CN102483420B - 通过质谱对蛋白质进行定量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种定量检测样品中的靶蛋白的方法，其中检测第2代片段离子用以提供一系列定量检测值，其中至少一个定量检测值与所产生的蛋白水解肽的量和所述样品中靶蛋白的量具有相关性，其特征在于，所选择的质量为(m/z)2的第1代片段是在第1位具有脯氨酸和/或组氨酸的带双电荷的肽。

Description

通过质谱对蛋白质进行定量的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质定量测定的技术领域。特别地，本发明涉及一种通过质谱进行蛋白质定量测定的新方法。 
已经开发了许多用于蛋白质定量测定的技术，诸如来自患者的血液样品(血清、血浆)的复杂流体中的蛋白质测定在诊断中至关重要。ELISA(酶联免疫吸附测定)目前使用最为广泛。在多种已知的ELISA技术中，夹心反应使用最为广泛。该反应需要用于目的蛋白的两种抗体，其中一种与酶结合。最近，本申请人(T.Fortin et al.，MCP，2008 E-pub)和其他人(L.Anderson & C.Hunter，MCP，2006，573-588；H.Zhang et al.，MCP，2007，64-71)已经验证了对复杂流体中的蛋白质的定量测定，所述测定在数个SRM测定同时进行的情况下通过诸如SRM(选择反应监测)或MRM(多反应监测)的质谱技术通过其蛋白水解肽而进行。在质谱测定之前，通过酶的方式消化待测定蛋白质，以使蛋白质裂解为肽。然后，通过质谱测定被称为蛋白水解肽的蛋白质特异性肽。 
SRM或MRM与ELISA测定相比的优点在于开发该测定法所花的成本和时间大大降低，特别是在必须开发ELISA测定所需的抗体的情况下更是如此。因此，这类质谱技术似乎是用于测定蛋白质的可选方法，并且使得能够例如更简单和更快速地证实测定由蛋白质组分析的研究而鉴定为潜在标记的众多蛋白质的临床优点(S.Carr & L.Anderson，Clin.Cem.2008，1749-1752)。 
在MRM测定的情况下，在三极四联质谱仪(特别是适于MRM模式的)中，根据下文详细描述的原则对蛋白水解肽进行定量。首先，将待测定的含肽样品引入至电离源，所述肽在此于气态下电离，并被转化为与起始肽对应的具有一个、两个或甚至三个另外的质子且因此携带一个、两个或甚至三个电荷的“分子”离子。例如，借助于电喷射型电离源，所述肽被电离的同时在从液态转化为气态(Gaskell，Electrospray：principles and practise，J.Mass Spectrom.(1997)，32，677-688)。当通过反相液相色谱预先对所述肽进行分离时，该类型的电离源特别合适。尽管如此，肽电离率仍可根据存在的不同分 子的浓度和性质而变化。该现象通过本领域技术人员公知的基质效应而反映。另外，还可借助于MALDI(基质辅助激光解吸电离)源从固态电离肽。 
其次，四极分析仪(Q1)使得能根据其质量/电荷比(m/z)来过滤蛋白水解肽。仅具有所寻求的蛋白水解肽的质量/电荷比的肽(该比被称为(m/z)1)被传递至第二极(q2)并作为用于随后裂解的前体离子。 
q2分析仪使得能将质量/电荷比为(m/z)1的肽裂解为第1代片段离子。通常通过使用惰性气体(例如氮气或氩气)碰撞前体肽而获得所述裂解。 
第1代片段离子被传递至第三四极(Q3)，该第三四极根据特定的质量/电荷比过滤第1代片段离子，所述比被称为(m/z)2。仅具有所寻求的蛋白水解肽所特有的片段的质量/电荷比(m/z)2的第1代片段离子被传递至检测器以进行定量。 
该操作模式在关系上具有双重选择性，一方面，是对于前体离子的选择，另一方面，是对于第1代片段离子的选择。因此，MRM模式的质谱有利于定量。 
检测器中所测定的由第1代片段离子诱发的电流强度与第1代片段离子的量成正比，第1代片段离子的量自身与前体离子的量成正比，前体离子的量自身与待测定的蛋白质的量成正比。因此，所检测的由第1代片段离子诱发的电流量与待测定的蛋白质的量成正比。尽管如此，仍有必要进行校准，以能够使所检测的与第1代片段离子诱发的电流量对应的峰面积与第1代片段离子的相应量具有相关性(或相互关联)，并最终与待测定的蛋白质的量具有相关性。可在可以MRM模式或MS/MS(或MS2)模式操作的不同质谱模式下测定被称为“跃迁”的(m/z)1和(m/z)2对。通过举例，可提及的有三联四极型(L.Anderson & C.Hunter，MCP，2006，573-588…)或离子阱型(B.Han和R.Higgs，Brief Funct Genomic Proteomic.2008 Sep；7(5)：340-54)或飞行时间型(MALDI-TOF)(K.-Y.Wang et al.，Anal Chem，2008，80(16)6159-6167)模式。 
用于测定蛋白质的跃迁必须是待测定的蛋白质所特有的，且必须导致测定尽可能敏感、尽可能特异以及在再现性和可靠性方面尽可能强大。对此，必须谨慎选择。 
在所开发的用于选择蛋白水解肽(m/z)1和(m/z)2的方法中，所述选择基本上基于反应强度。对于更为详细的内容可参见V.Fusaro et al.，Nature Biotech. 27；2009；190-198。肽分离的质量、测定的上游、氨基酸组成、在可存在的另一种蛋白质中完全相同的前体肽的缺乏以及前体肽的电荷状态也是选择中考虑的因素。通常以MRM模式或MS/MS(MS2)模式检测由前体离子裂解而产生的质量。然后，选择导致最强信号的第1代片段离子。接着，优化前体离子裂解条件和分析条件以使所获得的信号最大化。已知，在Q1中选择双电荷离子和在Q3中选择单电荷第1代片段离子，优选具有比双电荷前体离子更高的m/z比的单电荷第1代片段离子是有利的。 
本领域技术人员可使用商业软件，例如来自Applied Biosystems的MIDAS和MRM Pilot软件或其他MRMaid(J.Mead et al.，MCP，Nov 15，2008，E-pub)，以使得其能够预测所有可能的跃迁对。他们还可使用由F.Desiere et al.(Nucleic Acids Res.2006，Jan 1；34(数据库登录号)：D655-8)构建的称为PeptideAtlas的数据库，以编辑由科学界描述的所有肽MRM跃迁。该PeptideAtlas数据库可在因特网上免费获得。 
用于选择(m/z)1和(m/z)2蛋白水解肽的可选方法是使用在其他工作场合获得的MS/MS裂解谱。该工作可以是，例如通过蛋白质组分析发现和鉴定生物标记的阶段。该方法由Thermo Scientific在用户会议中推荐(J.Mead et al.，MCP，Nov 15，2008，E-pub)。它使得能通过SIEVE软件(Thermo Scientific)由经实验鉴定的肽生成一系列候选跃迁。J.Mead et al.(MCP，见上文)已经详细描述了用于选择(m/z)1和(m/z)2离子的某些标准，且下文有详细描述： 
-应避免具有内部切割位点(即，具有内部赖氨酸或精氨酸)的肽，除非赖氨酸或精氨酸后是脯氨酸； 
-应避免具有天门冬酰胺或谷氨酰胺的肽，原因是它们可被脱氨基； 
-应避免具有N-末端谷氨酰胺或谷氨酸的肽，原因是它们可自发环化； 
-应避免具有甲硫氨酸的肽，原因是它们可被氧化； 
-应避免具有半胱氨酸的肽，原因是它们可在可能的变性、还原以及封闭巯基官能团的步骤过程中被非再现性地修饰； 
-具有脯氨酸的肽可被认为是有利的，原因是它们通常在MS/MS中产生具有非常突出的单一峰的强片段。然而，所述非常突出的单一片段不能证明复杂混合物中跃迁的身份。实际上，仅在数种特征性片段同时存在时方使得能证实确实检测到待寻求的前体离子； 
-应避免在C末端相邻的位置(第n-1位)或在相对于C末端的第2位(第n-2位)具有脯氨酸，原因是在该情况下，第1代肽片段的尺寸通常被认为太小而不具有足够的特异性； 
-选择质量比前体更大的片段是有利的，用以促进特异性。对此，有必要选择双电荷前体离子和选择质量比前体大的最强的第1代片段离子，即，单电荷第1代片段离子。 
另外，最普遍地，为了确保适于测定复杂流体(血液、血清、血浆、尿液、粪便、痰等)中数ng/ml浓度的蛋白质的灵敏度和特异性，通过质谱进行的定量测定应在消化步骤以及穿插于消化步骤前后的其他步骤之前，例如： 
阶段1：蛋白质分级，以消除主要蛋白质(非待测蛋白质)，或通过如下任何合适的技术纯化样品：电泳、色谱、免疫捕获(Kulasingam et al.，J.Proteome Res.，2008，640-647)。然而，后一种技术需要拥有或制备针对待测定蛋白质的特异性抗体，而要获得该抗体花费时间长且成本高。另外，通过质谱进行的测定接下来的性能水平与抗体的质量和特异性部分相关。 
阶段2：变性、还原和封闭巯基官能团； 
阶段3：消化； 
阶段4：肽分级； 
阶段3使得能增加消化产率，并确保测定在再现性和稳定性方面较强大。当不需要大的灵敏度时，阶段1和4是任选的(L.Anderson & C.Hunter，MCP，上文)。相反，当需要大的灵敏度(数ng/ml)时，它们是必需的。这已经被T.Fortin et al.，(见上文)，H.Keshishian et al.，MCP，2007，2212-2229和V.Kulasingam et al.，J.Proteome Res.，2008，640-647，L.Anderson et al.，J.Proteome Res.，2004，235-2344以及US 2004/0072251所证实。实际上，鉴于Q1和Q3中的三联四极的精确度，许多肽(同量异序肽或拟同量异序肽)都可以产生等于或包含在仪器的质量容许范围内的跃迁(J.Sherman et al.，Proteomics，2008，9：1120-1123)。在该情况下，蛋白水解肽和同量异序肽或拟同量异序肽的同时注射由于缺乏特异性而导致错误定量。在质谱之前进行肽色谱分离通过降低污染肽的数量而产生了额外的特异性水平(M.Duncan et al.，Proteomics，2009，9：1124-1127)。然而，该额外的分级步骤可能是不够的(H.Keshishian et al.，上文)，这使得有必要谨慎验证用于对蛋白质进行定量的任 何跃迁。 
