CN113433195A - 使用五甘醇单八烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用五甘醇单八烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法。所述方法先将纯化的膜蛋白复合物在C8E5存在下超滤脱盐，然后置换到含有C8E5的醋酸铵缓冲液中，并用含有C8E5的醋酸铵缓冲液透析进一步去除原始溶液中的表面活性剂，最后在相同的质谱条件下，分别对溶液中含有C8E5的膜蛋白复合物和蛋白质标准品进行质谱分析。本发明采用C8E5代替传统使用的表面活性剂DDM，大大降低膜蛋白的能态，有效维护膜蛋白的天然构象，从而可以快速而且准确地提供膜蛋白的结构生物学方面的信息，效果明显优于传统使用的表面活性剂DDM。

Description

使用五甘醇单八烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析 方法

技术领域

本发明属于蛋白质结构生物学技术领域，涉及一种使用五甘醇单八烷基醚(Pentaethylene glycol monoctyl ether，C8E5)进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法。

背景技术

膜蛋白承担着广泛的生物功能，一旦其功能失效，往往会引起严重的疾病，例如癌症等。虽然膜蛋白在人类基因组中只占有三分之一，但是目前一半以上的药物作用靶点都是膜蛋白。作为癌症和疾病的重要研究对象，膜蛋白以往是通过传统的结构生物学手段例如X光晶体衍射以及核磁共振对其结构开展研究。然而，膜蛋白重组表达往往因为其表达量和溶解性的难题导致其结构生物学研究难度重重。而且，对于常规的X光晶体衍射而言，晶体结构的分辨率不足以解析结合区域。

BtuCD是一类ABC转运蛋白，其生理功能是将水解ATP的能量用于耦合底物的跨膜转移。BtuCD包含两个用于水解ATP的核苷酸结合结构域(NBD)，利用水解ATP的能量控制跨膜区域的结构变化，从而实现维生素B12的转运过程。大肠杆菌BtuCD是II型ABC转运蛋白，它在结构和机制类似于转铁转运蛋白和血红素转运蛋白，其功能与某些革兰氏阴性病原体的毒力有关。BtuCD膜蛋白复合物常作为一种模式膜蛋白复合物用于膜蛋白研究。

非变性质谱是一种快速灵敏的分析方法，可以同时提供蛋白质复合物以及结合的小分子区域的结构信息。通常情况下为了维持膜蛋白的天然构象，高浓度的表面活性剂会被大量添加在溶液中，以至于形成了大小不一的表面活性剂胶束。由于这样的情况，膜蛋白一开始无法用于质谱方法分析，直到后来研究发现由十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside，DDM)表面活性剂包裹的膜蛋白可以被整体转移到气相。通过用高能量粒子轰击的办法，可以将表面活性剂分子从膜蛋白表面剥离，并且维持膜蛋白复合物各个亚基之间的相互作用。

膜蛋白质谱首先需要采用纳电喷雾的方法将含有表面活性剂的纯化后的膜蛋白质溶液离子化并转移到质谱仪中。这种质谱离子化的方法所获得的蛋白质喷雾主要成分是由带电荷膜蛋白复合物包裹着表面活性剂形成的。显然，在这种情况下是无法准确测量蛋白质复合物分子量的。因此需要通过热力学活化去除表面活性剂分子，这一目的的实现主要是通过提高碰撞活化过程的能量，随后通过四极杆质量分析器筛选出目标分子。加速离子使他们通过充满惰性气体的碰撞池，从而使得表面活性剂分子从蛋白质复合物上解离下来，从而将完整的蛋白质复合物无损地剥离出来。通过射频电导的进一步筛选，膜蛋白复合物离子被推进器转移到飞行时间质谱分析器。这样，膜蛋白复合物最终可以被微通道板探测器检测出来。

