CN114778736B - 一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备：将供试品粉末水洗，留残渣；向药渣中加入变性缓冲液和0.50mol/L二硫苏糖醇溶液，反应溶解，再加入0.55mol/L碘代乙酰胺溶液避光反应；将反应后的混合液置于截留分子量为3kD的超滤离心管中作离心处理；向超滤膜上方的截留物中加入胰蛋白酶溶液；再次离心，鹿茸多肽穿过超滤膜转移至膜下而被收集，用于仪器分析；高效液相色谱‑质谱联用检测。本发明的鉴别方法可以准确将脑灵素制剂中的梅花鹿茸和马鹿茸与其它掺伪品种区别开来。
Description
技术领域
本发明涉及药品检测领域，具体涉及脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用。
背景技术
鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，为药用历史悠久的补益类中药，除作饮片用外，鹿茸还作为原料制成中成药制剂。在巨大的市场需求下，梅花鹿茸、马鹿茸原料短缺，价格昂贵，原料供应远远不及生产量的需求。市场常出现以驼鹿、驯鹿、狍鹿等其他物种掺伪投料的现象，使相关产品的质量和安全性难以保证。
现行的鹿茸标准中，没有收载针对物种特异性的辨别方法，在鹿角胶质量标准中收载了鹿源性特征多肽的鉴别方法，该方法可以区分鹿科动物整体与牛科、马科等其它科哺乳动物，但却无法将梅花鹿、马鹿与其它非标鹿种分开，这就导致驼鹿、驯鹿、狍鹿等物种冒充梅花鹿、马鹿时无法精准判断。
脑灵素制剂是神经科常用中成药，主要用于神经衰弱，健忘失眠，头晕心悸，身倦无力，体虚自汗，阳痿遗精等症状。其处方由15味药材组成，其中包括鹿茸、鹿角胶两味来自于鹿源的贵细药材，作为方中佐药，发挥补肝肾、益精血的作用。由于鹿茸和鹿角胶的动物来源相同，两者的蛋白组成存在较高比例的交叉，因此当两味药材同时存在时，鹿角胶的蛋白成分会对鹿茸的鉴别造成干扰，难以判断制剂中是否有正确的鹿茸投料。
脑灵素制剂中的鹿茸为粉末直接入药，但是在处方中占比低至0.3％，采用常规的煎煮、回流、超声等通用提取方式，无法将蛋白成分从鹿茸药材中提取出来，若采用高温高压提取方法，则鹿茸中的热不稳定蛋白会被破坏；另外过于复杂的基质成分将会对鹿茸的离子对检测造成极大的影响，以致于目标信号被基质完全淹没，导致假阴性结果的出现，从而对药材投料情况造成误判。
发明内容
基于上述现有技术的问题，本发明提供了一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用，该鉴别方法可排除鹿角胶对鹿茸造成的干扰。
为了实现上述技术效果，本发明通过以下技术方案：
一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：将供试品粉末水洗，留残渣；向药渣中加入变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液(优选：0.50mol/L)，反应溶解(优选的：在75-85℃下进行反应，更优选：80℃下反应)，再加入碘代乙酰胺溶液(优选：0.55mol/L) 避光反应；将反应后的混合液置于超滤离心管(优选：截留分子量为3kD)中作离心处理；向超滤膜上方的截留物中加入胰蛋白酶溶液；再次离心，鹿茸多肽穿过超滤膜转移至膜下而被收集，用于仪器分析；
高效液相色谱-质谱联用检测。
优选的，色谱条件如下：色谱柱ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7 μm)，流速0.3ml/min，流动相A为0.1％甲酸乙腈，溶液B为0.1％甲酸溶液，进行梯度洗脱，0～25min流动相A(％)3→20，流动相B(％)97→80，25～40min 流动相A(％)20→50，流动相B(％)80→50。
优选的，质谱条件如下：采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，检测离子对如下：母离子605.0，子离子1169.1，子离子2275.1。
