CN110850001A - 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp3的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法。本发明针对意蜂蜜筛选出其中王浆主蛋白3（MRJP3）的特征肽段，并开发液相色谱串联质谱的定量方法，所述方法包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤。本发明提供的意蜂蜜中MRJP3的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中MRJP3。可用于辅助意蜂蜜真实性评价。此外，该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

Description

液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。一些不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。
王浆主蛋白3（major royal jelly protein 3，MRJP3）是王浆主蛋白大家族中的一类蛋白质，是蜂蜜中含量比较丰富的蛋白质。研究结果表明MRJP3的含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则其含量必定发生较大的变化，因此MRJP3含量可用以辅助鉴别蜂蜜的掺假现象。对于如何准确定量蜂蜜中MRJP3的含量，目前尚无相关报道。
液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略基础上，提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法。
本发明的另一目的是将该方法用于生产和商业中对蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP3的特征肽段，含有以下特征肽段：
特征肽段1：LTVAGESFTVK，用于定量；
特征肽段2：GGPLLRPYPDWSFAK，用于定性。
所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：
(1)提取缓冲液：0.01 M PBS，pH7.4；
(2)胰蛋白酶液20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；
(3)特征肽段1、2的标准品。
本发明提供的利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中MRJP3蛋白含量的方法，包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；
B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；
C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP3的定量检测。
优选地，液相色谱条件如下：
色谱柱：C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5 min，5%的B；0.5-1.0 min，5-15%的B；1.0-6.5 min，15-40%的B；6.5-7.0 min，40-95%的B；7.0-8.5 min，95%的B；8.5-8.6 min，95-5%B，8.6-10.0 min，5%的B；流速：0.3 mL/min；进样量：5.0 µL。
优选地，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速（sheath gas flow rate）38 L/min；辅助气的流速（aux gasflow rate）15 L/min；电喷雾电压（spray voltage）3.2 KV；离子导管的温度（capillarytemperature）275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度（Heater temperature）380℃；
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：
其中，Full MS的具体参数设置如下：分辨率（Resolution）：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：200-1500 Da；Spectrum data：Centroid；Inclusion：on；
其中，dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率（Resolution）：17500，AGC Target：1e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2；Isolation window：2.0 Da；NCE：15，25，35；Spectrumdata：Centroid；而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Excludeisotope：on；Dynamic exclus：4.0 s；If idle：pick other。
本发明成功筛选出意蜂定量特征肽段LTVAGESFTVK，其特异性通过Uniprot数据库进行了验证；并选择稳定的内标（IS）肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量MRJP3。
优选地，所述稳定同位素内标肽段为：LTVAGESFTVK *，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。
进一步，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有576.31897质荷比；包含质荷比为838.43048、767.39343的子离子。
所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z: 母离子为m/z: 580.32607，同时包含质荷比为846.44409、775.40686的子离子。
前述的方法，步骤C得到的标准曲线为Y=0.02712X-0.7996，R2=0.9983，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；MRJP1蛋白的线性检测范围为5-1000 ng/mL，最低检出限为2 ng/mL。
该方法采用UHPLC-Q Exactive Plus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过比较其图谱中MRJP3特征肽段/IS肽段峰面积比，推算MRJP3含量，进而判定蜂蜜是否掺假，主要基于MRJP3的特征肽段的定量母离子在液质上的峰面积和稳定同位素标记的内标（IS）肽段的在液质上的峰面积。
应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。
本发明采用UHPLC-Q Exactive plus仪器对蜂蜜中的MRJP3，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
研究发现，意蜂MRJP3的含量相对恒定，本发明据此建立起一套蜂蜜真实性评价的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本发明提供的意蜂MRJP3蛋白含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适用于意蜂MRJP3的准确定量。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus提取的意蜂MRJP3的特征肽段及其同位素内标肽段的离子流图。
图2为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP3的特征肽段及其同位素内标肽段的质谱图。
图3为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP3的特征肽段及其同位素内标肽段的二级碎片质谱图。
图4为本发明实施例1中备选的特征肽段在参考样品中的响应（相对丰度）。
图5为本发明实施例1中来自不同蜂蜜样本中MRJP3的含量的定量结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的仪器与试剂：