碰撞活化过程不仅仅可以将膜蛋白复合物从表面活性剂胶束中释放出来，提高能量的后果也包括膜蛋白复合物的解离。过高的活化能还会导致局部结构的坍塌，当能量越过某个阈值的时候，坍塌变性的蛋白质亚基甚至会从膜蛋白复合物中被抛射出来。由于母复合物电荷分离时的不对称分割，使得某个蛋白质亚基负载了过高的电荷，而余下的复合物只有很少的电荷。这种剥离有利于对带有较少电荷的复合物进行高分辨率分析，同时，剥离的结果也有利于膜蛋白亚基的化学计量研究以及多聚体蛋白质复合物的组成分析。

综上所述，膜蛋白复合物非变性质谱的研究关键是找到合适的表面活性剂，这种表面活性剂必须能够一方面在水溶液中维持膜蛋白的天然构象，另一方面便于在质谱实验中以较低的能态下去除。目前，主要使用表面活性剂DDM进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析，但是DDM价格昂贵，并且膜蛋白复合物在DDM存在下的平均电荷态较高，膜蛋白复合物不稳定，难以在较低的能态下去除DDM(Nat Chem.2014Mar；6(3):208-215.doi:10.1038/nchem.1868.)。

发明内容

针对膜蛋白复合物的非变性质谱的特点和难点，本发明提供一种使用五甘醇单八烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法。该方法采用五甘醇单八烷基醚作为表面活性剂，进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析。

本发明的技术方案如下：

使用五甘醇单八烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法，具体步骤如下：

第一步，将纯化的膜蛋白复合物在五甘醇单八烷基醚存在下用超滤膜进行脱盐处理，将脱盐后的膜蛋白复合物置换到含有五甘醇单八烷基醚的、pH8.0的醋酸铵缓冲液中，蛋白质标准品置换到pH7.4的醋酸铵缓冲液中；

第二步，将第一步得到的膜蛋白复合物溶液采用含有五甘醇单八烷基醚的醋酸铵缓冲溶液进行透析，进一步去除原始溶液中的表面活性剂，得到含有五甘醇单八烷基醚的膜蛋白复合物溶液；

第三步，在相同的质谱条件下，分别对溶液中含有五甘醇单八烷基醚的膜蛋白复合物和蛋白质标准品进行质谱分析，获得其非变性质谱数据并采集各自的离子淌度数据；

第四步，将得到的离子淌度数据处理，得到膜蛋白复合物和蛋白质标准品的漂移时间分布；

第五步，根据蛋白质标准品的漂移时间分布和理论碰撞横截面积，以及膜蛋白复合物的漂移时间分布，得到膜蛋白复合物的碰撞横截面积。

第一步中，所述的膜蛋白复合物为本领域知悉的膜蛋白复合物，可以是BtuCD膜蛋白复合物或其他已知膜蛋白质复合物如ATPase复合物、血红素转运蛋白复合物、铁转运蛋白复合物等，也可以是未知的膜蛋白复合物。

第一步中，膜蛋白复合物脱盐时，温度为4℃，离心转速为14000rcf，时间不低于30min，重复不少于5次。

第一步中，所述的蛋白质标准品为乙醇脱氢酶、刀豆蛋白、抗生物素蛋白、β-乳球蛋白、肌球蛋白、细胞色素c和血清淀粉样蛋白。

第三步中，离子淌度质谱仪条件为：针尖电压1.5kV，锥孔电压10V，源补偿电压10V，一级碰撞室电压2V，二级碰撞室电压2V，一级碰撞室和离子淌度分离室之间的反电压28V，碰撞室内氩气流速2mL/min，氦气室气体流速150mL/min，离子淌度分离室中用氮气做分离气体且流速为60mL/min，离子淌度分离室行波速度1100m/s，离子淌度分离室行波振幅37V。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明采用五甘醇单八烷基醚代替传统使用的表面活性剂DDM，能够更有效地帮助膜蛋白在水溶液中维持天然构象，而且在质谱实验中保持低能态，有利于膜蛋白的非变性质谱分析，明显优于传统使用的表面活性剂DDM。

