CN112213164A - 一种总蛋白提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种总蛋白提取试剂盒及提取方法，所述试剂盒包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III和助剂，所述缓冲液I在使用前需加入助剂，以对组织样本进行裂解。所述方法按照预处理蛋白提取样本与配置蛋白提取缓冲液，将蛋白提取缓冲液与蛋白提取样本混合；离心除去不溶物，沉淀杂质蛋白，然后再次离心，除去杂质；重复溶解、沉淀蛋白质；对得到的蛋白质进行干燥，溶解，储存备用的步骤进行。本发明所提供的总蛋白提取试剂盒，成分简单，成本低，适用范围广，所述方法操作简便，调节易控，提取效率高，质量好。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质分析技术领域，具体涉及一种总蛋白提取试剂盒及提取方法。
背景技术
蛋白质组指基因组表达的所有相应蛋白质的集合，即细胞、组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。相比基因组，蛋白质组是一个动态的概念，蛋白质组受到环境因素的影响而发生动态的改变。因此，通过检测蛋白质的蛋白种类变化，对细胞生理病理过程相关的分子机制研究，药物靶点的发现和疾病的诊断都有重要意义。液相色谱-质谱技术(LC-MS/MS)已被广泛用于大规模的蛋白组学，也是目前蛋白质组分析的主流技术。液相色谱-质谱技术通过提取细胞内全蛋白组并进行酶切，对产生的大量多肽片段进行液相色谱分析，然后经质谱进一步离子化和质荷比鉴定，通过生物信息手段对各多肽片段的质荷比进行计算得到其氨基酸组成，最终通过数据库检测比对后获得蛋白质的序列和种类信息。
急性胰腺炎涉及多种病理生理途径的变化，包括炎症、微循环功能障碍、细胞氧化应激反应、凋亡和坏死等，揭示胰腺炎早期的复杂蛋白质组变化能够为胰腺炎发病机制的研究提供新的帮助。
截至目前，胰腺炎相关的蛋白组学报道较少，且坚定蛋白数目极少，最新2018年的胰腺癌蛋白组学定量仅鉴定997种，远低于哺乳动物中定量蛋白组学平均约5000个蛋白质的鉴定数目。但是，液相色谱-质谱技术检测蛋白质组对样本的要求较高，样本提取的蛋白质质量会对鉴定的蛋白质组数目产生直接影响。目前传统的蛋白质组提取方法或试剂盒提取的总蛋白数量和种类少，蛋白易降解，质量差，均无法在以胰腺炎组织为样本的蛋白质组学应用中取得较好的效果。
因此，有必要提供一种总蛋白提取试剂盒及提取方法，其可以显著提高用于蛋白组学检测的总蛋白数量和质量，提高鉴定效率。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，设计出一种总蛋白提取试剂盒及提取方法，所述试剂盒通过设置不同浓度、组分的缓冲液，以及设定特定的提取条件，有助于在蛋白提取过程的裂解阶段、纯化阶段及沉淀阶段提高效率和提取质量，能够显著提高胰腺炎蛋白质组学中蛋白质的鉴定数目，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
第一方面，提供了一种总蛋白提取试剂盒，其中，所述试剂盒包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III和助剂，
所述缓冲液I在使用前需加入助剂，以对组织样本进行裂解。
第二方面，提供了一种总蛋白提取方法，优选采用第一方面所述的试剂盒进行，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤1，预处理蛋白提取样本与配置蛋白提取缓冲液，然后将蛋白提取缓冲液与蛋白提取样本混合；
步骤2，离心除去不溶物，沉淀杂质蛋白，然后再次离心，除去杂质；
步骤3，重复溶解、沉淀蛋白质；
步骤4，对步骤3中获得的蛋白质进行干燥，溶解，储存备用。
第三方面，提供了一种第一方面所述试剂盒在提取蛋白组学检测样本方面的用途。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明所提供的总蛋白提取试剂盒，成分简单，成本低，适用范围广；
(2)本发明所提供的总蛋白提取试剂盒，鉴定数目高，可将鉴定的胰腺炎蛋白质组数目提高至约3000个，能够推动急性胰腺炎蛋白质组学潜在靶点筛选；
(3)本发明所提供的总蛋白提取方法，操作简便，调节易控，提取效率高，质量好。
