CN111289661B - 一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的方法 - Google Patents

一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α‑淀粉酶的方法，包括：筛选分别属于中蜂和意蜂α‑淀粉酶的特征肽段，建立液相色谱串联质谱检测方法，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，数据分析等步骤；所述特征肽段包括意蜂α‑淀粉酶特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK和中蜂α‑淀粉酶特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR。本发明所提出的蜂蜜中意蜂和中蜂α‑淀粉酶的检测方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于意蜂蜜和中蜂蜜的鉴别，尤其适用于中蜂蜜中掺入意蜂蜜的鉴别。该方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

Description

一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的 方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的方法，该方法适用于区别中蜂蜜和意蜂蜜，尤其适用于中蜂蜜中是否混入意蜂蜜的掺假鉴别。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味的食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。为了追逐巨额利润，不法商贩在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序，侵害了消费者权益。中蜂蜜，亦称之为土蜂蜜，是由中华蜜蜂采集蜜源植物而酿制的蜂蜜。中蜂比意蜂个头小，背部黑，行动更敏捷，且两个种群之间存在生殖隔离，无法杂交繁殖。中蜂蜜的产量远低于意蜂蜜，从而导致中蜂蜜的市场价格较高，大约是意蜂蜜的5-10倍。不良商贩为了追逐高额利润，往往会采用意蜂蜜冒充中蜂蜜，或者在中蜂蜜中勾兑意蜂蜜进行掺假，甚至掺入廉价的果葡糖浆。加强蜂蜜真伪鉴别技术的研究，并制定相关蜂蜜掺假鉴别标准，已经成为蜂产品行业从业者的共识。
蜜蜂在酿制蜂蜜过程中会混入大量自身分泌的酶类等物质，从而促进蜜蜂成熟，如淀粉酶、葡萄糖脱氢酶、超氧化物歧化酶等。意大利蜜蜂和中华蜜蜂的α-淀粉酶属于同源性蛋白质，虽然两者的功能和作用一致，但是两者一级结构中氨基酸序列和蛋白三维空间结构均存在一定差异。由于α-淀粉酶属于动物源性蛋白，可以有效的作为蜜蜂品种的指示性物质，从而用来区别中蜂蜜和意蜂蜜。近年来，液相色谱串联质谱技术在蛋白质的检测分析方面具有高选择性和高灵敏度等优点，非常适用于复杂生物基质中靶向蛋白质的定性和定量研究。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中α-淀粉酶的方法，通过意蜂蜜和中蜂蜜中α-淀粉酶的特有肽段的检测对生产和商业中的中蜂蜜和意蜂蜜的真假进行鉴定。
第一方面，筛选出可用于液相色谱串联质谱鉴定蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的特征肽段组：
意蜂α-淀粉酶的特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK，
中蜂α-淀粉酶的特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR。
本发明根据意蜂蜜和中蜂蜜酶解产物的液相色谱串联质谱检测结果，成功筛选出意蜂蜜特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK，中蜂蜜特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR，并通过Uniprot数据库对两者特异性进行了验证。
进一步，意蜂蜜的α-淀粉酶的特征肽段VCLPPGQYCDVISGNLEK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有967.97116的质荷比，包含质荷比为1368.64639、1077.52449的子离子。
中蜂蜜的α-淀粉酶的特征肽段LVDFLDDLVAVGVAGFR在质谱中所产生的检测信号的母离子具有903.49344的质荷比，包含质荷比为1218.64771、776.44135的子离子。
第二方面，本发明提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的方法。
具体地，所述方法具体步骤如下：
A、根据筛选出的专属于意蜂α-淀粉酶的特征肽段和中蜂α-淀粉酶的特征肽段的母离子质荷比、子离子质荷比、碰撞能等信息建立液相色谱串联质谱检测方法。
B、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；
C、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。
进一步地，步骤A和B中采用UHPLC-Q Exactive plus进行液相色谱串联质谱检测。
a1、液相色谱条件如下：
色谱柱：为C18柱；
流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；
梯度洗脱条件为：0-2.0 min，10%的B；2.0-13.0 min，10-40%的B；13.0-16.0 min，40-90%的B；16.0-18.4 min， 90%的B；18.4-18.5 min，90-10%的B；18.5-20.0 min，10%B；流速：0.30 mL/min；进样量：5.0 µL；
a2、质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速38；辅助气的流速15；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.2kV；离子导管的温度275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380 ℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
该方法采用UHPLC-Q Exactive Plus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过在待测样品的质谱图中提取属于中蜂α-淀粉酶特征肽段和意蜂α-淀粉酶特征肽段的质荷比，若待测样品在正确的保留时间中仅提取出中蜂α-淀粉酶特征肽段，且子离子也符合，则可判断为中蜂蜜；若待测样品在正确的保留时间中仅提取出意蜂α-淀粉酶特征肽段，且子离子也符合，则可判断为意蜂蜜；若待测样品在正确的保留时间中同时提取出中蜂和意蜂α-淀粉酶特征肽段，且子离子也符合，则判断为中、意蜂蜜混掺。