另外，特别是当阶段1或4的过程中必须使用抗体时，除了消化步骤还包括阶段1、2以及4的完整测定方法花费时间长且成本高。 
最近，已经利用被称为MRM3的技术检测蛋白质。该技术在于选择第1代片段离子，并使其经受进一步的裂解以产生第2代片段离子。因此，所检测的是这些第2代片段离子。J.Niessen et al.(MCP，February 23，2009 E-Pub)特别使用了三联体：前体/第1代片段离子/第2代片段离子(被称为MRM3跃迁)SEQ ID No 1：VLLQTLR(双电荷)/SEQ ID No 2：LLQTLR(双电荷)/SEQ ID No 3：LQTLR(单电荷)。然而，作者没有讨论特别选择该MRM3跃迁的原因，仅仅具有证明靶蛋白存在的内容，没有测定后者的内容。最近，A.Izrael-Tomasevic et al.(Journal of Proteome Research，Targeting Interferon Alpha Subtypes in Serum：A comparison of analytical approaches to the detection and quantitation of proteins in complex biological mixtures，互联网公布日期：April 7，2009)已经使用MS3用以检测IFN-α，MS3与MRM3的区别在于用于描述所分析的蛋白水解肽的性质的完整的MS3谱。对此，为了检测IFN-α4，作者选择了分子离子SEQ ID No 4：HDFGFPQEEFGNQFQK(三电荷)和离子y15 2+SEQ ID No 5：DFGFPQEEFGNQFQK(双电荷)作为经受第二裂解的第1代片段离子，并且，对于IFN-α4的所有亚型均选择了分子离子SEQ ID No 6：YSPCAWEVVR(双电荷)和离子y8 2+SEQ ID No 7：PCAWEVVR(双电荷)作为要经受第二裂解的第1代片段离子。在MRM3模式或MS3模式中，均不进行定量测定，并且作者强调了IFN-α的离子阱定量并不令人满意。作者注意到，尽管MS3中第2代片段离子的信噪比得到改进，但计数量比FT-ICR至少低1000倍，并得出结论，它们有利于SRM(MS2)和AMT(准确质量和时间)(不进行裂解的MS)方法。 
在本文中，本发明提供了一种可靠、易于实施且价廉的利用质谱技术的新型蛋白质测定方法。本发明提供了一种蛋白质测定方法，所述方法利用MRM3且还基于对第1代片段离子的特定选择，使得该方法为令人满意的定量测定法。 
本发明涉及一种用于定量检测样品中靶蛋白的方法，其包括如下步骤： 
a)处理所述样品，以产生肽； 
b)通过质谱技术对由所述靶蛋白产生的至少一种蛋白水解肽进行定量测定，其中： 
i)电离蛋白水解肽以产生根据质量m/z进行过滤的前体离子，且根据所寻求的靶蛋白选择质量为(m/z)1的给定前体离子； 
ii)将所选择的前体离子裂解为第1代片段离子； 
iii)根据所产生的第1代片段离子的质量m/z对其进行过滤，并根据所寻求的靶蛋白选择质量为(m/z)2的给定第1代片段离子； 
iv)将所选择的第1代片段离子裂解为第2代片段离子； 
v)检测至少一部分所述第2代片段离子，以提供一系列定量检测值； 
vi)选择与第2代片段离子有关的至少一个定量检测值，并对其与所产生的蛋白水解肽的量和所述样品中存在的靶蛋白量进行相关性分析；
其特征在于，所选择的质量为(m/z)2的第1代片段离子是在第1位具有脯氨酸和/或组氨酸的双电荷肽。 
接下来的说明使得能更清楚地理解本发明。通过介绍，所使用的某些术语定义在下文给出。 
术语“肽”意在指具有至少两个氨基酸的序列。所述氨基酸可为天然氨基酸，或是经修饰的天然氨基酸，例如由酶促作用修饰的氨基酸。 
通常，术语“肽”是具有2至100个氨基酸的序列。具有超过6个氨基酸的序列也可称为“蛋白质”，这两个概念不可能通过清楚的分界线分开。在本发明的情况中，术语“蛋白质”是指最初存在于样品中的氨基酸序列，术语“肽”则是指起始蛋白质或其肽的至少一个肽键裂解而产生的氨基酸序列(例如，通过在质谱仪中消化、化学切割或裂解)。术语“蛋白质”包括全蛋白和杂蛋白，例如核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白以及糖蛋白、酶、受体、抗体和抗原。 
特别地，可通过本发明方法测定的蛋白质是包含由n个氨基酸组成的至少一个肽的蛋白质，其中所述肽自身在第2至n-2位包含至少一个脯氨酸和/或在第1至n-2位包含至少一个组氨酸，且通过起始蛋白的切割而获得。优选地，该肽包含1至15个氨基酸且至少为6个氨基酸。 
术语“蛋白水解肽”意在指通过将蛋白质裂解为肽的处理产生的肽，其所述蛋白质或所述蛋白质所属的极相似蛋白质的家族所特有的。 
术语“样品”意在指能够含有待检测的蛋白质的任何样品。所述样品可为生物来源，即，动物、植物或人，其可对应于生物流体样品(例如，全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、有机分泌物)、组织样品或分离的细胞样品。所述样品可以如此使用，或者除非说明书中另有指明，根据本领域技术人员已知的方法在分析前进行富集、萃取、浓缩、纯化型制备。所述样品可以是工业来源，即，根据非详尽列举如空气样品，水样品，由表面、组分或所制备的产品所取得的样品，或食物源性产品。在食物源性样品中，以非详尽方式可以提及的有乳产品样品(酸乳酪、乳酪)、肉、鱼、蛋、水果、蔬菜、水或饮料(乳、果汁、碳酸水等)。这些食物源性样品也可来自所制备的菜肴或调味料。最后，食物样品可源自动物饲料，例如，特别是动物膳食。 
m/z比对应于本发明情况中使用的电离肽的质量/电荷比。术语“质量/电荷比”、“比”以及甚至“质量”将无需区分地用于指该m/z比。该比的单位以Th表示，但其还可以通过使其扩展至“质量”而以Da表示。 
本发明的方法的第一步a)为处理包含在目的样品中的蛋白质。处理样品的所有蛋白质，以将所述蛋白质裂解为肽，例如，通过使用蛋白水解酶(蛋白酶)消化，或通过化学试剂的作用。实际上，可通过理化处理、通过生物处理或通过这两种处理的组合来进行蛋白质的裂解。在可使用的处理中，可提及的有使用羟基基团，特别是使用H2O2进行处理。使用羟基基团处理导致在蛋白质的任何肽键上随机发生肽键裂解。羟基基团的浓度决定所进行的裂解的数量并由此决定所获得的肽片段的长度。也可以使用其他化学处理，例如，使用溴化氰(CNBr)处理，溴化氰特异性地在甲硫氨酰基的羧基水平上裂解肽键。还可通过在1000℃加热含蛋白质的三氟乙酸溶液而在天冬氨酰基水平上进行部分酸切割。 
无论如何，优选通过酶促消化而处理蛋白质。与理化处理相比，酶促消化提供给蛋白质结构以较大的保护，并且较容易控制。术语“酶促消化”意在指一种或多种酶在合适的反应条件下的单作用或组合作用。进行蛋白水解的酶(被称为蛋白酶)在特定位点裂解蛋白质。各蛋白酶通常识别总是在其中进行相同裂解的氨基酸序列。某些蛋白酶识别单个氨基酸或在其之间进行切割的两个氨基酸的序列；其他蛋白酶仅识别较长的序列。这些蛋白酶可为内切蛋白酶或外切蛋白酶。在已知的蛋白酶中，可提及的有WO2005/098071中描 述的如下蛋白酶： 
-特异性酶，例如裂解Arg和Lys残基的羧基上的肽键的胰蛋白酶，裂解赖氨酸的-CO基团的肽键的内溶素(endolysin)，水解芳香基(Phe、Tyr以及Trp)的羧基上的肽键的糜蛋白酶，裂解芳香基(Phe、Tyr以及Trp)的NH2基团的胃蛋白酶，以及裂解Glu残基的羧基上的肽键的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)V8菌株的V8蛋白酶； 
-非特异性酶，例如，源自嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)的热解素，其水解疏水氨基酸(Xaa-Leu，Xaa-Ile，Xaa-Phe)的NH2基团的肽键；枯草菌溶素和链霉蛋白酶，它们是实际上水解所有键且可在受控反应条件(酶浓度和反应时间)下将蛋白质转化为寡肽的细菌蛋白酶。 
几种蛋白酶可以同时使用(如果它们的作用方式相容)或它们可顺次使用。在本发明的情况中，优选通过蛋白酶(例如胰蛋白酶)的作用进行样品的消化。 
这样的处理步骤使得能将样品中存在的以蛋白质为代表的大分子转化为小分子肽。由此提高其后的质谱检测的灵敏度。另外，对于给定的靶蛋白来说，所述处理步骤使得能产生数种蛋白水解肽，也称为报告肽。各蛋白水解肽的特异性必须通过确保例如没有其他蛋白质包含相同的肽序列或没有其他跃迁干扰而进行验证。所述处理由此使得能提高获得特异于待测定蛋白质的一种或多种蛋白水解肽的可能性。各蛋白水解肽使得能通过独立的测定方式来对蛋白质进行定量。复杂流体(例如血液样品)的MRM测定的特异性并不确定。因此，在这种情况下，测定各蛋白的数种蛋白水解肽使得能证明各独立的测定确实导致相同的检测量。因此，获得彼此正确关联的独立测定使得能保证独立进行的各测定的特异性和在可靠性和再现性方面的强大。 
因此，在所述方法的其他部分中，选择用于质谱分析的具有给定比(m/z)1的各前体离子将由待测定的靶蛋白的蛋白水解肽产生。 
