CN103299186A - 变应原的量化和表征 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方案包括测定组合物的变应原含量的方法。本发明的实施方案可以包括提供包含变应原的组合物；从所述组合物至少部分纯化所述变应原以形成提取物；并在紫外和质谱检测的情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量。

Description

变应原的量化和表征
优先权要求
本申请要求2010年10月1日提交的美国临时专利申请流水号61/388,748的、关于“QUANTIFICATION AND CHARACTERIZATION OFALLERGENS”的提交日权益。
发明背景
脂质转移蛋白(LTP)是先前认为在体外在膜间转移脂质中发挥重要生理学作用的低分子量蛋白质。该蛋白质已经在许多植物物种中得到表征，并且存在于多种组织和发育阶段中1。它们形成一个多基因家族，并且超过50种植物LTP氨基酸序列在基因组数据库中登记。已经分离出具有不同分子量的两种主要家族。一种由具有约9kDa的分子量的蛋白质构成，而另一种由具有7kDa的分子量的蛋白质构成，分别称为LTP1和LTP2。LTP1蛋白是碱性的，呈现9-10的等电点(pI)。在已知的LTP1序列中，全部以具有90-95个氨基酸残基为特征，其中8个是沿着一级结构的相似位置中保守的半胱氨酸。这些半胱氨酸残基牵涉在LTP1间严格保守的分子内二硫桥1。此外，LTP不含芳香族色氨酸或苯丙氨酸残基。两个完全保守的酪氨酸残基在多肽主链的N和C端定位。这两个家族中的蛋白质以前体蛋白质合成，并且在信号肽切割后进入分泌途径中。来自多种植物物种的LTP1位于拟南芥(Arabidopsis thaliana)2、玉蜀黍(Zea mays)3、蓖麻(Ricinus communis)4、和豇豆(Vigna unguiculata)5,w种子中的细胞壁。
LTP在植物中的功能作用已经广泛争论。在蓖麻仁中，已经在表征为乙醛酸循环体的细胞器内部找到LTP同等型。显示了此LTP在体外测试中提高乙酰辅酶A氧化酶酶活性，提示牵涉β-氧化，可能牵涉调节脂质贮积的代谢6。在青花菜(Brassica oleracea var.italica)中，发现LTP与叶的蜡状表面有关。表达样式提示了LTP在角质单体转运中的作用4。另外，非生物应激因子诸如干旱、寒冷、和盐已经描述为上调一些植物物种中的LTP家族成员1,7-9。已经主张膜的稳定化、角质膜沉积和/或细胞构造的变化为其在响应这些应激因子中的推定作用7,9,10。另外，LTP在植物生长和发育，包括胚胎发生1、萌发11、和花粉-雌蕊相互作用12中具有潜在的作用。虽然LTP的作用仍然是不清楚的，但是在针对植物病原体诸如细菌、真菌和病毒的植物防御机制中的作用似乎是完善建立的1,13,14。这已经导致将LTP分类为发病机制相关(PR)蛋白，其包括在PR-14家族中14。
此外，最近已经将LTP鉴定为植物食物变应原。它们已经鉴定为完全食物变应原，因为它们能够致敏，即诱导特异性IgE，以及引发重度症状。LTP似乎是一种强的食物变应原，其对蛋白水解攻击和食物加工有抗性。稳定性容许变应原以免疫原性和变应原性构象达到胃肠免疫系统，这容许致敏和系统性症状的诱导。已经在蔷薇科(Rosaceae)15,16,17和葡萄科(Vitaceae)18果实中以及在其它植物物种诸如石刁柏(Aspargus officinalis)和卷心菜(B.oleraceavar.capitata)19,20中报告了LTP。最近，Pastorello小组进行了一项对玉米变应原的广泛研究21。通过在玉米摄取后筛选来自22名具有系统性症状的患者的血清确认LTP是主要的玉米变应原，其中19(86%)患者识别LTP9kDa蛋白。在随访研究中，发现LTP是一种极端稳定的蛋白质，并且即使于100°C煮沸后仍维持IgE结合活性22。另外，玉米LTP似乎对胃肠消化也有抗性23。这些特征共同使LTP类蛋白质的成员能够成为可以引起重度反应的强烈食物变应原。令人感兴趣地，已经发现了玉米LTP是一种仅在南欧和还在一小组来自美国的患者中的相关变应原，提示了对LTP的致敏是相对罕见的24。公知的是，8种食物造成超过90%食物变态反应，包括花生、树坚果(tree nut)、小麦、乳、蛋、甲壳类、大豆、和鱼。
在许多情况中LTP的作用仍然是不清楚的，因为蛋白质的准确绝对定量是困难的。许多先前的研究受到广泛的样品制备或不充分的、不灵敏的、和非特异性的体外生物测定法挑战。为此目的通常采用的分析方法基于免疫学方法。虽然免疫化学方法一般是高度灵敏的且与高通量相容，但是它们遭受有限的特异性。此外，针对靶蛋白的抗体的开发是费时的过程。
发明概述
本发明的实施方案包括测定组合物的变应原含量的方法。本发明的实施方案可以包括提供包含变应原的组合物；从所述组合物至少部分纯化所述变应原以形成提取物；并在紫外和质谱检测的情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量。
附图简述
图1描绘了对纯化后来自玉米种子的内源LTP的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。M，分子量标志物；第1道玉米种子提取物；第2道，在LC-UV分析期间自玉米种子分离的LTP级分；第3道，LTP最终参照物。箭头标示检出的LTP条带。
