CN111855883B

CN111855883B - 一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法

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Publication number: CN111855883B
Application number: CN202011013552.8A
Authority: CN
Inventors: 杨术鹏; 李熠; 蔡冬梅; 傅怡; 周金慧; 杨宇晖
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN111855883A

Abstract

本发明涉及检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下:VLTTGLPALISWIK。该方法具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于复杂基质中蜂毒肽的准确定量，对保护蜂毒肽消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要的现实意义。

Description

一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法

技术领域

本发明涉及检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法。

背景技术

蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的毒液，它是蜜蜂蜇刺敌害时释放的一种生物武器。蜂毒中含有丰富的酶、多肽、生物胺、激素、有机酸、氨基酸等物质，其中蜂毒肽(蜂毒溶血肽)是蜂毒中主要成分，它占到干蜂毒重量的50%以上。蜂毒肽是由26种氨基酸组成的小肽类物质，呈α-螺旋构象，它具有广泛且强烈的生物学活性，如抗菌、抗炎、镇痛、免疫调节、抗病毒和抗肿瘤等功效。目前，我国和全球多个国家均已批准蜂毒肽作为上市药物，用于治疗风湿性疾病和周围神经炎。近年来研究发现，蜂毒肽在皮肤保养和部分皮肤病防治方面疗效确切，它能刺激肌肤胶原蛋白产生，紧实提拉，抚平细纹，恢复弹性，从而使得蜂毒肽成为护肤品行业的新宠。目前，国内外已经有众多企业开展了蜂毒肽在护肤品中应用探索，并在市场上推出了各式各样的护肤产品，如蜂毒保湿水、蜂毒护肤霜、蜂毒面膜等。一只成年工蜂蜇刺时，分泌的蜂毒肽仅仅几十微克，足见蜂毒产量非常稀少，从而导致蜂毒肽原料价格非常昂贵。近年来，采用电击方式收获蜂毒的方法虽然有效的提高了蜂毒产量，即便是如此，蜂毒肽的价格仍然比黄金要昂贵许多。鉴于蜂毒肽的高昂的价格，护肤品中添加蜂毒肽会显著增加生产成本，从而导致标识蜂毒肽的护肤品价格显著高于普通护肤品。当前，我国并未颁布有关护肤等产品中蜂毒肽的含量测定标准，不同企业的生产方式和质控标准并不统一，产品中蜂毒肽含量的标识完全基于企业自律，从而导致市场蜂毒肽类护肤品的质量参差不齐，甚至出现了假冒伪劣的现象。因此，加快制定护肤品等产品中蜂毒肽的准确定量分析方法已经成为养蜂业和护肤行业的共识。

当前，蜂毒肽的来源主要是来自规模化养殖的蜜蜂：意大利蜜蜂和中华蜜蜂，两者生产的蜂毒肽均是有26个氨基酸组成，且氨基酸序列完全一致，为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ（SEQ ID No.1）。当前常用的检测方法主要是通过液相串联质谱的技术定量测定完整蜂毒肽，检测其多电荷母离子及子离子进行定量。由于护肤品等产品中蜂毒肽的含量很低，仅处于痕量水平，而其基质又十分复杂，采用现有的分析方法，难以实现护肤品等产品中蜂毒肽的准确定量。

发明内容

本发明提供的方法有效克服了现有蜂毒肽分析方法的弊端，通过检测酶解之后的蜂毒肽的特征肽段，实现了复杂基质中蜂毒肽的准确定量。该方法可以用于护肤品、牙膏、膏药等产品中蜂毒肽的定量分析，对保护蜂毒肽消费者的权利具有一定的现实意义，同时为后续蜂毒肽行业标准的制定提供了方法参考。

具体而言，本发明首先提供了一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下: VLTTGLPALISWIK（SEQ ID No.2），并通过Uniprot和NCBI数据库进行特异性验证。

作为优选，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z 756.46343([M+2H]²⁺)；子离子图谱中包含碎片离子m/z 927.56409、m/z 585.35938；其允许偏差应在10 ppm以内。

作为优选，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N。

作为优选，所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z 761.47835；子离子包含m/z 935.60406和m/z 593.43632；其允许偏差应在10 ppm以内。

蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该蜂毒样本中的蜂毒肽含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂毒质量。