根据样品的复杂性，所述处理步骤可在一个或多个任选步骤之前。可在处理剩余蛋白质之前作为头一步对于目的样品中存在的蛋白质进行分级，以降低样品的复杂性。术语“分级”通常是指对所存在的数种蛋白质进行纯化：这可以是消除样品中的一种或多种蛋白质或选择一种或多种蛋白质(包括待测定的蛋白质)。这样的步骤可以是消除样品中存在的主要蛋白质例如白蛋 白、IgG、IgA等，所述这些蛋白质不是待测定的目的蛋白。所述消除可通过例如亲和色谱进行。该消除使得能通过减少所存在的蛋白质的数量来降低样品的复杂性。白蛋白消除已由申请人推荐(T.Fortin et al.，见上文)。其他研究小组也已经使用了对较大组的蛋白质的消除(H.Keshishian et al.，见上文；和V.Kulasingam et al.，见上文)。这些技术可以在本发明的情况中使用。尽管如此，亲和色谱的缺点是当其涉及免疫亲和树脂时使用昂贵的色谱介质。另外，如T.Fortin et al.(见上文)所证明的，如果捕获的特异性不够，则待测定的蛋白质自身也可被亲和树脂部分滞留，并对后续测定造成损失。 
对于蛋白质进行分级的另一可选方式是对目的蛋白进行免疫纯化，例如，通过亲和色谱。该方法使得能通过获得仅包含待测定蛋白质的级分(和可能的少量污染蛋白)而显著降低样品的复杂性。Kulasingam et al.(见上文)描述了这样的方法。无论如何，有利的是本发明的方法并不利用需要针对待测定蛋白质的抗体的所述技术。原因是，由于对于待测定的蛋白质的特异性，本发明的方法使得导致剩余蛋白质数量非常少的蛋白质分级成为多余的。 
对蛋白质进行分级的另一可选方式是通过SDS-PAGE电泳对待测定的样品进行纯化，然后切除与待测定蛋白质的分子量相对应的条带，如S.A.Gerber et al.(见上文)所详细描述的。通常，本领域技术人员熟知的所有蛋白质分级技术(电泳、色谱等类型)都可用于降低样品的复杂性。 
可进行另一任选的步骤：变性、还原以及然后封闭蛋白质的巯基官能团，特别是在导致蛋白质裂解的处理步骤之前，和在蛋白质分级步骤(如果存在的话)之后进行。尽管是任选的，该步骤使得能提高消化处理产率并确保后续测定更强大。某些蛋白质由于其三维构象而天然抵抗蛋白酶的蛋白水解作用(V.Brun et al.，MCP，2007，2139-2149)。在这种情况下，变性、还原以及然后封闭蛋白的巯基官能团的步骤有利于蛋白酶的作用并确保样品之间相似的消化处理产率。可对于目的样品中存在的所有蛋白质进行变性和还原，例如使用尿素或胍和二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)(M.Sun et al.，Bioconjug.Chem.2005，16(5)：1282-1290)。然后，使用例如碘乙酰胺或丙烯酰胺封闭所产生的三个巯基官能团(B.Herbert et al.Electrophoresis，2001，22：2046-2057)。 
根据本发明的方法，在所述处理步骤中所产生的至少一种蛋白水解肽通 过质谱来测定。通常，每个蛋白测定一种蛋白水解肽。尽管如此，每个蛋白仍可测定数种蛋白水解肽。也可顺次测定来自不同蛋白的蛋白水解肽。可将所述处理步骤中所产生的所有肽均注射至质谱仪中。然而，最常见的是，对所产生的肽进行分级，以特别将测定集中于目的蛋白的蛋白水解肽。这种对肽的分级可通过例如电泳或色谱技术来进行。这些分离技术可单独使用或相互组合使用，以获得多维分离。例如，如T.Fortin et al.，(见上文)和H.Keshishian et al.(见上文)所述，可通过将离子交换色谱分离与反相色谱结合进行多维色谱。在这些出版物中，色谱介质可处于柱子或小柱(cartridge)(固相萃取)中。 
蛋白水解肽的电泳或色谱级分(或在单维或多维色谱中的滞留时间)是各肽所特有的，因此，这些技术的实施使得能选择待测定的蛋白水解肽。所产生的肽的所述级分使得能提高通过质谱进行的后续测定的特异性。 
用于对肽进行分级的电泳或色谱技术的替代方式是特异性纯化N-糖肽(J.Stal-Zeng et al.，MCP，2007，1809-1817和专利申请WO 2008/066629)。然而，这种纯化仅允许定量已经进行了N-糖基化类型的翻译后修饰的肽。众所周知，并非所有蛋白均被糖基化，因此这限制了其使用。 
用于对肽进行分级的另一替代方式是对目的肽进行免疫纯化，例如通过亲和色谱。该方法使得能通过获得仅包含待测定肽(和可能的少量污染肽)的级分而显著降低样品的复杂性。这种方法(称为SISCAPA)在L.Anderson et al.(见上文)和专利申请US 2004/0072251中有描述。然而，获得特异性抗肽抗体是困难的，在这种情况下本发明的方法并不利用此种技术。另外，由于对于待测定的蛋白具有特异性，本发明的方法使得产生待测定的单个蛋白水解肽的肽的免疫亲和分级是多余的。 
总之，在本发明方法的情况中，通过质谱对所产生的肽进行的定量测定(对应于步骤b)优选地在色谱或电泳分离步骤a)所产生的肽之后。这种色谱分离将优选使用反相色谱、微流色谱(即，使用每分钟100μl至500μl的流速的色谱)进行分离，或否则使用固相萃取(SPE)进行纯化。 
本发明方法的步骤b)为通过质谱技术检测先前步骤中所产生的至少一种蛋白水解肽。通常，针对每个蛋白测定单个蛋白水解肽，但测定其两种或更多种蛋白水解肽也是可能的，通过所选择的肽分级技术将所述肽的到达顺序 设定在质谱的上游。 
多种质谱仪模式均可用于本发明。这些模型必须允许根据m/z比进行三个分离步骤，其中所述分离步骤之间穿插有两个顺次裂解，即被称为MS/MS/MS或可选地MS3的分析类型。通过举例，可提及的有三联四极型(L.Anderson & C.Hunter，MCP，2006，573-588…)或离子阱型(B.Han & R.Higgs，Brief Funct Genomic Proteomic.2008 Sep；7(5)：340-54)或飞行时间型(MALDI-TOF)(K.-Y.Wang et al.，Anal Chem，2008，80(16)6159-6167)模式。无论如何，整合离子阱的混合三联四极型为优选。向所选择的质谱仪中注射并在其中测定通常处于溶液中的待测定肽。 
在第一个步骤i)中，对注射至质谱仪中的由导致蛋白裂解的处理所产生的肽进行电离，从而产生分子离子(考虑到其随后将经受裂解而产生片段离子，而称之为前体)。为了将肽注射至质谱仪中，通常将肽溶解于水性溶液中。因此，待测定的样品优选为液态。在其中电离分子的离子源为例如MALDI(介质辅助雷射脱附电离)或电喷射(来自电喷雾电离的ESI)型。尽管如此，在中性条件，特别是在大气压和室温下进行的电喷射电离为优选。 
然后根据其质量m/z过滤所产生的前体离子，并根据所寻求的靶蛋白选择具有给定质量(m/z)1的前体离子。为此，通常在电场中对离子进行加速，然后根据取决于其质量/电荷(m/z)比的轨道使其指向电场和/或磁场。所使用的电场和/或磁场的变化使得能改变前体离子的轨道，并由此使得能选择所需的(m/z)1比。根据本发明的优选特征，所选择的前体离子是双电荷肽，其含有数量n为6至15个氨基酸，其中在第2至n-2位具有至少一个脯氨酸和/或在第1至n-2位具有至少一个组氨酸。这种选择使得能在后续步骤中获得良好的特异性和选择性，并且信噪比得到改进。根据一个优选实施方式，所选择的前体离子带双电荷，并具有至少两个脯氨酸或一个脯氨酸和一个组氨酸。这是因为在MS3中使用具有两个脯氨酸或一个脯氨酸和一个组氨酸的前体离子甚至产生更少的二级片段，且甚至更适于获得最有效的定量测定。 
表述“在第2至n-2位包含脯氨酸(或组氨酸)的肽”是指脯氨酸(或组氨酸)可在第2、3、4、5…n-5、n-4、n-3或n-2位。第1位对应于N末端部分，第n位对应于C末端部分，n为存在于肽中的氨基酸的数目。 
然后，在步骤ii)中将根据所寻求的靶蛋白而选择的前体离子裂解为第1 代片段离子。然后，在步骤iii)中根据其质量m/z过滤第1代片段离子，并选择质量为(m/z)2的给定的第1代片段离子。根据本发明的基本特征，所选择的第1代片段离子对应于在第1位(N末端)包含脯氨酸或组氨酸的双电荷肽。实际上，当前体离子包含脯氨酸或组氨酸时，具有与涉及脯氨酸或组氨酸的N末端位置的肽键裂解相对应的第1代片段离子。在本发明方法的步骤iv)中，所选择的第1代片段离子将进行进一步的裂解，且对前体离子和第1代片段离子的特定选择产生了良好的裂解并获得了强峰。在本发明的情况中，选择具有(m/z)1比的前体离子和具有(m/z)2比的第1代片段离子，使得为待测定的蛋白所特有的，并导致尽可能敏感、尽可能特异以及在再现性和可靠性方面尽可能强的测定。 
两个顺次的裂解通常通过在电场中与惰性气体(例如氮气或氩气)碰撞或通过在例如飞行时间管中单使用电位差来进行。电场的特性决定了裂解的强度和性质。因此，在惰性气体存在下采用的电场(例如在四极中)决定了应用于离子的碰撞能。本领域技术人员可对碰撞能进行优化，以提高待测定的跃迁的灵敏度。通过举例，在来自Applied Biosystems公司(Foster City，United States of America)的AB SCIEX QTRAP
Figure BPA00001498397200121
5500质谱仪的q2中的碰撞能可能在5和180eV之间变化。相似地，本领域技术人员可对碰撞步骤持续时间和例如离子阱中的激发能进行优化，以产生可能最敏感的测定。通过举例，可使来自Applied Biosystems公司的AB SCIEX QTRAP
Figure BPA00001498397200122
5500质谱仪的Q3中的该持续时间(称为激发时间)在0.010和50ms之间变化，使激发能在0和1(任意单位)之间变化。 
步骤i)至iii)对应于通常在MRM测定中使用的步骤。这些步骤可特别在三联四极中进行。三联四极包含两个串联的四极分析仪(称为Q1和Q3)，该两个四极分析仪由通常被较短的四极构成的碰撞单元(称为q2)分开。当然，有必要在具有将第1代片段离子裂解为第2代片段离子的能力的质谱仪中实施本发明的方法。在本发明的情况中，可例如在包含离子阱的三联四极的Q3中将第1代片段离子裂解为第2代片段离子并选择所述第1代片段离子。可使用在四极Q3中具有离子阱能力的混合三联四极。这样的仪器由Applied Biosystems公司以名称3200QTRAP
