CN110736802B - 一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法 - Google Patents

一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶的方法，包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤；所述特征肽段包括特征肽段1：SISNNEQVK和特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR。本发明所提出的意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶，可用于辅助意蜂蜜真实性评价。该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

Description

一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的 方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，该方法适用于意蜂蜜的真实性的鉴别与评价。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。为了追逐巨额利润，不法商贩在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序，侵害了消费者权益。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。
意蜂，来源于意大利，与中蜂之间无法杂交繁殖。意蜂相比于中蜂个体大，背部黄，但是适应性差，易发病。意蜂蜜及中蜂蜜中同样含有α-葡萄糖苷酶，但在这两种蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列不同。α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，意蜂蜜中所含有的葡萄糖苷酶为α-葡萄糖苷酶。
液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列特异于的胰蛋白酶特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略的基础上，提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法。
该方法可用于生产和商业中对意蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。
第一方面，本发明筛选出可用于液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段组：
特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，
特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。
本发明成功筛选出意蜂特征肽段1：SISNNEQVK，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，其中特征肽段1：SISNNEQVK可以作为定量肽段，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR可以作为定性肽段，两者特异性通过Uniprot数据库进行了验证；本发明同时设计特征肽段相对应的稳定同位素内标（IS）肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量α-葡萄糖苷酶。
优选地，所述稳定同位素内标肽段为：SISNNEQVK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。
进一步，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有509.76182质荷比；包含质荷比为713.36824、818.40027的子离子。
所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z: 513.76642，同时包含质荷比为1088.52023、858.45036的子离子。
第二方面，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:
特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，
特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。
进一步地，在检测之前用检测试剂盒处理所述待测蜂蜜，所述检测试剂盒由以下成分组成:
（1）提取缓冲液0.01 m/L PBS，pH 7.4；
（2）胰蛋白酶20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨；
（3）特征肽段1、2的标准品。
具体地，所述方法具体步骤如下：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入液相色谱串联质谱检测并绘制标准曲线；
B、提取所述待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本；
C、向所述待测样本中添加所述稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用步骤A中相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照步骤A所得标准曲线，获得所述待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对α-葡萄糖苷酶的定量检测。
进一步地，步骤A和C中采用UHPLC-Q Exactive plus进行液相色谱串联质谱检测。
a1、液相色谱条件如下：
色谱柱：为C18柱；
流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；
梯度洗脱条件为：0-0.5 min，5%的B；0.5-1.0 min，5-15%的B；1.0-6.5 min，15-40%的B；6.5-7.0 min，40-95%的B；7.0-8.5 min，95%的B；8.5-8.6 min，95-5%B，8.6-10.0min，5%的B；流速：0.30 mL/min；进样量：5.0 µL；
a2、质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速38；辅助气的流速15；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.2kV；离子导管的温度275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
