WO2022167733A1 - Plaque d'analyse pour une analyse de spectrométrie de masse et procédé de caractérisation de microorganismes par spectrométrie de masse associé - Google Patents

Plaque d'analyse pour une analyse de spectrométrie de masse et procédé de caractérisation de microorganismes par spectrométrie de masse associé Download PDF

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WO2022167733A1
WO2022167733A1 PCT/FR2022/000008 FR2022000008W WO2022167733A1 WO 2022167733 A1 WO2022167733 A1 WO 2022167733A1 FR 2022000008 W FR2022000008 W FR 2022000008W WO 2022167733 A1 WO2022167733 A1 WO 2022167733A1
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analysis
microorganism
population
antimicrobial agent
incubation
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Application number
PCT/FR2022/000008
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Inventor
Jean-Philippe Charrier
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bioMérieux
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • H01J49/0409—Sample holders or containers
    • H01J49/0418—Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI] plates or surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to the field of microbiology. More specifically, the invention relates to the characterization of a population of at least one microorganism using mass spectrometry, and in particular, mass spectrometry using a MALDI ionization technique (for Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
  • MALDI ionization technique for Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
  • TOF Time of Flight
  • Various systems suitable for such characterization are marketed by the applicant, and also by the companies Bruker Daltonics, ASTA and Bioyang.
  • the identification of a microorganism is carried out from the MALDI-TOF mass spectrum of the most abundant proteins in the microorganism, by comparison with reference data allowing the identification of the genus and most often of the species of the microorganism.
  • the protocol implemented includes the deposit of at least a portion of the colony of the microorganism on an analysis plate, the addition of a matrix adapted to the MALDI technique, the acquisition of the mass spectrum and the identification of the species by comparison with reference data stored in a database (Welker M, Moore ER. Syst. Appl. Microbiol. 2011 Feb;34(l):2-ll, Applications of Whole-Cell Matrix - Assisted Laser-Desorption/lonization Time-Of-FHght Mass Spectrometry in Systematic Microbiology).
  • the MALDI-TOF technique has also been used to detect the resistance of a microorganism to an antibiotic.
  • methods for detecting resistance to MALDI-TOF, after contact with an antibiotic with or without culture, are known.
  • the Applicant has proposed to functionalize the analysis surface by prior deposition of the antimicrobial agent, said microbial agent being dried after its deposition.
  • the analysis surface also called the target, can thus comprise a set of functionalized zones ready to receive a sample potentially containing microorganisms in order to characterize its resistance.
  • This functionalization makes it possible to simplify the operating mode advantageously for the user.
  • the targets functionalized can be prepared in advance, for example in the factory, so as to have a ready-to-use consumable. The sample containing at least one microorganism is then simply deposited in liquid form on one of the functionalized zones, incubated, dried and analyzed by MALDI-TOF.
  • Methods for detecting resistance mechanisms by MALDI-TOF of any type of antibiotic are also known after culturing the microorganisms in the presence of the antibiotic. These methods measure an alteration of the bacterial protein patern, or an increase in the bacterial biomass during the culture when the germ is resistant to the antibiotic. More particularly, the increase in biomass can be determined by comparing mass spectra obtained after growth with and without antibiotics, one of the growth conditions having been carried out in culture medium with heavy isotopes, or even by comparing the signal of the characteristic peaks of the microorganism to be analyzed compared to a reference substance added in measured form. This latter method is used in the MBT-ASTRA method described by Sparbier et al.
  • the solution of lysed cells is deposited on the MALDI-TOF analysis plate to acquire a mass spectrum and compare the intensity of the peaks of the proteins of the microorganism with that of the reference substance.
  • An algorithm finally makes it possible to classify the microorganism as resistant or sensitive to the antibiotic according to a certain threshold.
  • Idelevich et al. have recently simplified this process by carrying out the incubation of the solution of microorganisms with or without antibiotic directly on the target.