附图说明
图1示出根据本发明实验例1中所述的质谱鉴定蛋白维恩图；
图2示出根据本发明实验例2中所述的GO注释总图；
图3示出根据本发明实验例3中所述的非冗余蛋白GO分类图；
图4示出根据本发明实验例4中所述的全部非冗余蛋白KEGG图；
图5示出本发明实施例1、实施例16和实施例17所述样本的质谱鉴定代表性肽段谱图；
图6示出本发明实施例1、实施例16和实施例17所述样本的质谱搜库鉴定蛋白列表前10个蛋白的信息。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明的第一方面，提供了一种总蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III和助剂，
所述缓冲液I在使用前需加入助剂，以对组织样本进行裂解；
所述缓冲液II用于溶解初提的蛋白质，缓冲液III用于溶解最终提取的蛋白质。
根据本发明一种优选的实施方式，所述缓冲液I包括Tris-HCl缓冲液、离液剂一、表面活性剂一、螯合剂一和还原剂一。
在进一步优选的实施方式中，所述离液剂一为尿素和/或硫脲，优选为尿素。
其中，所述离液剂一可破坏氢键和亲水相互作用使蛋白折叠展开，从而暴露出电离基团促进蛋白溶解。尿素可以有效地破坏蛋白质二级结构，硫脲虽然可以增加蛋白质的溶解性，但可能会影响十二烷基硫酸钠和蛋白的结合，因此，本申请中优选选择尿素为离液剂。
在更进一步优选的实施方式中，所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为100～200mM，优选为120～170mM，如150mM；
所述尿素的终浓度为5～10M，优选为7～9M，如8M。
在本发明中，所述各组分的终浓度为试剂盒使用过程中各组分的使用浓度。
根据本发明一种优选的实施方式，所述表面活性剂一包括离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，其中，
所述离子型表面活性剂优选为十二烷基硫酸钠(SDS)，
所述非离子型表面活性剂选自辛基葡糖苷、十二烷基麦芽糖苷、Triton X-100和酰胺硫代甜菜碱中的一种。
在进一步优选的实施方式中，所述表面活性剂一为SDS和Triton X-100。
其中，SDS可以有效地溶解疏水性蛋白和膜蛋白，而Triton X-100不产生变性作用，能够确保蛋白溶解和防止蛋白聚集。本发明人研究发现，将SDS和Triton X-100联合使用作为表面活性剂，能够显著增强蛋白溶解性。
在更进一步优选的实施方式中，所述SDS的最终质量分数为0.3～0.8％，优选为0.5％；
所述Triton X-100的最终质量分数为0.8～1.8％，优选为1.0～1.5％，如1.2％。
本发明人研究发现，当SDS和Triton X-100的最终质量分数为上述范围时，优选SDS的最终质量分数为0.5％，Triton X-100的最终质量分数为1.2％时，既能确保蛋白有效溶解又不产生过度变性。
根据本发明一种优选的实施方式，所述螯合剂一选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸中的两种或多种，优选为乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)。
在本发明中，在蛋白提取的缓冲液中加入螯合剂，能够控制反应中金属离子浓度或去除金属离子，以保持提取的蛋白质的活性。
在进一步优选的实施方式中，所述EDTA的终浓度为10～30mM，优选为15～25mM，更优选为20mM；
所述EGTA的终浓度为10～30mM，优选为15～25mM，更优选为20mM。
本发明人发现，将EDTA和EGTA的终浓度设定为上述范围时，提取的蛋白活性最好。
根据本发明一种优选的实施方式，所述还原剂一选自三丁基氧膦(TBP)、磷酸三氯乙酯(TCEP)、聚乙烯基聚吡咯烷酮、抗坏血酸中的两种。
在进一步优选的实施方式中，所述还原剂一为聚乙烯基聚吡咯烷酮和抗坏血酸。
在本发明中，加入还原剂是为了提供一个强的还原环境，从而可有效地防止多酚氧化成多醌，以抑制多种蛋白酶的活性。
在更进一步优选的实施方式中，所述聚乙烯基聚吡咯烷酮的最终质量分数为1～3％，优选为1.5～2.5％，更优选为2％。
在本发明中，将聚乙烯基聚吡咯烷酮的最终质量分数设定为上述范围，有利于增加蛋白溶解性，同时又不会导致聚乙烯基聚吡咯烷酮与提取物的共沉淀反应。
