CN111518191B - 一种乳凝集素特征肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于乳凝集素检测技术领域，本发明提供了一种乳凝集素特征肽及其应用。所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述内标肽是将所述特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸和异亮氨酸，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。本发明通过筛选乳凝集素的特征肽，获取特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱‑质谱联用的分析技术，实现了乳凝集素的定量检测，该方法具有较好的线性、特异性、灵敏度、回收率和精密度。

Description

一种乳凝集素特征肽及其应用
技术领域
本发明涉及乳凝集素检测技术领域，尤其涉及一种乳凝集素特征肽及其应用。
背景技术
乳脂肪球膜(milk fat globule membrane,MFGM)蛋白是人乳中除乳清蛋白和酪蛋白以外的第三大蛋白组分，占人乳中总蛋白质含量的1％～4％。近年来已有多项研究证实了MFGM在调节肠道微生物菌群、促进肠道上皮和神经肌肉的发育以及预防感染等多方面的积极作用，MFGM蛋白由此受到日益广泛的关注。然而，目前国内外的研究对于MFGM的成分尚未完全阐明，有文献报道人乳中MFGM蛋白的种类多达191种，具有参与细胞间信号传导、免疫调节、能量代谢以及抵御多种细菌和病毒感染等多种功能。其中乳凝集素(lactadherin,LDH)是目前备受关注的一种MFGM蛋白，又称乳脂肪球表皮生长因子8(milkfat globule epidermal growth factor 8,MFG-E8)，是MFG-E8基因编码的一种免疫源性的亲脂糖蛋白，由387个氨基酸残基(如SEQ ID No.2所示)组成，分子量约为40.77KD。LDH由羧基末端和氨基末端两个不同的结构域组成，羧基末端包含两个与凝血因子V和凝血因子Ⅷ序列同源性的C样结构域，第二个C样结构域中的氨基酸残基能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸形成连接。氨基末端则包含两个相同的表皮生长因子样结构域，第二个表皮生长因子样结构域含有一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)结构，可结合巨噬细胞表面的α5β3蛋白，在凋亡细胞的清除过程中具有关键性的调节作用。人乳中的LDH还具有较强的抗轮状病毒感染能力。此外，LDH对肠黏膜也具有重要的保护作用。
然而，目前对MFGM蛋白检测方法的研究仍然以基于传统探索性的非靶向蛋白质组学的定性分析为主，而针对LDH蛋白的检测方法则更加匮乏。因此，尚缺少一种准确性强、灵敏度高的LDH的检测方法，用于人乳中LDH的定量测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳凝集素特征肽，用于人乳中乳凝集素的准确定量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种乳凝集素特征肽，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种乳凝集素特征肽的内标肽，所述内标肽是将所述特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸和异亮氨酸，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。
本发明还提供了所述乳凝集素特征肽在检测人乳中乳凝集素含量中的应用。
本发明还提供了所述乳凝集素特征肽检测人乳中乳凝集素含量的方法，包括如下步骤：
(1)制备待测样品：取人乳样品中加入所述内标肽，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(2)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测所述待测样品，得到所述特征肽和所述内标肽的峰面积，计算得到特征肽和内标肽的峰面积比；
(3)绘制标准曲线：将步骤(1)中的待测样品替换成乳凝集素特征肽系列标准溶液，按照步骤(2)的方法检测和计算，得到以特征肽和内标肽的峰面积比为纵坐标，以乳凝集素的浓度为横坐标的标准曲线；
(4)计算人乳样品中乳凝集素的含量：将步骤(2)得到的特征肽和内标肽的峰面积比代入所述标准曲线，得到人乳样品中乳凝集素的浓度，计算得到人乳样品中乳凝集素的含量。
优选的，所述内标肽的浓度为50～200nM，所述人乳样品和内标肽的体积比为2：(0.5～2)。
优选的，所述变性处理的试剂包括碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液，所述碳酸氢铵溶液的浓度为50～200nM，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为200～800nM，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为200～800nM，所述人乳样品、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液的体积比为(50～150)：790：10：30。
优选的，所述酶解处理的酶为胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.5～2mg/mL，所述胰蛋白酶溶液与人乳样品的体积比为(0.05～0.5):1。
优选的，所述终止处理的试剂为甲酸。