图2描绘了LTP参照标准品的完整MW的LC-UV/MS(215nm)层析图。
图3描绘了LTP参照物的解卷积(deconvolute)质谱(插图：多电荷包络质谱)。
图4描绘了玉米脂质转移蛋白的推导氨基酸序列。使用肽质量指纹法观察到的胰蛋白酶和Lys-C肽分别是加下划线的和加阴影的。
图5(A)描绘了从分析以总LTP浓度113.6μg/mL掺有参照LTP的玉米粒提取物获得的LC-UV/MS(215nm)层析图，图5(B)描绘了从分析以总LTP浓度4.08μg/mL掺有参照LTP的玉米粒提取物获得的LC-UV/MS(215nm)层析图，以及图5(C)描绘了在范围4.1-147μg/mL里的典型LTP测定标准曲线。
图6(A)描绘了来自系#13的玉米粒提取物的UV(215nm)层析图。图6(B)描绘了具有12.34分钟保留时间的组分的解卷积质谱。图6(C)描绘了来自系#5的玉米粒提取物的UV(215nm)层析图。Y轴已经相对于玉米粒系#13标准化。图6(D)描绘了具有12.74分钟保留时间的组分的解卷积质谱。图6(E)描绘了来自系#5的玉米粒提取物的UV(215nm)层析图。Y轴已经相对于玉米粒系#4标准化。图6(F)描绘了具有13.14分钟保留时间的组分的解卷积质谱。
发明详述
本发明的实施方案包括测定组合物的变应原含量的方法。本发明的实施方案可以包括提供包含变应原的组合物；从所述组合物至少部分纯化所述变应原以形成提取物；并在紫外和质谱检测的情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量。
如本文中所使用的，“变应原”是诱导变应性或过敏性应答的任何物质。在实施方案中，变应原可以是已知的变应原，例如已知在特定受试者中产生变应性或过敏性应答的物质，在实施方案中，可以选择变应原以通过本发明的方法分析，这原因在于其是已知的变应原。
如本文中所使用的，“变应性应答”或“变态反应”是通过暴露于特定变应原引起的过敏性应答或超敏感性，导致在后续暴露后对所述变应原的反应性显著升高。
在本发明的实施方案中，液相层析可以是一维或二维的。
如本文中所使用的，“从组合物至少部分纯化变应原以形成提取物”在包含变应原的固体组合物的情况中意指将变应原的至少一部分从包含的固体组合物取到液体组合物中以形成适合于在紫外和质谱检测情况下的液相层析的提取物。在实施方案中，可以以对于本领域普通技术人员可用的任何方式实施将变应原的至少一部分从包含的固体组合物取到液体组合物中。从固体组合物提取蛋白质或其它变应原是本领域中公知的，并且可以在单或多步骤方法中实施。可以在从固体组合物提取蛋白质或其它变应原中使用的技术的例子包括但不限于浸渍、液化、裂解、超声处理、冷冻/融化循环、匀浆化、过滤、电泳、透化、沉淀、变性、离心、层析、差别溶解、和过滤。
在包含变应原的液体组合物的情况中，“从组合物至少部分纯化变应原以形成提取物”可以认为通过液相层析步骤实施，所述液相层析步骤会与液体中的一种或多种其它组分分开变应原。
在具体的实施方案中，变应原可以是食物变应原、胶乳变应原、和/或空气变应原。食物变应原的例子包括但不限于食物谷类作物、花生、豆、豌豆、果实、芹菜、芝麻、树坚果、乳、蛋、甲壳类、鱼、或马铃薯变应原。食物谷类作物变应原的例子包括但不限于大豆、玉米、和小麦变应原。在实施方案中，变应原可以是玉米脂质转移蛋白。
如本文中所使用的，“空气变应原”是可以引起变应性应答的任何空气传播物质。空气变应原的例子包括但不限于花粉和孢子。
依照本发明的方法的实施方案还可以包括提供或分离纯化的变应原的来源；并使用纯化的变应原来校准用于在紫外和质谱检测情况下实施液相层析的设备。
在其它实施方案中，包含变应原的组合物可以包含变应原的多种同等型或变体。在其它实施方案中，可以使用依照本发明的方法来测定样品中变应原的多种不同同等型或变体的量。在实施方案中，可以在紫外和/或质谱检测步骤情况下用单一液相层析步骤确定变应原的不同同等型或变体量的测定。
最近已经成功开发LC-MS法来量化并鉴定不同生物标志物，这是由于其在复杂基质中的高特异性、灵敏度、和准确度所致25,26。可以在肽水平(蛋白水解后的标签肽)或在蛋白质水平(对完整蛋白质的分析)实施LC-MS的蛋白质定量。已经详细描述了使用同位素标记的合成类似物作为内部标准品通过分析胰蛋白酶标签肽的蛋白质定量方法27。然而，标签肽方法可提出几项挑战，包括(a)必须找到合适的肽，其序列仅对感兴趣的蛋白质是特异性的27，(b)内部标准品的行为与消化前的完整蛋白质的行为相比可显著不同，以及(c)它依赖于对要为完整的蛋白质的胰蛋白酶消化28。LC-UV/MS对完整蛋白质的定量避免费时的且潜在成问题的消化步骤。另外，可以解析并量化通过标签肽方法会丢失的不同同等型或变体。
如本文中所描述的，从玉米粒(maize kernel)纯化并表征LTP和类似物。为了实现检测LTP的高特异性和灵敏性，开发出用于快速鉴定和量化的LC-UV/MS法。开发此方法以在14种玉米系的比较中证明测定法特异性、灵敏性、和定量准确性。LC-UV/MS的使用可以导致最小化的样品处理、缩短的分析时间，而且容许准确量化组合物样品以评估变应原水平。
实施例
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例作为例示提供，而不意图以任何方式限制本发明。
实施例中使用的方法和材料：
材料：