优选地，所述抗坏血酸的终浓度为2～8mM，优选为3～6mM，如5mM。
本发明人研究发现，抗坏血酸的终浓度为2～8mM，优选为3～6mM，如5mM时，还原效果好，同时不会增加质谱图谱尾部背景峰。
根据本发明一种优选的实施方式，所述助剂包括磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、二流苏糖醇(DTT)和N-乙基马来酰亚胺。
在进一步优选的实施方式中，所述磷酸酶抑制剂选自氟化钠、钒酸钠或甘油-2-磷酸中的两种，
优选地，所述磷酸酶抑制剂为氟化钠和甘油-2-磷酸。
在更进一步优选的实施方式中，所述氟化钠的终浓度为30～70mM，优选为40～60mM，更优选为50mM；
所述甘油-2-磷酸的最终质量分数为0.5～2％，优选为0.8～1.4％，如1％。
在本发明中，选择上述终浓度范围的氟化钠可高效稳定修饰蛋白的降解；选择上述最终质量分数范围的甘油-2-磷酸既可抑制磷酸酶活性，又不会增加质谱背景峰。
根据本发明一种优选的实施方式，所述蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟(PMSF)和100×蛋白酶抑制剂。
其中，所述100×蛋白酶抑制剂为现有技术中常见的蛋白酶抑制剂，如Roche的Cat.No.04693132001。
在本发明中，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和100×蛋白酶抑制剂能够有效抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解。
在进一步优选的实施方式中，所述苯甲基磺酰氟(PMSF)的终浓度为0.5～1.5mM，优选为0.8～1.2mM，更优选为1mM。
根据本发明一种优选的实施方式，所述DTT的终浓度为3～8mM，优选为4～6mM，如5mM；
所述N-乙基马来酰亚胺的终浓度为10～30mM，优选为15～25mM，更优选为20mM。
其中，所述DTT是一种强还原剂，能够还原RNA酶中的二硫键，抑制RNA酶，促进蛋白酶消化组织；N-乙基马来酰亚胺为泛素酶抑制剂，可高效抑制泛素化蛋白降解。
在本发明中，选择上述终浓度的DTT和N-乙基马来酰亚胺，有利于抑制泛素化蛋白降解。
根据本发明一种优选的实施方式，所述缓冲液II包括Tris-HCl/PBS缓冲液、离液剂二、表面活性剂二、螯合剂二和还原剂二。
其中，所述Tris-HCl/PBS缓冲液是指以PBS(KH2PO4 2mM，Na2HPO4 8mM，NaCl136mM，KCl 2.6mM)为溶剂配制150mM Tris缓冲液，并用浓盐酸调整pH至7.6。
在进一步优选的实施方式中，所述Tris-HCl/PBS缓冲液的终浓度为30～70mM，优选为40～60mM，如50mM。
其中，将Tris-HCl/PBS缓冲液的终浓度设置为30～70mM，优选为40～60mM，如50mM，能够稳定提取体系酸碱值。
根据本发明一种优选的实施方式，所述离液剂二为尿素和/或硫脲，优选为尿素。
在进一步优选的实施方式中，所述尿素(离液剂二)的终浓度为6～10M，优选为7～9M，如8M。
根据本发明一种优选的实施方式，所述表面活性剂二为SDS、辛基葡糖苷、十二烷基麦芽糖苷、Triton X-100和酰胺硫代甜菜碱中的一种，优选为SDS。
在进一步优选的实施方式中，所述SDS的最终质量分数为0.5～1.8％，优选为0.8～1.5％，如1％。
其中，选择SDS的最终质量分数为上述范围时，既能确保蛋白有效溶解，又不产生过度变性。
根据本发明一种优选的实施方式，所述螯合剂二选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸中的一种，优选为EDTA。
在进一步优选的实施方式中，所述EDTA的终浓度为7～13mM，优选为8～12mM，如10mM。
其中，选择EDTA的终浓度为上述范围，提取的蛋白活性最好。
根据本发明一种优选的实施方式，所述还原剂二为2-巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇(DTE)中的一种，优选为DTT。
在进一步优选的实施方式中，所述DTT的终浓度为3～9mM，优选为4～8mM，更优选为5mM。
其中，所述缓冲液II的pH为7～8，如7.6。