优选的，所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：AcquityBEH Peptide 300C18柱1.7μm，2.1×100mm；柱温：30～40℃；进样体积：5μL；样品温度：10～20℃；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，采用梯度洗脱；流速为0.3mL/min；所述质谱的条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测；毛细管电压3.5kV；离子源温度：125～175℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：800L/hour；鞘气温度：375℃，鞘气流量：50L/hour。
本发明还提供了一种检测乳凝集素含量的试剂盒，包括乳凝集素特征肽、所述乳凝集素特征肽的内标肽、胰蛋白酶溶液、碳酸氢钠溶液、碘代乙酰胺溶液、二硫苏糖醇溶液和甲酸，所述乳凝集素特征肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述内标肽的氨基酸序列为将所述特征肽中的缬氨酸和异亮氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过筛选LDH的特征肽，获取该特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱-质谱联用的分析技术，实现了LDH的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
(2)本发明选择LDH中的特征肽段作为检测物质，不仅适用于变性蛋白的检测，还可以满足样品中的变性与非变性蛋白的同时检测，保证了方法的准确性。
附图说明
图1为标准溶液和人乳样品的质谱图；
图2为乳凝集素特征肽段的酶解曲线图；
图3为乳凝集素特征肽的标准曲线。
具体实施方式
特异肽段的选择是靶向蛋白质组学检测技术中的关键步骤，它直接关系到定量方法的准确性。本发明选择特异性强、酶解较稳定且质谱响应较高的肽段EVTGIITQGAR(SEQID No.1)和VTFLGLQHWVPELAR，进一步研究发现，肽段EVTGIITQGAR的灵敏度更高。此外，特征肽的酶解特性也会影响方法的准确性和效率。本发明筛选LDH特征肽，并获取该特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱-质谱联用的分析技术，实现了人乳中LDH的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
本发明提供了一种乳凝集素特征肽，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种乳凝集素特征肽的内标肽，所述内标肽是将所述特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸和异亮氨酸，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。
本发明还提供了所述乳凝集素特征肽在检测人乳中乳凝集素含量中的应用。
本发明还提供了所述乳凝集素特征肽检测人乳中乳凝集素含量的方法，包括如下步骤：
(1)制备待测样品：在人乳样品中加入内标肽，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(2)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，得到所述特征肽和所述内标肽的峰面积，计算得到特征肽和内标肽的峰面积比；
(3)绘制标准曲线：将步骤(1)中的待测样品替换成乳凝集素特征肽系列标准溶液，按照步骤(2)的方法检测和计算，得到以特征肽和内标肽的峰面积比为纵坐标，以乳凝集素的浓度为横坐标的标准曲线；
(4)计算样品中乳凝集素的含量：将步骤(2)得到的所述征肽和内标肽的峰面积比代入所述标准曲线，得到人乳样品中乳凝集素的浓度，计算得到人乳样品中乳凝集素的含量。
本发明在人乳样品中加入内标肽后，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品。
在本发明中，所述人乳样品还优选进行了前处理，所述前处理优选包括均质和稀释。所述均质优选使用超声波细胞粉碎机进行均质，超声功率优选为500～800，进一步优选为600，总时间优选为2min，工作时间与间隙时间均独立的优选为10s，报警温度优选为28℃。
在本发明中，所述稀释的倍数优选为100～1000倍，进一步优选为300～800倍，再进一步优选为500倍。
在本发明中，所述稀释优选采用超纯水进行稀释。
在本发明中，所述内标肽的浓度优选为50～200nM，进一步优选为70～150nM，再进一步优选为100nM；所述人乳样品和内标肽的体积比优选为2：(0.5～2)，进一步优选为2：(1～1.5)，再进一步优选为2：1。
在本发明中，所述变性处理的试剂优选包括碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液；所述碳酸氢铵溶液的浓度优选为50～200nM，进一步优选为100nM；所述二硫苏糖醇溶液的浓度优选为200～800nM，进一步优选为500nM；所述碘代乙酰胺溶液的浓度优选为200～800nM，进一步优选为500nM。
在本发明中，所述人乳样品、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液的体积比优选为(50～150)：790：10：30，进一步优选为100：790：10：30。
在本发明中，所述变性处理优选为在加入了内标肽的人乳样品中，先加入碳酸氢铵溶液和二硫苏糖醇溶液混匀进行变性反应，然后冷却，加入碘代乙酰胺溶液，静置。
在本发明中，所述混匀的方法优选为涡旋混匀。本发明对涡旋混匀的条件没有限制，能够混合均匀即可。
在本发明中，所述变性反应的温度优选为50～80℃，进一步优选为70℃；所述变性反应的时间优选为20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，所述冷却的温度优选为20～25℃，进一步优选为25℃。
在本发明中，所述静置优选为避光静置，所述静置的温度优选为25℃，所述静置的时间优选为20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，所述酶解处理优选在变性处理后加入酶混匀酶解，酶解完成后，进行终止处理。