前述的方法，步骤C得到的标准曲线为Y=0.00982X-0.000624，R2=0.9983，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；检测范围为10-1000ng/mL，最低检出限为5 ng/mL。
该方法采用UHPLC-Q Exactive Plus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过比较其图谱中α-葡萄糖苷酶特征肽段/IS肽段峰面积比，推算α-葡萄糖苷酶含量，进而判定蜂蜜是否掺假，主要基于α-葡萄糖苷酶的特征肽段的母离子在液质上的峰面积和稳定同位素内标肽段的在液质上的峰面积。
应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。
本发明采用UHPLC-Q Exactive plus仪器对蜂蜜中的α-葡萄糖苷酶定量，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
鉴于意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的含量相对恒定，本发明据此建立起一套蜂蜜真实性评价的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本发明提供的意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶蛋白含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适用于意蜂α-葡萄糖苷酶的准确定量。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q Exactive plus提取的意蜂α-葡萄糖苷酶的特征肽段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的离子流图；
图2为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂α-葡萄糖苷酶的特征肽段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的质谱图；
图3为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂α-葡萄糖苷酶的特征肽段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的二级碎片质谱图；
图4为本发明实施例1中备选的特征肽段在参考样品中的响应（相对丰度）；
图5为本发明实施例2提供的纯蜂蜜及掺假蜂蜜的液相色谱串联质谱检测结果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中涉及的仪器与试剂：
1.质谱仪(Q-Exactive)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；
3.全波长酶标仪(Multiskan GO)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
4.电子分析天平((PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5. pH计(DELTA 320)，德国METTLER TOLEDO公司；
6.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem, RVC2-18)，德国 MarinChrist公司；
7.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；
8.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；
9.1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
10.二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)，中国Solarbio公司；
11.碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)，美国Merk公司；
12.Bradford法蛋白质定量试剂盒，中国Solarbio公司；
13.碳酸氢铵(NH4HCO3)，美国Sigma公司。
实施例1 利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶含量的方法
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的意蜂蜜样本共20份。
2. 实验步骤
2.1溶液配制
5M Urea溶液：称取Urea 4.5 g，超纯水定容到15 mL；
100 mM DTT：称取DTT 308.5 mg，40 mM NH4HCO3溶液定容到20 mL，每管l mL分装，-20℃冰箱保存待用。
40 mM NH4HCO3溶液：称取0.316 g NH4HCO3，用超纯水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。
100 mM IAA溶液：称取IAA 0.39 g，用40 mM的NH4HCO3溶液定溶至20 mL，-20℃冰箱保存待用。
活化液：500 μL ACN、3 μL TFA，超纯水定容至1 mL，4℃保存。
平衡液:1 μL TFA，超纯水定容至1 mL，存于4℃。
洗脱液：800 μL ACN、1 μL TFA，用超纯水定容至1 mL，存于4℃。
2.2本发明对意蜂蜜进行液相色谱串联质谱检测，从结果中筛选得到α-葡萄糖苷酶的两个特征肽段特征肽段1：SISNNEQVK，
特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR。
图1-图3分别为这两个特征肽段的离子流图、质谱图和二级碎片质谱图，本发明经比对选取特征肽段1作为定量分析的特征肽段，并相对应地设计稳定同位素内标肽段SISNNEQVK*，其中，R*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。
合成特征肽段SISNNEQVK和稳定同位素内标（IS）肽段SISNNEQVK*，纯度超过98％，储存在-20℃备用。
2.3标准曲线的绘制：在初始流动相（97：3，v/v，水/ACN，含0.1％甲酸）中制备一系列特征肽段标准品（2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，800ng/mL和1000 ng/mL），然后向配置好的每个浓度的标准品中加入200 ng IS肽段使其浓度为100 μg/mL。
1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱液相条件如下：
色谱柱：Kinetex C18 (50 x 2.1 mm) 2.6µm，柱温为室温：20 ℃。
