FR3103197A1 - Determination par spectrometrie de masse de la sensibilite ou de la resistance de bacteries a un antibiotique - Google Patents
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Abstract
« DETERMINATION PAR SPECTROMETRIE DE MASSE DE LA SENSIBILITE OU DE LA RESISTANCE DE BACTERIES A UN ANTIBIOTIQUE » bioMérieux Procédé pour déterminer la sensibilité ou de la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : mise en contact d’un échantillon comprenant ladite bactérie avec ledit au moins un antibiotique, ledit antibiotique induisant la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique et provoquant la libération des composés intracellulaires de ladite bactérie lorsque celle-ci est dite « sensible » audit au moins un antibiotique, incubation dudit échantillon avec ledit au moins un antibiotique, purification dudit échantillon par élimination des bactéries intacts et des débris cellulaires, analyse de l’échantillon purifié par spectrométrie de masse, détection de la présence ou de l’absence d’au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de ladite bactérie, et détermination de la sensibilité ou de la résistance de ladite population bactérienne au dit antibiotique.
Description
La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et concerne, plus particulièrement, la détermination par spectrométrie de masse de la sensibilité ou de la résistance de bactéries à un antibiotique induisant la rupture de sa paroi et/ou de sa membrane cytoplasmique.
Au XIXesiècle, la découverte de l’existence des microorganismes et de leur rôle dans les maladies infectieuses a permis d’envisager leur traitement. La lutte antibactérienne a démarré avec la mise au point de l’arsphénamine en 1907, qui fut utilisée avec succès pour traiter la syphilis. C’est toutefois la découverte de la pénicilline, suivie de nombreux autres antibiotiques, qui a mené à une démocratisation de leur usage. Les antibiotiques ont permis de sauver la vie et d’améliorer la santé des patients et constituent assurément l’un des plus grands succès de la médecine moderne.
L’efficacité remarquable des antibiotiques a motivé leur utilisation massive et répétée en santé humaine et animale. Ainsi ils ont malheureusement été victimes de leur succès : leur administration répétée et parfois abusive a engendré l’émergence de souches de bactéries qui leur résistent. En effet dans une population de bactéries, il peut naturellement exister une fraction qui résiste partiellement ou totalement à l’action de l’antibiotique grâce à différents mécanismes. Ainsi, lorsque l’on soumet les bactéries à un antibiotique, on détruit celles qui y sont sensibles, et il ne reste que les bactéries ayant survécu, qui peuvent proliférer. L’application d’antibiotiques constitue une pression de sélection favorisant les bactéries résistantes. Les bactéries peuvent obtenir leur capacité à résister à un antibiotique donné spontanément par mutations génétiques, mais aussi l’acquérir par la transmission de fragments d’ADN de bactérie à bactérie, ce qui accélère la propagation des résistances.
Ponctuelles au départ, ces résistances sont devenues massives et préoccupantes. Certaines souches sont multirésistantes, c’est-à-dire résistantes à plusieurs antibiotiques. D’autres sont même devenues toto-résistantes, c’est-à-dire résistantes à quasiment tous les antibiotiques disponibles. Ce phénomène, encore rare en France mais en augmentation constante, place les médecins dans une impasse thérapeutique en ne disposant plus d’aucune solution pour lutter contre l’infection.
Selon l’Organisation mondiale de la santé, « la résistance aux antibiotiques constitue aujourd’hui l’une des plus graves menaces pesant sur la santé mondiale ». Due au mauvais usage de ces médicaments, l’antibiorésistance serait à l’origine de 12 500 décès par an en France et pourrait devenir la première cause de mortalité dans le monde en 2050.
Par ailleurs, il est important de noter qu’un traitement à l’aide d’un antibiotique n’est pas toujours un acte anodin pour le patient. En effet, les antibiotiques comportent quelques effets indésirables, variables selon les molécules. La plupart sont bénins, mais quelques-uns peuvent être sérieux, voire graves. Ainsi certains antibiotiques peuvent accroitre la morbidité, voir la mortalité, des malades du fait d’effets secondaires indésirables, notamment neurotoxique et néphrotoxiques (Poirel Let al., 2017). C’est notamment le cas de certains antibiotiques agissant sur la paroi bactérienne et/ou la membrane plasmique de certaines bactéries. La colistine, par exemple, antibiotique de la famille des polymyxines agissant sur la membrane cytoplasmique bactérienne, se fixe à la surface des membranes des cellules tubulaires du néphron, ce qui se traduit par une néphrite interstitielle albuminurique. La colistine a également un effet de blocage neuro-musculaire en bloquant la libération pré-synaptique de l’acétyl-choline et en réduisant la sensibilité des récepteurs post-synaptiques (Spapen, 2011).
Ces effets notamment les effets neurotoxiques doivent particulièrement être surveillés, notamment lors de traitement à haute dose. Ainsi ces antibiotiques sont réservés à des cas extrêmes, comme lorsque les bactéries sont résistantes à tous les autres antibiotiques, et à l'usage topique, tel que le traitement local des infections de la peau, des muqueuses, des yeux ou des oreilles. Dans le cas d'une otite, il faut avoir à l'esprit que l'administration d’une polymyxine, sur un tympan perforé peut entrainer une toxicité cochléaire et vestibulaire irréversible.
Pour toutes les raisons invoquées ci-dessus, les antibiotiques ne doivent être utilisés que si la ou les bactéries pathogènes y sont sensibles et pour certains d’entre eux uniquement réservés aux traitements de dernier recours.
Dans ce contexte, la détermination rapide de la sensibilité ou de la résistance d’une bactérie identifiée à un antibiotique est indispensable, de préférence avant d’engager un traitement, ou à défaut le plus tôt possible.
A l’heure actuelle le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) et l’European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) recommandent conjointement la méthode phénotypique de microdilution en bouillon, ou broth micro-dilution (BDM), notamment pour la détermination de la résistance à la polymyxine, antibiotique agissant au niveau de la membrane cytoplasmique. Cette méthode peut être considérée comme la méthode de référence, néanmoins elle est longue, assez lourde à mettre en œuvre et n’est pas adaptée aux contraintes des laboratoires de microbiologie clinique (Poirel Let al., 2017). De plus des résultats non reproductibles et non interprétables ont été décrits pour la détermination de la sensibilité de certains antibiotiques agissant sur la membrane cytoplasmique, notamment la colistine, probablement dus au phénomène d’hétérorésistance à la colistine (Landman Det al., 2013). Enfin, les souches hébergeant un plasmide conférant une résistance plasmidique ne sont pas toujours détectées.
Les autres méthodes classiques, incluant la dilution en agar ou encore la diffusion à partir de disque ou de gradient, ne sont explicitement pas recommandé par le CLSI et l’ECAST. Ceci peut s’expliquer par les propriétés polycationiques de certains antibiotiques qui favorisent leur adsorption sur les surfaces et leur capacité à former des micelles qui peinent à diffuser correctement dans les géloses (Hindler JAet al., 2013). En outre le phénomène d’hétérorésistance semble compliquer l’utilisation de ces méthodes (Landman Det al., 2013).
D’autres méthodes ont également été proposées en remplacement des méthodes phénotypiques, notamment dans la demande WO 2015/48696. Cette demande décrit un procédé pour déterminer la sensibilité par mise en contact avec un antibiotique, à une concentration proche de la concentration minimale inhibitrice (CMI), suivi d’une lyse, mécanique ou chimique, puis d’une détermination du taux de lyse. La sensibilité est établie en fonction de la comparaison de ce taux de lyse à une valeur seuil. Le taux de lyse est notamment déterminé à l’aide du marquage des composants intracellulaires présents en dehors de la cellule bactérienne lysée. Ainsi sont proposées l’utilisation de la coloration au bleu de Coomassie, la mesure de la luminescence de l’ATP ou encore l’utilisation de sondes peptidiques d’acide nucléique (PNA) avec une étiquette fluorescente qui s’hybrident avec des acides nucléiques.
Néanmoins, ces méthodes nécessitent, en plus de l’utilisation d’un antibiotique, de conditions lysant les parois bactériennes à l’aide notamment d’un détergent. Or l’utilisation de détergents est considérée comme incompatible avec la spectrométrie de masse MALDI-TOF. En effet, les détergents génèrent des ions qui masquent le signal des protéines. De plus, les bactéries ont des parois avec des structures biochimiques pouvant changer d’une espèce à l’autre. De ce fait, différentes espèces peuvent être plus ou moins résistantes aux conditions de lyse et le choix de ces conditions de lyse peut s’avérer délicat pour éviter les résultats faussement négatifs ou faussement positifs.