变性缓冲溶液配制：称取573.1g盐酸胍，12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.734g 乙二胺四乙酸，加水溶解，加盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L,摇匀，即得。
本发明的目的之二，是保护上述鉴别方法在鹿茸物种鉴别中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的鉴别方法有效克服了由于鹿茸在脑灵素制剂中含量低，无法通过现有技术的提取方法将蛋白成分从鹿茸药材中提取出来的问题，该鉴别方法不受复杂的基质成分对鹿茸的离子对检测造成的影响，结果准确，避免假阴性。
本发明的鉴别方法可以准确将梅花鹿茸和马鹿茸与其它掺伪品种区别开来。
本发明的鉴别方法中选用的离子对信息具有独特的优势，该离子来源于鹿角器官中热不稳定蛋白，制作鹿茸时该蛋白保持稳定因而离子信息可以检出，而鹿角胶在高温高压熬制的过程中热不稳定蛋白均被破坏降解，该离子信息在鹿角胶中检测不到，针对脑灵素制剂中鹿茸与鹿角胶同时存在的问题，本发明所选用的离子对信息可排除鹿角胶对鹿茸造成的干扰。
附图说明
图1鹿茸专属性试验图谱，自上至下分别为鹿茸参比溶液；标准制剂；脑灵素鹿茸阴性样品；
图2鹿茸耐用性试验图谱，自上至下分别为Agilent SB-C18色谱柱；WatersACQUITY UPLC HSS C18色谱柱测定的鹿角胶；
图3鹿茸专属性试验图谱，自上至下分别为标准制剂；脑灵素制剂鹿茸阴性样品。
具体实施方式
为方便本技术领域人员的理解，下面结合附图，对本发明的技术方案进一步具体说明。
一、仪器、试剂与样品信息
仪器：Waters Quattro Premier XE高效液相色谱-质谱联用仪；AB SCIEX TripleQuad 6500+高效液相色谱-质谱联用仪；Sartorius CP225D电子天平。
试剂：甲酸，乙腈均为色谱纯；纯净水为Milli-Q纯水；胰蛋白酶为质谱级，购自Sigma公司。
参比样品及阴性对照样品：本实验室按照规定的处方量及工艺自制脑灵素胶囊、脑灵素片各一批，作为参比样品使用；分别自制缺鹿角胶、鹿茸药味的脑灵素制剂各一批，作为阴性样品使用。具体样品信息见表1，脑灵素制剂处方量见表2-3 表1样品列表
表2脑灵素胶囊处方量
脑灵素胶囊标准制剂制备：以上十五味药材，人参、鹿茸、鹿角胶、龟甲、远志、茯苓、麦冬、黄精、枸杞子、五味子、酸枣仁、白糖51.7g粉碎成细粉，过筛，其余淫羊藿等四味药材加水煎煮三次，第一次3小时，第二次、三次各位 2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成膏。将浓缩膏加入上述细粉中，混匀，烘干，粉碎，装入胶囊制成1000粒，即得。
缺鹿茸脑灵素胶囊阴性制剂制备：除鹿茸外十四味药材，参照脑灵素胶囊标准制剂制备方法同法操作，即得。
缺鹿角胶脑灵素胶囊阴性样品制备：除鹿角胶外十四味药材，参照脑灵素胶囊标准制剂制备方法同法操作，即得。
表3脑灵素片处方量
脑灵素片标准制剂制备：以上十五味，人参、鹿茸、鹿角胶、龟甲、远志、茯苓、麦冬、黄精、白糖粉碎成细粉；其余淫羊藿等七味药材加水煎煮三次(3、 2、1小时)，分次滤过，合并滤液，浓缩成膏，与上述细粉混合，干燥，粉碎，加适量辅料，混匀，制成颗粒，压制成1000片，包糖衣，即得。
缺鹿茸脑灵素片阴性样品制备：除鹿茸外以上十四味，参照脑灵素片标准制剂制备方法同法操作，即得。
缺鹿角胶脑灵素片阴性样品制备：除鹿角胶外以上十四味，参照脑灵素片标准制剂制备方法同法操作，即得。
二、色谱、质谱条件与系统适用性试验
液相条件：色谱柱ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，流速 0.3ml/min，流动相A为0.1％甲酸乙腈，溶液B为0.1％甲酸溶液，进行梯度洗脱，见表4。
表4梯度洗脱程序