碳酸氢铵和MES缓冲液购自Sigma(St.Louis,MO)。HPLC级异丙醇(IPA)、痕量金属级氢氧化铵、氢氧化钠、氯化钠、甘油、LC/MS级三氟乙酸(TFA)、氯化氢、二硫赤藓糖醇(DTE)和β-巯基乙醇购自Thermo FisherScientific(Pittsburgh,PA)。HPLC级乙腈(ACN)和甲醇购自J.T.Baker(Phillipsburg,NJ)。具有0.22μm膜滤器的Steriflip一次性真空过滤系统购自Millipore(Billerica,MA)。SP Sepharose阳离子交换柱购自GE HealthcareBioSciences(Piscataway,NJ)。聚丙烯自动取样器管形瓶插入物购自Agilent(Santa Clara,CA)。标准4-20%Tris-HCl凝胶购自Bio-Rad(Hercules,CA)。Lys-C和胰蛋白酶获自Roche Applied Sciences(Indianapolis,IN)。对于所有分析，使用Milli-Q(Millipore,Billerica,MA)去离子水。
参照LTP制备：从非转基因玉米种子纯化LTP。
如下实施玉米衍生的LTP蛋白的提取和分离。将常规的玉米粒用含有相等量干冰的Robot Coupe研磨机(#:RSI2Y-1型,Robot Coupe USA,Inc.)研磨成细粉末。容许干冰于-20℃排放过夜，并在次日，将50克粉状粒在350mL125mM碳酸氢铵缓冲液中重悬。用NaOH将混合物的pH调节至8.0，并将样品于72℃在不断摇动的情况下加热2小时。通过于20℃以37000g将样品离心5分钟除去不溶性颗粒。将所得的上清液过滤流过P8级滤纸，并将样品于40℃用5mg胰蛋白酶(Sigma产品目录#T7168)消化过夜。在蛋白水解后，用HCl将样品的pH降低到5.2，并通过于20℃以30000g离心15分钟进一步使样品澄清。将所得的上清液过滤流过0.45μm滤器，并将样品加载到用50mM MES缓冲液，pH5.5(缓冲液A)预平衡的SP Sepharose柱(5mL/分钟，以50/50与Milli-Q水混合)上。在样品加载后，将该柱在缓冲液A中广泛清洗，直到A280降低到基线。用缓冲液A至缓冲液B(缓冲液A+0.5M NaCl)的线性梯度洗脱结合的蛋白质，并通过SDS-PAGE检查收集的级分。将含有约9kDa LTP蛋白的级分组合，并通过定量氨基酸分析测定蛋白质浓度。将合并的级分等分取样到管形瓶中，并于-80℃贮存。
样品制备：从玉米粒分离LTP和LTP变体。
实施从研磨的玉米粒提取LTP，在一些修改的情况下如先前所报告的21。简言之，将于-20℃贮存的研磨玉米粒于室温在含有Dry-RiteTM的冷箱中融化。称重约100mg研磨的玉米粒，并添加700μL0.125M碳酸氢铵缓冲液，pH8.3，并使用ThermoMixerTM于22℃以1,100rpm混合2小时。通过以16100g离心30分钟使样品澄清，并将所得的上清液转移到1.5mL微离心管。在将等分试样转移到自动取样器管形瓶前，将提取物以16100g再离心2分钟。
SDS-PAGE分析和蛋白质消化。
为了便于鉴定及表征LTP，用4-20%Tris-HCl凝胶Bio-Rad(Hercules,CA)运行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。简言之，将样品在具有5%β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中稀释。将所得的样品以371g离心45秒，然后于95℃加热1.5分钟。用考马斯亮蓝R-250检测分离的蛋白质。分离并染色后，将感兴趣的蛋白质条带切出，并于37℃与胰蛋白酶或Lys-C一起温育过夜。用25mM碳酸氢铵缓冲液中50%CAN和0.5%TFA从凝胶提取肽。然后，用25mM碳酸氢铵缓冲液中70%CAN和5%甲酸提取仍然在凝胶中的肽。将提取物合并，并在Vacufuge中干燥。将干燥的肽在18μL中重建。通过质谱术直接分析所得的蛋白水解肽。
用于表征LTP和变体的质谱条件。
在具有Agilent1200SL液相层析系统的Agilent6520Q-TOF质谱仪上获得所有质谱。通过在Agilent1200SL系统Agilent(Santa Clara,CA)上在100x2.1mm柱尺寸和1.7μm粒度的情况下于50°C从Acquity BEH130C18柱(Waters,Milford,MA)梯度洗脱实施层析。使用95%流动相A(水中的0.1%(v/v)FA；MPA)和5%流动相B(乙腈中的0.1%(v/v)FA；MPB)以200μL/分钟的流速平衡柱。注射体积在5和20μL之间变化。采用在17.2分钟里从5%MPB至40%MPB和1.7分钟里从40%MPB至45%MPB的线性梯度。然后，将柱再平衡到初始条件达6分钟。
获得UV(210-600nm)和MS(200-1800amu,1Hz)数据两者。使用Agilent1200SL二极管阵列检测仪Agilent(Santa Clara,CA)获得UV数据。在具有双重ESI离子源的6520QTOF质谱Agilent(Santa Clara,CA)上实施阳离子电喷射离子化(ESI)。质谱采集的仪器参数如下：VCap设置为3500V，碎裂器(fragmentor)为145V，撇取器(skimmer)1为65V，气体温度为350C，气体流速为8L/分钟，喷雾器为310kPa。在串联MS实验期间，采用具有静态排斥范围的靶向MS/MS。对于串联MS以9amu宽度分离峰，并应用3.6V/100Da+2V的倾斜碰撞能量。手动加工所有获得的数据(MS和MS/MS)。