  • the new method has been named DOT-MGA for direct-on-target microdroplet growth assay (Idelevich et al., Clin Microbiol Infect. 2018 Jul;24(7):738-743, Rapid Detection of Antibiotic Resistance by MALDI-TOF Mass Spectrometry Using a Novel Direct-On-Target Microdroplet Growth Assay).
  • DOT-MGA direct-on-target microdroplet growth assay
  • the sample incubation step possibly comprising microorganisms with or without antibiotics, must imperatively be carried out in a liquid medium by controlling the composition of the medium.
  • This incubation can last several hours. However, a drop of a few microliters dries all the more quickly in the open air as the temperature is high and the air is dry. When the drop dries, the composition of the liquid medium changes: the concentration of salts and nutrients increases and can end up inhibiting the growth of the microorganism to be characterized. A resistant isolate could thus not grow and give the illusion that the microorganism is sensitive to the antibiotic tested. It is therefore imperative to carry out the incubation in a humid atmosphere, and if possible in an atmosphere saturated with humidity, to limit evaporation as much as possible.
  • the Bruker company has tried to solve this difficulty by proposing a humid chamber, retaining humidity by deliquescence of an appropriate substance (WO 2019/011746 A2). Nevertheless, maintaining a humid atmosphere has the disadvantage of favoring the development of sporulating molds which will contaminate the air and all the surfaces of the humid chamber or oven. The spores thus formed will contaminate the drops during their incubation and falsify the result of the analysis, either by disturbing the growth of the microorganisms to be characterized, or by contributing to the appearance of artifactual peaks on the mass spectrum.
  • the step of blotting the drop of liquid present on the target at the end of the incubation step is also a delicate operation. It requires great application so as not to contaminate two adjacent wells, which are generally very close.
  • the blotter must not touch the surface so as not to risk removing by scraping or wiping any microorganisms that may be there. Failing this, the blotter may entrain some of the microorganisms, which falsifies the quantitative analysis of their growth rate.
  • the blotter can be contaminated with pathogenic microorganisms. It must therefore be handled and disposed of as potentially soiled by infectious microorganisms, which is potentially dangerous for the safety of operators.
  • the blotting step is currently carried out by hand, its reproducibility is therefore insufficient from one operator to another to generalize its routine use in clinical laboratories. Also, if automated, potentially infectious blotters can contaminate the robot, dropping droplets or if their discharge creates aerosols.
  • the Bruker company has tried to solve these difficulties by proposing an extraction process using an absorbent material comprising a pattern of indentations or holes, in patent application EP 3 376 202 Al. The arrangement of these corresponds to the positions predefined sample droplets on the target. In this way the edges of the indentations or holes are supposed to come into contact with the droplets so as to gradually blot them from one of the sides of the droplets. However, this process remains difficult to implement.
  • the droplets are not necessarily positioned in a perfectly identical manner from one reception zone to another. They may be slightly off-center, which makes it difficult for correct contact between the absorbent material and the droplet. Consequently, the blotting can be inhomogeneous and not very reproducible.
  • the object of the invention is to remedy all or part of the aforementioned drawbacks and in particular to facilitate the characterization of microorganisms present in biological samples by limiting transfers from one support to another and by functionalizing the analysis plate.
  • the subject of the invention is an analysis plate configured to allow characterization of microorganisms by mass spectrometry, said analysis plate comprising at least one analysis zone configured for a biological sample containing a population of at least one microorganism, characterized in that all or part of said analysis zone is made of a porous material, said analysis zone comprises at least one antimicrobial agent.
  • the analysis plate thus configured eliminates the need to use different supports for incubation and ionization. Moreover, thanks to its functionalization by depositing a prior microbial agent, it is possible to characterize a microorganism and to know its resistance. Finally, the at least one porous analysis zone allows the filtration of the excess liquid while retaining the microorganisms within the analysis zone and maintaining a favorable humidity for incubation. Indeed, a few microliters of liquid possibly containing microorganisms and at least one antimicrobial agent can be incubated for several hours on the analysis plate according to the invention without drying.