Figure BPA00001498397200123
、4000QTRAP
Figure BPA00001498397200124
或AB SCIEX QTRAP
Figure BPA00001498397200125
5500出售。还能在任何离子阱分析仪中以MS3模式裂解第1代片段离子。在 该情况下，在离子阱中选择前体离子，然后将其裂解为第1代片段离子。选择第1代片段离子，然后在相同离子阱装置中将其裂解为第2代离子。最后通过从离子阱中顺次排出所述第2代离子至检测器而最终检测所述第2代离子。 
在本发明的情况中，通常，四极分析仪(Q1)使得能根据由所选择的蛋白水解肽产生的前体分子离子的质量/电荷比(m/z)1而对其进行过滤。仅具有所寻求的前体离子的质量/电荷比(m/z)1的肽被传送至第二四极(q2)。q2分析仪使得能将质量/电荷比为(m/z)1的前体离子裂解为第1代片段离子。通常通过惰性气体(例如氮气或氩气)与前体肽的碰撞实现裂解。然后将第1代片段离子传送至第三四极(Q3)，该第三四极根据质量/电荷比(m/z)过滤所述第1代片段离子。仅具有所寻求的蛋白水解肽特有的片段的质量/电荷比(m/z)2的第1代片段离子将进行本发明方法的最后步骤。实际上，本发明的方法包括另外的裂解：在后续的步骤iv)中，将所选择的具有质量/电荷比(m/z)2的第1代片段离子裂解为第2代片段离子。在Q3中选择具有所寻求的蛋白水解肽片段的质量/电荷比(m/z)2的第1代片段离子之后，又对该第1代片段离子进行裂解，例如通过离子阱。然后，获得由所述第1代片段离子的裂解而产生的不同的第2代片段离子。然后，通过由离子阱或四极构成的质量分析仪将这些不同的第2代离子排出至检测器。例如，通过射频应用作为时间函数调整的电压而顺次进行从离子阱中的排出。 
为了检测所诱发的电流，引导所述第2代片段离子至检测器，该检测器收集根据m/z比在不同时间到达的第2代片段离子并放大与离子有关的信号。根据本发明方法的一种实施变体，在步骤v)中，以时间函数检测由所述第2代片段离子诱发的电流强度，且将在给定时间内获得的信号根据质量m/z分解为不同离子的质谱存在，以获得与在给定时间中经检测存在的各第2代离子有关的质量峰，将对应于至少一种所选择的第2代离子的电流的信号进行重构(recomposé，recompose)，并且所测定的相应电流的强度是步骤vi)中所选择的定量检测值。通常，通过时间段(time fraction)或时间(period)t获得总信号。时间t的时长取决于质量分析仪的扫描速度和待扫描的质量范围，其通常小于1秒。将在各给定时间t获得的总信号根据质量m/z分解为不同离子的质谱，以获得在该给定时间t内检测到的与各第2代离子有关的 质量峰。经数个连续时间t观察第2代离子，所述时间t对应于洗脱蛋白水解肽过程中的时间T。由蛋白水解肽产生的第2代片段离子信号为最大的时间t对应于蛋白水解肽的洗脱时间或滞留时间。通常，可使用纯化的蛋白水解肽溶液或纯化的靶蛋白溶液或其中蛋白水解肽或靶蛋白特别丰富的溶液通过例如MRM测定蛋白水解肽的洗脱时间。时间T的最小时长通常为5至30秒。然而，时间T的时长通常被延长，使得信号的检测值不受蛋白水解肽的洗脱时间的微小变化的影响。时间T的时长可由此延长到色谱分离的总时间。然而，传统上，通常将时间T固定为1分钟至5分钟之间，这集中于蛋白水解肽的洗脱时间。在时间T内针对各时间段t，可选择与特异于由待定量的蛋白产生的蛋白水解肽的至少一种第2代离子的电流对应的信号。然后可从总信号提取该信号。对应于在时间T的各时刻t或时间T的各段测定的强度总和的电流强度将对应于步骤vi)中所选择的定量检测值。实际上，如实施例1中所详细描述的，与作为时间函数检测到的由离子产生的电流相对应的信号可针对各个给定时间t(其实际上是非常短的时间)而被分解，并针对时间T的最典型部分加和，以获得根据其质量m/z存在的不同离子的质谱。由此获得与在步骤v)中检测到的各第2代离子相关并在时间T的最典型部分存在的质量峰。然后，可选择具有给定质量的一种或多种第2代离子，并重构对应于所选择的离子流的信号。由此，通过整合对应于蛋白水解肽的洗脱的时间T的最典型部分的连续时间t过程中观察到的信号总和，获得由各时间t(出现在时间T的最典型的部分中)的片段离子诱发的电流强度总和。该总和对应于例如使得能测定所存在的蛋白水解肽的量的定量检测值。其中信号被加和的时段T的最典型部分的最初和最后时间t可对应于其中的信号大于检测器的背景噪音的最初和最后时间t。由此检测到的电流强度可用作测定所存在的蛋白水解肽的量的定量检测值，其特征在于其以mol/m3或kg/m3类型的国际单位制(SI单位)来表示，或通过这些单位的倍数或因数，或通过SI单位的一般导数(usual derivatives)(包括其倍数或分数)来表示。通过非限制性实施例，诸如ng/ml或fmol/l的单位为表征定量检测值的单位。优选地，在步骤vi)中，选择与具有最强m/z峰的第2代片段离子相关的定量检测值。也可将不同的第2代片段离子的定量检测值加和。在该情况下，在步骤v)中，基于至少两个定量检测值(特别是两个或三个)的总和进行相关性分析，所述定 量检测值各自与具有最强m/z峰的第2代片段离子有关。 
数据处理计算机组能将检测器收到的信息转化为质谱。在检测器中检测的由所选择的第2代片段离子诱发的电流强度与第2代片段离子的量成正比，而第2代片段离子的量自身与第1代片段离子的量成正比，而第1代片段离子的量自身与通过所选择的蛋白水解肽的电离获得的前体离子的量成正比，而前体离子的量自身与待测定的蛋白的量成正比。因此，所检测的由第2代片段离子诱发的电流量与待测定的蛋白的量成正比。选择与第2代离子有关的至少一个定量检测值并将该定量检测值与所产生的蛋白水解肽的量和存在于样品中的蛋白量相关联使获得定量测定成为可能。 
有必要进行校准以使得所测定的与第2代片段离子诱发的电流强度对应的峰面积与相应的第2代片段离子的量具有相关性，而第2代片段离子的量自身可与相应的第1代片段离子的量具有相关性，而第1代片段离子的量自身可与前体离子的量具有相关性，而前体离子的量自身可与目的蛋白的量具有相关性。为此，在本发明的情况中，可实施用于MRM测定中的常规校准。如T.Fortin et al.所述(见上文)，通常使用外标或优选使用内标来校准MRM测定。通过相对于待测定量已知的标准信号校准检测到的信号而获得定量检测值与蛋白水解肽的量之间的相关性，以及接下来与靶蛋白的量之间的相关性。可通过校准曲线的方式进行校准，例如通过连续注射不同浓度的标准蛋白水解肽(外校)或优选通过使用重肽作为内标进行内部校准获得校准曲线，例如根据下文详细描述的AQUA、QconCAT或PSAQ方法。术语“重肽”是指对应于蛋白水解肽的肽，但其中1个或多个碳12(12C)原子被碳13(13C)取代，和/或一个或多个氮14(14N)原子被氮15(15N)取代。 
S.A.Gerber et al.(见上文)和专利申请US 2004/0229283中也推荐使用重肽作为内标(AQUA)。其原则是人工合成具有包含重于常用天然同位素的同位素的氨基酸的蛋白水解肽。此类氨基酸通过例如使用碳13(13C)取代某些碳12(12C)原子或通过使用氮15(15N)取代某些氮14(14N)原子而获得。由此合成的人工肽(AQUA)与天然肽具有严格相同的理化特性(除了质量较大外)。通常在质谱测定之前，例如，在引起目的样品的蛋白裂解的处理和在该处理步骤后获得的肽的分级之间，以给定浓度将其添加至样品。由此，在肽分级过程中，使AQUA肽与待测定的天然肽一起纯化。因此，将两种肽同时注射至质 谱仪中，用于测定。然后，它们在电离源中经历相同的电离率。天然肽与AQUA肽(其浓度已知)的峰面积的比较使得能计算天然肽的浓度并由此反过来计算待测定的蛋白质的浓度。J.-M.Pratt et al.(Nat.Protoc.2006，1：1029-1043)已经以名称QconCAT推荐了AQUA技术的变体。该变体还描述在专利申请WO 2006/128492中。它是串接不同AQUA肽并产生重重组蛋白形式的人工多肽。所述重组蛋白是由包含重表位的氨基酸合成的。以该方式，能以较低成本获得用于校准数种蛋白的同时测定的标准。在导致蛋白质裂解的处理开始时、其上游和在蛋白质分级、变性、还原和然后封闭所述蛋白的巯基官能团(如果这些步骤存在的话)的步骤前，添加QconCAT标准。QconCAT标准因此经历了导致作为天然蛋白的蛋白裂解的同一处理循环，使得能考虑导致蛋白裂解的处理步骤的产率。实际上，天然蛋白的处理，尤其是通过消化进行的处理，可能是不完全的。在该情况下，AQUA标准的使用会导致天然蛋白的量被低估。因此，为了绝对测定，考虑导致蛋白裂解的处理的产率是重要的。然而，V.Brun et al.(MCP，2007，2139-2149)已经揭示，有时QconCAT标准并不准确再现天然蛋白的处理(特别是通过天然蛋白的消化进行的处理)的产率，毫无疑问这是由于QconCAT蛋白的不同三维构象。 
因此，V.Brun et al.(见上文)已经推荐使用专利申请WO 2008/145763中所描述的被称为PSAQ的方法。在该情况下，内标是重组蛋白，其与天然蛋白具有相同序列，但由重氨基酸合成。该合成是使用重氨基酸离体进行的。该内标与天然蛋白具有严格相同的理化特性(除了质量较大以外)。在蛋白分级步骤开始时、之前添加该内标。因此，所述内标在蛋白分级步骤过程中与天然蛋白一起纯化，其表现了与天然蛋白相同的处理产率，特别是通过消化进行的处理产率。如进行肽分级步骤的话，裂解之后获得的重肽还将与天然肽一起纯化。因此，将两种肽同时注射至质谱仪中，以进行定量测定。它们然后在电离源中经历相同的电离率。比较PSAQ方法中天然肽和参考肽的峰面积使得能在考虑测定方法所有步骤的同时计算待测定蛋白的浓度。 
在本发明的情况中，可以实施所有这些在质谱测定中，特别是在MRM或MS测定中使用的技术，即AQUA、QconCAT或PSAQ或任何其他校准技术，以进行校准。 
