JP5567662B2 - 質量分析によるタンパク質の新規な定量方法 - Google Patents
質量分析によるタンパク質の新規な定量方法 Download PDFInfo
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Description
・内部切断部位、すなわち、内部リシン又はアルギニンを有するペプチドは、そのリシン又はアルギニンの次にプロリンが続くものでなければ、避けるべきである。
・アスパラギン又はグルタミンを有するペプチドは、脱アミノされることがあるので、避けるべきである。
・N末端にグルタミン又はグルタミン酸を有するペプチドは、自然に環化することがあるので、避けるべきである。
・メチオニンを有するペプチドは、酸化されることがあるので、避けるべきである。
・システインを有するペプチドは、起こり得る変性、還元、及び、チオール官能基のブロッキングといった工程中に再現不可能に修飾されることがあるので、避けるべきである。
・プロリンを有するペプチドは、通常、MS/MSにおいて非常に顕著な単一ピークを示す強度の強いフラグメントを生成するので、好ましいと考えられるが、単一の非常に顕著なフラグメントでは、複雑な混合物中で遷移の同定を実行することができない。実際、特有のフラグメントがいくつか同時に存在する場合においてのみ、目的とするプリカーサーイオンが実際に検出されることを確認することができる。
・C末端の隣(n−1番目)、又は、C末端から2番目(n−2番目)にプロリンを有するペプチドは、通常、一次ペプチドフラグメントのサイズが十分な特異性を有するには小さすぎると考えられるので、避けるべきである。
・プリカーサーより質量が大きいフラグメントを選択することが、特異性を向上させるために好ましい。このためには、二価プリカーサーイオンを選択する必要があり、プリカーサーより質量が大きく、最も強度の強い一次フラグメントイオン、すなわち、一価一次フラグメントイオンを選択する必要がある。
a)ペプチドを生成するために上記サンプルを処理する工程と、
b)上記標的タンパク質から生成した少なくとも1つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって定量分析する工程とを含み、
上記質量分析法では、
i)上記プロテオタイピックペプチドをイオン化してプリカーサーイオンを生成し、上記プリカーサーイオンをその質量m/zに基づいてフィルタリングし、目的とする上記標的タンパク質に応じて所定の質量(m/z)1のプリカーサーイオンを選択し、
ii)その選択されたプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへと断片化し、
iii)その生成した一次フラグメントイオンをその質量m/zに基づいてフィルタリングし、目的とする上記標的タンパク質に応じて所定の質量(m/z)2の一次フラグメントイオンを選択し、
iv)その選択された一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化し、
v)上記二次フラグメントイオンの少なくとも一部を検出し、一連の定量的測定値を得、
vi)二次フラグメントイオンに関する少なくとも1つの定量的測定値を選択し、上記生成したプロテオタイピックペプチドの量及び上記サンプル中に存在する上記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、
選択された上記質量(m/z)2の一次フラグメントイオンは、プロリン及び/又はヒスチジンを1番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法に関する。
PSA(前立腺特異抗原、Scipac社(イギリス)製)を、以下の校正範囲のポイントを得るために、女性の血清(フランス血液銀行[French Blood Bank])中、下記濃度で使用する。
・200μg/mlのポイントを得るために、女性の血清165μl中、1.14mg/mlのPSAを35μl
・50μg/mlのポイントを得るために、女性の血清150μl中、上記200μg/mlのポイントを50μl
・10μg/mlのポイントを得るために、女性の血清160μl中、上記50μg/mlのポイントを40μl
・1μg/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記10μg/mlのポイントを20μl
・100ng/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記1μg/mlのポイントを20μl