1.质谱仪(Q-Exactive)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；
3.全波长酶标仪(Multiskan GO)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
4.电子分析天平((PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5. pH计(DELTA 320)，德国METTLER TOLEDO公司；
6.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem, RVC2-18)，德国 MarinChrist公司；
7.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；
8.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；
9.1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
10.二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)，中国Solarbio公司；
11.碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)，美国Merk公司；
12.Bradford法蛋白质定量试剂盒，中国Solarbio公司；
13.碳酸氢铵(NH4HCO3)，美国Sigma公司。
实施例1 液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP3蛋白含量的方法
1. 样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的意蜂蜜样本共20份。
2. 实验步骤
（1）溶液配制
5M Urea溶液：称取Urea 4.5 g，超纯水定容到15 mL。
100 mM DTT：称取DTT 308.5 mg，40 mM NH4HCO3溶液定容到20 mL，每管l mL分装，-20℃冰箱保存待用。
40 mM NH4HCO3溶液：称取0.316 g NH4HCO3，用超纯水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。
100 mM IAA溶液：称取IAA 0.39 g，用40 mM的NH4HCO3溶液定溶至20 mL，-20℃冰箱保存待用。
活化液：500 μL ACN、3 μL TFA，超纯水定容至1 mL，4℃保存。
平衡液:1 μL TFA，超纯水定容至1 mL，4℃保存。
洗脱液：800 μL ACN、1 μL TFA，用超纯水定容至1 mL，4℃保存。
（2）标准曲线的绘制：在初始流动相（97：3，v/v，水/ACN，含0.1％甲酸）中制备一系列特征肽段标准品（2，5，10，20，40，80，100，200，400，800和1000 ng/mL）， 然后向配置好的每个浓度的标准品中加入200 ng IS肽段。
1290 Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱液相色谱条件如下：
色谱柱：Kinetex C18 (50 mm × 2.1 mm) 2.6µm，柱温为室温：20℃。
流动相组成：流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈。梯度洗脱条件为：0-0.8 min，10%的B；0.8-1.3 min，10-20%的B；1.3-4.5 min，20-30%的B；4.5-5.4 min，30-95%的B；5.4-6.0min，95%的B；6.0-6.1 min，95-5%B，6.1-7.0 min，5%的B。流速：0.3 mL/min；进样量：5.0 µL。
质谱条件如下：
离子源参数：鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min；辅助气温度290 ℃；辅助气流速11L/min；毛细管电压正模式3.5kV；iFunnel参数正模式高压200V、低压100V，采集的模式为正离子模式下的MRM模式。通过绘制特征肽段/IS肽段峰面积比与分析物浓度来绘制校准曲线。
（3）蜂蜜样本的前处理
①准确称取待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200 μL并加入4 μL的100 μg/mL内标肽段（LTVAGESFTVK*），并与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用1290 Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测。检测时，液相色谱条件如下：
色谱柱：Kinetex C18 (50 mm×2.1 mm) 2.6µm，柱温为室温：20℃。
流动相组成：流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈。梯度洗脱条件为：0-0.8 min，10%的B；0.8-1.3 min，10-20%的B；1.3-4.5 min，20-30%的B；4.5-5.4 min，30-95%的B；5.4-6.0min，95%的B；6.0-6.1 min，95-5%B，6.1-7.0 min，5%的B。流速：0.3 mL/min；进样量：5.0 µL。
质谱条件如下：
离子源参数：鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min；辅助气温度290 ℃；辅助气流速11L/min；毛细管电压正模式3.5kV；iFunnel参数正模式高压200V、低压100V，采集的模式为正离子模式下的MRM模式。
（5）蜂蜜样本的数据处理
根据特征肽段/IS肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式（2）得到意蜂MRJP3蛋白的含量。
X=(ФcVM1)/(M2m) 式（2）
其中，X为（ng/g）是蜂蜜样品意蜂MRJP3的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c（ng/mL）是特征肽段在胰蛋白酶消化物中的浓度，V（mL）是胰蛋白酶消化物的体积，M1、M2是MRJP3和特征肽段的摩尔质量，m（g）是蜂蜜样品的质量。以达到对蜂蜜样品中MRJP3定量的目的。
对蜂农处采集的真实意蜂蜜样本的MRJP3的肽段进行匹配检测，结果整理为见图4，从图4中可以看出在蜂蜜中，本发明筛选的MRJP3特征肽段LTVAGESFTVK和GGPLLRPYPDWSFAK的响应最高，表明在不同参考样品中其含量相对稳定，由此可以体现其含量相对稳定，且适合作为定量意蜂蜜样本中可以作为定量蜂蜜样本中由此可以体现其含量相对稳定，且可以作为定量蜂蜜样本中MRJP3的含量的肽段。
根据对蜂农处采集的真实蜂蜜样本中MRJP3的含量的定量结果整理为见图5，从图5中可以看出在蜂蜜中MRJP3含量相对稳定，并且结果重复性好。
实施例2 定量意蜂MRJP3对意蜂蜜样品的真实性检测
1. 样品来源
从市场购买真实的蜂蜜样本
2. 实验步骤
（3）蜂蜜样本的前处理
①准确称取待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200 μL并加入4 μL的100 μg/mL内标肽段（LTVAGESFTVK*），并与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用1290 Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测。
（5）蜂蜜样本的数据处理
根据特征肽段/IS肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式（2）得到意蜂MRJP3蛋白的含量。
对从市场中购买的蜂蜜样本的MRJP3的肽段进行检测，结果整理为见表1，从表1中可以看出，根据本发明筛选的MRJP3 特征肽段LTVAGESFTVK在质谱中检测的浓度，可以明显看出蜂蜜中MRJP3 的含量差异，对于掺假蜂蜜的样品中含量表现为异常或者含量为0。
通过UHPLC-Q Exactive plus提取的意蜂MRJP3的特征肽段及其同位素内标肽段的离子流图见图1。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP3的特征肽段及其同位素内标肽段的质谱图见图2。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP3的特征肽段及其同位素内标肽段的二级碎片质谱图见图3。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