在本发明中，所述酶优选为胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶溶液的浓度优选为0.5～2mg/mL，进一步优选为1mg/mL；所述胰蛋白酶溶液与人乳样品的体积比优选为(0.05～0.5):1，进一步优选为0.1～1。
在本发明中，所述混匀的方法优选为涡旋混匀。本发明对涡旋混匀的条件没有限制，能够混合均匀即可。
在本发明中，所述酶解的温度优选为37℃，所述酶解的时间优选为2～6h，进一步优选为3～5h，再进一步优选为4h。
在本发明中，所述终止处理的试剂优选为甲酸，进一步优选为纯甲酸。
在本发明中，所述甲酸与人乳样品的体积比优选为0.1：1。
在本发明中，还优选对所述待测样品进行过膜处理，所述过膜处理的滤膜的孔径优选为0.22μm。
本发明优选采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，得到所述特征肽和内标肽的峰面积，计算得到特征肽和内标肽的峰面积比。
在本发明中，所述高效液相色谱的检测条件：色谱柱优选为：Acquity BEHPeptide 300C18柱1.7μm，2.1×100mm；柱温优选为：30～40℃，进一步优选为35℃；进样体积优选为：5μL；样品温度优选为：10～20℃，进一步优选为15℃；流动相A优选为：0.1％甲酸-水，流动相B优选为：0.1％甲酸-乙腈，优选采用梯度洗脱；流速优选为0.3mL/min。
在本发明中，所述质谱的条件：电喷雾模式优选为：ESI+；质谱扫描方式优选为：多反应监测；毛细管电压优选为3.5kV；离子源温度优选为：125～175℃，进一步优选为150℃；脱溶剂温度优选为：325℃，脱溶剂气流量优选为：800L/hour；鞘气温度优选为：375℃，鞘气流量优选为：50L/hour。
本发明优选将步骤(1)中的待测样品替换成乳凝集素特征肽系列标准溶液，优选按照步骤(2)的方法检测和计算，得到以特征肽和内标肽的峰面积比为纵坐标，以乳凝集素的浓度为横坐标的标准曲线。
在本发明中，所述乳凝集素特征肽系列标准溶液优选将人乳凝集素特征肽标准液，加入所述内标肽，再加入甲酸水溶液稀释进行稀释，配置成乳凝集素特征肽系列标准溶液。
在本发明中，所述甲酸水溶液的质量浓度优选为0.1％。
在本发明中，所述乳凝集素特征肽系列标准溶液的浓度优选为0.25nmol/L，0.5nmol/L，1nmol/L，1.5nmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，15nmol/L，20nom/L。
本发明优选将步骤(2)得到的所述特征肽和内标肽的峰面积比代入所述标准曲线中，得到样品中乳凝集素的浓度，计算得到样品中乳凝集素的含量。
在本发明中，所述计算的公式优选为A＝x·F·M·10-6，其中
A表示乳凝集素的含量，mg/L；
x表示乳凝集素的浓度，nmol/L；
F表示稀释倍数；
M表示乳凝集素的分子量，为44772.99g/mol。
本发明还提供了一种检测乳凝集素含量的试剂盒，优选包括乳凝集素特征肽、所述乳凝集素特征肽的内标肽、胰蛋白酶溶液、碳酸氢钠溶液、碘代乙酰胺溶液、二硫苏糖醇溶液和甲酸，所述乳凝集素特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述内标肽的氨基酸序列为将所述特征肽中的缬氨酸和异亮氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。
下面结合实施例对本发明提供一种乳凝集素特征肽及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
准确吸取100μL均质的人乳样品于15mL塑料离心管中，加入4.9mL超纯水稀释，涡旋混匀。然后准确吸取100μL稀释后的人乳样品，加入50μL 100nM内标肽溶液，790μL 100nM碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液，10μL 500mM二硫苏糖醇(DTT)溶液，涡旋混匀后于70℃反应30min，取出冷却至25℃，加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光静置30min，再加入10μL1 mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃恒温酶解4小时，完成后取出，加入10μL纯甲酸终止反应，混匀后于25℃反应30min，过0.22μm滤膜，得到待测人乳样品。
准确吸取10nM的人乳凝集素特征肽标准液100μL于15mL塑料离心管中，加入4.9mL超纯水稀释，涡旋混匀。然后吸取100μL稀释后的标准溶液，之后按照与人乳同样的方法加入同样的内标肽溶液，进行变性处理、酶解处理和终止处理，过滤，得到待测标准溶液。
本实施例的检测方法采用高效液相色谱-质谱联用技术对制备的待测标准溶液和待测人乳样品进行检测。
本实施例采用的仪器设备为：超高效液相色谱串联四级杆质谱(Xevo TQ-XS，Waters公司，美国)。
采用的液相色谱条件如下：硅烷基C18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm，孔径
Figure GDA0002915984910000071
柱温35℃；流动相A相：0.1％甲酸-水；B相：0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱：参考梯度洗脱程序见表1；
表1流动相梯度洗脱程序
Figure GDA0002915984910000081
注：A相+B相＝100％；
流动相流速：0.3mL/min；样品温度：15℃；进样体积：5μL。
采用的质谱条件如下：
电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压3.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：800L/hour；鞘气温度：375℃，鞘气流量：50L/hour；其它质谱参数见表2。
表2质谱参数
Figure GDA0002915984910000082
