submetendo-se a mesma a uma condi- ção selecionada dentre um grupo que consiste em exposição à luz branca fria, exposição a peróxido de hidrogênio, exposição à luz ultra-

violeta, calor ou combinações dos mesmos, incluindo degradação for- çada sob diretrizes da ICH.

[00232] Em algumas modalidades, a % de heterodímero da segun- da proteína em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que a primeira proteína é tratada com um composto não marcado e a segunda proteína é tratada com um com- posto marcado, pode ser calculada com o uso da fórmula determinada abaixo: quantidade de segunda proteína como % de heterodímero da áre leve = heterodímero = segunda proteína quantidade total de segunda proteína área leve + área pesada em que a área leve é a área sob a curva de picos de MS determinados para a segunda proteína tratada com um composto não marcado e a área pesada é a área sob a curva de picos de MS determinados para a segunda proteína tratada com um composto marcado. O método pode ser também implantado de modo que a primeira proteína seja tratada com um composto marcado e a segunda proteína seja tratada com um composto não marcado.

[00233] Em algumas modalidades, a % de heterodímero da segun- da proteína em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína, em que a primeira proteína é tratada com um composto não marcado e a segunda proteína é tratada com um com- posto marcado, pode ser calculada com o uso da fórmula determinada abaixo: quantidade de segunda proteína como áre leve % de heterodímero da heterodímero = = segunda proteína área leve + 10 (área pe- quantidade total de segunda proteína sada) em que a área leve é a área sob a curva de picos de MS determinados para a segunda proteína tratada com um composto não marcado e a área pesada é a área sob a curva de picos de MS determinados para a segunda proteína tratada com um composto marcado. O método pode ser também implantado de modo que a primeira proteína seja tratada com um composto marcado e a segunda proteína seja tratada com um composto não marcado.

[00234] A marcação consecutiva de etapas de métodos conforme fornecido no presente documento com números e/ou letras não se destina a limitar o método ou quaisquer modalidades do mesmo à or- dem indicada particular.

[00235] Várias publicações, incluindo patentes, pedidos de patente, pedidos de patente publicados, números de acesso, artigos técnicos e artigos acadêmicos são mencionados por todo o relatório descritivo. Cada uma dessas referências citadas está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade e para todos os propósitos.

[00236] A divulgação será mais completamente entendida com refe- rência aos Exemplos a seguir, que são fornecidos para descrever a divulgação em mais detalhes. Os mesmos destinam-se a ilustrar exemplos e não devem ser interpretados como limitantes ao escopo da divulgação.

EXEMPLOS

[00237] Material e reagentes. Água foi adquirida junto à Honeywell (Muskegon, MI). Acetato de amônio foi adquirido junto à Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Tris-HCl 1 M, pH 7,5 foi adquirido junto à Teknova (Hollister, CA). Tubagem de sílica fundida (Diâmetro interno (ID) 150 µm, diâmetro externo (OD) 360 µm), conector de 3 vias e luva foram adquiridos junto à IDEX (Oak Harbor, WA). PicoTip EMITTER SilicaTip (FS360-20-10-D-20-7CT) foi adquirido junto à New Objective (Woburn, MA). Coluna ACQUITY UPLC Protein BEH SEC, 200Å, 1,7 µm, 4,6 × 300 mm foi adquirida junto à Waters (Milford, MA). Aquecedor de colu- na de bolso quente foi adquirido junto à Thermo-Fisher (Waltham, MA). Todos os reagentes foram usados sem purificação adicional.