  • an analysis plate comprising a set of analysis zones made of porous material makes it possible to carry out the incubation and filtration steps jointly for all the samples analyzed on the analysis zones. analysis, which is particularly advantageous from an ergonomic point of view to ensure a high rate of analysis.
  • the analysis plate according to the invention comprises several analysis zones.
  • each analysis zone forms a “spot” or a target, preferably circular in shape.
  • the surface of the analysis plate is conductive, in order to promote subsequent ionization, at least at the level of the analysis zone(s).
  • the analysis plate according to the invention is formed from a polymer such as polypropylene, said polymer being covered with a layer of stainless steel.
  • the polymer may contain a conductive material such as carbon black.
  • the analysis plate according to the invention comprises between 48 and 96 analysis zones.
  • the analysis plate according to the invention further comprises at least one, or even two or three reference analysis zones, which may be of different size with respect to the analysis zones. These reference analysis zones serve as a calibration zone and/or as an analysis validation zone.
  • analysis zone refers to a zone intended to receive a biological sample to be analyzed, said zone being made of a porous material and comprising at least one antimicrobial agent.
  • Porous material means a matrix containing pores or cavities of small size and possibly containing one or more fluids (liquid or gas).
  • the porous material can be “open”, ie the pores are interconnected, forming very fine channels.
  • the porous material of the analysis zone or zones is a capillo-porous, hygroscopic and air-permeable material, which makes it possible to at least partially filter the substances deposited on the analysis zone.
  • the porous material according to the invention thus makes possible the absorption of water or water vapor and the passage of air.
  • the porous material of the at least one analysis zone is a filter material.
  • the size of the pores of the porous material of the analysis zone is smaller than the size of said at least one microorganism to be characterized.
  • said at least one microorganism does not risk passing through the pores of the analysis zone and therefore remains in the analysis zone in order to be characterized.
  • the microorganisms are naturally retained on the surface, without being able to cross it, the underside of the analysis plate thus remaining devoid of any potentially infectious microorganism.
  • pore "size” means the diameter of the pore. All the pores of the same analysis zone can be of the same size or of different size. Thus, in the context of the invention, the pore whose size is the largest in an analysis zone is smaller than the size of the microorganism to be characterized.
  • the analysis zone when an antimicrobial agent is deposited on said analysis zone of the analysis plate, the analysis zone is said to be “functionalized”.
  • antimicrobial agent a compound capable of reducing the viability of a microorganism and/or of reducing its growth or reproduction.
  • antimicrobial agents can be antibiotics when directed against bacteria. Nevertheless, the invention is applicable to any type of microorganism of the bacteria, yeast, mold or parasite type and therefore to the corresponding antimicrobial agents.
  • the antimicrobial agent can be selected so as to allow the identification of resistance to any antimicrobial agent, for example an antibiotic or an antifungal.
  • the analysis plate when the analysis plate comprises several analysis zones, at least two zones, or even more, will carry a different antimicrobial agent. It is thus possible to characterize several populations of microorganism(s) with the same analysis plate during a single analysis.
  • each of the analysis zones may carry a different antimicrobial agent.
  • the same antimicrobial agent can be present on at least two distinct analysis zones, in order to carry out the characterizations in duplicate.
  • the analysis plates according to the invention can be provided directly to the user, who will therefore only have to deposit the population of microorganism(s) thereon. to be analyzed, then after an incubation step, depositing a matrix therein.
  • Said analysis plates may be marketed in individual packaging or comprising several plates.
  • a subject of the present invention is also a system comprising: an analysis plate according to the invention, on which a population of at least one microorganism and a culture medium are deposited on at least one analysis zone and one element of incubation configured to maintain humidity in the at least one analysis zone, said incubation element being positioned under the analysis plate.
  • the incubation element makes it possible to prevent the drop or drops of culture medium liquid, microorganism population and antimicrobial agent from drying out or being sucked up by capillarity by the porous material of the at least analysis zone and it also avoids having recourse to a humid chamber which complicates the process.