注：表中带*为定量离子；不同质谱仪器，质谱参数条件可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳。
经检测标准溶液和人乳样品的质谱图如图1所示，从图1中可以看出标准溶液和人乳样品的峰型和保留时间一致，表明人乳样品中，含有乳凝集素。
实施例2
为了得到稳定的乳凝集素特征肽，本实施例进行了二甲基化衍生标记实验，以轻链与重链的峰面积比为纵坐标，以酶解时间为横坐标的乳凝集素特征肽段的酶解曲线。
准确吸取500μL均质的人乳于15mL塑料离心管中，加入4.5mL超纯水稀释，涡旋混匀。准确吸取100μL稀释后的人乳，依次加入850μL 100mM碳酸氢钠(NaHCO3)溶液和10μL500mM二硫苏糖醇(DTT)溶液，混匀后于70℃金属浴1000rpm振荡反应30min，待冷却至25℃后加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光反应30min。然后加入10μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃金属浴1000rpm振荡反应8h，酶解反应过程中，选择1min，5min，10min，15min，30min，45min，60min，90min，120min，150min，180min，210min，240min，300min，360min，480min共16个酶解时间点取反应液作为样本，冷却样本至25℃后用0.22μm滤膜过滤，得到不同时间点的酶解肽段溶液。
取500μL上述酶解肽段溶液，依次加入20μL 4％(V/V)甲醛(CH2O)溶液和20μL600mM氰基硼氢化钠溶液，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应1h。然后加入80μL 1％(V/V)氨水溶液，涡旋混匀，再加入40μL纯甲酸，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应30min，制得二甲基衍生的肽段溶液。同时另取500μL酶解肽段溶液，加入20μL 4％(V/V)同位素甲醛(13CD2O)溶液和20μL 600mM氰基硼氢化钠溶液，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应1h。然后加入80μL 1％(V/V)氨水溶液，涡旋混匀，再加入40μL纯甲酸，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应30min，制得同位素二甲基衍生的肽段溶液，作为内标溶液。按1:1的体积混合二甲基衍生的肽段溶液和内标溶液，即制得待测液。然后采用超高效液相色谱串联高分辨静电场轨道离子阱质谱(UPLC-Q-Exactive，ThermoFisher Scientific公司，美国)法检测人乳中二甲基衍生的肽段(轻链)和内标(重链)的峰面积，并计算轻链和重链的峰面积比值(light/heavy Ratio)。得到轻链与重链的峰面积比值随酶解时间的变化，如图2所示。可知在酶解4h时酶解反应达到平稳，因此，本发明提供的乳凝集素特征肽具有很好的稳定性，能够用来检测人乳中乳凝集素的含量。
实施例3
标准曲线的建立：
(1)乳凝集素特征肽系列标准溶液的制备：分别准确吸取10nM人乳凝集素特征肽标准液25μL，50μL，100μL，150μL，200μL，和100nM人乳凝集素特征肽标准液50μL，100μL，150μL，200μL于2mL塑料离心管中，各加入50μL 100nM内标肽溶液，再分别加入0.1％甲酸水溶液925μL，900μL，850μL，800μL，750μL，900μL，850μL，800μL，得到标准特征肽浓度分别为0.25nmol/L，0.5nmol/L，1nmol/L，1.5nmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，15nmol/L，20nmol/L的乳凝集素特征肽系列标准溶液。
(2)检测方法：
按照实施例1提供的检测方法和条件检测乳凝集素特征肽系列标准溶液，得到乳凝集素特征肽和内标肽的峰面积，进一步计算得到乳凝集素特征肽和内标肽的峰面积比。
然后绘制的得到以乳凝集素特征肽和内标肽的峰面积比为纵坐标，以乳凝集素的浓度为横坐标的标准曲线，如图3所示，标准曲线公式为：y＝1.03x+0.0353，R2＝0.9989，其中x为乳凝集素(LDH)特征肽的浓度(nmol/L)，y为LDH特征肽与内标肽的峰面积比。
实施例4
对实施例1提供的高效液相色谱-质谱联用技术的准确性进行验证，方法的准确性主要通过低、中、高三个浓度水平加标实验来评估，其中低、中、高三个浓度水平的加标量分别为14.96mg/L、29.92mg/L、74.80mg/L，每个加标水平实验平行六次，回收率(％)＝(加标后试样的测定值-本底含量)/加标量×100％。加标水平及回收率结果，如表3所示。精密度则通过日间、日内(连续重复三天)RSD(相对标准偏差)来表示。
表3回收率及精密度结果
Figure GDA0002915984910000101
低、中、高三水平加标回收率在100.98％～101.46％之间，日内精密度在5.22～5.49％之间，日间精密度在3.42％～4.35％之间，均满足方法学验证的基本要求。本发明提供的乳凝集素特征肽实现了对LDH的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
实施例5
本实施例选取青岛、武汉、呼和浩特三城共50份人初乳和53份成熟乳作为研究对象，进行人乳中LDH含量的测定。
(1)制备待测样品：准确吸取100μL均质的人乳于15mL塑料离心管中，加入4.9mL超纯水稀释，涡旋混匀。然后准确吸取100μL稀释后的人乳，加入50μL 100nM内标肽溶液，790μL 100nM碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液，10μL 500mM二硫苏糖醇(DTT)溶液，涡旋混匀后于70℃反应30min，取出冷却至25℃，加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光静置30min，再加入10μL1 mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃恒温酶解4小时，完成后取出，加入10μL纯甲酸终止反应，混匀后于25℃反应30min，过0.22μm滤膜，得到待测样品。
