CN102162808B - 一种基于体积排阻色谱/质谱法的动态组合化学方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于体积排阻色谱/质谱法的动态组合化学方法，其特征在于在完成DCL的合成后，利用体积排阻色谱柱将靶点蛋白以及靶点蛋白－活性分子的复合物从DCL中分离出来；然后使靶点蛋白失活，释放出靶点蛋白筛选出来的活性分子；最后利用质谱表征活性分子的结构。本发明方法将靶点蛋白－活性分子从DCL分离后直接采用质谱法确定少量活性分子的结构，DCL库的容量和多样性可以大大提高；且不需要再进行任何单体合成或者库解缠绕，大大简化了动态组合化学的操作流程。本发明方法在动态组合化学中，尤其是动态组合化学应用于药物研发中具有广泛的适用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种动态组合化学方法，尤其是涉及一种基于体积排阻色谱/质谱法（SEC-MS）的动态组合化学方法。
背景技术
动态组合化学(Dynamic Combinatorial Chemistry: DCC)是利用可逆反应构建动态组合化合物库（Dynamic Combinatorial Library: DCL），在DCL中加入靶点分子，使DCL的构建单元和靶点分子发生识别作用，在DCL中诱导组装出与靶点分子具有最好结合效果的产物，并加以富集，为确认具有活性结构的主客体化合物提供了新的思路。动态组合化学过程包括：（1）建立一个有效的动态组合化学库（DCL）；（2）建立一套由靶点分子驱动的筛选机制。在动态组合化学中，这两个过程可以同时实现。
动态组合化学（DCC）是一门将筛选与基于小分子组合的库合成相结合的技术手段。与传统的高通量筛选不同，DCC更倾向于提高动态组合化合物库（DCL）中分子多样性，而不是合成纯度高的单体化合物结构。通常，DCC中所涉及的反应为可逆反应或至少含有可逆步骤，以保证动态组合化学的“动态”，从而通过筛选机制使DCL中的活性结构的产率能够被提升。
虽然诸多靶点，如小金属离子、超大分子等，都已被用于DCC的研究，但DCC研究涉及的主要领域还是药物先导化合物的筛选。在这一研究中，所涉及的靶点主要为蛋白质。与传统先导化合物筛选方法不同，动态组合化学不是进行单一化合物的逐一合成和筛选，而是将库合成和筛选同时进行。这样，就可以有效地提高合成及筛选的速度，大大地缩短药物研发流程的时间。
目前，制约动态组合化学发展的主要瓶颈为分析手段的限制，特别是当DCL中的产品数量较多时的分析方法的选择，如何对动态组合化学库中的复杂组分进行有效的分析是制约动态组合化学发展的重要因素。
由于仪器的普及性，高效液相（HPLC）和液质联用（LC-MS）为目前DCC中最常用的分析手段。HPLC不能直接表征产品结构，同时由于HPLC的分离效率有限，不能分离太复杂的混合物，限制了DCL库产品的数量。虽然LC-MS中的MS可以直接确认库产品结构（库产品的分子量可以根据反应机理计算得出），但是该方法仍因为LC所带来的限制，大大限制DCL库产品的数量。采用高效液相（HPLC）或液质联用（LC-MS）作为分析方法，库产品的数量通常限制在数十个。
以动态组合化学中最常用的高效液相（HPLC）分析为例，其基本操作流程为：
1. 以已知构建单元（building blocks，为化学小分子）合成两个组合化合物库，其中一个库含有靶点（如疾病的靶点蛋白），即动态组合化合物库（Dynamic Combinatorial Library: DCL）；另一个不含靶点，即对照品库。
2. 将合成所得两库进行HPLC分析（DCL通常需先进行蛋白的失活处理，使其释放与之结合的配体即活性分子），比较结果，寻找差异，若发现产品峰在DCL中被放大，即默认DCL中含有配体(活性化合物)。
3. 进行单体合成或者库的解缠绕，确证配体的结构。
该流程的缺陷主要在于两个方面：其一，由于使用HPLC进行分析，考虑到分析时产品峰分离情况，通常库中所包含的化合物数量较少；其二，由于HPLC不能直接定性表征产物，所以必须进行单体合成或者复杂的库解缠绕以确定活性产品的结构。这两个缺陷已成为动态组合化学发展的瓶颈。