[00238] Análise por SEC-nano-ESI-MS online. Sistema ACQUITY

UPLC classe I (Waters, Milford, MA) foi acoplado a espectrômetro de massa Orbitrap de quadrupolo híbrido Q Exactive HF (Thermo Scienti- fic, Bremen, Alemanha) para todas as análises por SEC-nano-ESI-MS online. A coluna ACQUITY UPLC Protein BEH SEC (200Å, 1,7 µm, 4,6 × 300 mm) foi ajustada a 30 °C e usada para mAbs e separação de ADCs. A fase móvel foi acetato de amônio 100 mM a pH 6,8. Cada se- paração levou 30 minutos com uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min, e a quantidade de injeção foi ajustada a 40 µg. Um divisor de três vias (di- visor em T) foi conectado após a coluna SEC. A tubagem de sílica fundida (L: 140 cm, ID: 150 µm) e SilicaTip (L: 5 cm, ID: 10 µm) foram conectados ao divisor em T. A fração de volume alto foi transferida pa- ra o detector de UV por meio de uma tubagem de sílica fundida, en- quanto a fração de volume baixo foi desviada para a MS por meio de um SilicaTip. Os parâmetros de MS a seguir foram usados para aqui- sição de dados de SEC-nano-ESI-MS online. Cada aquisição levou 25 minutos começando imediatamente após a injeção de amostra. As amostras foram ionizadas em modo positivo com voltagem de asper- são de 3 kV, temperatura de capilar de 200 °C e nível de RF 70 S-lens. CID em fonte foi definido em 75 eV. Varreduras por MS completas fo- ram adquiridas a 15 K dissolvendo pó com faixa de massa entre m/z 2000-8000. Um tempo de injeção máximo de 100 ms, valor alvo de controle de ganho automatizado de 3e6 e 10 microvarreduras foram usadas para varreduras de MS completas.

[00239] Análise de dados. O software Protein Metrics Intact Mass foi usado para desconvolução de dados brutos. Thermo Xcalibur Qual Browser foi usado para análise de cromatograma de íon extraída. Mi- crosoft Excel foi usado para cálculo de DAR de ADCs. EXEMPLO 1.

1.1 INSTRUMENTAÇÃO DE SEC-NANO-ESI-MS ONLINE

[00240] Tecnologias de SEC e MS são rotineiramente usadas para caracterizar amostras de proteína. SEC permite o isolamento e a ca- racterização de proteínas sob condições que minimizam alterações em estrutura de proteína, enquanto MS permite a identificação de compo- nentes individuais em amostras complexas. Combinar as capacidades individuais de SEC e MS em uma única plataforma poderia ser alta- mente desejável, mas se provou desafiador devido à alta taxa de fluxo e sais não voláteis usados para análises por SEC são compatíveis com MS nativa. Para superar essa limitação, a redução de solvente e admissão de sal na MS dividindo-se o fluxo de eluído da SEC com o uso de um divisor em T pós-coluna foi realizada (Consultar a Figura 1). O divisor em T foi, então, conectado à MS por meio de um SilicaTip e, em paralelo, a um detector de UV por meio de uma tubagem de sílica fundida. Essa disposição possibilitou detecção dupla por UV/MS simul- tânea de eluídos de SEC. Mediante a variação do comprimento e diâ- metro da tubagem de sílica fundida, a taxa de fluxo à MS por meio do SilicaTip poderia ser regulada (por exemplo, tubagem mais longa/mais pode gerar resistência mais alta que causa fluxo aumentado ao Silica- Tip e MS). As amostras de proteína foram separadas com uma coluna de SEC de 4,6 mm com o uso de uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min. A tubagem de sílica fundida que conecta o divisor em T e o detector de UV com um comprimento de 140 cm e um diâmetro interno de 150 µm resultou em uma taxa de fluxo desejável de ~1 µl/min ao SilicaTip. O comprimento e o diâmetro da tubagem de sílica fundida também pos- sibilitaram detecção quase sincronizada de moléculas pela UV e MS.

1.2 PREPARAÇÃO COFORMULADA

[00241] Uma formulação que compreende mAb1, mAb2 e mAb3 foi usada para o experimento. Seis espécies de dímero podem estar pos- sivelmente presentes na formulação (Consultar a Figura 5). As amos- tras foram estressadas sob várias condições, incluindo condições for- necidas nas diretrizes da ICH, tal como teste de fotoestabilidade (UV

1xICH e CW 1xICH).