Des méthodes de détection de mécanismes de résistance par MALDI-TOF après mise en contact avec un antibiotique et sans culture sont connues. Notamment dans les demandes WO 2018/099500 et WO 2011/154517, déposées par la société Bruker Daltonik GMBH, où l’hydrolyse des β-lactamines par action des β-lactamases est détectée. Dans ces demandes, une modification de la masse de l’antibiotique est détectée après réaction avec les β-lactamases de l’échantillon bactérien. Ces méthodes nécessitent la mesure des taux d’antibiotique actif et hydrolysé après un certain temps d’action des β-lactamases. Ce temps peut être d’une à 2 heures pour une β-lactamase comme KPC, mais doit généralement être beaucoup plus long pour des β-lactamases moins actives ou moins abondantes dans la cellule (Mirandeet al., 2015). Les protéines bactériennes ne sont pas directement observées dans ces méthodes. La lyse bactérienne sous l’action de l’antibiotique n’est pas recherchée.
De même, des procédés de détection de la résistance en MALDI-TOF après mise en culture des microorganismes en présence d’antibiotiques sont connus et sont décrits par exemple dans les demandes US 2008/009029, WO 2014/187517 et EP2801825. Lorsque le germe est résistant à l’antibiotique, ces procédés mesurent une augmentation de la biomasse bactérienne, ou une altération du paterne protéique bactérien, au cours de la culture. Ces procédés nécessitent donc un temps de culture suffisamment long pour s’assurer que les bactéries ont répondu à l’action de l’antibiotique, soit en se multipliant après éventuellement un temps de latence (microorganismes résistants), soit en ne se divisant plus (microorganismes sensibles).
Dans ce contexte, l’objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détermination de la sensibilité ou de la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, qui permette de palier les inconvénients des procédés de l’art antérieur, à savoir fournir un procédé peu coûteux, sans utilisation de détergeant, sans réactifs spécifiques à chaque espèce, donnant un résultat en un temps court, inférieur à une heure, et utilisable en clinique de routine, sans nécessiter un personnel hautement qualifié.
A cette fin, l’invention propose un nouveau procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact d’un échantillon comprenant ladite bactérie avec ledit au moins un antibiotique, ledit antibiotique induisant la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique et provoquant la libération des composés intracellulaires de ladite bactérie lorsque celle-ci est dite «sensible» audit au moins un antibiotique,
- incubation dudit échantillon avec ledit au moins un antibiotique,
- purification dudit échantillon par élimination des bactéries intacts et des débris cellulaires,
- analyse de l’échantillon purifié par spectrométrie de masse,
- détection de la présence ou de l’absence d’au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de ladite bactérie,
- détermination de la sensibilité ou de la résistance de ladite population bactérienne au dit antibiotique.
Dans le cadre du procédé de l’invention, l’échantillon pourra provenir de différentes sources. A titre d'exemples, nous pouvons citer les échantillons d'origine biologique, notamment animale ou humaine. Un tel échantillon peut correspondre à un prélèvement de fluide biologique, du type sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, à un prélèvement tissulaire ou à des cellules isolées. Ce prélèvement pourra être utilisé tel quel, ou sera, de préférence, soumis préalablement à sa mise en contact avec l’antibiotique, à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d'extraction ou de purification selon des méthodes connues de l'homme du métier. Néanmoins, une telle préparation ne peut pas correspondre à une étape de lyse qui entraine la désintégration des micro-organismes et une perte de leur contenu avant la mise en contact avec l’antibiotique. L’échantillon pourra être utilisé sous la forme d'un inoculum.
Le plus souvent, l’échantillon pourra au préalable avoir été mis en culture dans un bouillon ou sur une gélose de manière à l'enrichir en bactérie. De tels milieux, gélosés ou en bouillon, sont bien connus de l'homme de l'art.
L’échantillon, comprendra, de préférence, une seule espèce bactérienne. Il n'est cependant pas exclu d’utiliser un échantillon comprenant plusieurs bactéries. Dans ce cas, il sera préférable que les bactéries soient connues pour être susceptibles de développer des mécanismes de résistance différents, de manière à savoir lequel présenterait la résistance qui serait identifiée.
Les bactéries qui peuvent être caractérisées par le procédé de l’invention sont toutes les bactéries, pathogènes ou non, rencontrées tant dans l’industrie que dans la clinique.
Au sens de la présente invention, le terme bactérie recouvre les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif.
Avantageusement la bactérie est une bactérie à Gram négatif, préférentiellement choisie parmi les espèces et sous-espèces suivantes:Escherichia c oli,Acinetobacter b aumannii,Klebsiella p neumoniae,Acinetobacter haemolyticus,Acinetobacter junii,Cit r obacter freundii,Enterobacter asburiae,Enterobacter cloacae,Pseudomonas fluorescens,Salmonella enteriticasérotype Enteritidis,Salmonella enteriticasérotype Paratyphi B variant Java,Salmonella enteriticasérotype Agona,Salmonella enteriticasérotype Enteritidis,Salmonella enteriticasérotype Haifa,Salmonella enteriticasérotype Newport etPseudomonas aeruginosa.
Par sensibilité d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, on entend la capacité de cet antibiotique à tuer ou inhiber suffisamment la croissance de cette bactérie.
Par détermination de la sensibilité en entend détermination de la susceptibilité d’une bactérie à être tuer ou dont la croissance est inhibée par un antibiotique.
Par résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, on entend un phénomène selon lequel la bactérie conserve tout ou partie de sa viabilité, de sa croissance ou de sa reproduction, quand elle est exposée à une concentration d'antibiotique qui est reconnue comme étant efficace vis-à-vis de cette bactérie en l'absence de résistance. Cette résistance peut être acquise par une ou plusieurs souches d’une espèce bactérienne naturellement sensible à cet antibiotique. Cette résistance peut également être innée ou naturelle.
Dans le cadre de la présente invention, la résistance aux antibiotiques peut être une résistance chromosomique et/ou extra-chromosomique, également appelé plasmidique.
La génétique bactérienne ayant trait aux mécanismes de résistance aux antibiotiques est largement décrite dans la littérature notamment dans l’ouvrage de référenceANTIBIOGRAMME(P. Courvalin et R.Leclercq, 2012, 3eEdition,Chapitre 3. GENETIQUE DE LA RESISTANCE).
Par détermination de la résistance à au moins un antibiotique, on entend la détermination de la capacité d’une bactérie à se multiplier lorsqu’elle est exposée à un antibiotique auquel elle est naturellement sensible.
Le procédé objet de la présente invention est également applicable aux souches bactériennes qui expriment une hétérorésistance, c’est-à-dire que seule une partie, minoritaire ou non, de la population d’un clone bactérien exprime cette résistance.
Par antibiotique on entend toute substance chimique, naturelle ou synthétique, qui a une action spécifique sur les bactéries.
Dans le cadre de la présente invention, l’antibiotique induit la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique provoquant ainsi la libération des composés intracellulaires de la bactérie lorsque celle-ci est sensible à cet antibiotique. Les antibiotiques induisant la rupture de la paroi bactérienne et ceux induisant la rupture de la membrane cytoplasmique se distinguent par leur mode d’action sur les bactéries.
Parmi les antibiotiques agissant sur la paroi bactérienne, il y a ceux induisant l’inhibition de la synthèse de précurseurs de la paroi, ceux induisant l’inhibition du transfert des précurseurs de la paroi sur un lipide porteur, ceci permettant normalement leur transport à travers la membrane plasmique et ceux induisant l’inhibition de l'insertion des unités glycaniques, précurseurs de la paroi, et de la transpeptidation.
Le blocage de la synthèse de la paroi fragilise fortement l'enveloppe externe des bactéries, qui deviennent très sensibles à des stress extérieurs (pression osmotique, température, stress mécanique) induisant la lyse cellulaire et provoquant ainsi la libération des composés intracellulaires.
A titre d’exemples d’antibiotiques induisant l’inhibition de la synthèse de précurseurs de la paroi, nous pouvons citer la D-cyclosérine ou encore la fosfomycine.
A titre d’exemple d’antibiotique inhibant le transfert des précurseurs de la paroi sur un lipide porteur nous pouvons citer la bacitracine.
A titre d’exemples d’antibiotiques agissant sur l'insertion des unités glycaniques, précurseurs de la paroi, et de la transpeptidation, nous pouvons citer les β-lactamines, qui inhibent la transpeptidase intervenant dans la synthèse de la paroi ou encore les glycopeptides, qui se lient à un intermédiaire de synthèse du peptidoglycane.
L'existence d'une membrane cytoplasmique intacte est nécessaire à la survie bactérienne. Son rôle est double, d'une part elle permet de séquestrer métabolites et ions nécessaires à l'intérieur du cytoplasme, d'autre part, elle permet de maintenir un gradient de protons entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule, généré par la chaîne respiratoire et le cycle de Krebs et qui permet le stockage de l'énergie cellulaire. Ce gradient de protons alimente l'ATP synthase qui fabrique l'ATP. Toute perturbation de l'imperméabilité de la membrane rompt ces confinements, l'énergie chimiosmotique est dissipée et le contenu du cytoplasme fuit dans le milieu extracellulaire. Il existe un certain nombre de molécules antibiotiques qui agissent sur la membrane cytoplasmique des cellules, soit en agissant comme des détergents qui désorganisent les lipides, soit en formant un pore dans la membrane cytoplasmique qui va provoquer la libération des composés cellulaires.