用于表征和定量的层析和质谱术条件。
通过在Acquity UPLC系统(Waters,Milford,MA)上在100x2.1mm柱尺寸和1.7μm粒度的情况下于70°C从Acquity BEH300C4柱(Waters,Milford,MA)梯度洗脱实施层析。使用93%流动相A(水中的0.1%(v/v)TFA；MPA)和7%流动相B(IPA中的0.1%(v/v)TFA；MPB)以300μL/分钟的流速平衡柱。使用部分环路填充注射模式和5μL注射体积注射样品。采用15分钟里从7%MPB至14.5%MPB的线性梯度；然后，在7分钟里将MPB线性变速成50.5%。然后，将该柱再平衡到初始条件达5分钟。在注射样品前，用IPA(强清洗)和水(弱清洗)清洗自动取样器针以使样品遗留物最小化。
获得UV(215nm,10Hz)和MS(700-2300amu,1Hz)数据两者。使用Acquity TUV检测仪Waters(Milford,MA)获得UV数据。UV采集的仪器参数如下：215nm的波长，10个点/秒的取样速率，和0.2秒的时间常数。在具有锁喷雾接口(lock-spray interface)的Q-ToFmicroTM质谱仪(Waters,Milford,MA)上实施阳离子电喷雾离子化(ESI)。在MS入口前，将7%甘油/68%水/25%乙腈的溶液三通入(Tee’d-in)以改善在存在三氟乙酸情况下的离子化效率。质谱采集的仪器参数如下：毛细管设置为2850V，样品锥为35V，提取锥为1.5V，去溶剂化温度为410C，源温为100C，低和高质量分辨率为5，去溶剂化气体为600L/小时，锥气体为50L/小时，MCP检测仪为2350V，扫描时间0.9秒，扫描间延迟0.1秒以及碰撞能量为10。
方法开发
通过ELISA定量LTP已经成为选择的方法29。在来自玉米的LTP的情况中，由于缺乏特异性抗体，考虑定量LTP的备选方法。这导致决定开发用于通过LC-UV/MS分析定量测定玉米提取物的可溶性级分中玉米LTP的方法。玉米LTP中色氨酸残基的缺乏促使使用波长215nm。注意选择215nm的波长以使流动相(IPA和TFA)吸光度最小化，使分析物灵敏度最大化，并遍及整个溶剂梯度维持恒定的基线。先前已经显示了对反相蛋白质分离使用IPA和高温对于获得良好的回收和分辨率是至关重要的30。为了解决特异性问题，还监测MS响应。为了改善存在TFA情况下的质谱仪响应，进行水/乙腈混合物中甘油溶液的MS前添加。观察到增强的信噪比和转变为较高电荷状态。在存在甘油/水/乙腈混合物的情况中观察到的总离子流等于在存在甲酸流动相添加剂的情况中观察到的信号。先前显示了甘油的添加显著提高电喷雾离子化过程中蛋白质和蛋白质复合物的离子化31。
在方法开发期间，观察到参照LTP与玻璃管形瓶的结合。在分析纯化的参照LTP时观察到由于吸附所致的这种LTP损失。为了使由于吸附自动取样器管形瓶所致的损失最小化，对所有分析使用聚丙烯管形瓶插入物。另外，在参照LTP的LC-UV/MS分析过程中，还包括0.3mg/mL浓度的牛血清清蛋白。牛血清清蛋白的添加和聚丙烯管形瓶的使用两者对于在较低浓度维持线性是必需的。
实施例1：LTP MS表征。
虽然脂质转运蛋白是玉米的主要变应原，但是其量化方法尚未完善建立。已经在许多不同组织中观察到LTP的多种分子形式和异构体；因此，分析需要高灵敏度和选择性，这是由于同等型的低浓度和这些蛋白质的结构相似性。这导致LTP的纯化和表征。在纯化后通过SDS-PAGE分析玉米粒中的内源LTP。如图1中显示的，观察到约9kDa的蛋白质条带，其代表LTP的单体形式。图2和3分别描绘了纯化的蛋白质的总离子层析图和相应的质谱。质谱揭示了在m/z9047.1处生成[M+H]+离子的主要组分的存在。此测量的质量在m/z9046处的理论前体质量[M+H]+离子的0.01%内。
在胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶进行凝胶中消化后通过肽质量指纹法(PMF)进一步确认约9kDa蛋白质条带的身份。基于玉米LTP氨基酸序列与胰蛋白酶肽和Lys-C肽比较，实现LTP的完全覆盖(图4)。对N端胰蛋白酶肽AISCGQVASAIAPCISYAR和经Lys-C切割的C端肽CGVSIPYTISTSTDCSRVN进一步测序，以使用LC-MS/MS通过MS/MS确认。所有观察到的前体电荷状态的全扫描MS和MS/MS谱的手动解读揭示序列。
通过由碎片离子生成的y或b离子系列至少确认每个氨基酸残基。
实施例2：确认实验。
通过分析掺有11个浓度水平(范围为4.1至147μg/mL)的参照LTP的玉米粒提取物的一式两份注射评估测量LTP的测定法的准确性。使用参照LTP(84.7μg/mL)实施插入(bracketed)单点校准。为了测定未掺入的提取物中的LTP浓度，实施未掺入提取物的5次注射。计算测定法准确性(百分比相对误差，%RE)，并在表1中呈现(*LTP浓度按照溶液中的浓度和种子中的相应浓度报告)。还使用相同数据来确定方法的线性。通过将LTP的峰面积对浓度绘图获得线性曲线。使用线性回归来获得在范围4.1-147μg/mL里的线性方程。
对于线性曲线计算，方程不聚焦到原点。
表1：在玉米粒提取物中掺入的LTP的多点准确性。
Figure BDA00003282047500091