・10ng/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記100ng/mlのポイントを20μl
・1ng/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記10ng/mlのポイントを20μl
・5μg/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記50μg/mlのポイントを20μl
・500ng/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記5μg/mlのポイントを20μl
・50ng/mlのポイントを得るために、H2O180μl中、上記500ng/mlのポイントを20μl
・pH=8.0の50mM重炭酸塩3mlで、100μlの血清を希釈。
・最終濃度が15mMとなるようにジチオトレイトール(DTT)を添加。
・60℃で40分間還元。
・常温でチューブを冷却。
・最終濃度が25mMとなるようにヨードアセトアミドを添加。
・常温、暗所で40分間アルキル化。
・1/30の比でトリプシンを添加。
・37℃で4時間消化。
・最終濃度が10mMとなるようにDTTを添加。
・60℃で40分間還元。
・常温でチューブを冷却。
・最終濃度が15mMとなるようにヨードアセトアミドを添加し、40分間、常温、暗所でチオール官能基をアルキル化。
・1/30の質量比でトリプシンを添加。
・37℃で一晩、消化。
・ギ酸(すなわち、最終濃度の0.1%)によるサンプルの酸性化。
・1mlのメタノール、次いで1mlのH2O/0.1%ギ酸でWaters社のHLB Oasisカラムを平衡化。
・サンプルの投入、そのサンプルは重力で流れる。
・1mlのH2O/0.1%ギ酸で洗浄。
・H2O/0.1%ギ酸混合物中の80%メタノール1mlで溶出。
・メタノール1ml、次いでpH3.00の200mM酢酸アンモニウム緩衝液1mlでカートリッジを調整する。
・上記pH3.00の200mM酢酸アンモニウム緩衝液で希釈した血清をすべて、MCXカートリッジに投入し、重力によって流す。
・pH3.00の200mM酢酸アンモニウム緩衝液1ml、次いで80%メタノール+pH3.00の20%酢酸緩衝液の1mlでカートリッジを洗浄する。
・200mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.5)/メタノール(50/50)1mlで溶出を行う。
・体積を約100μlにするために、SpeedVac(登録商標)SPD2010型エバポレータ(Thermo Electron社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム)で溶出液を2時間蒸発させる。
・Dionex社(アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーベール)製のUltimate 3000クロマトグラフィーシステム
・Waters社のSymmetryC18カラム(内径2.1mm、長さ100mm、粒子径3.5μm)
・溶媒A:H2O+0.1%ギ酸
・溶媒B:ACN+0.1%ギ酸
走査タイプ:MS/MS/MS(MS3)
極性:正
走査モード:プロファイル(Profile)
イオン源:Turbo V(登録商標)(Applied BioSystems社)
プリカーサー:636.80Da
一次イオン:472.30Da
Q1設定:ユニット分解能(unit resolution)でフィルタリング
Q3設定:線形イオントラップ
走査スピード:10000Da/秒
Q0でのトラッピング:有
Q3での線形イオントラップ充填時間:200.00ミリ秒
Q3入力電圧:8.00V
断片化:有
励起時間:25.00ミリ秒
Q3でのイオントラップ走査増分:0.12Da
走査開始質量(Da):500.00Da
走査終了質量(Da):850.00Da
時間(秒):0.0350秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):4.30
トラッピング無線周波数振幅(終了):4.48
イオントラップ出力電圧(開始):−136.24V
イオントラップ出力電圧(終了):−125.09V
カーテンガス:50.00psi
コーン電圧:5500.00V
源温度:500.00℃
噴霧ガス:50.00psi
加熱ガス:40.00psi
衝突セル充填:高
クラスタ分離電位:50.00V
Q0前の入力電位:3.00V
衝突エネルギー:28.00eV
励起エネルギー(AF2):0.07
T.Tortinら(MCP,2008,E−pub)により記載されたプロトコルに従って、ある原子の重同位元素を含むアミノ酸を用いて、内部較正の標準を合成する。