根据本发明一种优选的实施方式，所述缓冲液III包括尿素和TEAB溶液，其中，
所述尿素的终浓度为4～12M，优选为6～10M，如8M；
所述TEAB溶液的终浓度为30～70mM，优选为40～60mM，如50mM。
在本发明中，所述尿素和TEAB的作用是溶解提取总蛋白，其中，TEAB为无离子型酸碱缓冲液，兼容质谱，选用上述终浓度范围尿素和TEAB，既可保证最终提取蛋白在上样前的稳定性，同时又可兼容质谱。
在进一步优选的实施方式中，所述试剂盒还包括丙酮和甲醇。
本发明的第二方面，提供了一种总蛋白提取方法，优选采用第一方面所述的试剂盒进行，所述方法包括以下步骤：
步骤1，预处理蛋白提取样本与配置蛋白提取缓冲液，然后将蛋白提取缓冲液加入到蛋白提取样本中；
步骤2，离心除去不溶物，沉淀杂质蛋白，然后再次离心，除去杂质；
步骤3，重复溶解、沉淀蛋白质；
步骤4，对步骤3中获得的蛋白质进行干燥，溶解，储存备用。
以下进一步描述所述方法：
步骤1，预处理蛋白提取样本与配置蛋白提取缓冲液，然后将蛋白提取缓冲液加入到蛋白提取样本中。
其中，所述预处理为将组织样本用液氮预冷，然后用预冷的研钵和研杵将组织样本研磨成细粉末。
根据本发明一种优选的实施方式，所述蛋白提取缓冲液为在缓冲液I中加入助剂配置而成，
其中，所述缓冲液I包括Tris-HCl缓冲液、离液剂一、表面活性剂一、螯合剂一和还原剂一；
所述助剂包括磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、二流苏糖醇(DTT)和N-乙基马来酰亚胺。
在进一步优选的实施方式中，所述离液剂一为尿素和/或硫脲，优选为尿素；
所述表面活性剂一为SDS和Triton X-100；
所述螯合剂一选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸中的两种或多种，优选为乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)；
所述还原剂一选自三丁基氧膦(TBP)、磷酸三氯乙酯(TCEP)、聚乙烯基聚吡咯烷酮、抗坏血酸中的两种，优选为聚乙烯基聚吡咯烷酮和抗坏血酸。
在更进一步优选的实施方式中，所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为100～200mM，优选为120～170mM，如150mM；
所述尿素的终浓度为5～10M，优选为7～9M，如8M；
所述SDS的最终质量分数为0.3～0.8％，优选为0.5％；
所述Triton X-100的最终质量分数为0.8～1.8％，优选为1.0～1.5％，如1.2％；
所述EDTA的终浓度为10～30mM，优选为15～25mM，更优选为20mM；
所述EGTA的终浓度为10～30mM，优选为15～25mM，更优选为20mM；
所述聚乙烯基聚吡咯烷酮的最终质量分数为1～3％，优选为1.5～2.5％；
所述抗坏血酸的终浓度为2～8mM，优选为3～6mM，如5mM。
根据本发明一种优选的实施方式，所述磷酸酶抑制剂选自氟化钠、钒酸钠或甘油-2-磷酸中的两种，
优选地，所述磷酸酶抑制剂为氟化钠和甘油-2-磷酸；
所述蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟(PMSF)和100×蛋白酶抑制剂。
在进一步优选的实施方式中，所述氟化钠的终浓度为30～70mM，优选为40～60mM，更优选为50mM；
所述甘油-2-磷酸的最终质量分数为0.5～2％，优选为0.8～1.4％，如1％；
所述苯甲基磺酰氟(PMSF)的终浓度为0.5～1.5mM，优选为0.8～1.2mM，更优选为1mM；
所述DTT的终浓度为3～8mM，优选为4～6mM，如5mM；
所述N-乙基马来酰亚胺的终浓度为10～30mM，优选为15～25mM，更优选为20mM。
根据本发明一种优选的实施方式，所述蛋白提取缓冲液按照体积重量比为(1～5)：1加入到蛋白提取样本中，
优选体积重量比为(2～4)：1，更优选为3:1。
其中，将蛋白缓冲液加入到蛋白提取样本中混合后，迅速振荡混匀。
步骤2，离心除去不溶物，沉淀杂质蛋白，然后再次离心，除去杂质。
根据本发明一种优选的实施方式，对步骤1中处理后的组织样本进行离心，所述离心在4℃下进行，
所述离心速度为10000～20000g，优选为13000～17000g，更优选为16000g；