应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。
本发明采用UHPLC-Q Exactive plus仪器检测蜂蜜中的α-淀粉酶，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。
本发明提供一种液相色谱串联质谱检测中蜂蜜和意蜂蜜α-淀粉酶的方法，至少具有如下有益效果：
本发明研究发现，意蜂α-淀粉酶和中蜂α-淀粉酶的氨基酸序列有区别，可以确定各自的特异性的肽段，本发明据此建立起一套鉴别中蜂蜜和意蜂蜜的方法，既可以区分中蜂蜜和意蜂蜜，也可以鉴定中蜂蜜和意蜂蜜的真假。本发明提供的蜂蜜中中蜂和意蜂α-淀粉酶的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q Exactive plus提取的意蜂α-淀粉酶的特征肽段和中蜂α-淀粉酶的特征肽段的离子流图；
图2为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂α-淀粉酶的特征肽段和中蜂α-淀粉酶的特征肽段的质谱图；
图3为本发明实施例2提供的向中蜂蜜中掺入意蜂蜜后的检测结果；
图4为本发明实施例3提供的通过特征肽段对市场中蜂蜜掺假的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中涉及的仪器与试剂：
1.质谱仪(Q-Exactive)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；
3.全波长酶标仪(Multiskan GO)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
4.电子分析天平((PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5. pH计(DELTA 320)，德国METTLER TOLEDO公司；
6.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem, RVC2-18)，德国 MarinChrist公司；
7.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；
8.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；
9.1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
10.二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)，中国Solarbio公司；
11.碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)，美国Merk公司；
12.Bradford法蛋白质定量试剂盒，中国Solarbio公司；
13.碳酸氢铵(NH4HCO3)，美国Sigma公司。
实施例1
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的蜂蜜样本共20份。
2. 实验步骤
2.1溶液配制
5M Urea溶液：称取Urea 4.5 g，超纯水定容到15 mL。
100 mM DTT：称取DTT 308.5 mg，40 mM NH4HCO3溶液定容到20 mL，每管l mL分装，-20℃冰箱保存待用。
40 mM NH4HCO3溶液：称取0.316 g NH4HCO3，用超纯水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。
100 mM IAA溶液：称取IAA 0.39 g，用40 mM的NH4HCO3溶液定溶至20 mL，-20 oC冰箱保存待用。
活化液：500 μL ACN、3 μL TFA，超纯水定容至1 mL，4 oC保存。
平衡液:1 μL TFA，超纯水定容至1 mL，存于4 oC。
洗脱液：800 μL ACN、1 μL TFA，用超纯水定容至1 mL，存于4 oC。
2.2本发明对意蜂蜜酶切后得到的肽段进行纳升级高效液相色谱系统串联超高静电场轨道阱傅里叶变换台式质谱高分辨质谱仪检测，然后将质谱结果导入PEAK软件中进行肽段的匹配，从结果中筛选得到意蜂α-淀粉酶的特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK；中蜂α-淀粉酶的特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR。
本发明对蜂农处采集的真实蜂蜜样本的α-淀粉酶的肽段进行匹配检测，从结果中整理筛选出意蜂α-淀粉酶的特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK；中蜂α-淀粉酶的特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR的响应最高，由此可以体现其含量相对较高，且可以作为检测蜂蜜样本中α-淀粉酶的肽段。
2.3蜂蜜样本的前处理
（1）准确称取均匀待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4 oC条件下离心10 min。收集上清液于新的离心管中。
（2）移取蛋白质溶液100 μL与400 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入50 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入250 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
（3）每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37 oC过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用超高效液相串联高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive plus）对蜂蜜样本进行检测，质谱液相条件如下：
使用C18 色谱柱（ThermoFisher Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)），流动相：0.1%甲酸-水（A），0.1%甲酸-乙腈（B）；流速：0.3 μL/min；进样体积：5 μL；柱温：27℃；梯度洗脱条件为：0-2.0 min，10%的B；2.0-13.0 min，10-40%的B；13.0-16.0 min，40-90%的B；16.0-18.4 min， 90%的B；18.4-18.5 min，90-10%的B；18.5-20.0 min，10%B。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：300-1500 m/z；扫描分辨率：70000；采集的模式为正离子模式下的Full MS/dd MS2；扫描模式运行时间2-8 min。