1.3 RESULTADOS

[00242] Cinco dímeros (mAb1-mAb1, mAb1-mAb2, mAb2-mAb2, mAb2-mAb3 e mAb3-mAb3) foram diferenciados com sucesso com o uso do sistema ilustrado em 1.1 com o uso de ambos os cromatogra- mas de íon extraídos (XIC) e as medições de peso molecular, confor- me mostrado nas Figuras 6 e 7. O único heterodímero não identificado foi o mAb1-mAb3 visto que seu peso molecular foi muito próximo ao heterodímero mAb2-mAb2 (diferenciado em 15 Da) (Consultar a Figu- ra 7). EXEMPLO 2.

2.1 INSTRUMENTAÇÃO DE SEC-NANO-ESI-MS ONLINE

[00243] A instrumentação, conforme ilustrado em 1.1, foi usada.

2.2 PREPARAÇÃO COFORMULADA

[00244] Uma formulação que compreende mAb1, e uma proteína de fusão foi usada para o experimento. Três espécies de dímero podem estar possivelmente presentes na formulação (Consultar a Figura 8). A presença de N-glicanos na proteína de fusão complica significativa- mente a análise de massa intacta.

[00245] Uma coformulação que compreende mAb1 e proteína de fusão na razão de 120:40, uma coformulação que compreende mAb1 e proteína de fusão na razão de 60:40, uma formulação de mAb1 (120 mg/ml), uma formulação de mAb1 (60 mg/ml) e uma formulação de proteína de fusão (40 mg/ml) foram submetidas a quatro condições de estresse: (a) luz branca fria (CW), (b) peróxido de hidrogênio por 18 horas, (c) luz ultravioleta (UV) e (d) aquecimento a 37 °C por 28 horas. As condições de estresse incluíram condições fornecidas pelas diretri- zes da ICH.

[00246] As formulações e coformulações submetidas ao aqueci- mento a 37 °C por 28 horas e tratamento com peróxido de hidrogênio por 18 horas levaram a um aumento moderado em espécie de alto pe- so molecular (dímeros e outros agregados). Pelo contrário, as formula- ções e coformulações submetidas a tratamento com luz branca fria e luz ultravioleta compreenderam altos níveis de espécies de alto peso molecular.

2.3 IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE DÍMERO

[00247] A coformulação que compreende mAb1 e proteína de fusão na razão de 120:40 submetida a luz branca fria foi analisada com o uso do sistema ilustrado em 1.1. A Figura 9 mostra a cromatograma de íon extraída (XIC) da coformulação analisada com o uso de SEC- nano-ESI-MS. O método leva à diferenciação das espécies de monô- mero e das espécies de dímero.

[00248] A aplicação de técnica de redução de carga aumentou grandemente a medição de massa de um ingrediente proteico que é altamente heterogêneo em peso molecular conforme exemplificado na Figura 10.

[00249] Uma ionização por plataforma de SEC-nanoeletroaspersão (nano-ESI)-MS com detecção dupla por ultravioleta (UV) e MS foi de- senvolvida. A utilidade dessa plataforma foi validade identificando-se as espécies de homodímero e heterodímero em uma preparação co- formulada.

[00250] O divisor de três vias usado para dividir desproporcional- mente eluídos de SEC a uma MS e um detector de UV, com a fração de volume baixo direcionada à MS e a fração de volume alto direcio- nada ao detector de UV. A plataforma atual possibilitou a detecção du- pla por UV e MS nativa, com a possibilidade de coleta de fração e po- de ser aplicada à caracterização de espécies de dímero. Outras modi- ficações a essa plataforma SEC-nano-ESI-MS online, tal como altera- ção da química de coluna ou com o uso de um instrumento Q Exactive UHMR, poderiam permitir que a mesma seja adaptada para outras aplicações, tal como analisar variantes de carga ou complexos de pro- teína muito grandes. O método descrito no presente documento abriu a possibilidade de combinar técnicas de separação de alto teor de sal (isto é, HIC, WCX) com detecção baseada em espectrometria de mas- sa. Em conclusão, a plataforma SEC-nano-ESI-MS online poderia ser amplamente aplicada à análise de produtos biofarmacêuticos de prote- ína para uma variedade de aplicações. EXEMPLO 3.