所述离心时间为10～30min，优选为15～25min，更优选为20min。
其中，在离心后，观察是否仍有不溶物存在，若有，则重复离心，直至不存在不溶物；若无，则继续后续操作。
根据本发明一种优选的实施方式，所述沉淀为将离心后除去不溶物的上清与丙酮、甲醇混合物混合，并在-20℃下过夜沉淀杂质蛋白。
其中，所述杂质蛋白为生成的尿素-甲醇蛋白。
在进一步优选的实施方式中，所述除去不溶物的上清与丙酮、甲醇混合物的体积比为1：(2～5)，优选为1：(2～4)，更优选为1:3。
其中，所述丙酮和甲醇在混合前经过预冷处理。在本发明中，将除去不溶物的上清与丙酮、甲醇混合物的体积比设置为1：(2～5)，优选为1：(2～4)，更优选为1:3时，有利于高效去除样品中脂质等非蛋白有机成分。
在更进一步优选的实施方式中，所述丙酮与甲醇的体积比为(8～18)：1，优选为(10～15):1，如12:1。
本发明人研究发现，丙酮与甲醇的体积比为(8～18)：1，优选为(10～15):1，如12:1，有利于高效去除非蛋白有机成分。
根据本发明一种优选的实施方式，所述再次离心为取过夜沉淀的体系的蛋白质上清液进行离心，所述离心在4℃下进行，
所述离心速度为10000～20000g，优选为13000～17000g，更优选为16000g；
所述离心时间为10～30min，优选为15～25min，更优选为20min。
在进一步优选的实施方式中，对上述离心得到的蛋白质沉淀用洗涤液进行洗涤，
所述洗涤液包括丙酮、甲醇和水，三者的体积比为(8～16)：(0.5～1.6)：1.4，优选为(10～14)：(0.8～1.2)：1.4，更优选为12:1:1.4。
在本发明中，采用洗涤液冲洗蛋白质沉淀，是为了除去其中残留的提取物色素成分(色素来源于有色细胞培养基或有色组织)与尿素沉淀物。
其中，将丙酮、甲醇和水，三者的体积比设置为(8～16)：(0.5～1.6)：1.4，优选为(10～14)：(0.8～1.2)：1.4，更优选为12:1:1.4，有利于去除非蛋白有机成分及微量水溶性非蛋白有机成分。
其中，所述丙酮、甲醇和水均为经过预冷处理的，所述水为双蒸水。
步骤3，重复溶解、沉淀蛋白质。
其中，将步骤2中得到的蛋白质沉淀在空气中干燥，然后重新溶解于缓冲液II中，重复4℃离心后，沉淀用丙酮、甲醇和水的混合液对沉淀进行洗涤，三者的体积比为(8～16)：(0.5～1.6)：1.4，优选为(10～14)：(0.8～1.2)：1.4，更优选为12:1:1.4。
根据本发明一种优选的实施方式，所述蛋白质沉淀与缓冲液II的重量体积比为1:1。
根据本发明一种优选的实施方式，所述缓冲液II包括Tris-HCl/PBS缓冲液、离液剂二、表面活性剂二、螯合剂二和还原剂二。
在进一步优选的实施方式中，所述离液剂二为尿素和/或硫脲，优选为尿素；
所述表面活性剂二为SDS、辛基葡糖苷、十二烷基麦芽糖苷、Triton X-100和酰胺硫代甜菜碱中的一种，优选为SDS；
所述螯合剂二选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸中的一种，优选为EDTA；
所述还原剂二为2-巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇(DTE)中的一种，优选为DTT。
在更进一步优选的实施方式中，所述Tris-HCl/PBS缓冲液的终浓度为30～70mM，优选为40～60mM，如50mM；
所述尿素(离液剂二)的终浓度为6～10M，优选为7～9M，如8M；
所述SDS的最终质量分数为0.5～1.8％，优选为0.8～1.5％，如1％；
所述EDTA的终浓度为7～13mM，优选为8～12mM，如10mM；
所述DTT的终浓度为3～9mM，优选为4～8mM，更优选为5mM。
其中，将蛋白质重悬液按上述步骤依次进行离心、洗涤和重悬，重复两次。
根据本发明一种优选的实施方式，对上述经过多次沉淀、悬浮的蛋白质沉淀进行离心处理，所述离心在4℃下进行，
所述离心速度为10000～20000g，优选为13000～17000g，更优选为16000g；
所述离心时间为10～30min，优选为15～25min，更优选为20min。
在进一步优选的实施方式中，将离心得到的蛋白质沉淀采用步骤2中的洗涤液冲洗2～5次，如3次。
步骤4，对步骤3中获得的蛋白质进行干燥，溶解，储存备用。
其中，将步骤3中获得的蛋白质沉淀在空气中干燥，并重新溶解于缓冲液III中，所述蛋白质沉淀与缓冲液III的重量体积比为1:1。