（5）蜂蜜样本的数据处理
如图1和图2所示，检测蜂蜜样本的图谱中应该含有意蜂α-淀粉酶的特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK，其精确m/z值： 967.97116（[M+2H]2+）；或者包含中蜂α-淀粉酶的特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR，其精确m/z值：903.49344（[M+2H]2+），其允许偏差应在10 ppm以内。
其子离子图谱中应该含有意蜂α-淀粉酶的特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK，其特征碎片离子m/z 1368.64639、1077.52449；或者包含中蜂蜜α-淀粉酶的特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR，其特征碎片离子m/z 1218.64771、776.44135。且其精确质量数的误差应当小于10 ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方可肯定该蜂蜜样本中的α-淀粉酶检测结果可信，以此鉴别中蜂蜜和意蜂蜜。
实施例2 蜂蜜掺假的检测
1、样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的中蜂蜜、意蜂蜜样本以及糖浆。
2、实验步骤
（1）溶液配制
同实施例1。
（2）蜂蜜的混掺：按不同比例向中蜂蜜中掺入意蜂蜜。
向蜂蜜中按照5%、10%、20%、50%的比例掺入意蜂蜜。
（3）蜂蜜样本的前处理
①准确称取均匀待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200 μL与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用超高效液相串联高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive plus）对蜂蜜样本进行检测。
（5）蜂蜜样本的数据处理
从质谱数据中提取特征肽段的质荷比，以m/z 967.97116的峰面积作为对比依据。结果如图3所示，结果表明本发明能够检测出掺入意蜂蜜为5%以上的蜂蜜掺假现象。
实施例3 商品中蜂蜜的检测
1、样品来源
从商场购买的不同厂家的中蜂蜜50瓶。
2、实验步骤
（1）溶液配制
此步骤和实施例1中的溶液配制步骤相同。
（2）待测样本的前处理
①准确称取均匀待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200 μL与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用超高效液相串联高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive plus）对蜂蜜样本进行检测。
（5）蜂蜜样本的数据处理
从质谱数据中提取特征肽段的质荷比，以m/z 967.97116和m/z 903.49344的峰面积作为对比依据。结果如图4所示，结果表明目前蜂蜜市场的中蜂蜜掺假现象严重，多数掺入或直接使用意蜂蜜冒充中蜂蜜，另外还有部分掺入糖浆进行中蜂蜜的掺假。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的方法
<130> KHP201111338.0
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Val Cys Leu Pro Pro Gly Gln Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Asn Leu
1 5 10 15
Glu Lys
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Leu Val Asp Phe Leu Asp Asp Leu Val Ala Val Gly Val Ala Gly Phe
1 5 10 15
Arg
<210> 3
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Met Pro Ala Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ile Ala His Asn Asp Pro His Phe Ala Pro Gly His Asp Ala
20 25 30
Ile Val His Leu Phe Glu Trp Lys Trp Asn Asp Ile Ala Lys Glu Cys
35 40 45
Glu Gln Phe Leu Gly Pro Val Gly Phe Gly Gly Val Gln Val Ser Pro
50 55 60
Val Gln Glu Asn Ile Val Ile Asp Lys Arg Pro Trp Trp Glu Arg Tyr
65 70 75 80
Gln Pro Ile Ser Tyr Lys Trp Ile Thr Arg Ser Gly Thr Arg Glu Gln
85 90 95
Phe Ile Asp Met Val Ala Arg Cys Asn Lys Ala Gly Val Arg Ile Tyr
100 105 110
Val Asp Val Ile Met Asn His Met Ser Gly Asp Arg Asn Asp Ala His
115 120 125
Gly Thr Gly Asn Ser Arg Ala Asn Thr Tyr Asn Phe Asp Tyr Pro Gln
130 135 140
Val Pro Tyr Thr Val Lys Asn Phe His Pro Arg Cys Ala Val Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asn Asp Pro Ser Asn Val Arg Asn Cys Glu Leu Val Gly Leu His
165 170 175
Asp Leu Asp Gln Ser Gln Glu Tyr Val Arg Ser Lys Leu Val Asp Phe
180 185 190
Leu Asn Asp Leu Val Ala Ile Gly Val Ala Gly Phe Arg Val Asp Ala
195 200 205
Ala Lys His Met Trp Pro Ser Asp Leu Arg Thr Ile Tyr Ser Arg Val
210 215 220
Arg Asn Leu Asn Arg Thr His Gly Phe Pro Asn Asp Ala Gln Pro Tyr