作为优选，所述待测样本的前处理包括：对待测样本中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解，对酶解产物进行除盐后，用0.1%甲酸溶液复溶。

作为优选，采用UHPLC-Q Exactive plus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。

优选的，液相色谱条件如下：

色谱柱：C18柱；

流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；

梯度洗脱条件为：0-1.0 min，5% 流动相B；1.0-2.0 min，5-15% 流动相B；2.0-12.0 min，15-40% 流动相B；12.0-14.0 min，40-95% 流动相B；14.0-16.5 min，95% 流动相B；16.0-17.5 min，5% 流动相B；

流速：0.30 mL/min；

进样量：5.0 µL；

柱温：40 ℃。

在一个优选的实施方式中，所述C18 色谱柱为ThermoFisher Hypersil Gold(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)。

优选的，质谱条件如下：

离子源参数：鞘气的流速38 arb；辅助气的流速15 arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.2 kV；离子导管的温度275 ℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380 ℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS²。

应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。

基于高分辨质谱提供的精确质量数，上述方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相色谱串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。

本领域人员可对上述优选方案进行组合，得到本发明的较佳实施例。

本发明还提供一种用于检测蜂毒肽的试剂盒，标准物质包括序列为VLTTGLPALISWIK的特征肽段。

作为优选，所述标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明发现了蜂毒肽的特征肽段，并据此建立了鉴别和定量蜂毒肽的检测方法，用于辅助蜂毒掺假的鉴别，该检测方法具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，并且适用于复杂基质中蜂毒肽的检测，对于维护蜂毒行业健康发展和蜂毒消费者的权益具有重大意义。

附图说明

图1. A为未酶切的蜂毒样品通过UHPLC-Q Exactive plus提取的蜂毒肽特征肽段的离子流图；B为酶切过的蜂毒样品通过UHPLC-Q Exactive plus提取的蜂毒肽特征肽段的离子流图。

图2. A为通过UHPLC-Q Exactive plus检测的未酶切蜂毒中蜂毒肽特征肽段的二级碎片质谱图；B为通过UHPLC-Q Exactive plus检测的酶切过的蜂毒样品蜂蜜中蜂毒肽的特征肽段的二级碎片质谱图。

图3. A为未酶切的蜂毒样品通过UHPLC-Q Exactive plus提取的稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*的离子流图；B为酶切过的蜂毒样品通过UHPLC-Q Exactive plus提取的稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*的离子流图。

图4. A为通过UHPLC-Q Exactive plus检测的未酶切蜂毒中稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*的二级碎片质谱图；B为通过UHPLC-Q Exactive plus检测的酶切过的蜂毒样品稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*的二级碎片质谱图。

图5. 特征肽段在未酶切和酶切蜂毒样品中的响应(相对丰度)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中涉及的仪器与试剂：

1.质谱仪(Q-Exactive)，美国Thermo Fisher Scientific公司；

2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；

3.全波长酶标仪(Multiskan GO)，美国Thermo Fisher Scientific公司；

4.电子分析天平((PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；

5.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem, RVC2-18)，德国 MarinChrist公司；

6.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；

7.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；

8.二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)，中国Solarbio公司；

9.碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)，美国Merk公司；

10.Bradford法蛋白质定量试剂盒，中国Solarbio公司；

11.碳酸氢铵(NH4HCO3)，美国Sigma公司。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1 利用液相色谱串联质谱测定蜂毒中蜂毒肽含量的方法

1.样品来源

从市场或者蜂农处购买真实的蜂毒样本共140余份。

2. 实验步骤

2.1溶液配制

100 mM DTT：称取DTT 308.5 mg，40 mM NH₄HCO₃溶液定容到20 mL，每管l mL分装，-20 ℃冰箱保存待用。

40 mM NH₄HCO₃溶液：称取0.316 g NH₄HCO₃，用超纯水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。

100 mM IAA溶液：称取IAA 0.39 g，用40 mM的NH₄HCO₃溶液定容至20 mL，-20℃冰箱保存待用。

活化液：500 μL ACN、3 μL TFA，超纯水定容至1 mL，4℃保存。

平衡液:1 μL TFA，超纯水定容至1 mL，存于4℃。

洗脱液：800 μL ACN、1 μL TFA，用超纯水定容至1 mL，存于4℃。

2.2对酶切后得到的肽段进行液相色谱串联质谱检测，然后将肽段质谱结果导入PEAKS软件中进行匹配，从结果中筛选得到蜂毒肽的特征肽段：VLTTGLPALISWIK。