流动相组成：流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈。梯度洗脱条件为：0-0.8 min，10%的B；0.8-1.3 min，10-20%的B；1.3-4.5 min，20-30%的B；4.5-5.4 min，30-95%的B；5.4-6.0min，95%的B；6.0-6.1 min，95-5%B，6.1-7.0 min，5%的B。
流速：0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min；辅助气温度290 ℃；辅助气流速11 L/min；毛细管电压正模式3.5kV；iFunnel参数正模式高压200V、低压100V，采集的模式为正离子模式下的MRM模式。通过绘制特征肽段/IS肽段峰面积比与特征肽段浓度来绘制标准曲线。
2.4蜂蜜样本的前处理
（1）准确称取均匀待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
（2）移取蛋白质溶液200 μL并加入4 μL的100 μg/mL稳定同位素内标肽段，并与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
（3）每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL TFA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测
（5）蜂蜜样本的数据处理
根据式2计算得到意蜂α-葡萄糖苷酶的含量：
X=(ФcVM1)/(M2m) 式2，
式2中，X（ng/g）是蜂蜜样品中意蜂α-葡萄糖苷酶的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c（ng/mL）是特征肽在胰蛋白酶消化物中的浓度，V（mL）是胰蛋白酶消化物的体积，M1、M2是α-葡萄糖苷酶和特征肽段的摩尔质量，m（g）是蜂蜜样品的质量。以达到对蜂蜜样品中α-葡萄糖苷酶定量的目的。
如图1-图3所示，检测蜂蜜样本的图谱中应该含有意蜂α-葡萄糖苷酶特征肽段SISNNEQVK的精确m/z值： 509.76182（[M+2H]2+）；样本的图谱中应该含有添加的稳定同位素内标（IS）肽段SISNNEQVK *（R*-13C6, 15N4）的精确m/z值：513.76642（[M+2H]2+），其允许偏差应在5 ppm以内。
其子离子图谱中应该含有特征肽段SISNNEQVK的特征碎片离子m/z 713.36824、m/z 818.40027，相应地，稳定同位素内标肽段SISNNEQVK *的子离子图谱（MS/MS）中应含有碎片离子m/z 1088.52023、858.45036且其精确质量数的误差应当小于5 ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的意蜂α-葡萄糖苷酶含量可信，可以根据含量的高低鉴别蜂蜜质量。
对蜂农处采集的真实意蜂蜜样本的α-葡萄糖苷酶的肽段进行匹配检测，结果整理为图结果见图4，从图4中可以看出在意蜂蜜中，本发明筛选的α-葡萄糖苷酶特征肽段SISNNEQVK和IYTHDIPETYNVVR的响应最高，由此可以体现其在不同参考样品中其含量相对稳定，且可以作为定量意蜂蜜样本中适合作为定量意蜂蜜样本中α-葡萄糖苷酶的含量的肽段。
实施例2 蜂蜜掺假的定量检测
1、样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的意蜂蜜样本以及糖浆。
2、实验步骤
（1）溶液配制
同实施例1。
（2）蜂蜜的混掺：按不同比例向意蜂蜜中掺入糖浆。
向意蜂蜜中按照5%、10%、50%的比例掺入糖浆。
（3）蜂蜜样本的前处理
①准确称取均匀待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200 μL并加入4 μL的100 μg/mL稳定同位素内标肽段SISNNEQVK *，并与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用1290 Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测。
（5）蜂蜜样本的数据处理
从质谱数据中提取特征肽段SISNNEQVK的质荷比，以m/z 509.76182的峰面积作为对比依据。结果如图5所示，结果表明本发明能够检测出掺入糖浆为5%以上的意蜂蜜掺假现象。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法
<130> KHP191115394.4
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ile Ser Asn Asn Glu Gln Val Lys
1 5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Tyr Thr His Asp Ile Pro Glu Thr Tyr Asn Val Val Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Ala Val Ile Val Phe Cys Leu Met Ala Leu Ser Ile Val Asp
1 5 10 15
Ala Ala Trp Lys Pro Leu Pro Glu Asn Leu Lys Glu Asp Leu Ile Val
20 25 30
Tyr Gln Val Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Glu Gly Ile Lys Glu Lys Leu Asp His Phe Leu Glu Met
50 55 60
Gly Val Asp Met Phe Trp Leu Ser Pro Ile Tyr Pro Ser Pro Met Val
65 70 75 80
Asp Phe Gly Tyr Asp Ile Ser Asn Tyr Thr Asp Val His Pro Ile Phe
85 90 95
Gly Thr Ile Ser Asp Leu Asp Asn Leu Val Ser Ala Ala His Glu Lys
100 105 110
Gly Leu Lys Ile Ile Leu Asp Phe Val Pro Asn His Thr Ser Asp Gln
115 120 125
His Glu Trp Phe Gln Leu Ser Leu Lys Asn Ile Glu Pro Tyr Asn Asn
130 135 140
Tyr Tyr Ile Trp His Pro Gly Lys Ile Val Asn Gly Lys Arg Val Pro
145 150 155 160
Pro Thr Asn Trp Val Gly Val Phe Gly Gly Ser Ala Trp Ser Trp Arg
165 170 175
Glu Glu Arg Gln Ala Tyr Tyr Leu His Gln Phe Ala Pro Glu Gln Pro
180 185 190
Asp Leu Asn Tyr Tyr Asn Pro Val Val Leu Asp Asp Met Gln Asn Val