3.1 PREPARAÇÃO DE AMOSTRA

[00251] Uma coformulação que compreende mAb1 e proteína de fusão 1 foi usada. As diferentes amostras (50 µl) usadas para o expe- rimento são ilustradas na Tabela 1. O controle negativo (amostra 3) foi preparado misturando-se a proteína de fusão 1 estressada (amostra 1) e mAb1 estressada (amostra 1) pouco antes da análise, em que as amostras foram estressadas com o uso de luz ultravioleta conforme fornecido sob as diretrizes da ICH. O outro controle negativo (amostra 7) foi preparado misturando-se a proteína de fusão 1 estressada (amostra 6) e mAb1 estressada (amostra 5) pouco antes da análise, em que as amostras foram estressadas com o uso de luz branca fria conforme fornecido sob as diretrizes da ICH. TABELA 1. Amostras Conc. Info % de % de mo- % de % de % de (condições monô- nômero de Monô- HMW LMW de estresse) mero de proteína de mero mAb1 fusão 1 Total 1 mAb1 (UV) mAb1 (120 80,25 NA 80,25 18,51 1,24 mg/ml) 2 proteína de proteína de fu- NA 81,03 81,03 18,97 0 fusão 1 (UV) são 1 (40 mg/ml) 3 Controle ne- Mistura dos dois gativo (UV) acima 4 mAb1 + prote- 120:40, 67,64 14,75 82,39 16,63 0,98 ína de fusão 1 mAb1:proteína (UV) de fusão 1

Amostras Conc. Info % de % de mo- % de % de % de (condições monô- nômero de Monô- HMW LMW de estresse) mero de proteína de mero mAb1 fusão 1 Total 5 mAb1 (CW) mAb1 (120 73,75 NA 73,75 24,91 1,33 mg/ml) 6 proteína de proteína de fu- NA 81,78 81,78 18,23 0 fusão 1 (CW) são 1 (40 mg/ml) 7 Controle ne- Mistura dos dois gativo (CW) acima 8 mAb1 + prote- 120:40, 62,01 12,87 74,88 24,15 0,99 ína de fusão 1 mAb1:proteína (CW) de fusão 1

3.2 IMUNOPRECIPITAÇÃO

[00252] A imunoprecipitação foi executada conforme mostrado na Figura 11. Em seis tubos de centrifugação, 0,5 ml de Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (microesferas magnéticas) e 100 µg de anti- corpo anti-mAb1 foi adicionado. As amostras 1, 2, 4, 5, 6 e 8 foram adicionadas a tubos individuais e incubadas por 30 minutos à tempera- tura ambiente misturando-se delicadamente em um agitador adequa- do. Os tubos foram colocados em um suporte magnético por 3 minutos para garantir que todas as microesferas sejam coletadas. O sobrena- dante foi removido e 0,4 ml de 100 mM de tampão acetato de amônio foi adicionado. Os tubos foram incubados por 5 minutos em um Ther- momixer a 800 rpm. Essa etapa foi repetida duas vezes (total 3 vezes). Todo o sobrenadante, 1,2 ml de sobrenadante, foi coletado em um tu- bo de 1,5 ml (e marcado como FT1-fluxo passante). As microesferas magnéticas foram lavadas com 0,4 ml de Acetonitrila 10% com o uso de um Thermomixer a 800 rpm. As microesferas foram colocadas no suporte magnético por 3 minutos para garantir que todas as microesfe- ras sejam coletadas. O sobrenadante foi removido entre lavagens. Es- sa etapa foi repetida duas vezes (total 4 vezes). Todo o sobrenadante foi coletado - 1,2 ml de sobrenadante. Em um tubo de 1,5 ml, marcado como FT2; 0,2 ml de tampão de eluição (50% de ACN, 0,1% de ácido fórmico) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente por 5 min em um Thermomixer a 1000 rpm. Todo o sobrenadante foi coletado em um tubo e marcado como PD-pull down.