对蜂农处采集的真实蜂毒样本的蜂毒肽的肽段进行匹配检测，从结果中整理筛选出蜂毒肽的肽段：VLTTGLPALISWIK响应最高，由此可以体现其含量相对较高，且可以作为检测蜂毒样本中蜂毒肽的特征肽段。而其他肽段则无法作为蜂毒肽的特征肽段，比如：GIGAVLK肽段在搜库匹配时，不具备唯一性，且在质谱数据中响应极低，故不可做为检测蜂毒肽的特征肽段。

2.3蜂毒样本的前处理

（1）准确称取均匀待测蜂毒1 g至10 mL离心管中，加入1 mL 去离子水，涡旋至蜂毒充分溶解。于14000 rpm，4 ℃条件下离心12 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。

（2）移取蛋白质溶液200 μL与800 μL 40 mM NH₄HCO₃混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。

（3）每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37 ℃过夜酶切。酶切反应完成后，加入1 μL甲酸以使胰蛋白酶失活，终止酶切反应，向每个样品中加入IS肽段，保证其浓度在后续复溶时浓度保持在40 ng/mL。将酶切产物与0.1%甲酸溶液按2:3体积比混合后，通过C18柱除盐，除盐后的样品进行质谱分析。

（4）蜂毒样本的质谱分析

使用超高效液相串联高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive plus）对蜂毒样本进行检测，未酶切样品与酶切样品采用相同的液相色谱串联质谱方法进行检测，从结果中筛选得到蜂毒肽的特征肽段VLTTGLPALISWIK。

图1中A图为该肽段的离子流图，图2中A图为二级碎片质谱图，本发明经比对选取该肽段进行定量分析，并相对应地设计稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N。

合成特征肽段VLTTGLPALISWIK和稳定同位素内标(IS)肽段VLTTGLPALISWIK*，纯度超过98％，储存在-20℃备用。

2 .3标准曲线的绘制：在初始流动相(97：3，v/v，水/ACN，含0 .1％甲酸)中制备一系列特征肽段标准品(2 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，40 ng/mL，80 ng/mL，100ng/mL，200 ng/mL，400 ng/mL，800 ng/mL和1000 ng/mL)，然后向配置好的每个浓度的标准品中加入200 ng IS肽段使其浓度为100 ug/mL。

液相条件如下：

使用C18 色谱柱（ThermoFisher Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)），流动相：0.1%甲酸-水（A），0.1%甲酸-乙腈（B）；流速：0.3 μL/min；进样体积：5 μL；柱温：40℃；梯度洗脱条件为：0-1.0 min，B 5%；1.0-2.0 min，B 5-15%；2.0-12.0 min，B 15-40%；12.0-14.0 min，B 40-95%；14.0-16.5 min，B 95%；16.0-17.5 min，B 5%。

质谱条件如下：

离子源参数：鞘气的流速38 arb；辅助气的流速15 arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.2 kV；离子导管的温度275 ℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380 ℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS²。（5）蜂毒样本的数据处理

根据式1得到蜂毒中蜂毒肽的含量：

X＝(ФcVM1)/(M2m) 式1，

式1中，X(ng/g)是蜂毒样品中蜂毒肽的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c(ng/mL)是特征肽在胰蛋白酶消化物中的浓度，V(mL)是胰蛋白酶消化物的体积，M1、M2是蜂毒肽和肽段的摩尔质量，m(g)是蜂毒样品的质量。以达到对蜂毒样品中蜂毒肽定量的目的。

如图1-4所示，检测蜂毒样本的图谱中应该含有蜂毒肽的肽段：VLTTGLPALISWIK，其精确m/z值：756.46343（[M+2H]²⁺）其允许偏差应在10 ppm以内；应含有添加的稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*的m/z 761.47835（[M+2H]²⁺），其允许偏差应在10 ppm以内。

其MS/MS图谱（子离子图谱）中应该含有蜂毒肽的肽段：VLTTGLPALISWIK的特异性碎片离子m/z 927.56409、585.35938；相应的，稳定同位素内标肽段特征肽段VLTTGLPALISWIK*的子离子图谱(MS/MS)中应含有碎片离子m/z 935.60406和m/z593.43632，且其精确质量数的误差应当小于10 ppm。蜂毒样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方可肯定所求的该蜂毒样本中的VLTTGLPALISWIK含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂毒质量。