为了突破DCC发展的限制瓶颈，研究人员尝试了多种新的分析手段，如RBDCC，STDNMR，Tethering等。这些手段都涉及了特殊仪器的使用或特殊技术的应用；而且这些技术手段尚不能完全解决DCC发展的瓶颈，目前也只能应用于实验室研究中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于体积排阻色谱/质谱法（SEC-MS）的动态组合化学方法，能够解决动态组合化学方法存在的对DCL中复杂组分进行有效分析的技术问题，克服现有的HPLC或LC-MS方法对于DCL库产品数量上的限制和结构确定方法上存在的缺陷，使动态组合化学真正实现其最初的构想，即通过一次合成和一次分析即可完成传统合成中需要数百次合成和数百次筛选才能完成的工作。
实现本发明目的的技术方案如下：
一种基于体积排阻色谱/质谱法的动态组合化学方法，其特征在于在完成DCL的合成后，利用体积排阻色谱柱将靶点蛋白以及靶点蛋白－活性分子的复合物从DCL中分离出来；然后使靶点蛋白失活，释放出靶点蛋白筛选出来的活性分子；最后利用质谱表征活性分子的结构。
本发明方法具体包括以下步骤：
1) DCL合成：以已知构建单元（化学小分子）为原料进行DCL合成，在DCL合成中添加靶点蛋白，使合成与筛选同时进行；
2) 靶点蛋白－活性分子复合物分离：使用体积排阻色谱柱（SEC）对DCL进行分离，得到主要由靶点蛋白和靶点蛋白-活性分子复合物所组成的洗脱液；
3) 靶点蛋白失活处理：向步骤2中所得溶液加入有机溶剂（通常为甲醇或乙腈），使靶点蛋白失活；
4) 质谱分析：将步骤3中所得溶液进行离心分离，取上层清液，进行质谱分析。
所述的DCL可以按照现有的动态组合化学方法合成，凡能构建有效的动态组合化学库的可逆反应均可应用本发明方法，且不受构建单元（化学小分子）或库产品数量的限制，包括但不限于生成C=N双键、二硫键、C=C交换及酯交换等可逆反应。例如在实施例中将本发明方法应用于胺与醛化合物生成亚胺的反应，该反应是在动态组合库合成中应用最多的可逆过程，具有反应条件温和的优点，反应的最终产物还可以通过还原剂不可逆还原为胺而被富集和检测。
所述的靶点蛋白包括各种酶、凝集素等，其分子量通常大于6000，均符合SEC柱分离要求。
所述的DCL使用体积排阻色谱柱（SEC）进行分离，SEC柱可以吸收小分子，包括不能与靶点蛋白结合（即不具有生物或药物活性）的库产品、原料或反应中间体，而生物大分子靶点蛋白或蛋白-活性分子（配体）的复合物可以顺利通过SEC柱，得到主要含有靶点蛋白和靶点蛋白-活性分子复合物的洗脱液。例如在本发明的具体实施例中，使用的SEC柱可以吸附分子量6000以下的小分子。
体积排阻色谱法是根据分子量大小进行分离的一种液相色谱技术，适用于分离蛋白质和多肽类生物大分子样品。根据现有技术中的色谱分析技术和仪器，根据靶点蛋白的分子量，可以优选SEC柱，使其分子直径大于SEC柱凝胶最大孔隙，靶点蛋白和靶点蛋白-活性分子复合物全部被排阻在凝胶颗粒之外（全排阻），从而得到不包括库产品、原料或反应中间体等小分子的洗脱液。使用微型离心式体积排阻色谱柱可以在极短的时间内分离得到包含靶点蛋白－活性分子复合物的洗脱液。
包含靶点蛋白-活性分子复合物的洗脱液中加入有机溶剂使靶点蛋白失活，释放出与靶点蛋白结合的活性分子，将失活处理后的洗脱液离心分离，其上层清液中主要包含通过动态组合化学方法所筛选出来的活性分子（配体），可直接对其进行质谱分析，确定活性分子的结构。
鉴于在动态组合化学应用于药物研发过程中，所涉及的靶点都是蛋白质等生物大分子（分子量数万至数十万），它们都能顺利通过SEC柱，因而通过本发明方法可以有效地将活性分子从DCL库中分离出来，并通过质谱检测，直接确定其结构。