プリカーサー:639.80Da
一次イオン:475.30Da
患者の血清(その外部又は内部較正を用いたMRM3による分析はそれぞれ実施例1及び2に記載済みである)を、一方ではVidas(登録商標)TPSAキット(ビオメリュー、フランス、マーシー・レトワール)及びVidas(登録商標)自動分析器を用いて、他方では総PSAキット及びModular Analytics E170自動分析器(Roche Diagnostics社、ドイツ、マンハイム)を用いてELISAで分析する。いずれの場合も、製造業者によって記載されたプロトコルを用いる。これらの血清は、前立腺癌(PCa)又は良性前立腺肥大症(BPH)に罹患した患者に対応している。表7に示すように、これらの3つの分析方法によって得られた量の比較を行う。
本実施例は、梅毒の病原菌であるトレポネーマパリダム(Treponema pallidum)由来のタンパク質であり、組み換えにより発現させた2種類のタンパク質(ビオメリュー、フランス、マーシー・レトワール)を用いて行う。組換えタンパク質のin vitroでの発現及び精製を容易にするために、トレポネーマパリダムタンパク質の天然配列は、製造業者により修飾されている。用いた2種類のタンパク質の正確な配列を以下に示す。
配列番号51:
MRGSACVSCTTVCPHAGKAKAEKVECALKGGIFRGTLPAADCPGIDTTVTFNADGTAQKVELALEKKSAPSPLTYRGTWMVREDGIVELSLVSSEQSKAPHEKELYELIDSNSVRYMGAPGAGKPSKEMAPFYVLKKTKKGSSKYKYHHHHH
配列番号52:
MRGSAHHETHYGYATLSYADYWAGELGQSRDVLLAGNAEADRAGDLDAGMFDAVSRATHGHGAFRQQFQYAVEVLGEKVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSVTKMVRASASFQDLGEDGEIKFEAVEGAVALADRASSFMVDSEEYKITNVKVHGMKFVPVAVPHELKGIAKEKFHFVEDSRVTENTNGLKTMLTEDSFSARKVSSMESPHDLVVDTVGTGYHSRFGSDAEASVMLKRADGSELSHREFIDYVMNFNTVRYDYYGDDASYTNLMASYGTKHSADSWWKTGRVPRISCGINYGFDRFKGSGPGYYRLTLIANGYRDVVADVRFLPKYEGNIDIGLKGKVLTIGGADAETLMDAAVDVFADGQPKLVSDQAVSLGQNVLSADFTPGTEYTVEVRFKEFGSVRAKVVAQSSKYKTHHHHHH
・各タンパク質80μgをサンプリングし、pH=8.0の50mM重炭酸アンモニウム緩衝液を添加し、最終的に400μlとなるようにする。
・150mMのDTT100μlを添加する。
・95℃で20分間培養する。
・60℃で20分間培養する。
・サンプルを常温に冷却する。
・150mMヨードアセトアミド100μlを添加する。
・常温、暗所で40分間培養する。
・トリプシン4μgを添加する。
・37℃で4時間培養する。
・消化終了時の各タンパク質消化産物の濃度は133.3μg/mlである。
・100μlの各血清を、pH=8.0の50mM重炭酸アンモニウム3mlで希釈する。
・DTTを最終濃度が15mMとなるように添加する。
・60℃で40分間還元する。
・チューブを常温に冷却する。
・ヨードアセトアミドを最終濃度が25mMとなるように添加する。
・暗所、常温で40分間、アルキル化を行う。
・1/30の質量比でトリプシンを添加する。
・37℃で4時間、消化を行う。
・DTTを最終濃度が10mMとなるように再添加する。
・60℃で40分間還元する。
・チューブを常温に冷却する。
・ヨードアセトアミドを最終濃度が15mMとなるように再添加する。
・暗所、常温でアルキル化を行う。
・1/30の比でトリプシンを再添加する。
・37℃で一晩、消化を行う。
・ギ酸(すなわち最終濃度の0.1%)でサンプルを酸性化する。
・メタノール1ml、次いで「超純」水/0.1%ギ酸の1mlでWaters社Oasis HLBカラムを平衡化する。
・サンプルを投入し、重力で流す。
・1mlの水/0.1%ギ酸混合物で洗浄する。
・水/0.1%ギ酸混合物中の80%メタノール1mlで溶出する。
・体積が約500μlになるまで、SpeedVac(登録商標)SPD2010型のエバポレータ(Thermo Electron社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム)で1時間、チューブを乾燥させる。
・均質な消化血清プールを得るために、処理した血清のチューブ8本を混合する。