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测 (MRM)，检测离子对见表5。
表5检测离子对
系统适用性：取参比溶液，进样5μl，按上述离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于10:1。
三、溶液制备
鹿茸参比溶液：取梅花鹿茸或马鹿茸10mg，加入10ml变性缓冲液，1ml DTT 溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心，量取上清液750μL，加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心；对样品溶液脱盐后，量取上清液500μL，加入25μL牛胰蛋白酶溶液(1mg/ml)，37℃酶解2h，取出放冷至室温，离心，取上清液，即得。
供试品溶液：
①将制剂粉末用水反复振摇洗涤5次，将制剂中的水溶性蛋白质充分洗净，此时鹿茸粉末存在于药渣中；
②向药渣中加入变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液，在80℃下充分反应溶解，此时鹿茸粉末中的蛋白溶为液态，再加入碘乙酰胺避光反应，将鹿茸蛋白烷基化稳定为链状结构；
③将液态蛋白置于截留分子量为3kD的超滤离心管中作离心处理，此时盐和小分子化合物可穿过超滤膜被离心到膜下弃去，鹿茸蛋白与多糖、纤维素等大分子物质一并被截留于超滤膜上方；
④向超滤膜上方的截留物中加入胰蛋白酶溶液，此时鹿茸蛋白被酶解为多肽片段从而分子量降至3kD以下；
⑤再次离心，非蛋白类的大分子物质仍然截留在膜上，而鹿茸多肽此时可穿过超滤膜，转移至膜下而被收集，用于仪器分析。
具体步骤如下：取脑灵素片，除去包衣，研细，取11g，精密称定；或取脑灵素胶囊，研细，取10g，精密称定，置50ml锥形瓶中，加水50ml，超声处理 30分钟，离心(转速为每分钟6000转)5分钟，弃去上清液，残渣继续按上述方式超声、离心操作4次。离心后的残渣，加无水乙醇50ml，摇散，超声处理 30分钟，离心(转速为每分钟6000转)5分钟，弃去上清液，残渣继续按上述方式超声、离心操作4次。残渣挥干，加入10ml变性缓冲液，1ml DTT溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心，量取上清液750μL，加入100 μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心；取上清液400μL加入超滤膜上方， 12000rpm离心15分钟，再加入1％碳酸氢铵溶液300μL，12000rpm离心15分钟，继续按上述方式加入1％碳酸氢铵溶液离心操作4次；向膜上残留溶液中加入1％碳酸氢铵溶液200μL和1mg/ml牛胰蛋白酶溶液10μL，混匀，37℃酶解2h，更换套管，12000rpm离心15分钟，取下层套管中溶液作为供试品溶液。
四、专属性实验
以自制的脑灵素标准制剂为阳性样品，以缺鹿茸阴性样品为阴性样品，以鹿茸参比溶液为对照，选择m/z 605.0(双电荷)→169.1、275.1作为检测离子对进行测定。结果含有鹿茸的标准制剂样品中，在与参比溶液相应的保留时间位置上，均呈现上述离子流色谱峰，不含鹿茸的阴性样品色谱图中，在与参比溶液相应的位置上无相应的色谱峰，认为方法专属性较好。结果见图1。
五、色谱柱耐用性
分别选用Agilent SB-C18色谱柱和Waters ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱，按上述色谱条件进行测试，选择m/z 605.0(双电荷)→169.1、275.1作为检测离子对进行测定。离子流色谱见图2。结果表明鹿茸在上述两种色谱柱上均可检出。
六、筛查结果和分析
对63批脑灵素制剂样品中鹿茸投料进行考察，结果两生产企业9批样品中检出鹿茸成分。其它样品中均未出现鹿茸特征成分。可能存在鹿茸投料不足或以骨化严重的劣质鹿茸投料的问题。