根据本发明一种优选的实施方式，所述缓冲液III包括尿素和TEAB溶液，其中，
所述尿素的终浓度为4～12mM，优选为6～10mM，如8mM；
所述TEAB溶液的终浓度为30～70mM，优选为40～60mM，如50mM。
在本发明中，所述溶解的蛋白质储存在-80℃中备用。
本发明的第三方面，提供了一种第一方面所述试剂盒在提取蛋白组学检测样本方面的用途，如在提取胰腺蛋白组学检测样本方面的用途。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
在下述实施例中，试剂的来源如下：
尿素、SDS、Triton X-100、EDTA、EGTA、聚乙烯基吡咯烷酮、抗坏血酸、氟化钠、PMSF、DTT、1％的甘油-2磷酸和N-乙基马来酰亚胺和DTT均购自sigma，100×蛋白酶抑制剂购自Roche，产品批号为Cat.No.04693132001，TEAB购自Thermo Scientific。
实施例1
步骤1，取100g胰腺炎组织样本(来自大鼠牛磺胆酸钠诱导急性胰腺炎病变胰腺)置于液氮中冻存，然后使用液氮预冷的研钵和研杵将组织样本研磨成细粉末；
将助剂加入缓冲液I中制备蛋白提取缓冲液，其中，缓冲液I包括：终浓度为150mM的Tris-HCl缓冲液，终浓度为8M的尿素，质量分数为0.5％的SDS，质量分数为1.2％的Triton X-100，终浓度为20mM的EDTA，终浓度为20mM的EGTA，质量分数为2％的聚乙烯基吡咯烷酮，终浓度为5mM的抗坏血酸；
助剂包括：终浓度为50mM的氟化钠，终浓度为1mM的PMSF，终浓度为5mM的DTT，质量分数为1％的甘油-2磷酸，终浓度为20mM的N-乙基马来酰亚胺，100×蛋白酶抑制剂；
将上述制备的蛋白提取缓冲液添加到研磨后的组织中，冷冻组织粉末与蛋白提取缓冲液的比例为1:3(重量：体积)，然后快速振荡。
步骤2，将步骤1中获得的组织样本于4℃下16000g离心20分钟除去细胞碎片，观察是否仍有不溶物存在，若有，则重复离心，直至不存在不溶物；若无，则继续后续操作；
将离心后除去不溶物后的上清与3倍体积的预冷丙酮和甲醇(丙酮和甲醇的体积比为12:1)进行混合，然后在-20℃下过夜沉淀尿素-甲醇蛋白；
取上清液再次在4℃16000g离心20分钟，对离心得到的蛋白质沉淀用30ml预冷的丙酮、甲醇、水(体积比为12:1:1.4)混合物冲洗，以除去残留的色素与尿素沉淀物。
步骤3，将上述得到的蛋白质沉淀在空气中干燥，然后重新溶解于9ml缓冲液II中，4℃16000g离心20分钟，沉淀用30ml预冷的丙酮、甲醇、水(体积比为12:1:1.4)混合物冲洗，其中，
缓冲液II包括：终浓度为50mM的Tris-HCl/PBS缓冲液，终浓度为8M的尿素，质量分数为1％的SDS，终浓度为5mM的DTT，终浓度为10mM的EDTA，pH为7.6；
蛋白质重悬液按上述步骤依次进行离心、洗涤和重悬，重复两次；
将上述体系在4℃下16000g离心20分钟，将得到的蛋白质沉淀采用预冷的丙酮、甲醇、水(体积比为12:1:1.4)混合物冲洗三次。
步骤4，将步骤3中获得的蛋白质沉淀在空气中干燥并重新溶解于3ml缓冲液III中，其中，所述缓冲液III包括终浓度为8M的尿素和终浓度为50mM的TEAB；将溶解的蛋白质储存在-80℃中备用。
实施例2
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，缓冲液I中SDS的最终质量分数为0.8％，Triton X-100的最终质量分数为1.5％。
实施例3
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，缓冲液I中SDS的最终质量分数为0.3％，Triton X-100的最终质量分数为0.8％。
实施例4
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，缓冲液I中EDTA的终浓度为15mM，EGTA的终浓度为10mM。
实施例5
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，缓冲液I中EDTA的终浓度为30mM，EGTA的终浓度为25mM。
实施例6
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，缓冲液I中聚乙烯基聚吡咯烷酮的最终质量分数为3％，抗坏血酸的终浓度为3mM。