195 200 205
Leu Arg Phe Trp Leu Arg Arg Gly Phe Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala
210 215 220
Leu Pro Tyr Ile Cys Glu Asp Met Arg Phe Leu Asp Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
Gly Glu Thr Asn Asp Pro Asn Lys Thr Glu Tyr Thr Leu Lys Ile Tyr
245 250 255
Thr His Asp Ile Pro Glu Thr Tyr Asn Val Val Arg Lys Phe Arg Asp
260 265 270
Val Leu Asp Glu Phe Pro Gln Pro Lys His Met Leu Ile Glu Ala Tyr
275 280 285
Thr Asn Leu Ser Met Thr Met Lys Tyr Tyr Asp Tyr Gly Ala Asp Phe
290 295 300
Pro Phe Asn Phe Ala Phe Ile Lys Asn Val Ser Arg Asp Ser Asn Ser
305 310 315 320
Ser Asp Phe Lys Lys Leu Val Asp Asn Trp Met Thr Tyr Met Pro Pro
325 330 335
Ser Gly Ile Pro Asn Trp Val Pro Gly Asn His Asp Gln Leu Arg Leu
340 345 350
Val Ser Arg Phe Gly Glu Glu Lys Ala Arg Met Ile Thr Thr Met Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Asn Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly
370 375 380
Met Ser Asp Thr Tyr Ile Ser Trp Glu Asp Thr Gln Asp Pro Gln Gly
385 390 395 400
Cys Gly Ala Gly Lys Glu Asn Tyr Gln Thr Met Ser Arg Asp Pro Ala
405 410 415
Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Asp Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Asn Thr Trp Leu Arg Val Asn Glu Asn Tyr Lys Thr Val Asn
435 440 445
Leu Ala Ala Glu Lys Lys Asp Lys Asn Ser Phe Phe Asn Met Phe Lys
450 455 460
Lys Phe Ala Ser Leu Lys Lys Ser Pro Tyr Phe Lys Glu Ala Asn Leu
465 470 475 480
Asn Thr Arg Met Leu Asn Asp Asn Val Phe Ala Phe Ser Arg Glu Thr
485 490 495
Glu Asp Asn Gly Ser Leu Tyr Ala Ile Leu Asn Phe Ser Asn Glu Glu
500 505 510
Gln Ile Val Asp Leu Lys Ala Phe Asn Asn Val Pro Lys Lys Leu Asn
515 520 525
Met Phe Tyr Asn Asn Phe Asn Ser Asp Ile Lys Ser Ile Ser Asn Asn
530 535 540
Glu Gln Val Lys Val Ser Ala Leu Gly Phe Phe Ile Leu Ile Ser Gln
545 550 555 560
Asp Ala Lys Phe Gly Asn Phe
565
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法
<130> KHP191115394.4
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ile Ser Asn Asn Glu Gln Val Lys
1 5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Tyr Thr His Asp Ile Pro Glu Thr Tyr Asn Val Val Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Ala Val Ile Val Phe Cys Leu Met Ala Leu Ser Ile Val Asp
1 5 10 15
Ala Ala Trp Lys Pro Leu Pro Glu Asn Leu Lys Glu Asp Leu Ile Val
20 25 30
Tyr Gln Val Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Glu Gly Ile Lys Glu Lys Leu Asp His Phe Leu Glu Met
50 55 60
Gly Val Asp Met Phe Trp Leu Ser Pro Ile Tyr Pro Ser Pro Met Val
65 70 75 80
Asp Phe Gly Tyr Asp Ile Ser Asn Tyr Thr Asp Val His Pro Ile Phe
85 90 95
Gly Thr Ile Ser Asp Leu Asp Asn Leu Val Ser Ala Ala His Glu Lys
100 105 110
Gly Leu Lys Ile Ile Leu Asp Phe Val Pro Asn His Thr Ser Asp Gln
115 120 125
His Glu Trp Phe Gln Leu Ser Leu Lys Asn Ile Glu Pro Tyr Asn Asn
130 135 140
Tyr Tyr Ile Trp His Pro Gly Lys Ile Val Asn Gly Lys Arg Val Pro
145 150 155 160
Pro Thr Asn Trp Val Gly Val Phe Gly Gly Ser Ala Trp Ser Trp Arg
165 170 175
Glu Glu Arg Gln Ala Tyr Tyr Leu His Gln Phe Ala Pro Glu Gln Pro
180 185 190
Asp Leu Asn Tyr Tyr Asn Pro Val Val Leu Asp Asp Met Gln Asn Val
195 200 205