在三个浓度水平(低的、中等的、和高的)通过分析碾磨过的谷粒的三次重复制备(对于每次制备为一式两份注射)在四天的每天评估测量LTP的测定法的精确性。用单点参照LTP校准标准品(85μg/mL)插入每天的样品组。计算测定法当天和各天间精确性(百分比变异系数，%CV)，并表2中呈现。
表2：使用单点参照标准品校准来测定存在于三种不同玉米系中的LTP的当天和各天间精确性。
Figure BDA00003282047500101
数值已经四舍五入以显示有效数字；已经用完全精确性(full precision)完成统计学计算。
由于所有玉米种子样品中内源LTP的存在，如下测量测定法的选择性，即通过ESI-LC/MS测定完整的分子质量及通过SDS-PAGE分析LC(LTP)级分。另外，通过在最高的标准样品后立即分析溶剂空白来评估分析物遗留物。为了测定方法的稳健性，调查下列参数：提取效率、柱温、TFA浓度、和参照LTP溶液和玉米粒提取物的稳定性。
测定LTP从玉米粒的提取效率。通过上文详述的方案将来自参照系3和13的研磨玉米粒提取1小时、2小时、5小时或17小时。通过LC-UV/MS分析测定这些不同时间点时提取的LTP浓度。另外，通过进一步添加500μL碳酸氢铵缓冲液将除去400μL上清液后的2小时提取样品进一步进行第二轮提取，再进行2小时。提取后，通过LC-UV/MS分析测定LTP浓度，并应用修正以解决从第一轮提取剩余的LTP。
使用研磨的玉米粒提取物来评估柱温(65°C、70°C和75°C)和TFA浓度(0.09%、0.1%和0.11%)对层析分辨率和LTP定量的影响。对于测定浓度，还在相同的实验条件下分析参照LTP。
在一段48小时的时间里评估参照LTP和玉米粒提取物于室温和4°C的稳定性。将玉米粒提取物和参照LTP的等分试样于4°C和室温贮存48小时。在样品制备后立即测量参照LTP和玉米粒提取物的响应。在贮存后，通过LC-UV/MS分析稳定性样品。通过比较贮存的样品与新鲜制备的参照LTP来评估稳定性。
为了表征具有12.7和13.1分钟保留时间的LTP变体，将20mL玉米粒提取物(参照系#5)注射几次，并手动收集级分。将收集的级分合并，在Centrivap装置中蒸发，并进行SDS-PAGE。将蛋白质条带切出，并进行Lys-C或胰蛋白酶消化，并对凝胶提取出肽。然后，通过LC-MS/MS分析提取的肽。
来自某些玉米系的粒的水性提取物含有质量相似并且在反相柱上具有相似保留特征的蛋白质变体。所述方法解析LTP与具有相似反相保留特征的其它蛋白质的特异性可以从图5推断。虽然图6中具有保留时间12.3分钟的峰对应于玉米LTP，但是12.7和13.1分钟处的峰分别对应于LTP变体A和B。获得基线分辨率以分开具有测量的分辨率为1.6的这两种蛋白质。在图1(第2道)中显示的SDS-PAGE中进一步显示LTP峰的纯度。如下进行LTP变体A和B的进一步表征。即收集LC级分，并用胰蛋白酶或内蛋白酶Lys-C将它们进行溶液中蛋白水解，然后通过LC-MS/MS分析肽。肽质量指纹法和串联MS数据揭示了LTP变体A具有第34位的单氨基酸多态性(精氨酸至赖氨酸)。这也得到通过完整的分子量测量在LTP和LTP变体A之间观察到的28amu差异确证(图6B和D)。基于部分肽质量指纹法和完整的分子量分析，不能确认LTP变体B的修饰的确切位置(+33amu)。这些结果进一步例示开发的LC-UV/MS法的特异性。柱温是在获得这两种组分的分辨率上的一项至关重要的因素。于60°C和90°C的温度，这两对组分间的分辨率是不充分的。
玉米粒中内源LTP的存在使为测定法的总体确认制备LTP参照标准样品复杂化。因此，为了开发确认研究，首先通过使用LTP参照标准品测定非掺入的玉米粒提取物中的LTP浓度。发现用于线性和精确性研究的玉米粒系中存在的内源LTP水平是58μg/g。使用玉米粒提取物通过掺入参照LTP或用碳酸氢铵缓冲液稀释在11个浓度测量测定法的线性和精确性。观察到测定法对于玉米粒提取物中的LTP在4.1-147μg/mL的范围里是线性的(图5)，R2值为0.999。此浓度范围对应于玉米粒中28.6至1030μg/g LTP。测定法精确性范围(%RE)是0-5.1%，回收范围为94.9-103%(表1)。在LTP的最低测量浓度4.1μg/mL时观察到信噪响应215。
为了测定所述方法的线性，实施参照LTP在牛血清清蛋白中的连续稀释。虽然获得具有R2值0.999的线性响应，但是在小于44.2μg/mL的LTP浓度时观察到响应因子(面积/浓度)的快速降低。在将玉米粒提取物中的内源LTP用缓冲液向下连续稀释到10.4μg/mL的LTP浓度时没有观察到此降低。这些观察结果可以指示在缺乏基质组分的情况下由于吸附所致的LTP损失。
表2中呈现了当天和各天间精确性的确认结果。通过使用先前测定为具有低、中等和高水平LTP的三种不同玉米粒系来测量精确性。还通过使用两名分析者、两种柱批次、和两种不同LC系统来评估中间精确性。在这四天时段中在所有样品里，精确性范围(%CV)是9.1-14.4%，合并的相对标准差是11.6%。发现在高LTP玉米粒系后存在于空白样品中的绝对遗留物是约0.6%。这转化为玉米粒中6μg/g的LTP浓度。为了进一步减轻任何遗留物效应，遍及整个设置放置溶剂空白以分开分析兴趣的样品。