本发明方法的优点在于：其一，因为完成DCL合成后，配体-靶点被分离出来，所以最终的分析对象只是少量的目标物活性分子（配体），而不是目前动态组合化学中常用的对象-整个DCL。这样，DCL中的化合物结构的多少对分析结果没有影响，DCL库的容量和多样性可以大大提高；其二，在进行DCL合成时，只需合成单一的动态组合化合物库DCL，而不需合成不含靶点的对照品库，更无需对两库进行HPLC等分析；其三、由于采用质谱法来分析活性分子，而DCL中所有产品的分子量都是可以通过计算获得，可以直接确定活性分子的结构；因此，不需要再进行任何单体合成或者库解缠绕来确证配体的结构，从而大大简化了动态组合化学的操作流程。
此外，在动态组合化学的主要应用领域药物研发中，所涉及的靶点都是蛋白质等生物大分子（分子量数万至数十万），均可以采用SEC柱简单、快速地从DCL中进行分离，而具有生物活性的有机小分子都可以采用质谱检测，因此本发明方法（SEC-MS）在动态组合化学中，尤其是动态组合化学在药物研发中的应用具有广泛的适用性。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
附图说明
图1 SEC-MS方法流程示意图；
图2 HEWL配体结构的质谱图；
图3 配体活性测定的Lineweaver-Burk曲线。
具体实施方式
在具体实施方式中，以溶菌酶抑制剂的动态组合化学筛选为例，说明本发明的基于体积排阻色谱/质谱法的动态组合化学方法。
选择鸡蛋白溶菌酶（hen egg-white lysozyme: HEWL）为靶点，HEWL对免疫防御体系有重要作用，它可以通过水解细胞壁中多聚糖中N-乙酰基葡萄糖氨（NAG）之间的1,4-β连接来杀死病毒。NAG是HEWL的一个已知的抑制剂，它与HEWL的结合活性（Kd）大约在20-60mM范围内。
基于NAG的结构设计DCL，以溶菌酶为靶点，以2种氨（A1-A2）和10种醛（B1-B10）为原料构建DCL库，通过醛氨反应生成Schiff碱，反应所得的Schiff碱被硼氰酸钠进一步还原为稳定的胺结构，如式1所示：
DCL合成后，利用SEC柱（微型离心式体积排阻色谱柱）将之分离，向分离后的溶液（即含有配体-靶点复合物结构的溶液）中加入有机试剂，使HEWL失活，释放出配体，最后将所得溶液用质谱进行分析，得出配体的结构。所采用的SEC柱为Bio-Spin P6柱，质谱分析采用Waters Micromass LCT electrospray mass spectrometer (ES mode)。
上述过程以及A1-A2、B1-B10和筛选得到的活性分子的结构如图1所示。
具体实施方法包括以下步骤：
1. 将200μL的醛溶液（B1-B10, 每个醛浓度为5mM，在10%的DMSO水溶液中）、10μL的A1氨溶液（浓度为1M，在DMSO中）、10μL的A2氨溶液（浓度为1M，在DMSO中）、500μL的溶菌酶溶液（2mM，在水中）和60μL的水混合。混合所得溶液在室温下搅拌3小时。接着向溶液体系中加入硼氰酸钠溶液220μL（100mM，在水中），反应体系继续在室温下搅拌18小时。
2. 取25μL溶液，注入SEC柱。将SEC柱置于离心机中，在1000g的离心速度下离心2分钟。
3. 向步骤2所得溶液中加入75μL乙腈，静置半小时。离心分离（100g转速，10秒）。
4. 取步骤3中的上层清液，用于质谱分析，所得结果如图2。发现3个活性结构，即A2B2, A2B4和A2B6。
为了进一步确认实施例的结果和本发明方法的可靠性，A2B2, A2B4和A2B6分别被单独合成，并进行与HEWL的生物活性分析。生物活性的测试方法根据文献（Carbohydr. Res. 2005, 340, 1876-1884; J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 16015-16019）报道的方法进行（图3）。所得的KM值和IC50值如表1所示。
结果显示，A2B2，A2B4，A2B6确为HEWL的配体。当配体的浓度设定在0.33mM时，活性参数KM的测定值如表1所示。其中，A2B6的活性最强，而A2B4与A2B2活性相当。相对应的，HEWL的已知的抑制剂NAG在30mM的浓度没有显示明显活性。IC50测定显示，A2B2，A2B4，A2B6的IC50数值在2-3mM，而NAG在10mM左右。由此可见，A2B2, A2B4和A2B6的活性都强于HEWL的已知活性结构N-Acetyl-D-Glucosamine (NAG)，从而证明本发明方法的可靠性。