Leu Arg Phe Trp Leu Arg Arg Gly Phe Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala
210 215 220
Leu Pro Tyr Ile Cys Glu Asp Met Arg Phe Leu Asp Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
Gly Glu Thr Asn Asp Pro Asn Lys Thr Glu Tyr Thr Leu Lys Ile Tyr
245 250 255
Thr His Asp Ile Pro Glu Thr Tyr Asn Val Val Arg Lys Phe Arg Asp
260 265 270
Val Leu Asp Glu Phe Pro Gln Pro Lys His Met Leu Ile Glu Ala Tyr
275 280 285
Thr Asn Leu Ser Met Thr Met Lys Tyr Tyr Asp Tyr Gly Ala Asp Phe
290 295 300
Pro Phe Asn Phe Ala Phe Ile Lys Asn Val Ser Arg Asp Ser Asn Ser
305 310 315 320
Ser Asp Phe Lys Lys Leu Val Asp Asn Trp Met Thr Tyr Met Pro Pro
325 330 335
Ser Gly Ile Pro Asn Trp Val Pro Gly Asn His Asp Gln Leu Arg Leu
340 345 350
Val Ser Arg Phe Gly Glu Glu Lys Ala Arg Met Ile Thr Thr Met Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Asn Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly
370 375 380
Met Ser Asp Thr Tyr Ile Ser Trp Glu Asp Thr Gln Asp Pro Gln Gly
385 390 395 400
Cys Gly Ala Gly Lys Glu Asn Tyr Gln Thr Met Ser Arg Asp Pro Ala
405 410 415
Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Asp Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Asn Thr Trp Leu Arg Val Asn Glu Asn Tyr Lys Thr Val Asn
435 440 445
Leu Ala Ala Glu Lys Lys Asp Lys Asn Ser Phe Phe Asn Met Phe Lys
450 455 460
Lys Phe Ala Ser Leu Lys Lys Ser Pro Tyr Phe Lys Glu Ala Asn Leu
465 470 475 480
Asn Thr Arg Met Leu Asn Asp Asn Val Phe Ala Phe Ser Arg Glu Thr
485 490 495
Glu Asp Asn Gly Ser Leu Tyr Ala Ile Leu Asn Phe Ser Asn Glu Glu
500 505 510
Gln Ile Val Asp Leu Lys Ala Phe Asn Asn Val Pro Lys Lys Leu Asn
515 520 525
Met Phe Tyr Asn Asn Phe Asn Ser Asp Ile Lys Ser Ile Ser Asn Asn
530 535 540
Glu Gln Val Lys Val Ser Ala Leu Gly Phe Phe Ile Leu Ile Ser Gln
545 550 555 560
Asp Ala Lys Phe Gly Asn Phe
565

Claims (6)

1.一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:
特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，
特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性;
在检测之前用检测试剂盒处理所述待测蜂蜜，所述检测试剂盒由以下成分组成:
（1）提取缓冲液0.01 m/L PBS，pH 7.4；
（2）胰蛋白酶20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨；
（3）特征肽段1、2的标准品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入液相色谱串联质谱检测并绘制标准曲线；
B、提取所述待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本；
C、向所述待测样本中添加所述稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用步骤A中相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照步骤A所得标准曲线，获得所述待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对α-葡萄糖苷酶的定量检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A和C中采用三重四级杆或Q Exactiveplus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以SISNNEQVK为定量特征肽段，其在质谱中所产生的检测信号的母离子具有509.76182的质荷比，包含质荷比为713.36824、818.40027的子离子，检测允许偏差在10 ppm以内。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：SISNNEQVK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N；
所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z: 513.76642，包含质荷比为1088.52023、858.45036的子离子。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A得到的标准曲线为Y=0.00982X-0.000624，R2=0.9983，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；检测范围为10-1000 ng/mL，最低检出限为5 ng/mL。
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