A titre d’exemples d’antibiotiques agissant au niveau de la membrane cytoplasmique, nous pouvons citer les polymyxines ou encore gramicidine. Les polymyxines agissent comme des détergents cationiques : grâce à leur caractère amphipathique, elles pénètrent dans la cellule bactérienne et s'insèrent parmi les phospholipides de la paroi, perturbant ainsi la perméabilité membranaire. La gramicidine est un peptide qui s'insère dans la membrane en formant un pore cylindrique permettant la fuite des cations.
Avantageusement, l’antibiotique est choisi parmi les polymyxines, les β-lactamines, les aminosides et les glycopeptides, préférentiellement l’antibiotique est une polymyxine et est choisi parmi la colistine et la polymyxine B.
Avantageusement, et selon l’invention, l’antibiotique présente une concentration comprise entre deux fois la concentration minimale inhibitrice et dix fois la concentration minimale inhibitrice pour la population bactérienne étudiée.
Dans un mode de réalisation particulier, l’antibiotique présente une concentration au moins dix fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique pour la population bactérienne étudiée. De manière préférentielle, l’antibiotique présente une concentration au moins cent fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique pour la population bactérienne étudiée. Et encore plus préférentiellement, l’antibiotique présente une concentration au moins mille fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique pour la population bactérienne étudiée.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, est la plus faible concentration d’antibiotiques capable d’inhiberin vitrotoute culture visible de la souche étudiée à une température donnée et pendant une période de temps définie. Cette valeur caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique sur une bactérie. La CMI est spécifique d’un couple antibiotique/bactérie, chaque souche ayant sa propre valeur, en fonction des résistances naturelles et/ou acquises pour la molécule testée.
Avantageusement, en plus de l’antibiotique, un composé connu pour accélérer la réaction enzymatique mise en œuvre dans le mécanisme de résistance considéré peut être également mis en contact avec l’échantillon. Ce composé peut par exemple être du zinc, sous la forme ZnCl2ou sulfate de zinc notamment, qui est un co-facteur important pour l'activité des métallo-β-lactamases. Ce composé peut être ajouté en combinaison avec l'antibiotique ou à tout autre moment dans la préparation de l’échantillon.
Dans le cadre de la présente invention, suite à l’étape de mise en contact de l’échantillon avec un antibiotique, le procédé comprend une étape d’incubation pour permettre l'interaction entre la ou les populations bactériennes et le ou les antibiotiques.
Les conditions et le temps d'incubation seront adaptés par l'homme du métier en fonction des populations à analyser. L’échantillon peut être laissé à une température appartenant, par exemple, à une gamme allant de 15 à 100°C, et notamment à température ambiante (22°C). Il est également possible de le transférer dans une enceinte thermostatée, par exemple à 37°C.
Avantageusement, et selon l’invention, la température d’incubation sera de 50°C ou environ 50°C.
Dans les conditions sélectionnées, le temps d'incubation devra être suffisant pour permettre la lyse des bactéries lorsque celles-ci sont sensibles et ainsi permettre la détection ultérieure par spectrométrie de masse de ses composés intracellulaires notamment de protéines intracellulaires qui auront été libérées. L'incubation est, le plus souvent, réalisée pendant une durée comprise entre 45 et 90 minutes, plus préférentiellement pendant au moins 20 minutes et encore plus préférentiellement pendant au moins au 5 minutes.
Il a été constaté, dans le cadre de l'invention, que la réalisation d'une telle étape d'incubation ne gênait en rien une identification ultérieure d’une bactérie, s’il était souhaité de réaliser une telle caractérisation, en plus de la détermination de la sensibilité ou de la résistance.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé de l’invention peut comprendre après l’étape d’incubation, une étape d’homogénéisation. Dans le cadre de la présente invention, si le procédé comprend une étape d’homogénéisation, cette étape ne doit pas induire la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique, notamment par cavitation. Cette étape pourra notamment être mise en œuvre par des techniques telle que la sonication, le vortex mécanique ou magnétique, à l’aide d’un mélangeur thermique, de type thermomixeur, si tant est que ces techniques n’induisent pas la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique.
Cette étape permet de mélanger intimement l’antibiotique et le microorganisme à analyser et de réduire le temps d’incubation nécessaire à la diffusion de l’antibiotique au voisinage de la paroi et/ou de la membrane.
Selon la présente invention la technique de sonication consiste en l’incubation de microtubes dans un bain à ultrason.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, la sonication se déroule pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, le vortexage mécanique se déroule pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, le vortexage magnétique se déroule pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes.
Dans le cadre de la présente invention, le procédé comprend une étape de purification dudit échantillon par élimination des bactéries intactes et des débris cellulaires. Cette étape consiste à conserver dans l’échantillon uniquement les composés intracellulaires libérés par la bactérie analysée lorsque celle-ci a été mise en contact avec un antibiotique auquel elle est sensible. Ainsi les bactéries non sensibles, qui seront intactes, et les débris cellulaires, suite à la lyse, sont éliminés de l’échantillon à analyser.
Avantageusement, cette étape de purification de l’échantillon pourra notamment être mis en œuvre par des techniques telle que la centrifugation, la filtration, la chromatographie ou encore l’électrophorèse.
Ces techniques séparatives peuvent être utilisées seules ou combinées entre elles pour obtenir une séparation multidimensionnelle. Par exemple, une chromatographie multidimensionnelle peut être utilisée en associant une séparation par chromatographie d’échange d’ions à une chromatographie en phase inverse, comme décrit par T. Fortinet al.(2009) ou H. Keshishianet al.(2007) pour l’analyse de peptides protéiques protéotypiques. Dans ces travaux, le milieu chromatographique peut être en colonne ou en cartouche (extraction en phase solide). La fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des peptides protéotypiques est caractéristique de chaque peptide et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner le ou les peptides protéotypiques à doser. Un tel fractionnement des peptides générés permet d’accroître la spécificité du dosage ultérieur par spectrométrie de masse. Il est également possible de travailler sur des protéines entières notamment par une technologie dite «t op-down» comme synthétisées par Donnellyet al., (Nature Methods, 2019). Dans ces travaux, la fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des protéines est caractéristique de chaque protéine et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner la ou les protéines à doser.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, la centrifugation se déroule pendant une durée comprise entre 1 et 60 minutes et à une vitesse de rotation comprise entre 300 g et 30000 g.
Dans le cadre de la présente invention, la filtration consiste en une filtration sur filtre de porosité comprise entre 0.02 et 0.22µm.
Dans le cadre de la présente invention, l’électrophorèse consiste en une technologie de séparation sous l’action d’un champ électrique. De nombreuses techniques et leurs variantes sont bien connues de l’homme du métier. A titre d’exemple et sans être limitatif, l’électrophorèse pourra être choisie parmi l’isotachophorèse, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sulfate Dodecyl de Sodium (SDS-PAGE), l’isoéléctrofocalisation (IEF), ou encore l’électrophorèse bi-dimensionnelle qui est une combinaison d’IEF et de SDS-PAGE.
Dans le cadre de la présente invention, la chromatographie consiste en une séparation de molécules présentes dans une phase mobile à l’aide d’une phase stationnaire. De nombreuses techniques et leurs variantes sont bien connues de l’homme du métier. A titre d’exemple et sans être limitatif, la chromatographie pourra être choisie parmi la chromatographie sur couche mince, la chromatographie sur cartouche d’extraction en phase solide (SPE) ou la chromatographie sur colonne de chromatographie. La cartouche ou la colonne pourra contenir un composé chromatographique pour assurer la sélectivité de la méthode selon les propriétés physicochimiques des molécules d’intérêt. A titre d’exemple et sans être limitatif, ce composé pourra permettre une chromatographie phase inverse (C18, C8 ou C4), une chromatographie d’exclusion sérique, une chromatographie d’échange d’ions ou une chromatographie d’affinité.
La spectrométrie de masse à mettre en œuvre dans le procédé de l’invention est largement connue de l’homme du métier comme un outil puissant pour l’analyse et la détection de différents types de molécules. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisée peut être détecté en fonction de sa masse moléculaire à l’aide d’un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à détecter, d’origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la détection, cette dernière comprend une étape d’ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires, dans le cas présent une étape d’ionisation des protéines d’au moins une bactérie, et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse.
Tous les spectromètres de masse comportent donc :
- une source d’ionisation destinée à ioniser les marqueurs présents dans l’échantillon à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces marqueurs;
- un analyseur de masse destiné à séparer les marqueurs ionisés, ou ions moléculaires, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z);
- un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci-après.
L’étape d’ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d’une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l’homme du métier. La source d'ionisation permet d’amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer, notamment:
- l'ionisation électronique (EI), l'ionisation chimique (CI) et la désorption-ionisation chimique (DCI);
- le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS);
- le couplage plasma inductif (ICP);
- l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI);
- l'électronébulisation ou électrospray (ESI);
- la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS);
- l’ionisation à pression atmosphérique, par exemple par désorption-ionisation par électronébulisation (DESI), nano désorption-ionisation par électronébulisation (nDESI), ionisation électrospray par ablation laser (LAESI), ionisation par évaporation MS rapide (REIMS), ou paperspray;
- l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART).