实施例7
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，助剂中的磷酸酶抑制剂为氟化钠和钒酸钠。
实施例8
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，助剂中氟化钠的终浓度为70mM。
实施例9
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，助剂中PMSF的终浓度为0.5mM，DTT的终浓度为3mM，N-乙基马来酰亚胺的终浓度为10mM。
实施例10
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，助剂中PMSF的终浓度为1.2mM，DTT的终浓度为6mM，N-乙基马来酰亚胺的终浓度为25mM。
实施例11
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤2中，将离心后除去不溶物后的上清与4倍体积的预冷丙酮和甲醇(丙酮和甲醇的体积比为18:1)进行混合，然后在-20℃下过夜沉淀尿素-甲醇蛋白。
实施例12
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤2中，将离心后除去不溶物后的上清与2倍体积的预冷丙酮和甲醇(丙酮和甲醇的体积比为8:1)进行混合，然后在-20℃下过夜沉淀尿素-甲醇蛋白。
实施例13
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤2中，取上清液再次在4℃16000g离心20分钟，对离心得到的蛋白质沉淀用30ml预冷的丙酮、甲醇、水(体积比为16:1.2:1.4)混合物冲洗。
实施例14
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤3中，缓冲液II中，采用TritonX-100替代SDS，采用柠檬酸替代EDTA。
实施例15
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤3中，缓冲液II中，采用2-巯基乙醇替代DTT。
实施例16
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，胰腺炎组织样本来自雨蛙肽诱导急性胰腺炎大鼠病变胰腺。
实施例17
本实施例所述方法与实施例1相似，区别在于，步骤1中，胰腺炎组织样本来自L-精氨酸诱导急性胰腺炎大鼠病变胰腺。
实验例
实验例1
选取样本1、2、3(1，2，3分别为实施例1、实施例16和实施例17提取的蛋白质)，应用Q-ExactiveHFX质谱检测系统，thermo scientific得到质谱鉴定蛋白维恩图，结果如图1所示，其中，质谱鉴定原始代表性肽段谱图如图5所示(由上到下依次为样本1～3)，质谱鉴定蛋白代表性前10个蛋白如图6所示。
由图1可知看出，样本1、2、3分别含有2842、2816、2664个蛋白，说明与目前最新已报道文献中鉴定997个蛋白样品相比，本发明实施例所述方法极大提高了最易降解胰腺组织(胰腺中含有大量蛋白酶类，是蛋白提取中最易降解组织)中蛋白鉴定数目。
实验例2
采用Q-Exactive HFX质谱检测系统，thermo scientific对实验例1中所述胰腺炎组织样本1～3进行鉴定，得到GO注释总图，结果如图2所示。
由图2可知，去除重复后三个样本共有3628个蛋白，其中，984个蛋白有BP注释，681个蛋白有CC注释，703个蛋白有MF注释，表明本发明实施例所述方法提取各种蛋白覆盖类别完整。其中，BP(生物过程)含25亚类，CC(细胞成分)含8亚类，MF(分子功能)含14亚类。
实验例3
采用Q-Exactive HFX质谱检测系统，thermo scientific对实验例1中所述胰腺炎组织样本1～3进行鉴定，得到了非冗余蛋白GO分类图，结果如图3所示。
由图3可知，根据细胞成分、分子功能、生物过程三大组件对蛋白进行GO注释分类后，可知蛋白样本主要分布在细胞，尤其是细胞器和细胞膜等部位。蛋白的分子功能主要为结合，其次为催化活性，主要参与细胞功能进程和生物学调控。其中，细胞功能进程和生物学调控蛋白多存在磷酸化修饰调控及泛素化降解途径，但同时又是价值较高的兴趣蛋白，图3提示本发明所述蛋白提取方法可较好稳定提取价值较高的生物过程蛋白，而非仅仅提高背景蛋白提取量来增加质谱鉴定蛋白数目。