(2)检测方法：按照实施例1提供的检测方法对步骤(1)制备的待测样品进行检测。
(3)计算：按照下述公式进行计算，结果如表4所示，三组及三组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05时认为差异有显著统计学意义。
A＝x·F·M·10-6，其中
A表示乳凝集素的含量，mg/L；
x表示乳凝集素的浓度，nmol/L；
F表示稀释倍数，F＝500倍；
M表示乳凝集素的分子量，为44772.99g/mol。
表4不同地区和类型人乳样品中LDH的含量
Figure GDA0002915984910000111
Figure GDA0002915984910000121
注：median(IQR)表示含量的中位数(四分位距)；a表示差异有统计学意义(p<0.01)，b表示差异有统计学意义(p<0.05)。
从检测结果可以看出，本发明提供的乳凝集素特征肽及内标肽和检测方法可以准确测定人乳中总LDH的含量。来自三座城市的初乳的LDH含量均较成熟乳中的含量高。来自呼和浩特市的成熟乳中LDH含量在三地区中最高，为31.40(39.14)mg/L，其次为武汉市，LDH含量为22.65(16.29)mg/L，青岛市成熟乳中LDH含量最低，为16.30(9.74)mg/L；且三地区成熟乳中LDH含量之间的差异显著(p<0.001)。进一步两两比较发现该显著性差异来自于青岛与呼和浩特市之间(p<0.01)和武汉与呼和浩特市之间(p<0.05)。而在初乳中，青岛、武汉和呼和浩特市的LDH含量分别为77.17(56.36)mg/L、76.93(39.17)mg/L和81.33(46.48)mg/L，差异均无统计学意义。
由以上实施例可知，本发明提供的乳凝集素特征肽实现了对LDH的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州璞湃科技有限公司
<120> 一种乳凝集素特征肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys
20 25 30
His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp
35 40 45
Val Glu Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn
50 55 60
His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Leu Glu Asn Gly Asn
65 70 75 80
Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu
85 90 95
Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly
100 105 110
Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile
115 120 125
Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln
130 135 140
Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val
145 150 155 160
Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn
165 170 175
Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His
180 185 190
Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr
195 200 205
Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser
225 230 235 240
Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly
245 250 255
Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln
260 265 270
Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp
275 280 285
Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr
290 295 300
Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys
305 310 315 320
Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro
325 330 335
Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser
340 345 350
His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg
355 360 365
Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu
370 375 380
Leu Gly Cys
385

Claims (5)

1.一种非诊断和治疗目的的乳凝集素特征肽在检测人乳中乳凝集素含量中的应用，其特征在于，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特征肽的内标肽是将所述特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸和异亮氨酸，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。
