CN111929390B

CN111929390B - 一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂mrjp1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用

Info

Publication number: CN111929390B
Application number: CN202011100678.9A
Authority: CN
Inventors: 杨术鹏; 李熠; 傅怡; 蔡冬梅; 周金慧; 杨宇晖
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-10-15
Also published as: CN111929390A

Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体提供了一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用，具体的包括：小蜜蜂蜂蜜样品前处理，搜库匹配蛋白质，特异性肽段筛选，液相色谱分离以及串联质谱检测等步骤。本发明提供的蜂蜜中小蜜蜂MRJP1的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，尤其适用于小蜜蜂蜂蜜真实性的鉴别。本发明提供的方法对遏止小蜜蜂蜂蜜的供销提供了方法支撑，同时对保护小蜜蜂这一濒危种群和维持蜜蜂基因生态多样性具有重大的现实意义。

Description

一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用。

背景技术

小蜜蜂(Apis florea Fabricius)是膜翅目蜜蜂科蜜蜂属的社会性昆虫，主要分布在北半球的热带和亚热带地区，如印度、巴基斯坦、泰国、马来西亚、印度尼西亚等。在中国，小蜜蜂主要分布在云南、贵州、广西和海南等。小蜜蜂一般栖息在海拔1900 m以下，年平均温度在15-22℃的地区，在次生灌木或杂草丛中营造露天的单一巢脾。小蜜蜂蜂群较小，每年可以猎取1-2 kg的蜂蜜。小蜜蜂蜂蜜营养物质丰富，口感香味俱佳，且蜂巢形状独特，出于吃“野味”的猎奇心理，云南等当地群众对其甚是喜爱。小蜜蜂属于野生蜜蜂，目前尚未人工驯化，难以规模性生产蜂蜜，因此其蜂蜜供给量非常有限，尽管售价每斤高达数百元，往往是其它蜂蜜的十几倍以上，市场依然供不应求。为了经济利益，在小蜜蜂的栖息地涌现了大量的职业性“猎蜂人”，寻找野生小蜜蜂蜂群，猎取蜂蜜。猎取过程中，多采用烟熏火燎等方式驱离蜜蜂离开蜂脾，然后取走整个蜂巢，甚至有时采用杀虫剂等毒死蜜蜂，这对蜂群造成毁灭性伤害。随着网络销售的普及，猎蜜人可以通过网络将小蜜蜂蜂蜜销售到其它地区，这使得小蜜蜂蜜蜂的需求日益增加，进而导致猎蜜活动更加频繁，最终导致小蜜蜂野生种群的破坏，乃至消亡。当前，我国小蜜蜂种群已经处于濒危状态，尽管近年来涌现了一些人工驯养小蜜蜂的技术和方法，但是距离规模化养殖和生产依然面临诸多技术难题亟需攻克。当前市场上流通的小蜜蜂蜂蜜依然是主要通过猎取野生小蜜蜂蜂巢获得。小蜜蜂作为热带和亚热带地区的主要授粉昆虫，其在维护地方生态平衡和物种多样性方面起着重要的作用。保护小蜜蜂种群，制止小蜜蜂蜂蜜的猎蜜和销售等行为尤为关键。小蜜蜂蜂蜜同其它蜂蜜一样，通过感官等方法难以鉴别其真假，如何科学准确地鉴别小蜜蜂蜂蜜，从而为后续执法等提供技术依据成为当前亟需解决难题之一。

蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜、蜜露等与自身分泌物相混合，经充分酿造储存在蜂巢中的天然甜味物质。小蜜蜂蜂蜜同中华蜜蜂和意大利蜜蜂酿制的蜂蜜一样，都属于植物源性物质，其中混入了少量的来自蜜蜂的分泌物，如酶类、王浆主蛋白、脂肪酸等。这些来自蜜蜂的分泌物可以用来溯源和指示酿制蜂蜜的蜜蜂品种。近年来，已经有文献报道了基于蜂蜜中的蛋白质用来鉴别意大利蜜蜂酿制的蜂蜜，或者中华蜜蜂酿制土蜂蜜。但是有关小蜜蜂蜂蜜的真实性研究尚属空白。