・133.3μg/mlのTp574タンパク質50μlを133.3μg/mlのTp435タンパク質50μlに添加する。Tp574及びTp435タンパク質それぞれの濃度が26.6μg/mlとなる原液が得られるように、0.1%ギ酸が添加された水400μlに上記混合物をすべて添加する(原液)。そして、各タンパク質が10000ng/mlの溶液が得られるように、上記原液75μlを0.1%ギ酸が添加された水125μlで希釈する。
・5000mg/mlの溶液が得られるように、上記原液37.5μlを0.1%ギ酸が添加された水162.5μlで希釈する。
・1000ng/mlの溶液が得られるように、上記10μg/mlの溶液20μlを水180μlで希釈する。
・100ng/mlの溶液が得られるように、上記1μg/mlの溶液20μlを水180μlで希釈する。
・10ng/mlの溶液が得られるように、上記100ng/mlの溶液20μlを水180μlで希釈する。
・500ng/mlの溶液が得られるように、上記5μg/mlの溶液20μlを水180μlで希釈する。
・50ng/mlの溶液が得られるように、上記500ng/mlの溶液20μlを水180μlで希釈する。
・1、5、10、50、100、500及び1000ng/mlのポイントを含む標準範囲を得るために、消化前の血清100μlに相当する消化された血清サンプルの7つ分に対してそれぞれ、上記の10000から50ng/mlの各溶液10μlを添加する。
・0ng/mlの範囲ポイントを得るために、上記血清サンプルの最後の分に水10μlを添加する。
・Dionex社(アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーベール)のUltimate3000クロマトグラフィーシステム
・Waters社のSymmetry C18カラム(内径2.1mm、長さ100mm、粒子径3.5μm)
・溶媒A:H2O+0.1%ギ酸
・溶媒B:ACN+0.1%ギ酸
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは実施例1と同じである。
プリカーサー:496.50Da
一次イオン:417.50Da
Q3入力バリア:4.00V
走査開始質量(Da):430.00Da
走査終了質量(Da):750.00Da
時間(秒):0.0320秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):2.88
トラッピング無線周波数振幅(終了):4.10
イオントラップ出力電圧(開始):−142.07V
イオントラップ出力電圧(終了):−129.13V
源温度:450.00℃
加熱ガス:50.00psi
クラスタ分離電位:80.00V
衝突エネルギー:18.00eV
励起エネルギー(AF2):0.12
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間1と同じである。
プリカーサー:618.40Da
一次イオン:495.50Da
走査開始質量(Da):500.00Da
走査終了質量(Da):850.00Da
時間(秒):0.0350秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):3.15
トラッピング無線周波数振幅(終了):4.48
イオントラップ出力電圧(開始):−139.24V
イオントラップ出力電圧(終了):−125.09V
クラスタ分離電位:90.00V
衝突エネルギー:25.00eV
励起エネルギー(AF2):0.09
y=4.14×105X−1.5×106
y=4.38×104X−1.5×105
同じサンプル処理条件の下で、従来のMRM分析、又は二価一次フラグメントを用いないMRM3分析で得られた性能レベルと、実施例4において得られた分析性能レベルを比較する。各タンパク質について、上記3つの方法を用いて同じプロテオタイピックペプチド、すなわち、PSAについてはペプチドLSEPAELTDAVK(配列番号50)、Tp435タンパク質についてはペプチドSAPSPLTYR(配列番号53)、Tp574タンパク質についてはペプチドFVPVAVPHELK(配列番号54)を分析する。
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは実施例1と同じである。
プリカーサー:636.80Da
一次イオン:943.50Da
走査開始質量(Da):600.00Da
走査終了質量(Da):800.00Da
時間(秒):0.0200秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):3.53