因此，可实施本发明的方法，以进行蛋白质的定量和定性测定，用于特别是体外诊断应用。下表1A详细描述了可通过本发明的方法测定的蛋白以及所选择的一定数量的蛋白水解肽。 
表1A 
Figure BPA00001498397200181
所研究的蛋白质对应于Swiss Prot数据库的下列编码：丝束蛋白-1(Q14651)、埃兹蛋白(P15311)、氨基酰化酶1(Q03154)、蛋白质二硫化物异构酶(P07237)、角蛋白、1型细胞骨架20(P35900)，14-3-3σ蛋白(P31947)、S100-A11蛋白钙平衡素(P31949)。 
从其氨基酸序列确定蛋白水解肽的理论质量。许多软件包能进行该计算，例如MRM Pilot(Applied Biosystems)、Sequence Editor(Bruker Daltonik，Bremen，Germany)等。表1A中给出的计算使用MRM Pilot进行。通过将两个质子的质量与蛋白水解肽的理论质量加和并用所得总和除以2而测定双电荷前体离子(M2H+)的理论质量。 
表1B根据所选择的双电荷前体离子给出各蛋白中所存在的脯氨酸和组氨酸的位置和所存在的氨基酸的数量(AA表示氨基酸)。 
表1B 
Figure BPA00001498397200191
在蛋白质二硫化物异构酶蛋白的情况下仅包含17个氨基酸的蛋白水解肽HNQLPLVIEFTEQTAPK(SEQ ID No 14)，和在角蛋白、1型细胞骨架20蛋白情况下包含18个氨基酸的肽SLSSSLQAPVVSTVGMQR(SEQ ID No 23)不产生对相应双电荷前体离子的任何检测。表1C给出了对于各蛋白所选择的双电荷第1代片段离子中所存在的脯氨酸和组氨基酸的位置。 
表1C 
Figure BPA00001498397200211
下文参照附图的实施例本质上并不具有限制性，且使得能例示本发明。 
图1A以总离子色谱图的形式显示了作为时间函数所获得的信号的实例。 
图1B显示了图1A中在11.70和11.90分钟之间洗脱的第2代片段离子的质谱。 
图1C显示了图1A的在三点上平滑处理的对应于PSA的蛋白水解肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的第2代片段y5、y6、y7-H2O、y7以及y8的质量的萃取离子的色谱图的汇总。 
图1D是校准曲线的实例。 
图2A显示了针对天然肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)(滞留时间11.78分钟)所获得的色谱图，图2B显示了针对重肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)(滞留时间11.79分钟)所获得的色谱图。 
图3、4A以及4B是校准曲线的其他实例。 
图5A、5B以及5C是使用不同碰撞能(分别为40、35以及30eV)获得的不同质谱。 
图5D显示了作为用于形成第1代片段离子的碰撞能(CE)的函数的所诱发电流强度的变化。 
图6A、6B以及6C表示当选择以下离子作为第1代片段离子时从Tp435蛋白的蛋白水解肽SAPSPLTYR(SEQ ID No 53)获得的第2代片段离子的质谱：最强的单电荷片段离子(图6A-在0.098和0.300分钟之间洗脱)，或单电荷形式的含有脯氨酸的片段离子(图6B-在0.101和0.306分钟之间洗脱)，或双电荷形式同一离子(图6C-在0.102和0.298分钟之间洗脱)。 
实施例1：使用肿瘤标记前列腺特异性抗原(PSA)的外部校准通过MRM 3 进行的定量测定的原则
以下文所描述的浓度使用包含在女性血清(Etablissement Francais du Sang[French Blood Bank])中的PSA(前列腺特异性抗原，由British company Scipac供应)，以形成校准范围内的点(范围点)： 
-在165μl女性血清中包含35μl的1.14mg/ml PSA，以获得200μg/ml的点； 
-在150μl女性血清中包含50μl的200μg/ml，以获得50μg/ml的点； 
-在160μl女性血清中包含40μl的50μg/ml，以获得10μg/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的10μg/ml点，以获得1μg/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的1μg/ml点，以获得100ng/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的100ng/ml点，以获得10ng/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的10ng/ml点，以获得1ng/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的50μg/ml点，以获得5μg/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的5μg/ml点，以获得500ng/ml的点； 
-在180μl H2O中包含20μl的500ng/ml点，以获得50ng/ml的点； 
-使用200μl女性血清以获得0ng/ml点。 
然后，根据下列方案消化范围点和待测定的血清样品，该血清样品为从患有胰腺癌或良性前列腺增生的患者所取的样品： 
-将体积为100μl的血清稀释在3ml的50mM碳酸氢盐(pH＝8.0)中； 
-添加二硫苏糖醇(DTT)，以获得15mM的终浓度； 
-在60℃还原40分钟； 
-将试管冷却至室温； 
-添加碘乙酰胺，以获得25mM的终浓度； 
-在室温和黑暗中进行烷基化40分钟； 
-以1/30的比例添加胰蛋白酶； 
-在37℃消化4小时； 
-添加DTT，以获得10mM的终浓度； 
-在60℃还原40分钟； 
-在室温下冷却试管； 
-添加碘乙酰胺，以获得15mM的终浓度，并在室温和黑暗中对巯基官能团进行烷基化40分钟； 
-以1/30的质量比添加胰蛋白酶； 
-在37℃过夜消化。 
然后根据下列方案对血清进行脱盐和浓缩： 
使用甲酸(即，0.1％终浓度)对样品进行酸化； 
使用1ml甲醇并随后使用1ml H2O/0.1％甲酸对Waters HLB Oasis柱进行平衡； 
对样品进行上样，所述样品通过重力流动； 
使用1ml H2O/0.1％甲酸洗涤； 
使用1ml含80％甲醇的H2O/0.1％甲酸混合物进行洗脱； 
然后将所洗脱的级分稀释于3ml的200mM乙酸铵缓冲液(pH 3.00)中； 
根据下列方案在Waters Oasis MCX SPE小柱上对样品进行分级： 
-使用1ml甲醇并随后使用1ml的200mM乙酸铵缓冲液(pH 3.00)调整小柱； 
-将稀释于200mM乙酸铵缓冲液(pH 3.00)的所有血清上样至MCX小柱上，然后使其通过重力流动； 
-使用1ml的200mM乙酸铵缓冲液(pH 3.00)，然后使用在1ml 80％甲醇、20％乙酸缓冲液(pH 3.00)洗涤小柱； 
-使用1ml的200mM乙酸铵缓冲液(pH 5.5)/甲醇(50/50)进行洗脱； 
-使用SpeedVac
Figure BPA00001498397200231
SPD2010型蒸发仪(Thermo Electron Corporation，Waltham，Massachusetts，United States of America)蒸发洗脱物2小时，以获得大约100μl的体积。 
然后使洗脱物被吸收在10％乙腈(ACN)/90％H2O 0.5％甲酸混合物中，200μl足量(QS)。 
根据下列条件注射所获得的100μl体积的样品并对其进行分析： 
-来自Dionex公司(Sunnyvale，California，United States of America)的Ultimate 3000色谱系统； 
-Waters Symmetry C18柱，内径2.1mm，长100mm，粒度3.5μm； 
-溶剂A：H2O+0.1％甲酸 
-溶剂B：ACN+0.1％甲酸 
在下列表2中限定HPLC梯度： 
表2 
  时间   流速(μl)   溶剂A(％)   溶剂B(％)
  0   300   95   5
  3   300   95   5
  15   300   78   22
  16   300   0   100
  24   300   0   100
  24.1   300   95   5
  32   300   95   5
将离开色谱柱的洗脱液直接注射至来自Applied Biosystems公司(Foster City，United States of America)的QTRAP
Figure BPA00001498397200241
5500质谱仪的电离源中。 
所使用的机械参数如下： 
Figure BPA00001498397200242
Figure BPA00001498397200251
所获得的信号作为时间函数以总离子色谱图形式显示(图1A)。 
在各时刻t时，可以以质谱形式观察到第2代离子质量。因此，质谱测量从柱洗脱并同时注射至质谱仪中的各实体的质量。由此，图1B中显示了在11.70和11.90分钟之间洗脱的第2代片段离子的质量。这些质量中的某些对应于PSA的蛋白水解肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的第2代片段的质量。因此，质量533.0、646.2、757.6、775.4以及846.6分别对应于片段y5、y6、y7-H2O、y7以及y8。如本领域公知，“y5”片段通常是其序列为蛋白水解肽序列的最后5个氨基酸的片段，“y6”片段则通常是其序列为蛋白水解肽序列的最后6个氨基酸的片段，等等。 