发明内容

研究发现，小蜜蜂MRJP1的含量相对恒定，据此，本发明重点围绕MRJP1进行研究，开发的特征肽段为小蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供技术和方法参考，对执法机构制止小蜜蜂蜂蜜的猎取销售等行为提供技术和方法支持，同时为保护小蜜蜂这一濒危种群具有重要的现实意义。

具体而言，本发明的第一目的在于提供一种用于检测小蜜蜂MRJP1的特征肽段，所述特征肽段的序列为：IKEALPHVPILDR（SEQ ID No.1）。

本发明的第二目的在于提供所述的特征肽段在检测小蜜蜂MRJP1中的应用。

本发明进一步提供一种鉴别小蜜蜂蜂蜜的方法，包括：检测蜂蜜样品中是否含有所述的特征肽段；若含有所述特征肽段，则判定所述蜂蜜样品中含有小蜜蜂蜂蜜；若不含有所述特征肽段，则判定所述蜂蜜样品中不含有小蜜蜂蜂蜜。

本发明进一步提供一种检测小蜜蜂MRJP1的方法，包括：在蜂蜜样品中检测序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段。

作为优选，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 500.96808（[M+2H]³⁺）的质荷比；子离子包含质荷比为m/z 613.36679和m/z 946.54688的子离子，其允许偏差在5 ppm以内。

作为优选，采用同位素内标法对小蜜蜂MRJP1进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为¹³C，所有N置换为¹⁵N；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z 505.31199（[M+2H]³⁺）；子离子包含质荷比为m/z 624.38288和m/z 957.56297的子离子，其允许偏差在5 ppm以内。

蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的小蜜蜂MRJP1含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂蜜质量。

作为优选，所述蜂蜜样品的前处理包括：对待测蜂蜜中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解。

作为优选，采用UHPLC-Q Exactive plus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。

基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。

本发明还提供一种用于检测小蜜蜂MRJP1的试剂盒，标准物质包括所述的特征肽段。

作为优选，所述标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为¹³C，所有N置换为¹⁵N。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明中的特征肽段为小蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供了技术和方法参考。借由该特征肽段，本发明提供的小蜜蜂MRJP1含量的检测方法具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点。该方法对遏止小蜜蜂蜂蜜的供销提供了方法支撑，同时对保护小蜜蜂这一濒危种群和维持蜜蜂基因生态多样性具有重大的现实意义。

附图说明

图1为UHPLC-Q Exactive plus提取的小蜜蜂MRJP1特异性肽段IKEALPHVPILDR的离子流；

图2为UHPLC-Q Exactive plus检测的小蜜蜂MRJP1特异性肽段IKEALPHVPILDR的质谱图；

图3为UHPLC-Q Exactive plus检测的小蜜蜂MRJP1特异性肽段IKEALPHVPILDR的二级碎片质谱图；

图4为UHPLC-Q Exactive plus提取的稳定同位素内标肽段IKEALPHVPILDR*(R*-¹³C₆, ¹⁵N₄)的离子流；

图5为UHPLC-Q Exactive plus检测的稳定同位素内标肽段IKEALPHVPILDR*(R*-¹³C₆, ¹⁵N₄)的质谱图；

图6为UHPLC-Q Exactive plus检测的稳定同位素内标肽段IKEALPHVPILDR*(R*-¹³C₆, ¹⁵N₄)的二级碎片质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1.超高效液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱仪(UHPLC-Q ExactivePlus)，美国Thermo Fisher Scientific公司；

2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；

3.电子分析天平((PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；

4. pH计(DELTA 320)，德国METTLER TOLEDO公司；

5.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem, RVC2-18)，德国 MarinChrist公司；

6.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；

7.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；

8. 1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；

尿素(Urea)购自Solarbio公司；硫脲、CHAPS、Tris碱、二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)购自Amresco公司；碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)购自Merk(Kenilworth, NJ, USA)公司；丙酮、Ti(SO₄)₂、三氟乙酸(TFA)购自J.T.Baker公司；Bradford法蛋白质定量试剂盒购自普利莱公司；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)均购自Roche (Basel, Switzerland)公司；碳酸氢铵(NH₄HCO₃)购自Sigma Aldrich公司；质谱级胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega (Madison, WI, USA) 公司，甲酸(FA)购自从MREDA Technology (Carlsbad, CA, USA）公司；乙睛(ACN)购自Fisher公司；Zip-Tip除盐洗脱柱购自Millipore；其余化学试剂均购买自北京化学试剂公司。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1 小蜜蜂MRJP1特异性肽段的发掘