表1 特征肽段LTVAGESFTVK在不同蜂蜜样品中的浓度
Figure 890682DEST_PATH_IMAGE001
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP3蛋白含量的方法
<130> KHP191115398.8
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 1
Leu Thr Val Ala Gly Glu Ser Phe Thr Val Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 2
Gly Gly Pro Leu Leu Arg Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 544
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 3
Met Thr Lys Trp Leu Leu Leu Val Val Cys Leu Gly Ile Ala Cys Gln
1 5 10 15
Asp Val Thr Ser Ala Ala Val Asn His Gln Arg Lys Ser Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ala His Ser Met Lys Val Ile Tyr Glu Trp Lys His Ile Asp Phe
35 40 45
Asp Phe Gly Ser Asp Glu Arg Arg Asp Ala Ala Ile Lys Ser Gly Glu
50 55 60
Phe Asp His Thr Lys Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Arg Trp Arg Asp
65 70 75 80
Lys Thr Phe Val Thr Ile Glu Arg Asn Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu
85 90 95
Asn Val Val Thr Asn Lys Lys Gly Lys Gly Gly Pro Leu Leu Arg Pro
100 105 110
Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Ile Val
115 120 125
Ser Ala Phe Lys Ile Ala Val Asp Lys Phe Asp Arg Leu Trp Val Leu
130 135 140
Asp Ser Gly Leu Val Asn Asn Asn Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu
145 150 155 160
Leu Thr Phe Asp Leu Lys Thr Ser Lys Leu Val Lys Gln Val Glu Ile
165 170 175
Pro His Asn Ile Ala Val Asn Ala Thr Thr Gly Met Gly Glu Leu Val
180 185 190
Ser Leu Ala Val Gln Ala Ile Asp Arg Thr Asn Thr Met Val Tyr Ile
195 200 205
Ala Asp Glu Lys Gly Glu Gly Leu Ile Met Tyr Gln Asn Ser Asp Asp
210 215 220
Ser Phe His Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Arg Tyr
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Ala Gly Glu Ser Phe Thr Val Lys Asn Gly Ile
245 250 255
Tyr Gly Ile Ala Leu Ser Pro Val Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro
260 265 270
Leu Leu Ser His Gly Leu Tyr Tyr Val Asp Thr Glu Gln Phe Ser Asn
275 280 285
Pro Gln Tyr Glu Glu Asn Asn Val Gln Tyr Glu Gly Ser Gln Asp Ile
290 295 300
Leu Asn Thr Gln Ser Phe Gly Lys Val Val Ser Lys Asn Gly Val Leu
305 310 315 320
Phe Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Gly Ile Ala Cys Val Asn Glu His
325 330 335
Gln Val Leu Gln Arg Glu Ser Phe Asp Val Val Ala Gln Asn Glu Glu
340 345 350
Thr Leu Gln Met Ile Val Ser Met Lys Ile Met Glu Asn Leu Pro Gln
355 360 365
Ser Gly Arg Ile Asn Asp Pro Glu Gly Asn Glu Tyr Met Leu Ala Leu
370 375 380
Ser Asn Arg Met Gln Lys Ile Ile Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asn Asp
385 390 395 400
Val Asn Phe Arg Ile Leu Gly Ala Asn Val Asp Asp Leu Met Arg Asn
405 410 415
Thr Arg Cys Gly Arg Tyr His Asn Gln Asn Ala Gly Asn Gln Asn Ala
420 425 430
Asp Asn Gln Asn Ala Asp Asn Gln Asn Ala Asn Asn Gln Asn Ala Asp
435 440 445
Asn Gln Asn Ala Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Arg
450 455 460
Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Lys Gln
465 470 475 480
Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn
485 490 495
Gly Asn Lys Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp
500 505 510
Asn Lys Arg Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Gln Asn Asn Gln Asn
515 520 525
Asp Asn Asn Arg Asn Asp Asn Gln Val His His Ser Ser Lys Leu His
530 535 540
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP3蛋白含量的方法
<130> KHP191115398.8
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 1
Leu Thr Val Ala Gly Glu Ser Phe Thr Val Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 2
Gly Gly Pro Leu Leu Arg Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 544
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 3
Met Thr Lys Trp Leu Leu Leu Val Val Cys Leu Gly Ile Ala Cys Gln
1 5 10 15
Asp Val Thr Ser Ala Ala Val Asn His Gln Arg Lys Ser Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ala His Ser Met Lys Val Ile Tyr Glu Trp Lys His Ile Asp Phe