表1. A2B2, A2B4, A2B6和NAG的生物活性测定结果
至此，关于HEWL的3个新的配体已被发现和确认。在本发明的SEC-MS方法中，仅需要进行一次库合成和一次分析。利用SEC将配体-靶点复合物从DCL中分离出来，分析所针对的对象大大简化，最终需检测的只是配体的结构，DCL中其他无活性产品被忽略。可见，SEC-MS法为DCC提供了一种新型的快速的分析方法，它可以直接表征配体的结构，以避免复杂的单体合成或库解缠绕，还可以有效地增加库产品的数量。
为了更好地说明本发明的基于SEC-MS的动态组合化学方法的优点，可将上述方法与文献报导的基于HPLC的方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 965-969）进行对比。上述实施例与Zameo等人的研究中，都是选用HEWL作为靶点，库合成的原料的结构也相近。文献中选用了2个氨与6个醛进行库合成。在进行HPLC对照后（合成两个库，一个含有HEWL，一个不含HEWL），发现有个别峰被放大。于是，将2x6的库解析为两个1x6的库，进行库的解缠绕。此外，HPLC法中的产品必须有紫外活性，这也是文献在原料氨中连接芳香官能团的原因。
总之，实施例通过基于SEC-MS的动态组合化学方法为HEWL寻找到了3个新的配体。本发明在方法学上第一次实现了配体-靶点从DCL中的分离，为DCC在药物先导化合物的研发中创造了极大的便利。
Claims (6)
1.一种基于体积排阻色谱/质谱法的动态组合化学方法，其特征在于在完成DCL的合成后，利用体积排阻色谱柱将靶点蛋白以及靶点蛋白－活性分子的复合物从DCL中分离出来；然后使靶点蛋白失活，释放出靶点蛋白筛选出来的活性分子；最后利用质谱表征活性分子的结构；
所述的方法包括以下步骤：
1）DCL合成：以构建单元为原料进行DCL合成，在DCL合成中添加靶点蛋白，使合成与筛选同时进行；
2）靶点蛋白－活性分子复合物分离：使用体积排阻色谱柱对DCL进行分离，得到主要由靶点蛋白和靶点蛋白-活性分子复合物所组成的洗脱液；
3）靶点蛋白失活处理：向步骤2）中所得溶液加入甲醇或乙腈，使靶点蛋白失活；
4）质谱分析：将步骤3）中所得溶液进行离心分离，取上层清液，进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的动态组合化学方法，其特征在于构建所述的DCL的可逆反应包括生成C=N双键反应、生成二硫键反应、C=C交换反应或酯交换反应。
3.根据权利要求2所述的动态组合化学方法，其特征在于所述的DCL由胺与醛化合物生成亚胺的反应构建。
4.根据权利要求1所述的动态组合化学方法，其特征在于所述的靶点蛋白其分子量大于6000。
5.根据权利要求1所述的动态组合化学方法，其特征在于所述的SEC柱能吸附分子量6000以下的小分子。
6.根据权利要求1所述的动态组合化学方法，其特征在于所述的SEC柱为微型离心式体积排阻色谱柱。
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| Sandrine Zameo 等.Dynamic Combinatorial Chemistry: Lysozyme Selects an Aromatic Motif That Mimics a Carbohydrate Residue.《Angew. Chem. Int. Ed.》.2005,(第44期),965-969. * |
| 周锦 等.动态组合化学及其在药物发现过程中的应用.《复旦学报(医学版)》.2004,第31卷(第6期),658-660. * |
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