实验例4
采用Q-Exactive HFX质谱检测系统，thermo scientific对实验例所述胰腺炎组织样本1～3进行鉴定，得到了全部非冗余蛋白KEGG分类图，结果如图4所示，其中，A为细胞处理，B为环境信息处理，C为遗传信息处理；D为新陈代谢系统，E为组织系统。
由图4可知，本发明实施例提取的蛋白主要分布于B类中的信号传导(signaltransduction)相关代谢通路，进一步确证图3中所示本发明提取蛋白效果不仅提高蛋白提取浓度及稳定性，同时保证了蛋白提取的质量，所提蛋白经质谱鉴定主要集中于潜在研究价值较高的信号通路相关类别。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种总蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III和助剂，其中，
所述缓冲液I在使用前需加入助剂，以对组织样本进行裂解。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I包括Tris-HCl缓冲液、离液剂一、表面活性剂一、螯合剂一和还原剂一，
所述离液剂一为尿素和/或硫脲；
所述表面活性剂一包括离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂；
所述螯合剂一选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸中的两种或多种；
所述还原剂一选自三丁基氧膦(TBP)、磷酸三氯乙酯(TCEP)、聚乙烯基聚吡咯烷酮、抗坏血酸中的两种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述助剂包括磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、二流苏糖醇(DTT)和N-乙基马来酰亚胺。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸酶抑制剂选自氟化钠、钒酸钠或甘油-2-磷酸中的两种；
优选为氟化钠和甘油-2-磷酸。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液II包括Tris-HCl/PBS缓冲液、离液剂二、表面活性剂二、螯合剂二和还原剂二，其中，
所述离液剂二为尿素和/或硫脲；
所述表面活性剂二为SDS、辛基葡糖苷、十二烷基麦芽糖苷、Triton X-100和酰胺硫代甜菜碱中的一种；
所述螯合剂二选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸中的一种；
所述还原剂二为2-巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇(DTE)中的一种。
6.一种总蛋白提取方法，优选采用权利要求1至5之一所述的试剂盒进行，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，预处理蛋白提取样本与配置蛋白提取缓冲液，然后将蛋白提取缓冲液与蛋白提取样本混合；
步骤2，离心除去不溶物，沉淀杂质蛋白，然后再次离心，除去杂质；
步骤3，重复溶解、沉淀蛋白质；
步骤4，对步骤3中获得的蛋白质进行干燥，溶解，储存备用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述蛋白提取缓冲液按照体积重量比为(1～5)：1加入到蛋白提取样本中。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述离心除去不溶物的操作在4℃下进行，离心速度为10000～20000g，离心时间为10～30min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述沉淀杂质蛋白为将离心后除去不溶物的上清与丙酮、甲醇混合物混合，
所述丙酮与甲醇的体积比为(8～18)：1。
10.一种权利要求1至5之一所述的试剂盒在提取蛋白组学检测样本方面的用途。
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