1. 按1:1的质量比称取小

蜜蜂蜂蜜及PBS溶液，充分涡旋后4℃条件下离心20 min，收集上清液；

2. 取50 μL上清液，加入200 μL 40 mM 的NH₄HCO₃溶液与之涡匀混合，加入25 μL100 mM 的DTT溶液，充分涡旋混匀后，室温条件下反应60 min，再加入125 μL 100 mM 的IAA溶液在室温条件暗反应60 min；

3. 向步骤3的最终溶液加入2 μg过量胰蛋白酶，37℃环境中过夜酶切。加入1 μL甲酸溶液，终止酶切反应。将酶切产物与0.1%甲酸溶液按2:3体积比混合后，通过C18柱除盐，除盐后的样品采用真空干燥处理。

4. 肽段的检测：步骤4所得样品使用0.1% FA溶液溶解，使用UHPLC-Q Exactiveplus对肽段进行正离子模式下的Full MS-ddMS2测序和鉴定。

质谱生成的数据收集并存储于Xcalibur软件，质谱采集的raw数据导入PEAKS 8.0定性分析。检索参数设置如下：母离子质量误差(The precursor mass tolerances)为15ppm，子离子质量误差(The fragment mass tolerances)为0.05 Da，酶为：Trypsin酶切，最大漏切位点数为2；可变修饰为oxidation (M, +15.99)，固定修饰为carbamidomethyl (C,+57.02)。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率(Falsediscovery rate FDR)，FDR<1%。

5. 肽段的筛选：经PEAKS 8.0定性分析后，针对以匹配到的小蜜蜂MRJP1（全长序列见SEQ ID No.8）的肽段数据分析处理，选取不同小蜜蜂蜂蜜都存在、响应较高、无修饰、无酶切位点且长度在8-20之的肽段。基于上述方法，共获得二十余钟小蜜蜂MRJP1的特征肽段。

实施例2 小蜜蜂MRJP1特征肽段的确立及检测方法的开发

将实施例1中筛选出所有具有特异性的肽段一一在NCBI及Uniprot网站进行验证，筛选只存在于小蜜蜂MRJP1的特异性肽段，获得多条小蜜蜂MRJP1的特异性性肽段，其序列分别如下：

1）IKEALPHVPILDR（SEQ ID No.1）

2）FFDYDFGNDER（SEQ ID No.2）

3）LTSNTFNYDPEYTK（SEQ ID No.3）

4）YNGVPSSLNVISNK（SEQ ID No.4）

5）NNYPSDIDQWHGK（SEQ ID No.5）

6）TVAQNNETLQMIVGMK（SEQ ID No.6）

7）QVQIPHDIAVNTTTGK（SEQ ID No.7）

尽管有多条特异性性肽段可供选择，但是考虑到肽段的独特性、稳定性、在质谱上离子响应等因素，只能选择其中一条最优的特征肽段用来定量分析。查看实施例1产生的质谱数据，最终挑选得到了响应高且无其他物质影响的特异性肽段为最终特异性肽段，即IKEALPHVPILDR。

2. 合成特异性肽段IKEALPHVPILDR和稳定同位素内标(IS)肽段IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为¹³C，所有N置换为¹⁵N，纯度超过98%，储存在-20℃备用。

3. 标准曲线的绘制

在初始流动相(97：3, v/v; 水/乙腈，含0.1%甲酸)中制备一系列特异性肽段标准品(1 ng/mL，3 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，40 ng/mL，80 ng/mL)，然后向配置好的每个浓度的标准品中加入IS肽段至其各自浓度均为10 ng/mL。通过特异性肽段和IS肽段峰面积的比值及该比值对应的特异性肽段浓度来绘制标准曲线。