35 40 45
Asp Phe Gly Ser Asp Glu Arg Arg Asp Ala Ala Ile Lys Ser Gly Glu
50 55 60
Phe Asp His Thr Lys Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Arg Trp Arg Asp
65 70 75 80
Lys Thr Phe Val Thr Ile Glu Arg Asn Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu
85 90 95
Asn Val Val Thr Asn Lys Lys Gly Lys Gly Gly Pro Leu Leu Arg Pro
100 105 110
Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Ile Val
115 120 125
Ser Ala Phe Lys Ile Ala Val Asp Lys Phe Asp Arg Leu Trp Val Leu
130 135 140
Asp Ser Gly Leu Val Asn Asn Asn Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu
145 150 155 160
Leu Thr Phe Asp Leu Lys Thr Ser Lys Leu Val Lys Gln Val Glu Ile
165 170 175
Pro His Asn Ile Ala Val Asn Ala Thr Thr Gly Met Gly Glu Leu Val
180 185 190
Ser Leu Ala Val Gln Ala Ile Asp Arg Thr Asn Thr Met Val Tyr Ile
195 200 205
Ala Asp Glu Lys Gly Glu Gly Leu Ile Met Tyr Gln Asn Ser Asp Asp
210 215 220
Ser Phe His Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Arg Tyr
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Ala Gly Glu Ser Phe Thr Val Lys Asn Gly Ile
245 250 255
Tyr Gly Ile Ala Leu Ser Pro Val Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro
260 265 270
Leu Leu Ser His Gly Leu Tyr Tyr Val Asp Thr Glu Gln Phe Ser Asn
275 280 285
Pro Gln Tyr Glu Glu Asn Asn Val Gln Tyr Glu Gly Ser Gln Asp Ile
290 295 300
Leu Asn Thr Gln Ser Phe Gly Lys Val Val Ser Lys Asn Gly Val Leu
305 310 315 320
Phe Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Gly Ile Ala Cys Val Asn Glu His
325 330 335
Gln Val Leu Gln Arg Glu Ser Phe Asp Val Val Ala Gln Asn Glu Glu
340 345 350
Thr Leu Gln Met Ile Val Ser Met Lys Ile Met Glu Asn Leu Pro Gln
355 360 365
Ser Gly Arg Ile Asn Asp Pro Glu Gly Asn Glu Tyr Met Leu Ala Leu
370 375 380
Ser Asn Arg Met Gln Lys Ile Ile Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asn Asp
385 390 395 400
Val Asn Phe Arg Ile Leu Gly Ala Asn Val Asp Asp Leu Met Arg Asn
405 410 415
Thr Arg Cys Gly Arg Tyr His Asn Gln Asn Ala Gly Asn Gln Asn Ala
420 425 430
Asp Asn Gln Asn Ala Asp Asn Gln Asn Ala Asn Asn Gln Asn Ala Asp
435 440 445
Asn Gln Asn Ala Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Arg
450 455 460
Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Lys Gln
465 470 475 480
Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn
485 490 495
Gly Asn Lys Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp
500 505 510
Asn Lys Arg Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Gln Asn Asn Gln Asn
515 520 525
Asp Asn Asn Arg Asn Asp Asn Gln Val His His Ser Ser Lys Leu His
530 535 540

Claims (8)

1.液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法，其特征在于，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP3的特征肽段，含有以下特征肽段：
特征肽段1：LTVAGESFTVK，用于定量；
特征肽段2：GGPLLRPYPDWSFAK，用于定性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：
(1)提取缓冲液：0.01 M PBS，pH7.4；
(2)胰蛋白酶液20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；
(3)特征肽段1、2的标准品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；
B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；
C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP3的定量检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A和C中采用三重四级杆或Q Exactiveplus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，特征肽段LTVAGESFTVK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有576.31897的质荷比；包含质荷比为838.43048、767.39343的子离子，其允许偏差在10 ppm以内。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：LTVAGESFTVK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N；
所述稳定同位素内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有580.32607的质荷比；子离子包含质荷比为846.44409、775.40686的子离子。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A得到的标准曲线为Y=0.02712X-0.7996，R2=0.9983，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，MRJP3的线性检测范围为5-1000 ng/mL，最低检出限为2 ng/mL。
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