Analyst 1.5软件(Applied Biosystems)能萃取对应于作为时间函数的质量窗口的离子流。因此，该软件能获得例如对应于各目的第2代片段的质量单 位窗口的色谱图。该色谱图被称为萃取离子色谱图。Analyst 1.5软件还能将数个萃取离子色谱图加和在一起。该软件还能根据Stavitzky和Golay算法(A.Savitzky and M.Golay(1964).Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures.Analytical Chemistry，36：1627-1639)对信号进行平滑处理。由此，图1C显示了在三点上平滑处理的对应于PSA的蛋白水解肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的第2代片段y5、y6、y7-H2O、y7以及y8的质量的萃取离子色谱图之和。 
然后Analyst 1.5软件能合并在萃取离子色谱图上观察到的峰下面积。因此，对于PSA量为0-1000ng/ml的范围内的点，肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的y5、y6、y7-H2O、y7以及y8离子之和的信号的测量使得能获得下列表3的数据： 
表3 
  峰下面积   PSA浓度(ng/ml)
  1.25e+005   0
  4.99e+005   1
  1.50e+006   5
  1.62e+006   10
  9.42e+006   50
  1.90e+007   100
  9.73e+007   500
  1.90e+008   1000
这些结果能建立图1D中显示的校准曲线。使用方程(y＝1.9×105X+2.76×105)形式的线性回归对该曲线进行模建，这能计算PSA量未知的任何人血清样品的PSA浓度。 
通过举例，测定下列患者的血清，获得表4中给出的下列量： 
表4 
  患者   峰下面积   所计算的浓度(ng/ml)
  B2004   1.81E+06   8.07
  D4003   8.48E+05   3.01
  D4004   1.37E+06   5.77
实施例2：使用肿瘤标记前列腺特异性抗原(PSA)的内部校准通过MRM 3 进行定量测定的原则
根据T.Tortin et al.(MCP，2008E-pub)中所描述的方案使用包含某些原子的重同位素的氨基酸合成内部校准标准物。 
由此，使用2个丙氨酸化学合成PSA的器官型(organotypic)肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)，其中每个丙氨酸都包含3个取代碳12(12C)原子的碳13(13C)原子。使用ABI433A合成仪(Applied Biosystems，Foster City，United States of America)和L-(13C3)丙氨酸-N-FMOC(Euriso-Top，Saint-Aubin，France)进行合成。在合成结束时，将重肽分配至30个4ml的棕色玻璃瓶中，然后进行冷冻。 
通过偶联于质量分析仪(LCQ ion trap，ThermoFisher Scientific，Waltham，Massachusetts，United States of America)的色谱验证所合成的重肽的纯度。所述纯度被确定大于95％。然后，基于3个瓶子的样品，使用来自Agilent Technologies公司(Massy，France)的1100型氨基酸分析仪确定包含在棕色玻璃瓶中的重肽的量。由此，确定瓶中含有790μg纯度大于95％的重肽。 
使用1ml其中添加0.5％甲酸的水吸收瓶中具有的790μg重肽，获得浓度为6.2×10-10mol/μl的重肽储备液。 
在乙腈/水(50/50)和1％甲酸的混合物中10倍稀释重肽储备液，以获得6.2×10-11mol/μl的溶液。 
在乙腈/水(50/50)和1％甲酸的混合物中10倍稀释6.2×10-11mol/μl的溶液，以获得6.2×10-12mol/μl的溶液。 
在乙腈/水(50/50)和1％甲酸的混合物中20倍稀释6.2×10-12mol/μl的溶液，以获得3.1×10-13mol/μl的溶液。 
在乙腈/水(50/50)和1％甲酸的混合物中10倍稀释3.1×10-13mol/μl的溶 液，以获得3.1×10-14mol/μl的溶液。 
在乙腈/水(50/50)和1％甲酸的混合物中10倍稀释3.1×10-14mol/μl的溶液，以获得3.1×10-15mol/μl的溶液。 
根据实施例1中描述的方案处理患者血清样品和范围点，在酶促消化步骤和在Waters Oasis HLB柱上脱盐步骤之间添加50μl体积的3.1×10-15mol/μl的重肽溶液。 
然后根据实施例1中所描述的方案分析患者血清样品和范围点，增加对应于重肽的离子的监测，即：
前体：639.80Da 
第1代离子：475.30Da 
重肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)与天然肽具有相同的理化特性，并因此在色谱中具有相同的滞留时间。因此，将所述两种肽同时注射至质谱仪中。这是可在图2A的天然肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的色谱图(滞留时间11.78分钟)和图2B的重肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的色谱图上观察到的。 
另一方面，该重肽比天然PSA肽多包含6个质量单位。与天然肽的质量1277.66g/mol相比，其质量为1271.66g/mol。 
重肽的量是已知的(1.55×10-13mol)，且在所有范围点上都是相同的，所重构的信号因此应当在范围上是恒定的。然而，可在重肽上观察到信号的变化，这表示该相同变化已经影响了天然肽的信号。因此，可使用重肽的信号来校准轻肽的信号。为此，使用Analyst 1.5软件测定已经被萃取加和在一起的特异性第2代天然离子和重离子的色谱峰面积之间的比值。 
由此，天然肽和重肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)的y5、y6、y7-H2O、y7以及y8离子的总和的信号测量使得能获得下列表5的数据： 
表5 
  PSA浓度(ng/ml)   天然肽峰下面积   重肽峰下面积
  0   1.25E+05   8.11E+06
  1   4.99E+05   9.42E+06
  5   1.50E+06   8.96E+06
  10   1.62E+06   9.11E+06
  50   9.42E+06   9.80E+06
  100   1.90E+07   7.48E+06
  500   9.73E+07   8.89E+06
  1000   1.90E+08   9.55E+06
这些结果能建立图3中呈现的校准曲线。使用方程(y＝0.0208(X天然肽/X重肽)+0.0154)形式的线性回归对该曲线进行模建，这能计算PSA量未知的任何人血清样品的PSA浓度。 
通过举例，测定下列患者的血清，并给出表6中显示的量： 
表6 
Figure BPA00001498397200291
实施例3：使用外部校准或内部校准通过MRM 3 或通过ELISA获得的血清PSA的定量测定的比较
另一方面，使用VidasTPSA试剂盒(bioMérieux，Marcy l’Etoile，France)和Vidas
Figure BPA00001498397200293
自动分析仪通过ELISA对实施例1和2中分别描述的使用外部校准或内部校准通过MRM3测定的患者血清进行测定，另一方面，使用来自Roche Diagnostics公司(Mannheim，Germany)的总PSA试剂盒和Modular Analytics E170自动分析仪对其进行测定。在两种情况下，都实施供应商提供的方案。 这些血清对应于患有前列腺癌(PCa)或良性前列腺增生(BPH)的患者。根据这三种测定方法获得的剂量的比较如表7中所示确定： 
表7 
Figure BPA00001498397200301
使用外部校准或内部校准通过MRM3方法测定的量因此产生了与通过传统ELISA方法确定的那些极其接近的PSA浓度。 
在该方面，应注意ELISA测定并不测定存在于血流中的所有PSA分子。这是因为PSA与某些血液抗蛋白酶，例如α-1抗糜蛋白酶(ACT)和α-2巨球蛋白(A2M)形成了复合物。如T.Fortin et al.(MCP，2008 E-pub)已经确定的，与A2M结合的PSA不能被ELISA检测到，而可被质谱检测到。PSA-A2M复合物占总PSA的大约10％，但该量可根据患者的病理状况而调节。PSA的该特定性质部分解释了利用ELISA和MRM3技术观察到的量之间的差异。 
实施例4：人血清中梅毒螺旋体(Treponema pallidum)重组蛋白的定量测定
使用梅毒螺旋体(梅毒传染原)的2种重组表达蛋白(bioMérieux，Marcy l’Etoile，France)进行该实施例。为了促进重组蛋白的体外表达和纯化，供应商对梅毒螺旋体蛋白的天然序列进行了修饰。所使用的2种蛋白的确切序列如下提供： 
Tp435梅毒序列 
SEQ ID No 51： 
MRGSACVSCTTVCPHAGKAKAEKVECALKGGIFRGTLPAADCPGIDTTVTFNADGTAQKVELALEKKSAPSPLTYRGTWMVREDGIVELSLVSSEQSKAPHEKELYELIDSNSVRYMGAPGAGKPSKEMAPFYVLKKTKKGSSKYKYHHHHH 
Tp574梅毒序列 
SEQ ID No 52： 