实施例2 与现有蜂毒肽检测方法进行比较

1、样品来源

从市场或者蜂农处购买真实的蜂毒样本140余份。

2、实验步骤

（1）溶液配制

同实施例1。

（2）蜂毒样本的前处理

①准确称取均匀待测蜂毒1 g至10 mL离心管中，加入1 mL 去离子水，涡旋至蜂毒充分溶解。于14000 rpm，4 ℃条件下离心12 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。此上清溶液即可作为未酶切的蜂毒溶液进行分析，也可作为蛋白溶液进行下一步酶切反应。

②移取蛋白质溶液200 μL与800 μL 40 mM NH₄HCO₃混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。

③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37 ℃过夜酶切。酶切反应完成后，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。每个样品中加入IS肽段，保证其浓度在后续复溶时浓度保持在40 ng/mL。将酶切产物与0.1%甲酸溶液按2:3体积比混合后，通过C18柱除盐，除盐后的样品进行质谱分析。

（4）蜂毒样本的质谱分析

使用超高效液相串联高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive plus）对未酶切和酶切后的蜂毒样本分别进行检测。

（5）蜂毒样本的数据处理

从质谱数据中提取肽段的质荷比，以m/z756.46343处特征肽段和IS肽段峰面积的比值作为对比依据。结果如图5和表1所示，酶切后检出限（LOD）、定量限（LOQ）均明显低于未酶切样品，相对丰度高于未酶切样品，结果表明酶切后准确度、精确度和灵敏度更高，并且稳定性强。

表1

实施例3 蜂毒产品中蜂毒肽定量检测

1、样品来源

从市场购买标有“蜂毒”字样的产品，包括牙膏（10份）、面膜（25份）、膏药（5份）产品共40份。

2、实验步骤

（1）溶液配制

同实施例1。

（2）蜂毒样本的前处理

①准确称取均匀待测蜂毒产品1 g至10 mL离心管中，加入1 mL去离子水，涡旋至蜂毒产品充分溶解。于14000 rpm，4 ℃条件下离心12 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。

③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37 ℃过夜酶切。酶切反应完成后，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。每个样品中加入IS肽段，保证其浓度在复溶时保持在40 ng/mL。将酶切产物与0.1%甲酸溶液按2:3体积比混合后，通过C18柱除盐，除盐后的样品进行质谱分析。

（4）蜂毒样本的质谱分析

使用超高效液相串联高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive plus）对酶切后的样本进行检测。

（5）蜂毒样本的数据处理

从质谱数据中提取肽段的质荷比，计算以m/z 756.46343处特征肽段和IS肽段峰面积的比值。结果如表2所示，蜂毒产品中仅有22.5%可检测出蜂毒肽。

表2

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所

<120> 一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法

<130> KHP201116338.5YS

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

20 25

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys

1 5 10

Claims

1.一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法，采用同位素内标法在待测样本中对蜂毒肽的特征肽段进行定量检测；

所述特征肽段的序列如下: VLTTGLPALISWIK；特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z756. 46343([M+2H] 2+)；子离子图谱中包含碎片离子m/z 927. 56409、m/z585. 35938；

所使用的内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N；内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z 761.47835；子离子包含m/z935.60406和m/z 593.43632；其允许偏差应在10 ppm以内；

待测样本的前处理包括：对待测样本中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解，对酶解产物进行除盐后，用0.1%甲酸溶液复溶；

液相色谱条件如下：

色谱柱：C18柱；

流动相组成：

流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-1.0min，5%流动相B；1.0-2.0 min，5-15%流动相B；2.0-12.0 min，15-40%流动相B；12.0-14.0min，40-95%流动相B；14.0-16.5 min，95%流动相B；16.0-17.5 min，5%流动相B；

流速：0.30 mL/min；

进样量：5.0 µL；

柱温：40 ℃；

质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速38 arb；辅助气的流速15 arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.2 kV；离子导管的温度275 ℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS²。

2.一种用于检测蜂毒肽的试剂盒，其特征在于，标准物质包括序列为VLTTGLPALISWIK的特征肽段。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N。