  • the incubation element is a gas saturated with humidity or a liquid, for example ultra-pure water or physiological water, that is to say water containing salts to ensure an osmotic pressure and a pH adapted to the physiology of the microorganism to be characterised.
  • the system comprises a support formed from a porous material, said support being positioned under the analysis plate.
  • the incubation element is contained in the support and is configured to moisten said support.
  • the support is moistened with the culture medium, such as Muller-Hinton culture medium or any other culture medium well known to those skilled in the art. This humidification with a culture medium will make it possible to promote microbial growth during the incubation of the analysis plate according to the invention.
  • the porous material of the incubation support can have a porosity equivalent to or different from that of the porous material of the at least one analysis zone.
  • the support made of a porous material is capable of absorbing a certain quantity of liquid by capillarity.
  • a support made of a porous material we can cite a natural or synthetic sponge, blotting paper, synthetic foam, fiberglass, cotton, sand, sawdust.
  • synthetic materials we can cite, by way of example, polyethylenes, polyesters, such as polyethylene terephthalate (PET), or even polyamides. They may also be copolymers, such as polyethylene/polyester polymers, such as a polyethylene/PET copolymer.
  • the fibers can consist of a mono-component or bi-component material. A two-component fiber can for example consist of a PET core and a polyethylene sheath. Natural porous materials can also be used such as for example cotton fibers, paper fibers.
  • the incubation support is a blotting paper.
  • the term “blotting paper” is understood to mean a fibrous material consisting partly or entirely of fibers. These fibers can be assembled in an ordered or random fashion (i.e. a woven or a nonwoven). This material which has the capacity to absorb aqueous liquids can be composed of a single type of fiber, a mixture of fibers belonging or not belonging to the same class. Fibers can be classified according to their chemical composition (mineral or organic) and their origin (natural or artificial). By way of example, mention may be made of fiberglass as an artificial mineral fiber or alternatively cellulosic fiber (from cotton or even wood) as natural organic fibers of plant origin.
  • the system comprises an incubation chamber.
  • incubation chamber means a closed enclosure in which the incubation step can take place without the sample deposits or microorganism population drying out in a way that is detrimental to the analysis.
  • the closed enclosure is configured to maintain a humidity level sufficient for the at least one population of microorganisms to be able to develop, that is to say to divide and grow, without becoming dehydrated.
  • the closed enclosure is thermostatically controlled.
  • the closed enclosure can also be arranged inside another enclosure, itself thermostatically controlled.
  • the closed enclosure can be in the form of a cassette, into which the analysis plate is inserted.
  • the system comprises a suction device configured to allow the elimination of excess liquid on the surface of the analysis zone.
  • the suction device 50, 51 can be either in the form of a vacuum suction device 50 (FIG. 3) or else in the form of a porous support such as blotting paper for example.
  • the suction device when it is in the form of a porous material support can be identical to the incubation support.
  • the invention also relates to a method for characterizing a population of at least one microorganism, the characterization comprising at least the determination of the possible presence of resistance of said microorganism to at least one antimicrobial agent arranged on the plate of analysis according to the invention.
  • the method for characterizing a population of at least one microorganism is characterized in that that it comprises the following successive steps: a step consisting in providing an analysis plate or a system according to the invention, for characterization of said population of at least one microorganism, a step of depositing the population of said at least a microorganism in liquid form on said at least one analysis zone in contact with the antimicrobial agent previously deposited on said analysis zone, an incubation step, consisting in keeping said analysis plate, under conditions and for a period sufficient to allow the interaction of said at least one antimicrobial agent and said at least one microorganism present, a step of eliminating the liquid containing the population of said at least one microorganism by suction through the pores of the analysis zone, a step of depositing on said at least one analysis zone, a matrix suitable for the MALDI ionization technique, for example of
  • the population of microorganism(s) is deposited on an analysis zone of an analysis plate according to the present invention, in order to then proceed to its characterization.
  • the deposition is carried out in such a way that the population of microorganism(s) is deposited homogeneously on the analysis zone.