MRGSAHHETHYGYATLSYADYWAGELGQSRDVLLAGNAEADRAGDLDAGMFDAVSRATHGHGAFRQQFQYAVEVLGEKVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSVTKMVRASASFQDLGEDGEIKFEAVEGAVALADRASSFMVDSEEYKITNVKVHGMKFVPVAVPHELKGIAKEKFHFVEDSRVTENTNGLKTMLTEDSFSARKVSSMESPHDLVVDTVGTGYHSRFGSDAEASVMLKRADGSELSHREFIDYVMNFNTVRYDYYGDDASYTNLMASYGTKHSADSWWKTGRVPRISCGINYGFDRFKGSGPGYYRLTLIANGYRDVVADVRFLPKYEGNIDIGLKGKVLTIGGADAETLMDAAVDVFADGQPKLVSDQAVSLGQNVLSADFTPGTEYTVEVRFKEFGSVRAKVVAQSSKYKTHHHHHH 
根据Bradford方法(Bradford，M.M.(1976)A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.Anal.Biochem.72：248-254)使用来自Bio-Rad公司(Hercules，Califomia，United States of America)的“蛋白质测定”试剂通过蛋白质测定确定Tp435和Tp574重组蛋白的量。 
Tp435蛋白批次的量由此为0.97mg/ml。Tp574蛋白批次的量由此为1.4mg/ml。 
以如下方式消化Tp435和Tp574重组蛋白： 
-各蛋白取样80μg的量，并添加50mM的碳酸氢铵缓冲液(pH＝8.0)，以获得400μl的终体积； 
-添加100μl的150mM DTT； 
-在95℃孵育20分钟； 
-在60℃孵育20分钟； 
-将样品冷却至室温； 
-添加100μl的150mM碘乙酰胺； 
-在室温下于黑暗中孵育40分钟； 
-添加4μg胰蛋白酶； 
-在37℃下孵育4小时； 
-在消化结束时，各蛋白消化物的浓度为133.3μg/ml。 
根据如下方案平行消化来自据称为“健康”患者(Etablissement Francais du Sang[French Blood Bank])的8个100μl体积的血清： 
-将各100μl血清稀释于3ml 50mM的碳酸氢铵(pH＝8.0)中； 
-添加DTT以获得15mM的终浓度； 
-在60℃下进行还原40分钟； 
-将试管冷却至室温； 
-添加碘乙酰胺以获得25mM的终浓度。 
-在室温和黑暗中进行烷基化40分钟； 
-以1/30的比例添加胰蛋白酶； 
-在37℃消化4小时； 
-再次添加DTT，以获得10mM的终浓度； 
-在60℃还原40分钟； 
-将试管冷却至室温； 
-再次添加碘乙酰胺，以获得15mM的终浓度 
-在室温下于黑暗中进行烷基化； 
-再次以1/30的比例添加胰蛋白酶； 
-在37℃过夜消化； 
-使用甲酸(即，0.1％终浓度)对样品进行酸化； 
-使用1ml甲醇并然后使用1ml“超纯”水/0.1％甲酸对Waters Oasis HLB柱进行平衡； 
-对样品进行上样，并放置使得通过重力流动； 
-使用1ml水/0.1％甲酸混合物洗涤； 
-使用1ml含80％甲醇的水/0.1％甲酸混合物进行洗脱； 
-在SpeedVacSPD2010型蒸发仪(Thermo Electron Corporation，Waltham，Massachusetts，United States of America)中干燥试管1小时，直至获得大约500μl的体积； 
-混合8个试管的经处理的血清，以获得均匀的经消化的血清汇集物； 
制备如下校准范围： 
-将50μl的133.3μg/ml的Tp574蛋白添加至50μl 133.3μg/ml的Tp435蛋白中。将总混合物添加至其中添加了0.1％甲酸的400μl水中，以形成Tp574和Tp435蛋白浓度均为26.6μtg/ml的储备液。然后，将75μl体积的储备液稀释于其中添加了0.1％甲酸的125μl水中，以获得各蛋白均为10000ng/ml的溶液。 
-将37.5μl储备液稀释于其中添加了0.1％甲酸的162.5μl水中，以获得5000mg/ml的溶液； 
-将20μl 10μg/ml的溶液稀释于180μl水中以获得1000ng/ml的溶液； 
-将20μl 1μg/ml的溶液稀释于180μl水中以获得100ng/ml的溶液； 
-将20μl 100ng/ml的溶液稀释于180μl水中以获得10ng/ml的溶液； 
-将20μl 5μg/ml的溶液稀释于180μl水中以获得500ng/ml的溶液； 
-将20μl 500ng/ml的溶液稀释于180μl水中以获得50ng/ml的溶液； 
-使消化前各自对应于100μl血清的消化血清7个级分分别补充10 000ng/ml至50ng/ml的10μl各溶液，以获得具有1、5、10、50、100、500以及1000ng/ml点的标准范围； 
-使最终的血清级分补充10μl水，以获得0ng/ml的范围点。 
使用如下色谱参数和具有用于质谱仪的不同设定值的2个时间分析样品和范围点。 
-来自Dionex公司(Sunnyvale，California，United States of America)的Ultimate 3000色谱系统； 
-Waters Symmetry C18柱，内径2.1mm，长100mm，粒度3.5μm； 
-溶剂A：H2O+0.1％甲酸； 
-溶剂B：ACN+0.1％甲酸； 
在下列表8中限定HPLC梯度： 
表8 
  时间   流速(μl)   溶剂A(％)   溶剂B(％)
  0   300   95   5
  3   300   95   5
  28   300   60   40
  30   300   0   100
  38   300   0   100
  38.1   300   95   5
  48   300   95   5
时间1对应于对Tp435蛋白的蛋白水解肽SAPSPLTYR(SEQ ID No 53)的监测。时间2对应于对Tp574蛋白的蛋白水解肽FVPVAVPHELK(SEQ ID No 54)的监测。 
对于各蛋白水解肽，根据下列机械参数选择并裂解在第1位包含脯氨酸的双电荷第1代片段： 
Tp435蛋白的时间1： 
除了下列参数以外，其他机械参数与实施例1中相同： 
Figure BPA00001498397200351
Tp574蛋白的时间2： 
除了下列参数以外，其他机械参数与时间1中相同： 
对于量为5-50ng/ml的范围点，Tp435蛋白的蛋白水解肽SAPSPLTYR(SEQ ID No 53)的y3和y5离子(m/z 649.4和439.4)的总和的信号的测量使得能获得下列表9中的数据： 
表9 
Figure BPA00001498397200353
对于量为5-50ng/ml的范围点，Tp574蛋白的蛋白水解肽FVPVAVPHELK(SEQ ID No 54)的y5和y7离子(m/z 623.4和793.4)的总和的 信号的测量使得能获得下列表10的数据： 
表10 
Figure BPA00001498397200361
这些结果使得能建立分别在图4A和4B中所示的Tp435和Tp574蛋白的校准曲线。 
使用线性回归以方程形式对这些曲线进行模建，以使得能计算具有未知量的Tp435或Tp574的任何人血清样品的Tp435和Tp574浓度。 
通过方程：y＝4.14×105X-1.5×106来计算Tp435的浓度。 
通过方程：y＝4.38×104X-1.5×105来计算Tp574的浓度。 
实施例5：使用双电荷离子作为第1代片段通过MRM 3 方法进行的定量测定的性能水平的改进
在相同样品处理条件下，比较实施例4中所获得的分析性能水平与使用传统MRM测定或使用不利用双电荷第1代片段的MRM3测定获得的性能水平。对于各蛋白，通过所述三种方法来测定相同蛋白水解肽，即PSA的肽LSEPAELTDAVK(SEQ ID No 50)，Tp435蛋白的肽SAPSPLTYR(SEQ ID No 53)以及Tp574蛋白的肽FVPVAVPHELK(SEQ ID No 54)。 
对利用包含50μl 133.3μg/ml的Tp574、50μl133.3μg/ml的Tp435蛋白、50μl 133.3μg/ml的PSA蛋白以及其中添加0.1％甲酸的350μl水的储备液根据实施例4的方案制备的样品进行分析。 
针对所述三种蛋白，使用实施例4中所描述的色谱和质谱方法进行使用双电荷第1代片段的MRM3分析。对于对应于适于各蛋白水解肽的设定值的三个时间确定质谱设置。该测定被称为该实施例的方法1。 
对于m/z为636.8的PSA的蛋白水解肽使用离子y9(943.5m/z)、对于m/z为496.8的Tp435的蛋白水解肽使用y5(649.2m/z)以及对于m/z为618.8 的Tp574的蛋白水解肽使用y5(623.3m/z)来进行使用单电荷第1代片段的MRM3分析。通过将PSA的蛋白水解肽的m/z为609+627+646+698的第2代片段的信号、Tp435的蛋白水解肽的m/z为631.2+457.4+475.4的第2代片段的信号以及Tp574的蛋白水解肽的m/z为477.5+364.2+605.4的第2代片段的信号加和而获得色谱峰。该测定被称为该实施例的方法2。 
对于方法2，将质谱的操作分成了3个时间。 
用于PSA的时间1： 
除了下列参数以外，其他机械参数与实施例1相同： 
Figure BPA00001498397200371
Tp435蛋白的时间2： 
除了下列参数以外，其他机械参数与时间1相同： 
Figure BPA00001498397200372
Figure BPA00001498397200381
Tp574的时间3： 
除了下列参数以外，其他机械参数与时间1相同： 
Figure BPA00001498397200382