为了测定提取效率，在第一和第二次提取步骤后测量提取的LTP浓度。将校正因子应用于第二次提取步骤后提取的LTP。在此校正后，第一和第二次提取步骤中提取的LTP的浓度分别是来自参照系3的32.1和1.61μg/mL和来自参照系13的88.2和8.75μg/mL。第一步中的提取效率是91-95%。还在1小时、2小时、5小时和17小时时对参照系3和13测定提取效率的时间效应。对于参照系3，LTP浓度分别为204、225、241和220μg/g。对于参照系13，LTP浓度范围为526、619、658和648μg/g。总之，对于这两种参照系，2小时时的提取效率是5小时时观察到的效率的94%。
评估柱温变化及其对LTP浓度测定的影响。于柱温65°C、70°C和75°C，LTP的浓度分别测定为44.7、48.1和47.2μg/mL。在变化后，流动相A和B中0.09%、0.1%和0.11%的TFA浓度测定的LTP浓度是46.1、43.8和47.1μg/mL。由柱温和TFA浓度变化所致的本文观察到的偏差在方法的%RSD内。
评估溶液中参照LTP和粒提取物中LTP于4°C和室温的分析物稳定性。于4°C和室温在48小时后对溶液中的参照LTP分别观察到1.91%和4.75%损失。于4°C和室温在48小时后对粒提取物中的LTP分别观察到8.3%和11.5%损失。为了解决这些损失(虽然损失在测定法的精确性内)，在每个样品组的开始、中间和结束时分析参照标准LTP。
实施例3：分析玉米系中的LTP
如描述的那样一式三份制备14种不同玉米种子系。将每次制备的一式两份注射进行LC-UV/MS分析。用作为校准物(calibrant)的单点LTP参照标准品插入分析。还在对参照系的分析期间散布校准物。使用来自参照LTP的响应因子以测定LTP和保留时间分别为12.7和13.1分钟的两种变体(a和b)的水平。
表3中呈现了结果。
表3：测定来自不同系的LTP及变体LTPA和LTPB。
Figure BDA00003282047500131
数值已经四舍五入以显示有效数字；已经用完全精确性完成统计学计算。
报告的%CV基于μg/g。
使用开发的测定法测定14种感兴趣的玉米粒系中存在的LTP及其变体的水平。14种品系中LTP及变体A和B的浓度分别在58-678μg/g、31-528μg/g、和21-52μg/g之间变化(表3)。先前已经显示了LTP的表达水平依赖于分析的组织和组织的发育阶段3。此研究显示了玉米粒中LTP的变化水平可以依赖于个别玉米系的遗传背景或生长条件。对14种玉米系的分析获得的精确性(%CV)与确认研究期间测定的测定法精确性一致。这些结果指示可以使用测定方法可再现测量LTP水平。
实施例4：分析含有变应原的组合物
获得来自食物谷类作物、花生、树坚果、乳、蛋、甲壳类、鱼、或马铃薯的变应原提取物及每种变应原的参照标准品。将每种提取物的一式两份注射进行LC-UV/MS分析。用作为校准物的单点参照标准品插入分析。还在对参照系的分析期间散布校准物。使用来自参照标准品的响应因子来测定变应原及其变体的水平。分析不同提取物获得的精确性(%CV)与确认研究期间测定的测定法的精确性一致。这些结果指示可以使用测定方法可再现测量变应原水平。
虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述，但是本发明可以在本公开内容的精神和范围内进一步修改。因此，本申请意图覆盖使用其一般原理的本发明的任何变型、用途、或改编。此外，本申请意图覆盖本公开内容的此类偏离，其在本发明所属领域的已知或惯常实践内且落入所附权利要求书的限制内。
参考文献
1.Kader,J.-C.,Annual Review of Plant Physiology and Plant MolecularBiology1996,47,627-654.
2.Thoma S.L.;Kaneko Y.;Somerville C.Plant J1993,3,427-37.
3.Sossountzov,L.:Ruiz-Avila,L.;Vignols,F.;Jolliot,A.;Arondel,V.;Tchang,F.;Grosbois,M.;Guerbette,F.;Miginiac,E.;Delseny,M.;Puigdomenech,P.;Kader,J.-C.The Plant Cell,1991,3,923-933.
4.Pyee,J.;Yu,H.;Kolattukudy,P.E.Arch Biochem Biophys1994,311,460-468.
5.Carvalho,A.O.;Teodoro,C.E.S.;Da Cunha,M.;,Okorokova-Facanha,A.L.;Okorokov,L.A.;Fernandes,K.V.S.;Gomes,V.M.Physiol Plant2004,122,328-336.
6.Tsuboi,S.;Osafune,T.;Tsugeki,R.;Nishimura,M.;Yamada,M.J.Biochem.1992,111,500-508.
7.Kader,J.C.Trends Plant Sci.1997,2,66-70.
8.Gaudet,D.;Laroche,A.;Frick,M.;Huel,R.;Puchalski,B.Physiol.Plant.2003,117,195-205.
9.Bubier,J.;Schlappi,M.Plant Cell Environ.2004,27,929-936.
10.Douliez,J.;Michon,T.;Elmorjani,K.;Marion,D.J.Cereal Sci.2000,32,1-20.
11.Eklund,D.M.;Edqvist,J.Plant Physiol.2003,132,1249-1259.