4. 蜂蜜样本的前处理

（1）按1:1质量比称取小蜜蜂蜂蜜及PBS溶液，充分涡旋后4℃条件下离心20 min，收集上清液；

（2）取50 μL上清液，加入200 μL 40 mM 的NH₄HCO₃溶液与之涡匀混合，加入25 μL100 mM 的DTT溶液，充分涡旋混匀后，室温条件下反应60 min，再加入125 μL 100 mM 的IAA溶液在室温条件暗反应60 min；

（3）向（2）最终溶液加入加入2 μg过量胰蛋白酶，37℃环境中过夜酶切。加入1 μL甲酸溶液，终止酶切反应。反应完成时，加入1 μL FA终止酶切反应，向每个样品中加入IS肽段，保证其浓度在后续复溶时浓度保持在40 ng/mL。将酶切产物与0.1%甲酸溶液按2:3体积比混合后，通过C18柱除盐，除盐后的样品采用真空干燥处理。所得样品使用0.1% FA溶液溶解，采用1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱分析。

5. 蜂蜜样本的数据处理

根据特异性肽段/稳定同位素内标肽段峰面积比带入公式求得特异性肽段浓度，再根据式1得到特异性肽段IKEALPHVPILDR的含量：

X=(ФcV)/ m 式1

其中，X为(ng/g)是蜂蜜样品中特异性肽段IKEALPHVPILDR的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c (ng/mL)是特异性肽在胰蛋白酶消化物中的浓度，V (mL)是胰蛋白酶消化物的体积，m (g)是蜂蜜样品的质量。以达到对蜂蜜样品中特异性肽段IKEALPHVPILDR定量的目的。

经过对小蜜蜂蜂蜜样品的检测，特征肽段的离子流图、质谱图和二级碎片质谱图分别如图1-图3所示，内标(IS)肽段的离子流图、质谱图和二级碎片质谱图分别如图4-图6所示，蜂蜜样本的图谱中应该含有特异性肽段IKEALPHVPILDR的精确质量数为m/z500.968080 ([M+3H]³⁺)；样本的图谱中应该含有稳定同位素内标肽段特异性肽段IKEALPHVPILDR*的精确质量数为m/z 505.31199 ([M+3H]³⁺)，其允许偏差应在5 ppm以内。

其MS/MS图谱（子离子图谱）中应该含有小蜜蜂蜂蜜特异性肽段IKEALPHVPILDR的特异性碎片离子m/z 613.36679，m/z 946.54688，相应的，稳定同位素内标肽段特异性肽段IKEALPHVPILDR*的子离子图谱(MS/MS)中应含有碎片离子m/z 624.38288，m/z 957.56297，且其精确质量数的误差应当小于5 ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的特异性肽段IKEALPHVPILDR含量可信。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的IKEALPHVPILDR含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂蜜质量。

实施例3 小蜜蜂MRJP1特征肽段检测方法在实际中的应用

1. 从正规市场购买意大利蜜蜂酿制的蜂蜜(洋槐蜜、椴树蜜和荆条蜜)、土蜂蜜(中华蜜蜂酿制的蜂蜜)、大蜜蜂酿制的蜂蜜(树蜜)和小蜜蜂酿制的蜂蜜等样本进行实际样品的检测。

2. 8种不同品种蜜蜂酿制蜂蜜样本检测

（1）分别称取等量的不同蜂蜜于离心管中，按1:1的比例分别加入PBS溶液，充分涡旋后4℃条件下离心20 min，收集上清液；

（2）分别取100 μL上清液，加入400 μL 40 mM 的NH₄HCO₃溶液与之涡匀混合，加入50 μL 100 mM 的DTT溶液，充分涡旋混匀后，室温条件下反应60 min，再加入250 μL 100mM 的IAA溶液在室温条件暗反应60 min；

（3）向（2）8份最终溶液加入2 μg过量胰蛋白酶，37℃环境中过夜酶切。反应完成时，分别加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活，向每个样品中加入IS肽段，保证其浓度在后续复溶时浓度保持在10 ng/mL。对酶切产物进行除盐处理，除盐后的样品采用真空干燥处理，所得样品使用0.1% FA溶液溶解，采用UHPLC-Q Exactive Plus进样分析。