对于m/z为636.8的PSA的蛋白水解肽使用离子y9(943.5m/z)、对于m/z为496.8的Tp435的蛋白水解肽使用y5(649.2m/z)以及对于m/z为618.8的Tp574的蛋白水解肽使用y5(623.3m/z)来进行MRM分析。该测定被称为该实施例的方法3。 
对于方法3，质谱参数如下： 
Figure BPA00001498397200383
Figure BPA00001498397200401
如表11所示，通过计算所获得的信噪比为10的蛋白的量来确定三种蛋白的定量限。 
表11 
Figure BPA00001498397200402
使用本发明所述方法获得的定量限要比方法2和3所获得的要低得多。因此，本发明提供了比其他方法更敏感的定量测定。 
实施例6：碰撞能优化
选择用于进行MRM3的前体离子和第1代片段至关重要。并不一定必须选择最强的第1代片段。在本发明的情况中，已经证实了具有脯氨酸或组氨酸的双电荷离子在MS3中表现出更特异的裂解并产生了较少的次级裂解，因此证实它们更适于实现最有效的定量测定。 
通过举例，对Tp435蛋白的蛋白水解肽SAPSPLTYR(SEQ ID No 53)的碰撞能进行优化。 
消化50μl体积的Tp435蛋白，于Waters Oasis HLB柱上脱盐，并将其添加到300μl的ACN/水50/50和0.1％甲酸的混合物中。然后，以10μl/分钟的流速将混合物输入至质谱仪中。 
机械参数如下： 
Figure BPA00001498397200411
Figure BPA00001498397200421
据观察，当配置碰撞能为40eV(图5A)时，与使用35eV或30eV的碰撞能的裂解(分别图5B和5C)相比，对应于在N末端位置含有脯氨酸的双电荷第1代片段的片段417.2并不非常强。当第1代片段417.2的强度降低时，其他片段的强度提高。因此，试图在选择最强的第1代片段(即对应于单电荷第1代片段的649.5Da的片段)的同时使用40eV的碰撞能。然而，如通过可见于图5D的碰撞能的优化所示，该选择并非是最佳的。 
通过以10μl/min输入并仅在5至60eV变化碰撞能进行碰撞能的优化。与先前的参数相比仅有的差异是使用MRM型扫描模式，其中在Q1中选择质量496.5Da，和在Q3选择质量417.8或649.5，循环时间100为s，以及调整下列参数： 
雾化气体：35.00 
去簇电位：80.00 
在Q0之前的输入电位：3.00 
根据实施例4的测定，在图5D中，对对应于在N末端位置含有脯氨酸的双电荷片段的跃迁496.3/417.8和对应于最强单电荷片段的跃迁496.3/649.5的碰撞能的优化显示了碰撞能使得使用跃迁496.3/417.8能获得信号的显著增加。 
如表12所示，该信号增加反映为具有更佳分析性能水平的定量测定，该定量测定的特征是定量限较低。 
表12 
Figure BPA00001498397200431
在优化质谱参数后，根据本发明所述方法使用双电荷第1代离子获得的定量限要比使用单电荷第1代离子获得的强得多。因此，使用双电荷第1代离子的方法使得能获得更敏感的定量方法。 
实施例7：使用双电荷离子作为第1代片段的MRM 3 方法进行的定量测定的性能水平的改进
通过选择最强片段离子、或单电荷形式的含有脯氨酸的片段离子或双电荷形式的含有脯氨酸的片段离子作为第1代离子，对具有两个脯氨酸(其中一个位于第2位)的Tp435蛋白的蛋白水解肽SAPSPLTYR(SEQ ID No 53)的裂解进行比较。 
最强的单电荷第1代离子是m/z为649.2的y5离子。单电荷或双电荷形式的含有脯氨酸的第1代片段离子是y7离子，所述单电荷形式的m/z为833.4的y7离子，所述双电荷形式的m/z为417.5。 
裂解50μl体积的Tp435蛋白，于Waters Oasis HLB柱上脱盐，并将其添加到300μl的ACN/水50/50和0.1％甲酸的混合物中。然后，以10μl/分钟的流速将混合物输入至质谱仪中。 
机械参数如下： 
对于最强单电荷第1代离子的MS3： 
Figure BPA00001498397200432
对于单电荷第1代离子y7的MS3： 
Figure BPA00001498397200451
Figure BPA00001498397200461
对于双电荷第1代离子y7的MS3： 
Figure BPA00001498397200471
如图6A所示，对于m/z等于649.2的最强的第1代单电荷片段离子，如先前的情况，在MS3中所获得的裂解是非常复杂的，分解所有次级裂解峰之间的信号。MS3谱的最强峰对应于3.2×105计数。 
如图6B所示，对于m/z等于833.4的单电荷第1代片段离子y7，所观察到的裂解谱是非常复杂的，其含有许多次级裂解峰。MS3谱的最强峰对应于3.8×105计数。 
如图6C所示，对于m/z等于417.5的双电荷第1代离子y7，所获得的裂解要简单得多，且信号集中于5个主峰。主峰的信号是7.3×106计数。 
这表明，根据本发明进行的肽选择提供了更敏感的测定，并解释了实施例5中观察到的灵敏度增加。 
选择第1代片段用于实施MRM3是至关重要的。如该实施例所示，不一定必须选择最强的第1代片段。前体离子的选择也是重要的。在本发明的情况中，证实了具有两个脯氨酸或一个脯氨酸和一个组氨酸的双电荷前体离子在MS3中表现了更特异的裂解并产生了甚至更少的次级裂解，并证实了它们更适于获得最有效的定量测定。 
Figure IPA00001498396800011
Figure IPA00001498396800031
Figure IPA00001498396800041
Figure IPA00001498396800051
Figure IPA00001498396800071
Figure IPA00001498396800081
Figure IPA00001498396800091
Figure IPA00001498396800111
Figure IPA00001498396800121
Figure IPA00001498396800131

Claims (12)

1.一种用于定量检测样品中靶蛋白的方法，其包括如下步骤：
a)处理所述样品，以产生肽；
b)通过质谱技术对由所述靶蛋白产生的至少一种蛋白水解肽进行定量测定，其中：
i)电离所述蛋白水解肽以产生前体离子，根据所述前体离子的质量m/z进行过滤，并根据所寻求的靶蛋白选择质量为(m/z)1的给定前体离子；
ii)将所选择的前体离子裂解为第1代片段离子；
iii)根据质量m/z对所产生的第1代片段离子进行过滤，且根据所寻求的靶蛋白选择质量为(m/z)2的给定第1代片段离子；
iv)将所选择的第1代片段离子裂解成第2代片段离子；
v)检测至少一部分所述第2代片段离子，以产生一系列定量检测值；
vi)选择与第2代片段离子有关的至少一个定量检测值，并使其与所产生的蛋白水解肽的量和所述样品中存在的靶蛋白量进行相关性分析；
所述方法的特征在于，所选择的质量为(m/z)2的第1代片段离子是在第1位具有脯氨酸或组氨酸的带双电荷的肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所选择的质量为(m/z)1的前体离子是带双电荷的肽，所述带双电荷的肽含有数量n为6至15个氨基酸，且在第2至n-2位具有至少一个脯氨酸和/或在第1至n-2位具有至少一个组氨酸。
3.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在通过质谱对所产生的肽进行定量测定之前对步骤a)中所产生的肽进行色谱或电泳分离。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色谱分离是使用反相色谱分离。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，使用包含三联四极的质谱仪通过质谱对所产生的肽进行定量测定。
6.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，使用包含离子阱的质谱仪通过质谱对所产生的肽进行定量测定。
7.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，通过使用蛋白酶，例如胰蛋白酶进行消化来处理所述样品。
8.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，在步骤v)中，以时间函数检测由至少一部分所述第2代片段离子诱发的电流强度，且将在给定时间获得的信号分解为所存在的根据质量m/z的不同离子的质量谱，以获得在给定时间中存在的与所检测到的各第2代离子有关的质量峰，将对应于所选择的至少一种第2代离子的电流的信号进行重构，并且所检测到的相应电流的强度是步骤vi)中所选择的定量检测值。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤vi)中，选择与在给定时间内具有最强峰m/z的所述第2代片段离子有关的所述定量检测值。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在步骤vi)中，基于至少两个定量检测值之和进行相关性分析，各所述定量检测值与在给定时间内具有最强峰m/z的所述第2代片段离子相关。
11.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，在步骤vi)中进行的所述相关性分析是通过校准曲线进行的。
12.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其特征在于，在步骤vi)中进行的所述相关性分析是通过使用重肽的内部校准进行的。
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