12.Park,S.Y.;Jauh,G.Y.;Mollet,J.C.;Eckard,K.J.;Nothnagel,E.A.;Walling,L.L.;Lord,E.M.Plant Cell2000,12,151-164.
13.Garcia-Olmedo,F.;Molina,A.;Segura,A.;Moreno,M.TrendsMicrobiol.1995,3,72-74.
14.van Loon,L.;van Strien,E.Physiol.Mol.Plant Pathol.1999,55,514-519.
15.Diaz-Perales,A.;Garcia-Casado,G.;Sanchez-Monge,R.;Garcia-Salles,F.J.;Barber,D.;Salcedo,G.Clin.Exp.All.2002,32,87-92.
16.Pastorello,E.A.;Farioli,L.;Pravettoni,V.;Ortolani,C.;Ispano,M.;Monza,M.;Baroglio,C.;Scibola,E.;Ansaloni,R.;Incorvaia,C.;Conti,A.J.Allergy Clin.Immunol.1999,103,520-526.
17.Pastorello,E.A.;Farioli,L.;Pravettoni,V.;Giuffrida,M.G.;Ortolani,C.;Fortunato,D.;Trambaioli,C.;Scibola,E.;Calamari,A.M.;Robino,A.M.;Conti,A.J.Chrom.B.Biomed.Sci.Appl.2001,756,95-103.
18.Pastorello,E.A.;Farioli,L.;Pravettoni,V.;Ortolani,C.;Fortunato,D.;Giuffrida,M.G.;Perono Garoffo,L.;Calamari,A.M.;Brenna,O.;Conti,A.J.Allergy Clin.Immunol.2003,111,350-359.
19.Diaz-Perales,A.;Tabar,A.I.;Sanchez-Monge,R.;Garcia,B.E.;Gomez,B.;Barber,D.;Salcedo,G.J.Allergy Clin.Immunol.2002,110,790-796.
20.Palacin,A.;Cumplido,J.;Figueroa,J.;Ahrazem,O.;Sanchez-Monge,R.;Carrillo,T.;Salcedo,G.;Blanco,C.J.Allergy Clin.Immunol.2006,117,1423-1429.
21.Pastorello,E.A.;Farioli,L.;Pravettoni,V.;Ispano,M.;Scibola,E.;Trambaioli,C.;Giuffrida,M.G.;Ansaloni,R.;Godovac-Zimmermann,J.;Conti,A.;Fortunato,D.;Ortolani,C.J.Allergy Clin.Immunol.2000,106,744-751.
22.Pastorello,E.A.;Pompei,C.;Pravettoni,V.;Farioli,L.;Calamari,A.M.;Scibilia,J.;Robino,A.M.;Conti,A.;Iametti,S.;Fortunato,D.;Bonomi,S.;Ortolani,C.J.Allergy Clin.Immunol.2003,112,775-783.
23.Maleki,S.J.Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.2004,4,241-245.
24.Nakajima,O.;Teshima,R.;Takagi,K.;Okunuki,H.;Sawada,J.Regul.Toxicol.Pharmacol.2007,47,90-95.
25.Ji,Q.C.;Rodila,R.;Gage,E.M.;El-Shourbagy,T.A.Anal.Chem.2003,75,7008-7014.
26.Czerwenka,C.;Maier,I.;Potocnik,N.;Pittner,F.;Lindner,W.Anal.Chem.2007,79,5165-5172.
27.Kirkpatrick,D.S.;Gerber,S.A.;Gygi,S.P.Methods2005,35,265-273.
28.Barnidge,D.R.;Hall,G.D.;Stocker,J.L.;Muddiman,D.C.ProteomeRes.2004,3,658-661.
29.Borges,J.P.;Jauneau,A.;Brule,C.:Culerrier,R.;Barre,A,;Didier,A.;Rouge,P.Plant Physiology and Biochemistry,2006,44(10),535-542.
30.Dillon,T.M.;Bondarenko,P.V.;Rehder,D.S.;Pipes,G.D.;Kleemann,G.R.;Ricci,M.S.J.Chrom.A,2006,1120,112-120.
31.Iavarone,A.T.;Jurchen,J.C.;Williams,E.R.Anal.Chem.2001,73,1455-1460.
32.Sossountzov,L.;Ruiz-Avila,L.;Vignols,F.;Jolliot,A.;Tchang,V.A.F.;Grosbois,M.;Guerbette,F.;Miginiac,E.;Delseny,M.;Puigdomenech,P.;Kader,J-C.The Plant Cell,1991,3,923-933.