附图说明

图1是BtuCD膜蛋白复合物分别在DDM和C8E5存在下不同能态条件下的信号强度。

图2为BtuCD膜蛋白复合物在DDM和C8E5存在条件下的平均电荷态。

图3为BtuCD膜蛋白复合物分别在C8E5和DDM存在下的CIU(collision inducedunfolding)。

图4为BtuCD膜蛋白复合物在C8E5中在不同碰撞电压(collision voltage)下的存在状态。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1

第一步，一组BtuCD膜蛋白复合物在C8E5存在下用10kD的超滤膜进行脱盐处理；另一组BtuCD膜蛋白复合物在DDM存在下用10kD的超滤膜进行脱盐处理；所有的蛋白质标准品(包括乙醇脱氢酶、刀豆蛋白、抗生物素蛋白、β-乳球蛋白、肌球蛋白、细胞色素c和血清淀粉样蛋白)直接用10kD的超滤膜进行脱盐处理；脱盐处理条件为：离心温度为4℃，离心转速14000rcf，离心30min，重复5次。然后将C8E5存在下超滤脱盐后的BtuCD膜蛋白复合物置换到含有C8E5、pH8.0的醋酸铵缓冲液，DDM存在下超滤脱盐后的BtuCD膜蛋白复合物置换到含有DDM、pH8.0的醋酸铵缓冲液中，超滤脱盐后的蛋白质标准品置换到pH7.4的醋酸铵缓冲液中；

第二步，将置换到含有C8E5、pH8.0的醋酸铵缓冲液中的BtuCD膜蛋白复合物溶液采用含有C8E5的醋酸铵缓冲溶液进行透析，置换到含有DDM、pH8.0的醋酸铵缓冲液中的BtuCD膜蛋白复合物溶液采用含有DDM的醋酸铵缓冲溶液进行透析，进一步去除原始溶液中的表面活性剂，分别得到含有C8E5的BtuCD膜蛋白复合物溶液以及含有DDM的BtuCD膜蛋白复合物溶液；

第三步，分别吸取2μL终浓度为10uM、含有C8E5的BtuCD膜蛋白复合物溶液，2μL终浓度为10uM、含有DDM的BtuCD膜蛋白复合物溶液，以及2μL终浓度为5uM的蛋白质标准品上质谱，调节好仪器参数如：工作模式为离子淌度模式，电离模式为正离子模式，针尖电压1.5kV，锥孔电压10V，源补偿电压10V，一级碰撞室电压2V，二级碰撞室电压2V，一级碰撞室和离子淌度分离室之间的反电压28V，碰撞室内氩气流速2mL/min，氦气室气体流速150mL/min，离子淌度分离室中用氮气做分离气体且流速为60mL/min，离子淌度分离室行波速度1100m/s，离子淌度分离室行波振幅37V，采集膜蛋白复合物BtuCD、各蛋白质标准品的离子淌度数据；

第四步，将第三步得到的离子淌度数据经Masslynx和Driftscope软件处理，得到BtuCD膜蛋白复合物、各蛋白质标准品的漂移时间分布；

第五步，根据蛋白质标准品的漂移时间分布和理论碰撞横截面积，以及BtuCD膜蛋白复合物的漂移时间分布，得到BtuCD膜蛋白复合物的碰撞横截面积，最后根据漂移时间分布和碰撞横截面积，分析BtuCD膜蛋白复合物。

表1 DDM和C8E5存在下的BtuCD膜蛋白复合物的质谱分析结果

表1为分别在DDM和C8E5存在下的BtuCD膜蛋白复合物的质谱分析结果，由CCS结果可知，BtuCD膜蛋白复合物处于更低的能量状态，而且结构更为紧密，更接近天然状态。