七、对比例1
使用鹿角胶现行标准中的特征离子对m/z765.4(双电荷)→554.0和 m/z765.4(双电荷)→733.0作为检测离子对，检测标准制剂和脑灵素制剂鹿茸阴性样品的脑灵素样品，发现该特征离子对在两种样品中都同时出现，说明该特征离子对无法指征脑灵素制剂中是否正确投料鹿茸。
使用本发明的离子对m/z605.0(双电荷)→169.1和m/z605.0(双电荷) →275.1作为检测离子对，检测标准制剂和脑灵素制剂鹿茸阴性样品的脑灵素样品，发现该特征离子对在标准制剂中出现，而脑灵素制剂鹿茸阴性样品中未出现，说明本发明的离子对可以指征脑灵素制剂中是否正确投料鹿茸。参见图2。
八、对比例2
本制剂药味多，鹿茸在其中所占比例仅为0.3％，通过比较不同的前处理方式对鹿茸蛋白的提取和净化，发现本发明所涉及的方法可有效的净化基质效应对目标离子对测定的影响。
方法1：取脑灵素片，除去包衣，研细，取11g，精密称定；或取脑灵素胶囊，研细，取10g，精密称定，置50ml锥形瓶中，加入10ml变性缓冲液，1ml DTT 溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心，量取上清液750μL，加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心；取上清液100μL加入1％碳酸氢铵溶液900μL和1mg/ml牛胰蛋白酶溶液10μL，混匀，37℃酶解2h， 12000rpm离心取上清液作为供试品溶液。
方法2：取脑灵素片，除去包衣，研细，取11g，精密称定；或取脑灵素胶囊，研细，取10g，精密称定，加水50ml煎煮1小时，放冷，取上清液100μL 加1mg/ml牛胰蛋白酶溶液10μL，混匀，37℃酶解2h，12000rpm离心取上清液作为供试品溶液。
方法3：照前文供试品溶液制备方法制成供试品溶液。
将三种方法制备的对照品溶液同时进行质谱分析，结果可见，方法1和方法 2制备的供试品溶液基质效应明显，淹没了目标离子对的质谱信号，无法对脑灵素制剂中鹿茸投料情况进行判断。本发明中涉及的方法3可以明显净化基质，使目标离子显示出易于观察的信号峰，可达到对脑灵素制剂中鹿茸鉴别的目的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法，其特征是：包括以下步骤：
供试品溶液的制备：
取脑灵素片，除去包衣，研细，称定；或取脑灵素胶囊，研细，称定，置锥形瓶中，加水，超声处理，转速为每分钟6000转离心，弃去上清液，离心后的残渣，加无水乙醇，摇散，超声处理，转速为每分钟6000转离心，弃去上清液，残渣挥干，加入变性缓冲液，二硫苏糖醇DTT溶液，摇匀，在75-85℃下保温处理过夜，取出放冷至室温，离心，上清液加入碘代乙酰胺IAA溶液，避光反应后混匀，离心；取上清液加入超滤膜上方，12000rpm离心15分钟，再加入碳酸氢铵溶液，离心，向膜上残留溶液中加入碳酸氢铵溶液和牛胰蛋白酶溶液，混匀，酶解，更换套管，离心，取下层套管中溶液作为供试品溶液；
高效液相色谱-质谱联用检测；
色谱条件如下：流速0.3ml/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈，溶液B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱，0～25min流动相A 3%→20%，流动相B 97%→80%，25～40min流动相A 20%→50%，流动相B 80%→50%；
色谱柱ACQUITY UPLC® BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；
质谱条件如下：采用质谱检测器，电喷雾正离子模式ESI+，进行多反应监测MRM，检测离子对如下：母离子605.0，子离子1 169.1，子离子2 275.1。
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