3.一种非诊断和治疗目的的乳凝集素特征肽检测人乳中乳凝集素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备待测样品：取人乳样品中加入内标肽，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述内标肽是将所述特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸和异亮氨酸，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸；
所述内标肽的浓度为100 nM，所述人乳样品和内标肽的体积比为2:1；
所述变性处理的试剂包括浓度为100 nM碳酸氢铵溶液、浓度为500 mM二硫苏糖醇溶液和浓度为500 mM碘代乙酰胺溶液，所述人乳样品、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液的体积比为100:790:10:30；
所述酶解处理的酶为胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶溶液的浓度为1 mg/mL，所述胰蛋白酶溶液与人乳样品的体积比为0.1:1；
所述终止处理的试剂为甲酸；
（2）检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测所述待测样品，得到所述特征肽和所述内标肽的峰面积，计算得到特征肽和内标肽的峰面积比；
（3）绘制标准曲线：将步骤（1）中的待测样品替换成乳凝集素特征肽系列标准溶液，按照步骤（2）的方法检测和计算，得到以特征肽和内标肽的峰面积比为纵坐标，以乳凝集素的浓度为横坐标的标准曲线；
（4）计算人乳样品中乳凝集素的含量：将步骤（2）得到的特征肽和内标肽的峰面积比代入所述标准曲线，得到人乳样品中乳凝集素的浓度，计算得到人乳样品中乳凝集素的含量。
4.如权利要求3所述的非诊断和治疗目的的乳凝集素特征肽检测人乳中乳凝集素含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Acquity BEH Peptide 300C18柱1.7 μm，2.1×100 mm；柱温：30~40℃；进样体积：5 µL；样品温度：10~20℃；流动相A：0.1%甲酸-水，流动相B：0.1%甲酸-乙腈，采用梯度洗脱；流速为0.3mL/min；所述质谱的条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测；毛细管电压3.5kV；离子源温度：125~175℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：800 L/hour；鞘气温度：375℃，鞘气流量：50 L/hour。
5.一种检测乳凝集素含量的试剂盒，其特征在于，包括乳凝集素特征肽、所述乳凝集素特征肽的内标肽、胰蛋白酶溶液、碳酸氢钠溶液、碘代乙酰胺溶液、二硫苏糖醇溶液和甲酸，所述乳凝集素特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述内标肽的氨基酸序列为将所述特征肽中的缬氨酸和异亮氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述异亮氨酸为靠近C末端的异亮氨酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114137114A (zh) * 2020-11-26 2022-03-04 信立泰(苏州)药业有限公司 特立帕肽同位素内标及其制备方法与应用
CN117129605B (zh) * 2023-10-25 2024-02-02 济南和合医学检验有限公司 一种液相色谱串联质谱法检测11种抗高血压药物和3种代谢物的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699413A (zh) * 2005-02-28 2005-11-23 上海第二医科大学附属新华医院 一种乳凝集素功能肽以及制备方法
CN103987401A (zh) * 2011-04-28 2014-08-13 范斯坦医药研究院 Mfg-e8及其用途
CN109529019A (zh) * 2019-01-08 2019-03-29 西安交通大学医学院第附属医院 人乳脂球表皮生长因子8在制备预防/治疗重症急性胰腺炎药物中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005077397A2 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating vascular diseases
WO2010096713A2 (en) * 2009-02-20 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for the diagnosis of age-associated vascular disorders
CN103642895B (zh) * 2013-12-06 2015-12-30 贝因美婴童食品股份有限公司 一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒
CN107102149B (zh) * 2017-05-03 2019-03-29 杭州帕匹德科技有限公司 一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699413A (zh) * 2005-02-28 2005-11-23 上海第二医科大学附属新华医院 一种乳凝集素功能肽以及制备方法
CN103987401A (zh) * 2011-04-28 2014-08-13 范斯坦医药研究院 Mfg-e8及其用途
CN109529019A (zh) * 2019-01-08 2019-03-29 西安交通大学医学院第附属医院 人乳脂球表皮生长因子8在制备预防/治疗重症急性胰腺炎药物中的应用

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