3.3 ANÁLISE

[00253] A análise da amostra envolveu as seguintes etapas: Adicio- nar 20 ul de ureia 8 M em Tris-HCl 100 mM (pH 7,5) a cada tubo de amostra. Adicionar 1 μl de ditiotreitol 100 mM (DTT) em água Milli-Q a cada amostra, submeter a vórtice para misturar bem e incubar a 50 °C por 30 minutos. Após incubação, adicionar 1,1 ul de iodoacetamida marcada leve 200 mM (IAA leve) em água Milli-Q ao pull down, e adi- cionar 1,1 ul de iodoacetamida marcada pesada 200 mM (IAA pesada) em água Milli-Q ao fluxo passante. Incubar tanto o pull down quanto o fluxo passante à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. En- tão, o pull down inteiro e cerca de 10% do fluxo passante foram mistu- rados e digeridos adicionando-se 4 μg de tripsina e incubados de um dia para o outro a 37 °C. A mistura digerida foi analisada com o uso de LC-MS (sistema Waters ACQUITY UPLC e espectrômetro de massa Thermo Q Exactive).

[00254] A Figura 12 mostra a razão entre massa e carga do pull- down e do fluxo passante obtida para as amostras 7 e 8. A fração de pull-down contém proteína de fusão 1 em heterodímero e a fração de fluxo passante contém proteína de fusão 1 presente em monômero e homodímero. A Figura 13 mostra a porcentagem calculada de hetero- dímero de proteína de fusão 1. O cálculo foi executado com o uso da fórmula mostrada na Figura 4. Para alguns dos peptídeos usados para quantificar a proteína de fusão 1, os gráficos de razão entre massa e carga nas amostras 3,4, 7 e 8 são mostrados nas Figuras 14-17. O peptídeo 1, o peptídeo 2, o peptídeo 3 e o peptídeo 4 nas figuras re- 25 presentam o peptídeo ELVIPCR31, o peptídeo 73 EIGLLTCEATVNGHLYK89, o peptídeo 120 LVLNCTAR127 e o peptídeo

SDQGLYTCAASSGLMTK194, respectivamente.

[00255] A % de heterodímero de proteína de fusão 1 foi convertida em % de heterodímero seguindo o método conforme mostrado na Fi- gura 18. Com base nos cálculos para % de heterodímero representa- dos na Figura 18, a % de heterodímero na amostra 4 e na amostra 8 mostrou ser 6,4% e 8,5%, respectivamente. Os níveis baixos de "sinal de heterodímero" das amostras de controle negativo (amostras 3 e 7) poderiam ser atribuídos a partir da interação entre mAb1 e proteína de fusão 1 após mistura e interação não específica entre mAb1 e a resina de afinidade. A % de heterodímero foi consistente com a % de HMW global. EXEMPLO 4.

[00256] Para avaliar o limite de quantificação e linearidade do hete- rodímero de proteína de fusão por imunoprecipitação, as amostras com preparação de coformulação estressada com branco frio sequen- cialmente diluída foram usadas.

[00257] As amostras de teste foram preparadas conforme listado na Tabela 2. Uma coformulação que compreende mAb1 e proteína de fu- são 1 foi usada e estressada com o uso de uma luz branca fria. A amostra mista de controle negativo foi preparada misturando-se a pro- teína de fusão 1 estressada (amostra 6) e mAb1 estressado (amostra 5) pouco antes da análise. As diferentes amostras de teste usadas pa- ra o experimento foram preparadas conforme ilustrada na Tabela 2.