L’étape d’analyse de masse nécessaire pour la mise en œuvre d’une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l’homme du métier. L’analyseur de masse permet de séparer les molécules à doser, sous un état gazeux et ionisé, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Plusieurs types d’analyseur de masse existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), mobilité ionique, piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique ou électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique, ou encore l’orbitrap.
D'une manière générale, toute méthode de spectrométrie de masse adaptée à la détection d’au moins une molécule bactérienne peut être utilisée dans le cadre de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier, la spectrométrie de masse utilisée est la spectrométrie de masse par désorption-ionisation assistée par matrice et mesure du temps de vol (MALDI-TOF) qui présente notamment l'avantage d'une mise en œuvre relativement simple.
Une source d’ionisation MALDI permet d’ioniser des molécules, à partir d’un échantillon à l’état solide. Préalablement à son ionisation, l'échantillon est préférentiellement mis en contact avec une matrice.
La matrice utilisée contient avantageusement un composé choisi parmi l'acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique (i.e.acide sinapique ou acide sinapinique) ; l'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (i.e.alpha-cyano, alpha- matrice ou CHCA), l'acide férulique et l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (i.e.DHB).
Il existe plusieurs techniques de dépôt qui pourront être utilisées dans le cadre de l'invention pour mettre l'échantillon en contact avec la matrice ; dépôt sur une couche de matrice sèche, dit dépôt « couche mince », dépôt avec une goutte de matrice, dit dépôt « goutte séchée », dépôt sur une couche de matrice, puis rajout d'une goutte de matrice, dit dépôt « sandwich ».
Généralement, les matrices sont photosensibles et cristallisent en présence de l'échantillon tout en préservant l'intégrité des molécules. De telles matrices, notamment adaptées à la technique MALDI-TOF, sont bien connues et choisies parmi ; l'acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique; l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique, l'acide férulique et l'acide 2,5- dihydroxybenzoïque. De nombreux autres composés sont connus de l'homme du métier. Il existe même des matrices liquides qui ne cristallisent ni à pression atmosphérique, ni même sous vide (Tholey and Heinzie 2006). Tout autre composé qui permettra d'ioniser les molécules de l'échantillon sous l'effet d'un rayon laser pourra être utilisé. Notamment, la cible, c'est-à-dire le support sur lequel est déposé l'échantillon, pourra directement jouer le rôle de matrice, comme dans le cas des techniques « Nano-Assisted Laser Desorptiori/Ionization » (NALDI) ou « Desorption/Ionization On silicon » (DIOS). Le rayon laser pourra avoir tout type de longueur d'onde favorable à la sublimation ou à la vaporisation de la matrice. De préférence, la longueur d'onde ultraviolette ou même infrarouge sera utilisée.
Dans la matrice, un tel composé est mis en solution, le plus souvent dans l'eau, de préférence de qualité « ultrapure », ou dans un mélange eau/solvant(s) organique(s). A titre d'exemple de solvants organiques classiquement utilisés, on peut citer, l'acétone, l'acétonitrile, le méthanol ou l'éthanol. L'acide trifluoroacétique (TFA) peut parfois être ajouté. Un exemple de matrice est, par exemple, constituée de 20 mg/mL d'acide sinapique dans un mélange acétonitrile/eau/TFA de 50/50/0,1 (v/v). Le solvant organique permet aux molécules hydrophobes présentes dans l'échantillon de se dissoudre dans la solution, alors que l'eau permet la dissolution des molécules hydrophiles. La présence d'acide, tel que le TFA, favorise l'ionisation des molécules de l'échantillon par captation d'un proton (H+).
Le solvant présent dans la matrice est ensuite évaporé, par exemple, en laissant l’échantillon à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 30°C, et notamment à température ambiante (22°C) pendant quelques minutes, par exemple de 1 mn à 2h. Cette évaporation du solvant permet la cristallisation de la matrice dans laquelle l’échantillon est réparti. Ensuite, l’échantillon, placé au sein de la matrice cristallisée, est soumis à une ionisation douce. Cette ionisation sera, de préférence, réalisée avec un laser à azote émettant un rayon UV à 337.1 nm.
Lors de l’ionisation, l’échantillon est soumis à une excitation par laser. Les cristaux de la matrice absorbent alors l’énergie photonique et la restitution de cette énergie entraîne la sublimation de la matrice, la désorption de l’échantillon et l’apparition de matière dans un état qualifié de plasma. Au sein de ce plasma, il se produit des échanges de charges entre molécules de matrice et d’échantillon. Par exemple, des protons peuvent être arrachés à la matrice et transférés aux protéines et aux peptides de l’échantillon. Cette étape permet une ionisation douce des biomolécules sans induire leurs destructions. Les échantillons libèrent ainsi des ions de différentes tailles. Ces derniers sont alors accélérés par un champ électrique et volent librement dans un tube sous pression réduite, nommé tube de vol. La pression appliquée lors de l’ionisation et lors de l’accélération des ions générés appartient le plus souvent à la gamme allant de 10-6à 10-9millibar (mbar). Les ions les plus petits vont alors «voyager» plus rapidement que les ions plus gros permettant ainsi leurs séparations. A l’extrémité terminale du tube de vol est situé un détecteur. La durée de vol des ions est utilisée pour calculer leur masse. Ainsi, un spectre de masse est obtenu, représentant l’intensité du signal correspondant au nombre de molécules ionisées d’une même masse sur charge (m/z), en fonction du rapport m/z des molécules qui frappent le détecteur. Le rapport m/z est exprimé en Thomson (Th). Une fois introduite dans le spectromètre de masse, le spectre d’un échantillon est obtenu très rapidement, le plus souvent en moins d’une minute.
La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en œuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l’analyse est appelée MS/MS, ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l’analyse est appelée MS/MS/MS, ou MS3et plus généralement, lorsque n séparations MS successives sont réalisées, l’analyse est appelée MSn.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la spectrométrie de masse utilisée dans le procédé de l’invention est une spectrométrie de masse en tandem (MS2, MS3, MS4ou MS5), où plusieurs analyseurs de masse sont couplés entre eux. Par exemple, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement. Cette technologie permet une séparation successive dans deux analyseurs de masse, ce qui a notamment l'avantage de présenter une très bonne spécificité en sélectionnant un ion dans le premier analyseur, en le fragmentant et en analysant ses ions fils dans le deuxième analyseur.
Avantageusement, la séparation peut être réalisée dans un MALDI-TOF-TOF qui comporte deux analyseurs à temps de vol et la même simplicité d’utilisation qu’un MALDI-TOF.
Alternativement, la source d'ionisation peut être de tout type de source connue de l’homme du métier et l’analyseur de masse de tout type d’analyseur de masse connu de l’homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la spectrométrie de masse est en tandem et utilise une source électrospray et une combinaison d’au moins deux des analyseurs précédemment cités.
Notamment, l’ionisation peut être mise en œuvre comme suit: l’échantillon contenant les molécules cibles est introduit dans une source d'ionisation électrospray qui permet d’ioniser une molécule tout en la faisant passer d’un état liquide à un état gazeux. Les molécules sont ainsi transformées en ions moléculaires qui correspondent aux molécules initiales. Les ions moléculaires obtenus correspondent alors aux molécules initialement présentes dans l’échantillon liquide, avec en mode positif un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Par exemple, lorsque la molécule cible est une protéine en phase liquide, une ionisation grâce à une source électrospray fonctionnant en mode positif, conduit à des ions à l’état gazeux, avec un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et qui sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Ce type de source est particulièrement bien adapté, lorsque les molécules cibles, telles que des protéines, sont préalablement séparées par chromatographie liquide en phase inverse.
Parmi les techniques mettant en œuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM (Selected Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage d’une seule molécule cible, MRM (Multiple Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, ou bien PRM (Parallel Reaction Monitoring) sont des utilisations particulières de séparation MS2. De même le mode MRM3est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS (WO 2010136706). Les techniques SRM, MRM, PRM et MRM3sont des techniques de spectrométrie de masse ciblée, ce qui signifie que les ions de la molécule à détecter sont spécifiquement ciblés pour être analysés.
De même, les techniques DDA (data dependent acquisition) ou DIA (data independent acquisition) mettent en œuvre plusieurs séparations successives. Cependant, elles ne ciblent pas au moins un ion en particulier. A titre d’exemple, l’approche DDA consiste à i) acquérir un spectre MS, ii) sélectionner successivement chaque ion précurseur observé sur le spectre MS avec un signal intense, iii) fragmenter successivement chaque ion précurseur et acquérir son spectre MS/MS, iv) interroger des bases de données telles que SWISS-PROT ou NCBI, aux travers de logiciels tels que Mascot (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) ou SEQUEST (Thermo Scientific, Waltham, Etats-Unis d’Amérique), pour identifier la molécule ayant une forte probabilité de correspondre au spectre MS/MS observé. Cette méthode peut conduire à l’identification d’une molécule caractéristique d’un microorganisme sans pour autant cibler son analyse à priori. Les méthodes DIA ne comportent pas d’étape ii). Un ensemble d’ions est fragmenté et analysé à l’étape iii) indépendamment de leur intensité relative. Autrement dit, au lieu de fragmenter les ions un à un en fonction de l’acquisition réalisé en i), une fenêtre de masse comportant éventuellement plusieurs ions précurseurs est sélectionnée dans le premier analyseur de masse. Ces dits plusieurs ions précurseurs sont transférés dans le ou les analyseurs suivants pour être fragmentés et analysés simultanément. Cette technique est particulièrement avantageuse lors de l’utilisation d’un spectromètre de masse à haute résolution, capable d’identifier avec une grande précision l’ensemble des ions fragments correspondant respectivement aux différents ions précurseurs sélectionnés de façon concomitante.