トラッピング無線周波数振幅(終了):4.29イオントラップ出力電圧(開始):−135.20V
イオントラップ出力電圧(終了):−127.11V
源温度:450.00℃
加熱ガス:50.00psi
クラスタ分離電位:120.00V
Q0前の入力電位:4.00V
衝突エネルギー:23.00eV
励起エネルギー(AF2):0.12
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間1と同じである。
プリカーサー:496.50Da
一次イオン:649.20Da
Q3入力バリア:4.00V
走査開始質量(Da):430.00Da
走査終了質量(Da):640.00Da
時間(秒):0.0210秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):2.88
トラッピング無線周波数振幅(終了):3.68
イオントラップ出力電圧(開始):−142.07V
イオントラップ出力電圧(終了):−133.58V
クラスタ分離電位:80.00V
衝突エネルギー:23.00eV
励起エネルギー(AF2):0.12
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間1と同じである。
プリカーサー:618.40Da
一次イオン:623.30Da
Q3入力バリア:4.00V
走査開始質量(Da):350.00Da
走査終了質量(Da):620.00Da
時間(秒):0.0270秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):2.58
トラッピング無線周波数振幅(終了):3.60
イオントラップ出力電圧(開始):−145.30V
イオントラップ出力電圧(終了):−134.39V
衝突エネルギー:35.00eV
励起エネルギー(AF2):0.10
走査タイプ:MRM(MRM)
極性:正
イオン源:Turbo V(登録商標)(Applied BioSystems社)
Q1設定:ユニット分解能でフィルタリング
Q3設定:ユニット分解能でフィルタリング
2回の走査間の中断:5.007ミリ秒
Q1質量(Da):496.20
Q3質量(Da):649.30
走査時間:30.00
クラスタ分離電位:110V
衝突エネルギー:25eV
衝突セル出力電位:10V
Q3質量(Da):943.5
走査時間:35.00
クラスタ分離電位:115V
衝突エネルギー:23eV
衝突セル出力電位:22V
Q3質量(Da):623.4
走査時間:35.00
クラスタ分離電位:120V
衝突エネルギー:29eV
衝突セル出力電位:10V
コーン電圧:5500.00V
源温度:500.00℃
噴霧ガス:50.00psi
加熱ガス:40.00psi
衝突セル充填:9.00(任意単位)
Q0前の入力電位:5.00V
MRM3を実施するために、プリカーサーイオン及び一次フラグメントの選択は不可欠である。必ずしも最も強度の強い一次フラグメントを選択する必要はない。本発明において、プロリン又はヒスチジンを有する二価イオンは、より特異的な断片化を示し、MS3において生成される二次フラグメントがより少なくなること、及び、それらが最も有効な定量分析を行うのにはるかに適していることが実証された。
走査タイプ:高感度プロダクトイオン(Enhanced product ion(EPI))
極性:正
走査モード:プロファイル
イオン源:Turbo V(Applied Biosystems社)
プリカーサー:496.20Da
Q1の分解能:ユニット
走査速度:10000Da/秒
Q0でのトラッピング:無
Q3での線形イオントラップ充填時間:1.00ミリ秒
動的充填:アクティブ
TIC標的 EMS走査:10.00×107カウント
TIC標的:10.00×107カウント
最大充填時間:250.000ミリ秒
最小充填時間:0.050ミリ秒
初期設定充填時間:1.000ミリ秒
Q3入力電圧:8.00V
Q3でのイオントラップ走査増分:0.12Da
走査開始質量(Da):200.00Da
走査終了質量(Da):667.01Da
時間(秒):0.0467秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):2.19
トラッピング無線周波数振幅(終了):3.82
イオントラップ出力電圧(開始):−149.35V
イオントラップ出力電圧(終了):−125.68V
走査開始質量(Da):667.01Da
走査終了質量(Da):1000Da
時間(秒):0.0333秒
トラッピング無線周波数振幅(開始):3.82
トラッピング無線周波数振幅(終了):4.99
イオントラップ出力電圧(開始):−125.68V