  • the procedures described for carrying out the standard identification of microorganisms can be used, in the manuals for the use of systems or instruments using MALDI-TOF technology.
  • Verification that a population of at least one microorganism is indeed deposited can be done beforehand by a suitable test, in particular on agar.
  • a single population of a single microorganism will be deposited on the analysis zone.
  • the population of microorganism(s) may come from different sources.
  • samples of biological origin in particular animal or human.
  • Such a sample may correspond to a sample of biological fluid, of the whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, organic secretion type, to a tissue sample or to isolated cells.
  • This sample may be deposited as is, or will preferably be subjected prior to the deposit on the analysis zone concerned, to a preparation of the enrichment or culture type, to a concentration and/or to an extraction or purification step according to methods known to those skilled in the art.
  • the population of microorganism(s) may be deposited in the form of an inoculum.
  • the population of microorganism(s) deposited on the analysis zone will preferably be a population of living microorganism(s), although it is not excluded to carry out a extraction of the population of microorganism(s) from a biological sample, using a detergent which may affect the viability. In such a case, it may be wise to extend the incubation step.
  • the source of the population of microorganism(s) can also be an agri-food product such as meat, milk, yoghurt and any other consumable product likely to be contaminated, or even a cosmetic product. or pharmaceutical.
  • agri-food product such as meat, milk, yoghurt and any other consumable product likely to be contaminated, or even a cosmetic product. or pharmaceutical.
  • such a product may be subjected to a preparation of the enrichment or culture type, to a concentration and/or to an extraction or purification step, in order to obtain the population of microorganism(s) to be deposited.
  • the source of microorganism(s) may previously have been cultured in a broth or on an agar so as to enrich it in microorganisms.
  • Such media, agar or broth are well known to those skilled in the art. Enrichment on agar is particularly favorable since it makes it possible to obtain colonies of microorganisms which can be deposited directly on the analysis zone.
  • it is possible to deposit on the analysis zone preferably, a cell medium comprising a bacterial population.
  • the population of microorganisms deposited contains at least 10 5 CFU of microorganisms. By way of example, 10 5 to 10 9 CFU of a microorganism can be deposited.
  • the deposited population will preferably comprise a single species of microorganism. However, it is not excluded to deposit on the analysis zone a population comprising different microorganisms. In this case, it will be preferable that the microorganisms are known to be susceptible to developing different resistance mechanisms, so as to know which one would present the resistance that would be identified.
  • the deposit is of the antimicrobial agent is made from an aqueous solution of the antimicrobial agent.
  • An analysis zone bearing an antimicrobial agent referred to as functionalized, is thus obtained.
  • a buffer adapted to the solubility of the antimicrobial agent, as well as to an optimal activity of the mechanism at the origin of the targeted resistance can also be used to prepare the solution of the antimicrobial agent.
  • a drop for example of about 1 to 2 microliters, of the antimicrobial solution can be deposited, so that the entire analysis zone is covered.
  • the deposition of the microbial agent is followed by a drying operation.
  • the water contained in the solution is then evaporated, for example by simple drying in ambient air and at ambient temperature.
  • the analysis plate can be left at a temperature belonging, for example, to the range going from 17 to 40° C., and in particular at ambient temperature (22° C.). It is also possible to transfer it to a thermostatically controlled enclosure, for example at 37°C, to accelerate drying.
  • the antimicrobial agent premobilized on the analysis zone by covalent bonds or high affinity bonds.
  • the antimicrobial agent is bound to the analysis zone by electrostatic, ionic, covalent bonds, with or without the use of an arm or a specific binding partner (antibody, recombinant phage proteins) or not, by the use of biotin/streptavidin interaction previously grafted to the surface of the analysis zone and to the antibiotic, or by any type of bond adapted to the nature of the antimicrobial agent and on the surface of the analysis area.
  • the mode of binding or deposition of the antimicrobial agent will nevertheless be chosen so as not to hinder the possible interaction of the antimicrobial agent with a microorganism.