Dans le cas d’une détection en mode MS simple, c’est le rapport masse/charge des ions moléculaires obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter.
Dans le cas d’une détection en mode MS/MS, essentiellement deux étapes sont ajoutées, par rapport à un dosage MS qui sont :
une fragmentation des ions moléculaires, alors appelés ions précurseurs, pour donner des ions fils, dit ions fragments, et
une séparation des ions fils dit ions fragments en fonction de leur masse/charge (m/z)2, le rapport (m/z)1correspondant au rapport (m/z) des ions précurseurs.
C’est alors le rapport masse/charge des ions fragments ainsi obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Par ion fragment, on entend un ion issu de l’ion précurseur, suite à une étape de fragmentation et dont le rapport masse sur charge m/z est différent de l’ion précurseur.
Les couples (m/z)1et (m/z)2sont baptisés transitions et sont représentatifs des ions caractéristiques à détecter.
Le choix des ions caractéristiques qui sont détectés pour être corrélés à la molécule cible est effectué classiquement par l’homme du métier de façon à conduire avantageusement aux dosages les plus sensibles, les plus spécifiques et les plus robustes possibles, en termes de reproductibilité et fiabilité.
Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l’un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôles à trappe ionique sont généralement utilisés (WO 2011/045544). Le principe du mode PRM se distingue des modes SRM et MRM par l’utilisation d’un dernier analyseur à haute résolution. Ce dernier permet de détecter en parallèle l’ensemble des ions fragments avec une résolution suffisante pour assurer la spécificité de la méthode (Peterson ACet al., 2012). Pour une analyse PRM, des dispositifs hybrides de type quadripôles et temps de vol (Q-TOF)ou de type trappe ionique et orbitrap, ou encore quadripôles et orbitrap sont généralement utilisés.
Dans le cas d’un dispositif quadripôles et orbitrap (Q1 q2 Orbitrap) utilisé en mode PRM, en vue du dosage ou de la détection d’une protéine cible, le premier quadripôle (Q1) permet de filtrer les ions moléculaires, caractéristiques de la protéine à doser, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Seuls les ions ayant le ratio masse/charge de la protéine recherchée, ratio appelé (m/z)1, sont transmis dans le deuxième quadripôle (q2) et jouent le rôle d’ions précurseurs pour la fragmentation ultérieure. L’analyseur q2 permet de fragmenter les ions de ratio masse/charge (m/z)1en ions fragments. La fragmentation est généralement obtenue par collision des ions précurseurs avec un gaz inerte, comme de l’azote ou de l’argon dans q2. Les ions fragments sont transmis dans l’orbitrap qui détermine leur ratio m/z. Les ions fragments ayant le ratio masse/charge (m/z)i2de fragments caractéristiques de la ièmeprotéine recherchée sont alors détectés, voire quantifiés.
Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, en relation avec la sélection de l’ion précurseur d’une part et de la sélection d’au moins un ion fragment d’autre part.
La spectrométrie de masse en mode SRM, MRM ou PRM est avantageuse pour la quantification dans la mesure où elle détecte de façon quantitative des ions fragments caractéristiques de la molécule à détecter, voir quantifier.
L’utilisation d’un procédé de détection par MS est avantageux car il peut être réalisé en quelques minutes et qu’il nécessite un spectromètre de masse avec un seul analyseur, c’est à dire un instrument moins complexe qu’un spectromètre de masse en tandem utilisé en MS/MS.
L’utilisation d’un procédé de détection par MS/MS est également avantageux car il permet de générer un fragment spécifique des molécules à détecter et ainsi d’apporter une grande spécificité au procédé selon l’invention.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la spectrométrie MS/MS est de la MRM, ce qui a pour avantage d’utiliser un temps de cycle d’analyse dans le spectromètre de masse de quelques dizaines de millisecondes, ce qui permet de détecter avec une grande sensibilité, et de façon multiplexée, un grand nombre de molécules différentes.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la spectrométrie MS/MS est de la PRM, ce qui a pour avantage d’utiliser plusieurs ions fragments pour caractériser la détection de la molécule cible.
Avantageusement, le procédé selon l’invention peut être mis en œuvre à l’aide d’un MALDI-TOF, comme décrit par Claydonet al.et par T. Krishnamurthy et P. Ross. L’analyse associe l’acquisition d’un spectre de masse et l’interprétation d’un logiciel expert. Elle est extrêmement simple et peut être effectuée en quelques minutes.
Le procédé selon l’invention peut également être mis en œuvre avec une source électrospray sur échantillon brut, comme décrit par S. Vaidyanathanet al.ou encore par R. Everleyet al.après séparation chromatographique. Différentes gammes de m/z permettent alors d’identifier les protéines caractéristiques des microorganismes à analyser. S. Vaidyanathanet al.ont utilisé une fenêtre entre 200 et 2000 Th et R. Everleyet al.une fenêtre entre 620 et 2450Th. Les spectres de masse peuvent également être déconvolués pour accéder à la masse des protéines indépendamment de leur état de charge. R. Everleyet al.ont ainsi exploité les masses entre environ 5 000 et 50000Da.
L’identification de bactéries, via la détection de leurs protéines présentes dans l’échantillon par MRM en mode ciblé, a été décrite par la demanderesse dans la demande WO2011/045544. L’identification en mode non ciblé a également été largement appliquée par de nombreuses équipes. A titre d’exemple, il est possible de citer les travaux de Manes N.et al.qui ont étudié le peptidome deSalmonelle enterica, ou les travaux de R. Nandakumaret al.ou de L. Hernychovaet al .qui ont étudié le protéome de bactéries après digestion des protéines avec de la trypsine.
Ainsi dans le cadre de la présente invention lorsqu’une population bactérienne est sensible à un antibiotique induisant la rupture de sa paroi bactérienne et/ou de sa membrane cytoplasmique et libérant ainsi ses composés intracellulaires, le spectre généré par spectrométrie de masse présentera au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de cette population bactérienne.
On entend dans le cadre de la présente invention par pic de protéine caractéristique d’une population bactérienne, un pic qui permet de distinguer une population bactérienne de tout autre type d’échantillon moléculaire.
A contrario, lorsqu’une population bactérienne est résistante à un antibiotique, ce dernier ne provoque pas la rupture de sa paroi bactérienne ni de sa membrane cytoplasmique et par conséquent ne libère pas de composés intracellulaires, ainsi le spectre généré par spectrométrie de masse ne présentera pas de pic de protéine caractéristique de cette population bactérienne.
Des spectres de référence obtenus par technologie de spectrométrie de masse, notamment le MALDI-TOF, pour une bactérie donnée correspondant à ses protéines majoritaires et caractéristiques, sont disponibles et enregistrés dans des bases de données disponibles avec les appareils commerciaux, et permettent, par comparaison, la détermination de la sensibilité de cette bactérie à l’antibiotique avec lequel elle a été mise en contact.
Avantageusement et selon l’invention, la au moins une protéine caractéristique est choisie parmi les protéines ribosomiques et les protéines de liaison à l'ADN.
De manière plus avantageuse, lorsque la bactérie estEscherichia Coli, la au moins une protéine caractéristique est choisie parmi la protéine de phase stationnaire induite associée au ribosome (Stationary-phase-induced ribosome-associated protein, SPIRAP), la protéine chaperonne de stress acide HdeB (Acid stress chaperone HdeB), les protéines ribosomiques 50S (50S ribosomal protein s) L29, L31, L32, L33 et L35.
De manière plus avantageuse, lorsque la bactérie estKlebsiella p neumoniae, la au moins une protéine caractéristique est choisie parmi la protéine de liaison à l’ADN H-NS (DNA binding protein H-NS), les protéines ribosomiques L29, L31, L34 et US9.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, suite à l’étape e) de détection de la présence ou de l’absence de pic de protéine caractéristique de ladite bactérie, le procédé comprend une étape de calcul du ratio entre l’intensité d’au moins un pic de protéine caractéristique de la bactérie et l’intensité d’au moins un pic caractéristique de l’antibiotique utilisé.
Dans le cadre du mode de réalisation décrit dans le paragraphe précédent, lorsqu’il y a plusieurs pics de protéines caractéristiques le calcul du ratio se fait avec la somme des intensités des pics de protéines caractéristiques de la bactérie. De manière identique, lorsqu’il y a plusieurs pics caractéristiques de la colistine le calcul du ratio se fait avec la somme des intensités des pics caractéristiques de l’antibiotique utilisé.