Claims (19)

1.一种测定组合物的变应原含量的方法，该方法包括：
提供包含变应原的组合物；
从所述组合物至少部分纯化所述变应原以形成提取物；并
在紫外和/或质谱检测的情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量。
2.依照权利要求1的方法，其中所述液相层析是二维液相层析。
3.依照权利要求1的方法，其中所述变应原是食物变应原、胶乳变应原、和/或空气变应原(aero-allergen)。
4.依照权利要求3的方法，其中所述食物变应原是食物谷类作物、花生、树坚果、乳、蛋、甲壳类、鱼、或马铃薯变应原。
5.依照权利要求4的方法，其中所述食物谷类作物变应原是玉米脂质转移蛋白。
6.依照权利要求3的方法，其中所述空气变应原是花粉或孢子。
7.一种测定组合物的变应原含量的方法，该方法包括：
提供包含变应原的组合物；
从所述组合物至少部分纯化所述变应原以形成提取物；
在紫外和/或质谱检测的情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量；
提供纯化的变应原的来源；并
用所述纯化的变应原的来源校准用于在紫外和/或质谱检测情况下实施液相层析的设备。
8.依照权利要求7的方法，其中所述液相层析是二维液相层析。
9.依照权利要求7的方法，其中所述变应原是食物变应原、胶乳变应原、和/或空气变应原。
10.依照权利要求9的方法，其中所述食物变应原是食物谷类作物、花生、树坚果、乳、蛋、甲壳类、鱼、或马铃薯变应原。
11.依照权利要求10的方法，其中所述食物谷类作物变应原是玉米脂质转移蛋白。
12.依照权利要求9的方法，其中所述空气变应原是花粉或孢子。
13.一种测定组合物的变应原含量的方法，该方法包括：
提供包含变应原的多种同等型或变体的组合物；
从所述组合物至少部分纯化所述变应原以形成提取物；并
在紫外和质谱检测的情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量。
14.依照权利要求13的方法，其中在紫外和质谱检测情况下使用液相层析测定所述提取物中的变应原量包括在紫外和质谱检测情况下测定所述变应原的一种或多种变体或同等型的量。
15.依照权利要求13的方法，其中所述液相层析是二维液相层析。
16.依照权利要求13的方法，其中所述变应原是食物变应原、胶乳变应原、和/或空气变应原。
17.依照权利要求16的方法，其中所述食物变应原是食物谷类作物、花生、树坚果、乳、蛋、甲壳类、鱼、或马铃薯变应原。
18.依照权利要求17的方法，其中所述食物谷类作物变应原是玉米脂质转移蛋白。
19.依照权利要求16的方法，其中所述空气变应原是花粉或孢子。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106796206A (zh) * 2014-08-11 2017-05-31 美国陶氏益农公司 用于变应原的选择性定量与检测的系统和方法
CN115997119A (zh) * 2020-08-24 2023-04-21 株式会社岛津制作所 质谱分析控制装置、质谱分析装置、质谱分析方法以及程序

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103575832B (zh) * 2013-11-13 2015-05-20 天津中医药大学 在线全二维液相色谱分离系统及方法
WO2018016551A1 (ja) 2016-07-21 2018-01-25 株式会社日清製粉グループ本社 アレルゲン検出方法
SG11202000968TA (en) * 2017-08-07 2020-02-27 Agency Science Tech & Res Rapid analysis and identification of lipids from liquid chromatography-mass spectrometry (lc-ms) data
US11408895B1 (en) 2018-04-09 2022-08-09 Hob Biotech Group Corp., Ltd. Allergen characterization, potent allergen product formulation, comprehensive allergen reagent, and allergy assay
WO2021039147A1 (ja) 2019-08-30 2021-03-04 国立医薬品食品衛生研究所長が代表する日本国 アレルゲン検出用マーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法
CN113075396A (zh) * 2021-03-25 2021-07-06 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种检测辅助装置
CN114215479B (zh) * 2021-11-24 2023-09-19 北京卫星制造厂有限公司 钻具

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1222858A (zh) * 1996-05-10 1999-07-14 爱克斯欧玛公司 抗血栓形成的材料和方法
CN1420782A (zh) * 2000-01-05 2003-05-28 吴羽化学工业株式会社 新型免疫增强组合物
CN1984673A (zh) * 2004-05-17 2007-06-20 阿雷斯贸易股份有限公司 干扰素水凝胶制剂
CN101287991A (zh) * 2005-09-15 2008-10-15 阿尔克-阿贝洛有限公司 对变应原进行定量的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002159284A (ja) * 2000-11-27 2002-06-04 Sumitomo Bakelite Co Ltd 試料保存用マルチウェルプレート
JP2004309136A (ja) * 2003-04-01 2004-11-04 Canon Chemicals Inc 容器および相互作用方法
JP4492716B2 (ja) * 2008-02-29 2010-06-30 ソニー株式会社 ダイヤモンドライクカーボン薄膜を形成した基板

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1222858A (zh) * 1996-05-10 1999-07-14 爱克斯欧玛公司 抗血栓形成的材料和方法
CN1420782A (zh) * 2000-01-05 2003-05-28 吴羽化学工业株式会社 新型免疫增强组合物
CN1984673A (zh) * 2004-05-17 2007-06-20 阿雷斯贸易股份有限公司 干扰素水凝胶制剂
CN101287991A (zh) * 2005-09-15 2008-10-15 阿尔克-阿贝洛有限公司 对变应原进行定量的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPH CZERWENKA等: "Absolute Quantitation of β-Lactoglobulin by Protein Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Its Application to Different Milk Products", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 79, no. 14, 15 July 2007 (2007-07-15), pages 2 *
LUDIVINE PERROCHEAU等: "Probing heat-stable water-soluble proteins from barley to malt and beer", 《PROTEOMICS》, vol. 5, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 2849 - 2858 *
SUSANNE LUOTO等: "The identification of allergen proteins in sugar beet (Beta vulgaris) pollen causing occupational allergy in greenhouses", 《CLINICAL AND MOLECULAR ALLERGY》, vol. 6, no. 7, 11 August 2008 (2008-08-11) *
刘志刚等: "家蚕30kD特异性变应原的分析、纯化与质谱鉴定", 《昆虫学报》, vol. 50, no. 2, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 101 - 105 *
张维冰等: "多维液相色谱- 质谱用于酶解猪血蛋白中活性肽的研究", 《分析试验室》, vol. 25, no. 10, 31 October 2006 (2006-10-31) *
黄迎春主编: "《蛋白质工程简明教程》", 31 July 2009 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106796206A (zh) * 2014-08-11 2017-05-31 美国陶氏益农公司 用于变应原的选择性定量与检测的系统和方法
CN115997119A (zh) * 2020-08-24 2023-04-21 株式会社岛津制作所 质谱分析控制装置、质谱分析装置、质谱分析方法以及程序

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