  • an adhesive agent that is to say an agent which will adhere to the analysis plate and therefore improve the immobilization of the antimicrobial agent on the latter, we will deposit then a mixture of the adhesive agent and the antimicrobial agent in aqueous solution.
  • the adhesive agent will, in particular, be a water-soluble polymer.
  • an adhesive agent which can be used for the immobilization of the antimicrobial agent on the zone or zones for analysis mention may be made of heptakis(2,6-di-O-methyl)-
  • the adhesive agent will be chosen according to the antimicrobial agent to be immobilized on the analysis zone. In particular, it will be selected according to its mass, so that its presence does not falsify the subsequent detection by MALDI-TOF mass spectrometry aimed at determining the presence or absence of the microorganism.
  • a person skilled in the art will adjust the quantity of adhesive agent used to ensure the accessibility of the antimicrobial agent by the population of microorganism(s) when the latter has been deposited.
  • 3-cyclodextrin /antimicrobial agent from 1/20 to 1/2, preferably from 1/10 to 1/5.
  • the quantity of antimicrobial agent deposited on an analysis zone will be adapted by those skilled in the art, depending on the antimicrobial agent in question.
  • the antimicrobial agent is tested at a concentration, or with a range of concentrations, suitable for its therapeutic use.
  • This concentration, or this concentration range is specific to each antimicrobial agent and is generally chosen according to the recommendations of the European Committee on Antimicrobial Suceptibility Testing (EUCAST, cf. https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/) or of the Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI, see https://clsi.org/meetings/microbiology/clsi-and-ast/).
  • the method comprises an additional step of depositing a compound different from the antimicrobial agent.
  • the compound can be configured to accelerate the growth of microorganisms.
  • This compound can for example be a nutrient medium containing peptones.
  • This compound can be pre-deposited on the test area in combination with the antimicrobial agent or at any other time in the preparation of the test area.
  • a beta-lactamase inhibitor can be deposited, in order to characterize an ESBL phenomenon (extended-spectrum beta-lactamase).
  • a beta-lactam with a beta-lactamase inhibitor such as clavulanic acid, sulbactam or tazobactam.
  • the analysis zone carrying both the antimicrobial agent and the population of a microorganism to be characterized is subjected to an incubation step to allow the interaction between the microorganism and the agent antimicrobial and therefore in the case of the presence of a population of microorganisms, resistant to the antimicrobial agent, allowing the phenomenon at the origin of the resistance to occur.
  • the phenomenon of resistance will allow the growth of the microorganism, that is to say its division and its multiplication. This will result in an increase in the biomass of the microorganism, which after an appropriate incubation period will allow its detection by mass spectrometry analysis with a MALDI-TOF ionization source.
  • the phenomenon responsible for resistance to an antimicrobial agent therefore takes place directly on the analysis plate.
  • the phenomenon responsible for resistance to an antimicrobial agent occurs in a minimum volume corresponding to the characterization zone.
  • the conditions and the incubation period will be adapted by those skilled in the art according to the phenomenon of resistance to be characterized.
  • the analysis plate can be left at a temperature belonging, for example, to the range going from 17 to 40° C., and in particular at ambient temperature (22° C.). It is also possible to incubate the analysis plate, for example at 37°C, to promote growth and the phenomena at the origin of the resistance.
  • the incubation period should be sufficient to allow subsequent detection by mass spectrometry of the resistance phenomenon to be detected.
  • the incubation is most often carried out for at least 2 hours, more preferably for at least 4 hours, and even more preferably for a period of 4 to 12 hours.
  • the sample contains a heterogeneous population of microorganisms formed of subpopulations belonging to several species of which at least one species is resistant to antibiotic X and at least one other species is resistant to antibiotic Y.
  • the microbiologist can then decide whether it is a sample of polymicrobial origin or from a contaminated sample, for example during its collection. In the latter case, the results are not reliable and the sample must be repeated.
  • the incubation step is carried out in an incubation chamber.
  • a step of removing the excess liquid containing the population of said at least one microorganism is carried out following the incubation step.