イオントラップ出力電圧(終了):−108.80V
カーテンガス:30.00psi
コーン電圧:5500.00V
源温度:常温
噴霧ガス:18.00psi
加熱ガス:常温
衝突セル充填:高
クラスタ分離電位:100.00V
Q0前の入力電位:10.00V
衝突エネルギー:5〜60eV
噴霧ガス:35.00
クラスタ分離電位:80.00
Q0前の入力電位:3.00
プロリンを2個有し、そのうち1個は2番目にあるTp435タンパク質のプロテオタイピックペプチドSAPSPLTYR(配列番号53)の断片化を、最も強度の強いフラグメントイオン、又はプロリンを有する一価型フラグメントイオン、又は同イオンの二価型のいずれかを一次イオンとして選択することにより比較した。
最も強度の強い一価一次イオンのMS3の場合:
走査タイプ:MS3
極性:正
走査モード:プロファイル
イオン源:Turbo V(Applied Biosystems社)
プリカーサー:496.30Da
一次イオン:649.30Da
Q1の分解能:ユニット
走査速度:10000Da/秒
Q0でのトラッピング:有
Q3での線形イオントラップ充填時間:150.00ミリ秒
動的充填:無
断片化:有
励起時間:25.00ミリ秒
Q3入力電圧:8.00V
Q3でのイオントラップ走査増分:0.12Da
走査開始質量(Da):250.00Da
走査終了質量(Da):640.00Da
トラッピング無線周波数振幅(開始):3.08トラッピング無線周波数振幅(終了):4.36
イオントラップ出力電圧(開始):−144.99Vイオントラップ出力電圧(終了):−122.19Vカーテンガス:20.00psi
コーン電圧:5500.00V
源温度:常温
噴霧ガス:35.00psi
加熱ガス:常温
衝突セル充填:高
クラスタ分離電位:110.00V
Q0前の入力電位:10.00V
衝突エネルギー:24eV
励起エネルギー:0.11eV
走査タイプ:MS3
極性:正
走査モード:プロファイル
イオン源:Turbo V(Applied Biosystems社)
プリカーサー:496.30Da
一次イオン:833.40Da
Q1の分解能:ユニット
走査速度:10000Da/秒
Q0でのトラッピング:有
Q3での線形イオントラップ充填時間:150.00ミリ秒
動的充填:無
断片化:有
励起時間:25.00ミリ秒
Q3入力電圧:8.00V
Q3でのイオントラップ走査増分:0.12Da
走査開始質量(Da):300.00Da
走査終了質量(Da):820.00Da
トラッピング無線周波数振幅(開始):3.24
トラッピング無線周波数振幅(終了):4.95
イオントラップ出力電圧(開始):−142.06V
イオントラップ出力電圧(終了):−111.66V
カーテンガス:20.00psi
コーン電圧:5500.00V
源温度:常温
噴霧ガス:35.00psi
加熱ガス:常温
衝突セル充填:高
クラスタ分離電位:110.00V
Q0前の入力電位:10.00V
衝突エネルギー:24eV
励起エネルギー:0.14eV
走査タイプ:MS3
極性:正
走査モード:プロファイル
イオン源:Turbo V(Applied Biosystems社)
プリカーサー:496.30Da
一次イオン:417.50Da
Q1の分解能:ユニット
走査速度:10000Da/秒
Q0でのトラッピング:有
Q3での線形イオントラップ充填時間:150.00ミリ秒
動的充填:無
断片化:有
励起時間:25.00ミリ秒
Q3入力電圧:8.00V
Q3でのイオントラップ走査増分:0.12Da
走査開始質量(Da):300.00Da
走査終了質量(Da):850.00Da
トラッピング無線周波数振幅(開始):3.24
トラッピング無線周波数振幅(終了):5.05
イオントラップ出力電圧(開始):−142.06V
イオントラップ出力電圧(終了):−109.91V
カーテンガス:20.00psi
コーン電圧:5500.00V
源温度:常温
噴霧ガス:35.00psi
加熱ガス:常温
衝突セル充填:高
クラスタ分離電位:110.00V
Q0前の入力電位:10.00V
衝突エネルギー:25eV
励起エネルギー:0.12eV
Claims (13)
- サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、
a)ペプチドを生成するために前記サンプルを処理する工程と、
b)前記標的タンパク質から生成した少なくとも1つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって定量分析する工程とを含み、
前記質量分析法では、