TABELA 2. Amostra Tes- Soluções mistas tada amostra CW co- Amostra mista de Volume formulada (µl) controle negativo (µl) Final 1 CW-1 cofor- 20 0 20 mulado 2 CW-1/2 co- 10 10 20 formulado 3 CW-1/4 co- 5 15 20 formulado 4 CW-1/8 co- 2,5 17,5 20 formulado 5 CW-1/16 co- 1,25 18,75 20 formulado 6 Controle ne- 0 20 20 gativo

[00258] A imunoprecipitação e a análise foram executadas confor- me ilustrado em 3.2 e 3.3. O gráfico de % de heterodímero de proteína de fusão nas amostras testadas normalizado à % de heterodímero de proteína de fusão na amostra testada sem diluição é mostrado na Fi- gura 19. Além disso, a plotagem de % de heterodímero de proteína de fusão vs. % de amostra estressada com branco frio na amostra mista é mostrada na Figura 20, para três peptídeos usados para quantificar proteína de fusão 1, em que a amostra na diluição 1 representa a amostra coformulada estressada com branco frio pura. O método de quantificação manteve uma boa linearidade pelo menos tão baixa quanto 0,8% de heterodímero (o valor mais baixo testado). EXEMPLO 5.

[00259] Para avaliar a quantificação de heterodímero em amostras coformuladas estressadas com condições ambientes, amostras de uma preparação coformulada que compreende mAb1 e proteína de fusão 1 foram armazenadas a 25 °C por 12 meses e 5 °C por 46 me-

ses. A imunoprecipitação e a análise foram executadas conforme ilus- trado em 3.2 e 3.3. A quantificação calculada nas amostras é mostrada na Tabela 3 e na Figura 21, em que os diferentes peptídeos de proteí- na de fusão 1 foram usados para quantificação. TABELA 3. Quantificação 25°C 12 m 5°C 46 m CW misto (Con- trole Negativo) ELVIPCR 5,10% 3,38% 0,40% SDQGLYTCAASSGLMTK 5,18% 3,56% 0,36% EIGLLTCEATVNGHLYK 4,89% 3,47% 0,44% % médiaheterodímero 5,06% 3,47% 0,40% % de heterodímero (Cal- 2,78% 1,91% 0,22% culada) em Áreas de Pico de UV % de HMW 6,40% 5,26%

[00260] Assim, um novo método de imunoprecipitação foi desenvol- vido para a quantificação do nível de heterodímero em amostras obti- das de precipitações coformuladas. O mesmo foi aplicado com suces- so para quantificar o nível de heterodímero tanto em amostras estres- sadas com UV/CW e estressadas com condição ambiente de prepara- ções coformuladas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para identificar pelo menos uma espécie de dí- mero, caracterizado pelo fato de que o método compreende: colocar uma amostra incluindo a espécie de dímero em contato com um sistema cromatográfico que tem uma resina de cro- matografia por exclusão de tamanho; lavar a dita resina de cromatografia por exclusão de tama- nho com o uso de uma fase móvel para fornecer um eluente incluindo a espécie de dímero; e identificar as espécies de dímero no dito eluente com o uso de um espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão sob condições nativas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espectrômetro de massa de ionização por eletroas- persão é acoplado online ao sistema cromatográfico que tem a resina de cromatografia por exclusão de tamanho.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espectrômetro de massa de ionização por eletroas- persão é um espectrômetro de massa de ionização por nanoeletroas- persão.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos é usado para permitir a comunicação de fluido com o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão e o sistema cromatográfico que tem a resina de cromatografia por exclusão de tamanho.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um divisor com pelo menos três caminhos é usado para permitir a comunicação de fluido entre um detector de ultravioleta e o sistema cromatográfico que tem a resina de cromato- grafia por exclusão de tamanho.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o eluente da lavagem da resina de cromatografia por exclusão de tamanho é introduzido no detector de ultravioleta através de pelo menos um divisor a uma taxa de fluxo de cerca de 0,2 ml/min a cerca de 0,4 ml/min.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase móvel usada para lavar a resina de cromato- grafia por exclusão de tamanho compreende acetato de amônio.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase móvel usada para lavar a resina de cromato- grafia por exclusão de tamanho compreende um sal volátil.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase móvel usada para lavar a resina de cromato- grafia por exclusão de tamanho tem uma taxa de fluxo de cerca de 0,2 ml/min a cerca de 0,4 ml/min.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que uma quantidade da amostra incluindo as espécies de dímero em contato com o sistema de cromatografia é de cerca de 10 µg a cerca de 100 µg.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o eluente fornecido a partir da lavagem da resina de cromatografia por exclusão de tamanho é introduzido no espectrô- metro de massa de ionização por eletroaspersão, em que uma taxa de fluxo de eletroaspersão da ionização por eletroaspersão é de cerca de 10 nl/min a cerca de 50 nl/min.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o eluente fornecido a partir da lavagem da resina de cromatografia por exclusão de tamanho é introduzido no espectrô- metro de massa de ionização por eletroaspersão, em que uma volta- gem de aspersão de eletroaspersão é de cerca de 0,8 kV a cerca de