Dans le cadre du mode de réalisation décrit dans les deux paragraphes précédents, le procédé comprend après l’étape du calcul du ratio une étape de détermination de la sensibilité ou de la résistance de la population bactérienne à l’antibiotique en fonction du ratio obtenu et d’un seuil fixé pour chaque espèce. L’homme du métier, à l’aide de ses connaissances, saura parfaitement déterminer un seuil qui permette de distinguer une bactérie résistante d’une bactérie sensible.
De manière avantageuse, le procédé selon l’invention comprend en plus, une étape d’identification de la famille, du genre, ou, de préférence, de l'espèce d'une population bactérienne.
Le procédé de l'invention et ses avantages ressortiront de la suite de la présente description relatant divers exemples non limitatifs de mise en œuvre du procédé de l'invention. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :
Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention, sa mise en œuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
EXEMPLES
Profil MALDI-TOF de la colistine pure
La colistine (ou polymyxine E) est un antibiotique de la classe des polymyxine naturellement produits parPaenibacillus polymyxa subsp. colistinus(Benedict RGet al., 1947). Cinq classes de polymyxine (A, B, C, D, E) sont connues mais seules les polymyxine B et E (ou colistine) sont utilisés en thérapeutique (Dortet Let al., 2016).
Pour rappel, la colistine est un antibiotique de la famille des polymyxines qui agissent sur la membrane cytoplasmique bactérienne. Grâce à leur caractère amphipathique tout comme des détergents cationiques, elles vont pénétrer dans la cellule bactérienne et s'insèrent parmi les phospholipides de la paroi, perturbant ainsi la perméabilité membranaire.
La colistine est utilisée comme antibiotique de dernier recours en cas d’infection par une bactérie multi-résistante. C’est le cas lorsque des souches d’Enterobacteriaceae, dePseudomonas spp.ou d’Acinetobacter spp.résistent simultanément aux antibiotiques de la classe des Carbapénèmes, des Aminoglycosides et des Fluoroquinolones (Hancock RE, 1997). Ces phénomènes de multi-résistances augmentent de façon inquiétante dans certains pays, tels que la Grèce ou l’Italie, et oblige les médecins à prescrire de la colistine. Cet usage plus fréquent s’accompagne malheureusement de l’émergence de germes résistants à la colistine (Dortet Let al., 2016). Cette tendance est constatée tant chez les bactéries naturellement résistantes à la colistine, telle queSerratia,Morganella,ProteusouProvidencia, que chez des espèces habituellement sensibles mais ayant développé des mécanismes de résistance chromosomiques ou plasmidiques (Klebsiella,Escherichia,Salmonella,Enterobacter,Shigella, etc). Un gène plasmidique (mcr-1) conférant la résistance à la colistine par transmission horizontale a été pour la première fois décrit en Chine récemment (Liu Y-Yet al., 2016). Depuis sa diffusion a été documentée, ainsi que l’existence de plusieurs variants (ChenL et al., 2018), tant chez l’homme que chez les animaux. Ces observations inquiétantes font redouter une accélération de l’apparition de la résistance à la colistine (Dortet Let al., 2016).
La colistine de formule brute C52H98N16O13a une masse monoisotopique théorique de 1154.750 Da et une masse chimique moyenne théorique de 1155.434Da. Après ionisation avec un proton, elle est détectable en spectrométrie de masse MALDI-TOF sous forme d’un massif isotopique dont le premier pic (pic monoisotopique) à une masse de 1155.758 Da ou sous forme d’un massif non résolu avec un apex à 1156.442 Da. La possibilité de détecter le pic monoisotopique ou seulement l’apex du massif isotopique dépend de la résolution du spectromètre de masse. Les instruments à haute résolution peuvent généralement détecter le pic monoisotopique alors que les instruments à faible résolution se contentent de la détection de l’apex du massif isotopique.
Des expériences préalables ont été menées pour détecter la colistine avec un instrument VITEK®MS Plus, un instrument de type MALDI-TOF, commercialisé par la société bioMérieux. Ces expériences ont été réalisées en mettant en œuvre les étapes ci-dessous:
- 1 µl de sulfate de colistine (Sigma référence C4461) diluée à 10µg/ml en eau a été déposée sur une cible jetable (bioMérieux référence 410893),
- 1 µl de matrice HCCA (bioMérieux, référence 411071) a été déposé sur la colistine,
- séchage de la cible,
- introduction de la cible dans l’instrument, et
- analyse avec une ionisation en mode positif pour une plage de mesure de 2 à 20000 Th.
L’extraction pulsée a été optimisée pour une masse de 2000 Th et la puissance laser a été fixée à 85. Cent profils de dix tirs ont été cumulés pour former un spectre de masse. Les pics ont été détectés après soustraction de la ligne de base et lissage du signal.
LaF igure 1présente le spectre de masse obtenus sur la gamme de masse 100 et 4000 Th et montre un massif à 1156.46m/z et un autre massif à 1170.56m/z. Le premier correspond à la colistine native et le second correspond à la colistine méthylée (+14 Da). En effet la colistine comporte 4 fonctions amines susceptibles de se méthyler.
Le pic à 1178.68 m/z correspond aux ions colistine monochargés avec adduit de sodium (+22 Da) et le pic à 1192.70 m/z aux ions colistine méthylés monochargés avec adduit de sodium (14 + 22 = +36Da).
Ce travail permettra par la suite de distinguer les pics caractéristiques de la colistine des pics de protéines caractéristiques de la bactérie étudiée.
LaF igure 2est une observation du spectre sur la gamme de masse 2000-4500m/z. On observe quatre pics clairement définis, autour de 2283; 2987, 3439 et 4143 m/z. Ces pics correspondent à des polymères de colistine. L’écart de masse entre les pics à 2283 et 3439 m/z est de 1156 m/z, c’est-à-dire la masse de la colistine. Il en est de même pour l’écart entre les pics à 4143 et 2987 m/z.
Ce même profil de spectre a été obtenu (non illustré) pour toutes les concentrations de colistine testées (10, 5 et 2.5mg/ml) avec ou sans souches, sensible ou résistante, quel que soit le temps d’incubation (de 30min à 4h). Ces pics correspondent donc à des molécules issues de la solution de sulfate de colistine utilisée (Sigma référence C4461), non caractéristiques de l’échantillon bactérien.
Détermination de la sensibilité ou de la résistance
à la colistine
chez
Escherichia coli
en 4 heures
Cet essai a été réalisé en utilisant le procédé selon l’invention afin de déterminer la sensibilité ou la résistance à colistine de la bactérie à Gram négatifEscherichia coli. Cette bactérie, également appelée colibacille et abrégée enE. coli, est une bactérie intestinale (Gram négatif) des Mammifères, très commune chez l'être humain. Certaines souches d’E. colipeuvent être pathogènes, entraînant alors des gastro-entérites, infections urinaires, méningites, ou sepsis.E. coliest une espèce habituellement sensible à la colistine mais certaines souches sont connues pour avoir développé des mécanismes de résistance chromosomiques ou plasmidiques.
Dans le cadre de cet essai, deux souches ont été analysées, une souche d’E. colisensible à la colistine, elle sera nommée EC_S, et une souche résistante, qui sera nommée EC_R.
Cet essai a été réalisé en mettant en œuvre les étapes ci-dessous:
- préparation d’une suspension de souches EC_S et EC_R d’E. colià 1McFarland (McF) en eau (suspension medium, bioMérieux référence 70700),
- préparation d’une solution de sulfate de colistine (Sigma référence C4461) à la concentration 5mg/ml en eau pure (en tenant compte du titre de colistine indiqué par le fabriquant),
- mélange de 250 µl de chaque suspension avec 250µl de colistine pour obtenir une solution de microorganisme à 0.5 McF et à la concentration de 2.5 mg/ml de colistine,
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- incubation du mélange 4 heures à 37°C,
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- centrifugation à 4700 tour par minute (1500g) pendant une durée de 5minutes,
- dépôt de 1 µl du surnageant sur une cible jetable (bioMérieux référence 410893),
- dépôt sur la goute de surnageant de 1 µl de matrice HCCA (bioMérieux, référence 411071),
- analyse de l’échantillon par spectrométrie MALDI-TOF sur VITEK-MS Plus (bioMérieux) avec une méthode adaptée à la microbiologie, c’est-à-dire avec un mode d’ionisation positif et une gamme de masse de 2000 à 20000 Th.
- accumulation et comparaison des données avec les données contenues dans les bases de données pourE. coli,
- observation de la présence ou de l’absence de pics de protéines caractéristiques d’E. coli.
- détermination de la sensibilité à la colistine si des protéines caractéristiques d’E. colisont détectées ou de la résistance si aucune protéine d’E. colin’est détectée.