i)前記プロテオタイピックペプチドをイオン化してプリカーサーイオンを生成し、前記プリカーサーイオンをその質量m/zに基づいてフィルタリングし、目的とする前記標的タンパク質に応じて所定の質量(m/z)1のプリカーサーイオンを選択し、
ii)その選択されたプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへと断片化し、
iii)その生成した一次フラグメントイオンをその質量m/zに基づいてフィルタリングし、目的とする前記標的タンパク質に応じて所定の質量(m/z)2の一次フラグメントイオンを選択し、
iv)その選択された一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化し、
v)前記二次フラグメントイオンの少なくとも一部を検出し、一連の定量的測定値を得、
vi)二次フラグメントイオンに関する少なくとも1つの定量的測定値を選択し、前記生成したプロテオタイピックペプチドの量及び前記サンプル中に存在する前記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、
選択された前記質量(m/z)2の一次フラグメントイオンは、プロリン又はヒスチジンを1番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法。 - 選択された前記質量(m/z)1のプリカーサーイオンは、アミノ酸数nが6から15であり、且つ、少なくとも1個のプロリンを2番目からn−2番目に、及び/又は、少なくとも1個のヒスチジンを1番目からn−2番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 選択された前記質量(m/z)1のプリカーサーイオンは少なくとも、2個のプロリン、又は、1個のプロリンと1個のヒスチジンとを含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記生成したペプチドの質量分析による定量分析の前に、工程a)で生成した前記ペプチドのクロマトグラフィー又は電気泳動による分離を行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーによる分離は、逆相クロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記生成したペプチドの質量分析による定量分析は、三連四重極を備えた質量分析計を用いて行うことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生成したペプチドの質量分析による定量分析は、イオントラップを備えた質量分析計を用いて行うことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルの処理は、プロテアーゼ酵素、例えばトリプシン等による消化によって行うことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程v)において、前記二次フラグメントイオンの少なくとも一部によって誘導される電流の強度を時間の関数として検出し、所定期間に得られたシグナルを、存在する各種イオンの質量m/zに応じた質量スペクトルに分解し、前記所定期間に存在する検出された二次フラグメントイオンそれぞれに関する質量ピークを得、選択された少なくとも1つの二次フラグメントイオンの電流に相当するシグナルを再構成し、その相当する測定電流の強度を、工程vi)で選択される前記定量的測定値とすることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程vi)において、前記所定期間で最大のピークm/zを有する二次フラグメントイオンに関する定量的測定値を選択することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 工程vi)において、前記相関付けは、少なくとも2つの定量的測定値の合計値に基づいて行い、前記少なくとも2つの定量的測定値はそれぞれ、前記所定期間で最大のピークm/zを有する二次フラグメントイオンに関するものであることを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
- 工程vi)で行う前記相関付けは、較正曲線を用いて行うことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程vi)で行う前記相関付けは、重ペプチドを用いた内部較正によって行うことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
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