经检测，如表1，只在小蜜蜂蜂蜜样本中检测到特异性肽段信息，其他蜂蜜样本并未检测出特异性肽段信息。

表

不同品种蜜蜂酿制蜂蜜样本中小蜜蜂MRJP1的检出情况

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所

<120> 一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用

<130> KHP201115236.1YS

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Lys Glu Ala Leu Pro His Val Pro Ile Leu Asp Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Asn Asp Glu Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asn Tyr Asp Pro Glu Tyr Thr Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Asn Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Asn Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp His Gly Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Val Ala Gln Asn Asn Glu Thr Leu Gln Met Ile Val Gly Met Lys

1 5 10 15

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Ile Pro His Asp Ile Ala Val Asn Thr Thr Thr Gly Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Thr Arg Trp Leu Phe Met Val Val Cys Leu Gly Ile Val Cys Gln

1 5 10 15

Gly Thr Thr Gly Ser Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu

20 25 30

Asn Val Leu His Glu Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Asn Asp

35 40 45

Glu Arg Arg Gln Asp Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Arg Asn

50 55 60

Asn Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp His Gly Lys Ile Phe Val Thr

65 70 75 80

Met Leu Arg Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Asn

85 90 95

Lys Ile Ser Asp Gly Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser

100 105 110

Phe Ala Lys Tyr Asp Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Thr Lys Leu

115 120 125

Ala Ile Asp Lys Cys Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val

130 135 140

Asn Asn Thr Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Ala Phe Asp Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ser Gln Leu Leu Lys Gln Val Gln Ile Pro His Asp Ile Ala

165 170 175

Val Asn Thr Thr Thr Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln

180 185 190

Ala Leu Asn Cys Asp Ile Asn Ser Glu Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp

195 200 205

Asp Lys Gly Glu Gly Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe

210 215 220

His Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asn Tyr Asp Pro Glu Tyr Thr Lys

225 230 235 240

Met Thr Ile Asn Gly Glu Ser Phe Thr Met Gln Asn Gly Ile Ser Gly

245 250 255

Met Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Glu Ala

260 265 270

Ser Thr Ser Leu Tyr Phe Val Asn Thr Glu Gln Phe Lys Thr Ser Asp

275 280 285

Tyr Gln Gln Asn Gly Val His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp

290 295 300

Thr Gln Ser Thr Ala Lys Val Val Ser Lys Asn Gly Val Leu Phe Phe

305 310 315 320

Gly Leu Val Gly Asp Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Pro

325 330 335

Leu Glu Arg His Asn Ile Arg Thr Val Ala Gln Asn Asn Glu Thr Leu

340 345 350

Gln Met Ile Val Gly Met Lys Ile Lys Glu Ala Leu Pro His Val Pro

355 360 365

Ile Leu Asp Arg Tyr Ile Asn Ser Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn

370 375 380

Arg Met Gln Lys Met Val Asn Asn Asp Leu Asn Phe Asp Asp Val Asn

385 390 395 400

Phe Arg Ile Leu Asn Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Gln Asn Thr Arg

405 410 415

Cys Glu Asn Asn Asn Lys Asp Asp Thr Pro Phe Lys Ile Ser Val His

420 425 430

Leu

Claims

1.一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法，其特征在于，在蜂蜜样品中检测序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 500.96808的质荷比；子离子包含质荷比为m/z 613.36679和m/z 946.54688的子离子，其允许偏差在5 ppm以内。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为¹³C，所有N置换为¹⁵N；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z 505.31199；子离子包含质荷比为m/z 624.38288和m/z 957.56297的子离子，其允许偏差在5 ppm以内。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述蜂蜜样品的前处理包括：对待测蜂蜜中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-Q Exactive plus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。

6.权利要求1~5中任一项所述的方法在鉴别小蜜蜂蜂蜜真实性方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，若含有序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段，则判定蜂蜜样品中含有小蜜蜂蜂蜜；若不含有所述特征肽段，则判定蜂蜜样品中不含有小蜜蜂蜂蜜。

8.一种用于检测小蜜蜂MRJP1的试剂盒，其特征在于，标准物质包括序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为¹³C，所有N置换为¹⁵N。