LaF igure 3présente le spectre de masse obtenu pour la souche EC_S. Dans la fenêtre de masse comprise entre 4 500 et 10 000 Th, on observe la présence de pics peu intenses différents des pics de colistine. Ces pics sont principalement à 4650.01, 4666.55, 6258.69, 6318.33, 6414.85, 7176.22, 7276.56 et 7871.90 m/z. Un massif mal résolu est également visible autour de 5370 m/z.
Les masses 6318.33, 7162.22, 7276.56 et 7871.90 correspondent respectivement aux pics 6316.14, 7158.68, 7274.39, et 7872.02 d’E. coliqui ont été identifiés comme correspondant respectivement aux protéines ribosomiques L32, L35, L29 et L31 (Arnold RJ and Reilly JP. 1999; Wilcox SK et al., 2001; Ryzhov V and Fenselau C, 2001; Jones JJet al., 2003; Kallow Wet al., 2010;Welker M and Moore ERB, 2011; Momo RAet al., 2013)
Ces protéines sont donc caractéristiques d’E. coli. Cette observation indique que des cellules bactériennes ont subi une rupture de leur membrane cytoplasmique provoquent la libération des protéines ribosomiques dans le surnageant au cours des 4h d’incubation à 37°C en présence de 2,5mg/ml de colistine. Ainsi le procédé selon l’invention permet de montrer que la souche EC_S est sensible à la colistine.
A noter que la concentration en colistine (2,5mg/ml) correspond à 1250 fois la concentration minimale inhibitrice (CMI) au-delà de laquelle une souche est considérée comme résistante.
LaF igure 4présente le spectre de masse obtenu pour la souche EC_R. Le massif à 5313 et les pics à 4649 et 4666 m/z sont toujours détectés, en revanche les protéines d’E. coliL32, L35, L29 et L31, caractérisées respectivement par les pics 6316.14, 7158.68, 7274.39, et 7872.02 m/z ne sont pas visibles. Aucune protéine bactérienne n’est donc détectable. La bactérie ne semble donc pas avoir subi de rupture de sa membrane cytoplasmique au cours d’une incubation de 4h à 37°C en présence de 2,5mg/ml de colistine, concentration très largement au-dessus de la CMI. Le procédé permet donc de montrer que la souche EC_R est résistante à la colistine.
Détermination de la sensibilité ou de la résistance
à la colistine
chez
Escherichia coli
en 30minutes à 37°C
Cet essai a été réalisé pour démontrer que le procédé de l’invention permettait de déterminer la sensibilité ou la résistance en 30 minutes.
Les souchesE. coliS et R16 sont analysées avec le même protocole que l’exemple II à l’exception de la durée d’incubation de 30 minutes à 37°C. La souche S est sensible à la colistine et la souche R16 est résistante à la colistine.
LaF igure 5 ,présente le spectre de masse obtenu pour la souche S. Ce spectre présente des pics intenses à 6257.2, 6318.7, 7275.4 et 7871.6 m/z. Ces pics sont respectivement caractéristiques des protéines ribosomiques L33, L32, L29 et L31 d’E. coli. La souche S a donc subi une rupture de sa membrane cytoplasmique lors d’une incubation de 30 min à 37°C en présence de 2.5mg/ml de colistine. Son caractère sensible à la colistine a donc été confirmé.
LaF igure 6 ,présente le spectre de masse obtenu pour la souche R16. Contrairement au spectre de la souche S (Figure 5), ce spectre ne présente aucun pic intense entre 6000 et 10000 m/z. Elle n’a donc pas été lysée lors d’une incubation de 30 min à 37°C en présence de 2.5mg/ml de colistine. Le procédé confirme la résistance de cette souche à la colistine.
Détermination de la sensibilité ou de la résistance
à la colistine
chez
Escherichia coli
en 30minutes à 50°C
Les mêmes souchesE. coliR16 et S sont analysées avec le même protocole que l’exemple III à l’exception d’une incubation à 50°C.
LaF igure 7présente le spectre de masse obtenu pour la souche S. La souche S présente clairement des pics intenses à 6256.4, 6316.9, 7274.1 et 7870.2 m/z. Ces pics sont respectivement caractéristiques des protéines ribosomiques L33, L32, L29 et L31. La membrane cytoplasmique de la souche S a donc été lysée lors d’une incubation de 30 min à 50°C en présence de 2.5mg/ml de colistine. La sensibilité à la colistine de la souche S est donc confirmée.
LaF igure 8présente le spectre de masse obtenu pour la souche R16. Ce spectre ne présente aucun pic intense entre 6000 et 10000m/z. Cette souche n’a donc pas été lysée lors d’une incubation de 30 min à 50°C en présence de 2.5mg/ml de colistine. La résistance à la colistine de cette souche est donc confirmée.
De façon inattendue, les pics des protéines L33, L32, L29 et L31 sont plus intenses après une incubation à 50°C qu’après une incubation à 37°C pour la souche sensible, alors qu’ils restent quasiment indétectables pour la souche résistante.
Détermination de la sensib
ilité ou de la résistance de différentes bactéries
à la colistine
Ces essais ont été réalisés avec le procédé de la présente invention pour déterminer la sensibilité ou la résistance de plusieurs bactéries de plusieurs souches différentes afin de démontrer la reproductibilité du procédé sur des bactéries et des souches différentes. Les essais ont été réalisés en mettant en œuvre les étapes ci-dessous:
- préparation d’une suspension de microorganisme à 2 McF en eau (suspension medium, bioMérieux référence 70700),
- préparation d’une solution de sulfate de colistine (Sigma référence C4461) à la concentration 2X en eau pure (en tenant compte du titre de colistine indiqué par le fabriquant). X = 2,5 mg/ml pourE. colietK. pnemoniae, et X = 20 µg/ml pourA. baumannii et P. aeruginosa.
- mélange de 200 µl de microorganismes en suspension et 200 µl de colistine 2X pour obtenir une solution de microorganismes à 1 McF et à la concentration X de colistine,
- réalisation en parallèle un témoin négatif en diluant la solution de microorganismes de l’étape 3 dans une solution d’eau pure (sans colistine).
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- incubation du mélange pendant une durée de 10 minutes à 50°C sous agitation à 1400 rotation par minute à l’aide d’un thermomixeur.
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- filtration avec un filtre de porosité 0,22 µm (Centricon, Merck-Millipore).
- dépôt de 1 µl du filtrat sur une cible jetable (bioMérieux référence 410893).
- dépôt de 1 µl de matrice HCCA sur le filtrat (bioMérieux, référence 411071).
- analyse l’échantillon par spectrométrie MALDI-TOF avec une méthode classique en microbiologie, c’est-à-dire avec un mode d’ionisation positif et une gamme de masse de 2000 à 20000 Th.
- accumulation et comparaison des données avec les données contenues dans les bases de données pour l’espèce étudiée,
- observation de la présence ou de l’absence de pics de protéines caractéristiques de l’espèce étudiée.
- détermination de la sensibilité à la colistine si des protéines caractéristiques de l’espèce étudiée sont détectées ou de la résistance si aucune protéine de l’espèce étudiée n’est détectée.
- validation du résultat de détermination si le témoin négatif ne présente pas de pics de protéines du microorganisme.
Comme présenté dans leTableau 1ci-dessous, différentes souches d’Escherichia coli(EC_S10, EC_S15, EC_R16, EC_R17) et deKlebsiella pnemoniae(KP_S10, KP_S15, KP_R9, KP_R16) ont été analysées avec le protocole décrit ci-dessus.
Afin de pouvoir évaluer l’efficacité du procédé selon l’invention, différentes souches ont été préalablement analysées par microdilution en bouillon afin de déterminer leur statut (sensible ou résistante). Cette méthode est considérée comme la méthode de référence par le CLSI et l’EUCAST.
Ainsi parmi les souches analysés certaines sont sensibles à la colistine et d’autres sont résistantes et parmi les souches résistantes certaines présentent une résistance chromosomique et d’autres une résistance plasmidique.
Les protéines caractéristiques de l’espèceKlebsiella pneumoniaesont la protéine de liaison à l’ADN H-NS (DNA binding protein H-NS), les protéines ribosomiques L29, L31, L34 et US9, la protéine de choc froid contenant un domaine CsbD (CsbD domain-containing protein), et les protéines non caractérisées de m/z 6290 et 8308. Ces protéines sont caractérisées respectivement par les pics de 7705 (DNA binding protein H-NS), 7274 (L29), 7743 (L31), 5381 (L34), 7384 (US9), 8309 (CsbD), plus ou moins 1000 parties par million (ppm). Les protéines hypothétiques sont quant à elles caractérisées par des pics 6290 et 7678, plus ou moins 1000 parties par million (ppm).
LesF igure s 9 et 10présentent les spectres de masse obtenus respectivement pour les souches d’E. coliet deK. pneumoniaeprésentées dans leTableau 1. Les spectres pour les souches EC_S10, EC_S15, KP_S10 et KP_S15 présentent des pics caractéristiques de leur espèce et sont donc sensibles à la colistine.A contrario, les souches EC_R16, EC_R17, KP_R9 et KP_R16 ne présentent pas de pics caractéristiques de leur espèce et sont donc résistantes à la colistine.