1,5 kV.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a amostra compreende pelo menos duas espécies de dímeros.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a amostra compreende uma espécie de homodí- mero.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a amostra compreende uma espécie de heterodí- mero.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a amostra é obtida a partir de uma preparação co- formulada.

17. Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende: uma coluna cromatográfica que tem uma resina de croma- tografia por exclusão de tamanho, em que a coluna cromatográfica pode receber uma fase móvel e uma amostra incluindo uma proteína, e um espectrômetro de massa de ionização por eletroasper- são, em que o espectrômetro de massa de ionização por eletroasper- são pode ser acoplado online à dita coluna cromatográfica e em que o espectrômetro de massa de ionização por eletroaspersão pode ser executado em condições nativas.

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que a coluna cromatográfica pode ser acoplada ao espectrômetro de massa com o uso de um divisor.

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que a coluna cromatográfica pode, ainda, ser aco- plada a um detector de ultravioleta com o uso de um divisor com pelo menos três caminhos.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que o espectrômetro de massa de ionização por ele- troaspersão é um espectrômetro de massa de ionização por nanoele- troaspersão.

21. Método para quantificar uma espécie de heterodímero em uma amostra que compreende uma primeira proteína e uma se- gunda proteína, caracterizado pelo fato de que o método compreen- de: imobilizar um anticorpo específico para a primeira proteína em uma superfície sólida; incubar a amostra com o dito anticorpo; capturar uma amostra precipitada; coletar um fluxo passante; tratar a amostra precipitada com um primeiro composto; tratar o fluxo passante com um segundo composto; misturar a amostra precipitada tratada e pelo menos uma porção do fluxo passante tratado para formar uma mistura; e analisar a mistura com o uso de uma cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa para quantificar as espécies de heterodímero na amostra.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que o espectrômetro de massa é um espectrômetro de massa em tandem.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que compreende, ainda, adicionar um agente redu- tor à amostra precipitada.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que compreende, ainda, adicionar um agente redu- tor ao fluxo passante.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri-

zado pelo fato de que compreende, ainda, digerir a mistura antes de analisar a mistura.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que compreende, ainda, deglicosilar a mistura antes de analisar a mistura.

27. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a amostra precipitada tratada e cerca de 10% do fluxo passante tratado são misturados para formar a mistura.

28. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que o primeiro composto é um isótopo do segundo composto.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que o primeiro composto é iodoacetamida.

30. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a primeira proteína é um anticorpo.

31. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a primeira proteína é um anticorpo monoclonal.

32. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a primeira proteína é um anticorpo policlonal.

33. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a segunda proteína é uma proteína de fusão.

34. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a amostra é estressada submetendo-se a mes- ma a uma condição selecionada dentre um grupo que consiste em ex- posição à luz branca fria, exposição ao peróxido de hidrogênio, expo- sição à luz ultravioleta, calor ou combinações dos mesmos.

35. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a amostra é obtida a partir de uma preparação coformulada.

36. Método para quantificar uma espécie de heterodímero,

caracterizado pelo fato de que o método compreende: imunoprecipitar a espécie de heterodímero; e quantificar as espécies de heterodímero com o uso de um método de marcação com isótopo estável seguido por uma cromato- grafia líquida acoplada a um espectrômetro de massa.