225 230 235 240
Ile Phe Gln Glu Val Ile Asp Tyr Gly Asn Glu Ala Ile Ser Lys Arg
245 250 255
Glu Tyr Asn Gly Ile Gly Ala Val Ile Glu Phe Lys Tyr Ser Tyr Glu
260 265 270
Ile Ser Asn Ala Phe Arg Gly Asn Asn Asn Leu Lys Trp Leu Val Asn
275 280 285
Trp Gly Glu Gln Trp Gly Phe Leu Pro Ser Lys Asp Ser Leu Val Phe
290 295 300
Val Asp Asn His Asp Thr Gln Arg Asp Asn Pro Gln Ile Leu Thr Tyr
305 310 315 320
Lys Tyr Ser Lys Arg Tyr Lys Met Ala Val Ala Phe Met Leu Ser His
325 330 335
Pro Phe Gly Thr Pro Arg Ile Met Ser Ser Phe Asp Phe Gln Ser Lys
340 345 350
Asp Gln Gly Pro Pro Asn Asp Gly Asn Gly Asn Ile Leu Ser Pro Ser
355 360 365
Ile His Asp Asn Ile Cys Ser Asn Gly Trp Ile Cys Glu His Arg Trp
370 375 380
Arg Gln Ile Tyr Asn Met Val Arg Phe Arg Asn Leu Val Lys Gly Thr
385 390 395 400
Lys Ile Asp Asn Trp Trp Asp Asn Gly Ser Asn Gln Ile Ala Phe Ser
405 410 415
Arg Gly Cys Ser Gly Phe Val Ala Phe Asn Gly Asp Gln Tyr Asp Leu
420 425 430
Lys Lys Asn Leu Lys Val Cys Leu Pro Pro Gly Gln Tyr Cys Asp Val
435 440 445
Ile Ser Gly Asn Leu Glu Lys Gly Arg Cys Thr Gly Lys Ile Val Thr
450 455 460
Val Gly Ser Asp Gly Asn Ala Asn Ile Glu Ile Gly Ala Gly Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gly Val Leu Ala Ile His Val Lys Ala Lys Met Ala
485 490
<210> 4
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Met Pro Ala Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ile Ser His Asn Asp Pro His Phe Ala Pro Gly His Asp Ala
20 25 30
Ile Val His Leu Phe Glu Trp Lys Trp Gly Asp Val Ala Lys Glu Cys
35 40 45
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65 70 75 80
Gln Pro Ile Ser Tyr Lys Trp Val Thr Arg Ser Gly Thr Arg Glu Gln
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100 105 110
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Lys Arg Asn Leu Lys Val Cys Leu Pro Pro Gly His Tyr Cys Asp Val
435 440 445
Ile Ser Gly Asn Leu Glu Asn Gly Arg Cys Thr Gly Lys Val Val Thr
450 455 460
Val Gln Ser Asp Gly Asn Ala Gly Ile Glu Ile Gly Ala Gly Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gly Val Leu Ala Ile His Val Lys Ala Lys Met Ala
485 490

Claims (4)

1.一种液相色谱串联质谱定量检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测蜂蜜中意蜂和中蜂α-淀粉酶的特征肽段，所述特征肽段如下：
意蜂α-淀粉酶的特征肽段：VCLPPGQYCDVISGNLEK，
中蜂α-淀粉酶的特征肽段：LVDFLDDLVAVGVAGFR。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
A、对真实的中蜂蜜和意蜂蜜进行酶解，酶解产物除盐后干燥，用0.1%的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；
B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出专属于意蜂α-淀粉酶的特征肽段和中蜂α-淀粉酶的特征肽段；
C、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；
D、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中采用纳升级高效液相色谱系统串联超高静电场轨道阱傅里叶变换台式质谱高分辨质谱仪；步骤C中采用三重四级杆或QExactive plus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，意蜂α-淀粉酶的特征肽段VCLPPGQYCDVISGNLEK在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z 967.97116，子离子图谱中包含碎片离子m/z 1368.64639、m/z 1077.52449；中蜂α-淀粉酶的特征肽段LVDFLDDLVAVGVAGFR在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z 903.49344，子离子图谱中包含碎片离子m/z 1218.64771、m/z 776.44135的碎片离子，所有离子精确质量数的允许偏差在10 ppm以内。
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