图1为BtuCD膜蛋白复合物分别在DDM和C8E5存在下不同能态条件下的信号相对强度。可见，在很低的激发条件下就可以在C8E5获得较好信号。

图2为BtuCD膜蛋白复合物在DDM和C8E5存在条件下的平均电荷态。其中，BtuCD膜蛋白复合物在DDM存在条件下的平均电荷态为22.5，BtuCD膜蛋白复合物在C8E5存在条件下的平均电荷态约为18，较低的电荷态预示着蛋白质复合物的稳定性增强，说明BtuCD膜蛋白复合物在C8E5存在条件下结构更为稳定。

图3为BtuCD膜蛋白复合物分别在C8E5和DDM存在下的CIU(collision inducedunfolding)。(a)为BtuCD膜蛋白复合物在C8E5中的离子淌度质谱图，(b)为(a)中完整膜蛋白复合物，以及各种亚复合物以及单体的随能量变化的分布，(c)为BtuCD膜蛋白复合物在DDM中的离子淌度质谱图。可以看到在C8E5中蛋白质复合物的CCS(平均横截面积)更小，稳定性增强。

图4为BtuCD膜蛋白复合物在C8E5中在不同碰撞电压(collision voltage)下的存在状态。在这一系列图中，从下往上，碰撞能量逐渐升高。在每个质谱图中，处于较低电荷态为蛋白质单体，处于较高电荷态的是完整的蛋白质复合物。由于C8E5对于膜蛋白复合物的稳定作用，可以在较低能态下就可以观察到完整的复合物(Cone voltage＝100V)。随着碰撞电压的升高，膜蛋白亚复合物和膜蛋白的单体在质谱图上逐渐出现。

Claims (5)

1.使用五甘醇单八烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法，其特征在于，具体步骤如下：

第一步，将纯化的膜蛋白复合物在五甘醇单八烷基醚存在下用超滤膜进行脱盐处理，将脱盐后的膜蛋白复合物置换到含有五甘醇单八烷基醚的、pH8.0的醋酸铵缓冲液中，蛋白质标准品置换到pH7.4的醋酸铵缓冲液中；

第二步，将第一步得到的膜蛋白复合物溶液采用含有五甘醇单八烷基醚的醋酸铵缓冲溶液进行透析，进一步去除原始溶液中的表面活性剂，得到含有五甘醇单八烷基醚的膜蛋白复合物溶液；

第三步，在相同的质谱条件下，分别对溶液中含有五甘醇单八烷基醚的膜蛋白复合物和蛋白质标准品进行质谱分析，获得其非变性质谱数据并采集各自的离子淌度数据；

第四步，将得到的离子淌度数据处理，得到膜蛋白复合物和蛋白质标准品的漂移时间分布；

第五步，根据蛋白质标准品的漂移时间分布和理论碰撞横截面积，以及膜蛋白复合物的漂移时间分布，得到膜蛋白复合物的碰撞横截面积。

2.根据权利要求1所述的非变性质谱分析方法，其特征在于，第一步中，所述的膜蛋白复合物为BtuCD膜蛋白复合物、ATPase复合物、血红素转运蛋白复合物、铁转运蛋白复合物或未知的膜蛋白复合物。

3.根据权利要求1所述的非变性质谱分析方法，其特征在于，第一步中，膜蛋白复合物脱盐时，温度为4℃，离心转速为14000rcf，时间不低于30min，重复不少于5次。

4.根据权利要求1所述的非变性质谱分析方法，其特征在于，第一步中，所述的蛋白质标准品为乙醇脱氢酶、刀豆蛋白、抗生物素蛋白、β-乳球蛋白、肌球蛋白、细胞色素c和血清淀粉样蛋白。

5.根据权利要求1所述的非变性质谱分析方法，其特征在于，第三步中，离子淌度质谱仪条件为：针尖电压1.5kV，锥孔电压10V，源补偿电压10V，一级碰撞室电压2V，二级碰撞室电压2V，一级碰撞室和离子淌度分离室之间的反电压28V，碰撞室内氩气流速2mL/min，氦气室气体流速150mL/min，离子淌度分离室中用氮气做分离气体且流速为60mL/min，离子淌度分离室行波速度1100m/s，离子淌度分离室行波振幅37V。

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