Les résultats obtenus par la méthode de référence (microdilution en bouillon) ont donc été confirmés par le procédé selon la présente invention. En effet à l’aide du procédé de l’invention le même statut a été obtenu par microdilution en bouillon pour chaque souche.
Toujours dans le but de montrer le but de montrer la reproductibilité du procédé selon l’invention, dans leTableau 2ci-dessous, figure différentes souches d’Acinetobacter baumannii(AB_S044, AB_S045, AB_S046, AB_R-E105) et dePseudomonas aeruginosa(PA_S062, PA_SE64, PA_RE66, PA_RE68) qui ont été analysées selon le protocole décrit ci-dessus.
De même que précédemment, les différentes souches ont été préalablement analysées par microdilution en bouillon afin de déterminer leur statut (sensible ou résistante).
[Tableau 2]:
Les souches d’A. baumannii(AB_S044, AB_S045, AB_S046, AB_R-E105), dePseudomonas aeruginosa(PA_S062, PA_SE64, PA_RE66, PA_RE68) sont analysées avec le protocole décrit dans l’exemple V. Ainsi elles sont incubées en présence de 20 µg/ml de colistine.
LaFigure 1 1présente les spectres de masse obtenus pour les souches d’A. baumanniiprésentées dans leTableau 2. Sur ces spectres les souches AB_S044, AB_S045, AB_S046 présentent des pics de protéines caractéristiques de leur espèce, notamment à environ 5748 et 5770 Th, et sont donc sensibles à la colistine. Inversement, la souche AB_R-E105 ne présente pas de pics protéines caractéristiques de son espèce et est donc résistante à la colistine.
LaFigure 1 2présente les spectres de masse obtenus pour les souches deP. aeruginosaprésentées dans leTableau 2. Sur ces spectres les souches PA_S062 et PA_SE64 présentent des pics caractéristiques de leur espèce, notamment à environ 5449, 5469, 5793 et 6975 Th, et sont donc sensibles à la colistine. Inversement, les souches PA_RE66 et PA_RE68 ne présentent pas de pics caractéristiques de leur espèce et sont donc résistantes à la colistine.
Comme précédemment, ces résultats montrent que le procédé selon l’invention permet de déterminer le statut de chaque souche. Ces résultats sont confirmés par la méthode dite de référence.
Calcul d’un ratio pour déterminer la sensibilité ou la résistance d’une bactérie vis-à-vis d’un antibiotique
Dans le cadre de cette exemple, les essais ont été réalisés avec le procédé de la présente invention pour déterminer la sensibilité ou la résistance de plusieurs bactéries de plusieurs souches tel que dans l’exemple V et comprenant les étapes suivantes:
- mesurer l’intensité de chaque pic observé,
- effectuer un ratio entre la somme des intensités des pics de protéines du microorganisme et au moins 1 pics de colistine.
- déterminer le statut résistant ou sensible à la colistine en fonction de la somme des ratios obtenue et d’un seuil fixé pour chaque espèce.
- un microorganisme résistant aura un ratio faible et un microorganisme sensible un ratio élevé.
Dans le cadre de la présente invention, le seuil est fixé de façon empirique par observation des résultats. L’homme du métier saura, à l’aide de ses connaissances, déterminer ce seuil sans difficulté. Dans les exemples qui vont suivre un mode détermination de ce seuil sera illustré.
Analyse des souches d’
E. coli
Dans un premier temps les mêmes souches d’Escherichia coli(EC_S10, EC_S15, EC_R16, EC_R17), utilisées précédemment, sont étudiées et les protéines caractéristiques de l’espèceEscherichia colisont analysées. Il s’agit des protéines suivantes: la protéine de phase stationnaire induite associée au ribosome (Stationary-phase-induced ribosome-associated protein, SPIRAP), la protéine chaperonne de stress acide HdeB (Acid stress chaperone HdeB) et les protéines ribosomiques 50S (50S ribosomal protein s), L29, L31 et L33.
LeTableau 3ci-dessous présente l’intensité du pic observé pour la colistine et pour chaque protéine caractéristique d’Escherichia coli.
[Tableau 3]:
Dans leTableau 4ci-dessous sont présentés le résultat du ratio entre l’intensité du pic observé pour chaque protéine et l’intensité du pic observé pour la colistine ainsi que la somme de ces ratios pour chaque espèce.
[Tableau 4]:
Les résultats présentés dans leTableau 4montrent que les souches EC-S10 et EC-S15 présentent une somme des ratios supérieure à 0,3, alors que les souches EC-R16 et EC-R17 présentent une somme des ratios nulle. Par observation de ces résultats, les inventeurs ont fixé la valeur du seuil à 0,30. Par conséquent, dans ce cas de figure, les souches dont la somme des ratios est strictement inférieure à 0,30 seront considérées comme résistantes et inversement les souches dont la somme des ratios est supérieure ou égale à 0,30 seront considérées comme sensibles. Les souches EC-S10 et EC-S15 sont donc classées comme sensibles alors que les souches EC-R16 et EC-R17 sont classées comme résistantes.
Analyse des souches de
K. pneumoniae
Les souchesKlebsiella pneumoniaeKP S10-1, KP S10-2, KP S15-1, KP S15-2, KP R9-1, KP R9-2, KP R16-1 et KP R16-2, sont également étudiées et les protéines caractéristiques de l’espèceK. pneumoniaesont analysées. Ces protéines caractéristiques sont la protéine de liaison à l’ADN H-NS (DNA binding protein H-NS), les protéines ribosomiques L29, L31, L34 et US9, la protéine de choc froid contenant un domaine CsbD (CsbD domain-containing protein), et les protéines non caractérisées de m/z 6290 et 8308.
Dans leTableau 5ci-dessous sont présentées l’intensité du pic observé pour la colistine et pour chaque protéine caractéristique deKlebsiella pneumoniae.
[Tableau 5]:
LeTableau 6ci-dessous présente le résultat du ratio entre l’intensité du pic observé pour chaque protéine et l’intensité du pic observé pour la colistine ainsi que la somme de ces ratios pour chaque espèce.
[Tableau 6]:
Les résultats présentés dans leTableau 6montrent que les souches KP-S15 et KP-S10 présentent une somme des ratios supérieure à 0,45 alors que les souches KP-R16 et KP-R9 présentent une somme des ratios inférieure à 0,11. Ainsi, par observation des résultats les inventeurs ont fixé la valeur du seuil à 0,45. Par conséquent, dans ce cas de figure, les souches dont la somme des est strictement inférieure à 0,45 seront considérées comme résistantes et inversement les souches dont la somme des ratios est supérieure ou égale à 0,45 seront considérées comme sensibles. Les souches KP-S15 et KP-S10 sont donc classées comme sensibles alors que les souches KP-R16 et KP-R9 sont classées comme résistantes.
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Claims (10)
- Procédé pour déterminer la sensibilité ou de la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact d’un échantillon comprenant ladite bactérie avec ledit au moins un antibiotique, ledit antibiotique induisant la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique et provoquant la libération des composés intracellulaires de ladite bactérie lorsque celle-ci est dite «sensible» audit au moins un antibiotique,
- incubation dudit échantillon avec ledit au moins un antibiotique,
- purification dudit échantillon par élimination des bactéries intacts et des débris cellulaires,
- analyse de l’échantillon purifié par spectrométrie de masse,
- détection de la présence ou de l’absence d’au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de ladite bactérie, et
- détermination de la sensibilité ou de la résistance de ladite population bactérienne au dit antibiotique.
- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la spectrométrie de masse est de type MS, MS/MS ou MS suivie d’une spectrométrie de type MS/MS.
- Procédé selon la revendication la revendication 2, dans lequel la spectrométrie de masse de type MS est une spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
- Procédé selon la revendication 2, dans lequel la spectrométrie de masse de type MS/MS est une spectrométrie de masse de type PRM, SRM, MRM, DDA (data dependent acquisition) ou DIA (data independent acquisition).
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape de purification dudit échantillon se fait par au moins une des techniques suivantes, la centrifugation, la filtration, l’électrophorèse ou la chromatographie.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’antibiotique est choisi parmi les polymyxines, les β-lactamines, les aminosides et les glycopeptides.
- Procédé selon la revendication 6, dans lequel l’antibiotique est une polymyxine et est choisi parmi la colistine et la polymyxine B.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel ledit antibiotique présente une concentration au moins dix fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice dudit antibiotique pour ladite population bactérienne.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la population bactérienne est une bactérie à Gram négatif.
- Procédé selon la revendication 9, dans lequel la bactérie à Gram négatif est choisie parmiEscherichia c oli,Acinetobacter b aumannii,Klebsiella p neumoniae,Acinetobacter haemolyticus,Acinetobacter junii,Cit r obacter freundii,Enterobacter asburiae,Enterobacter cloacae,Pseudomonas fluorescens,Salmonella Enteritidis,Salmonella Paratyphi B var.Java,Salmonella ser.Agona,Salmonella ser.Enteritidis,Salmonella ser.Haifa,Salmonella ser.NewportetPseudomonas aeruginosa.
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