  • the step of eliminating the excess liquid is carried out by suction through the pores of the analysis zone, a suction device being positioned under the analysis plate.
  • the method comprises a step of drying the analysis zone.
  • the elimination of excess liquid participates in the drying.
  • the method further comprises a step of depositing a matrix suitable for the MALDI ionization technique is necessary for the analysis, said deposit step being carried out on said at least one analysis zone ,.
  • the matrices used in the MALDI technique are photosensitive and crystallize in the presence of the population of microorganism(s), while preserving the integrity of the molecules and microorganisms present.
  • Such matrices in particular suitable for the MALDI mass spectrometry technique, are well known and, for example, formed from a compound chosen from: 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid; ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ferulic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid. Many other compounds are known to those skilled in the art.
  • such a compound is dissolved, most often in water, preferably of “ultra-pure” quality, or in a water/organic solvent(s) mixture.
  • organic solvents conventionally used, mention may be made of acetone, acetonitrile, methanol or ethanol.
  • Formic acid, acetic acid, acid trifluoroacetic acid (TFA) may sometimes be added.
  • An example of a matrix is, for example, composed of 20 mg/mL of sinapic acid in an acetonitrile/water/TFA mixture of 50/50/0.1 (v/v).
  • the organic solvent allows the hydrophobic molecules present to dissolve in the solution, while the water allows the hydrophilic molecules to dissolve.
  • the presence of an acid, such as TFA promotes the ionization of molecules by capturing a proton (H + ).
  • the constituent solution of the matrix is directly deposited on the analysis zone and then covers the population of microorganism(s) and the antimicrobial agent present on the latter.
  • the method according to the invention further comprises, before the step of ionizing the characterization zone, a step of crystallizing the matrix present.
  • the crystallization of the matrix is obtained by leaving the matrix to dry in the ambient air the solvent present in the matrix is thus evaporated, for example, by leaving the analysis plate at a temperature belonging, for example, to the range ranging from 17 to 30° C., and in particular at ambient temperature (22° C.) for a few minutes, for example from 5 minutes to 2 hours.
  • This evaporation of the solvent allows the crystallization of the matrix in which the population of microorganism(s) and the antimicrobial agent are distributed.
  • the analysis plate thus prepared is thus sufficiently dry not to cause splashing or projection of droplets when it is placed under vacuum within the MALDI ionization source.
  • the population of microorganism(s) and the antimicrobial agent, placed within the MALDI matrix, forming the characterization zone, are subjected to gentle ionization.
  • the laser beam used for the ionization may have any type of wavelength favorable to the sublimation or to the vaporization of the matrix. Preferably an ultraviolet or even infrared wavelength will be used. This ionization could, for example, be carried out with a nitrogen laser emitting a UV ray at 337.1 nm.
  • the population of microorganism(s) and the antimicrobial agent are subjected to laser excitation.
  • the matrix then absorbs the photonic energy and the restitution of this energy leads to the sublimation of the matrix, the desorption of the molecules present in the population of microorganism(s) and of the antimicrobial agent and the appearance of matter in a qualified state. of plasma.
  • charge exchanges occur between matrix molecules, microorganisms and antimicrobial agent.
  • protons can be torn from the matrix and transferred to proteins, peptides and organic compounds present at the level of the characterization zone. This step allows gentle ionization of the molecules present without inducing their destruction.
  • This analyzer can be, for example, an analyzer of the “time of flight” type (or TOF for “Time Of Flight”).
  • TOF time of flight
  • ions are accelerated by an electric field and fly freely in a tube under reduced pressure, called a flight tube.
  • the pressure applied during ionization and during acceleration of the generated ions most often belongs to the range from 10-6 to 10-9 millibars [mbar].
  • the smaller ions will then “travel” faster than the larger ions, thus allowing their separation.
  • a detector At the terminal end of the flight tube is located a detector. The travel time (or flight time) of the ions is used to calculate their mass.
  • a mass spectrum is obtained, representing the intensity of the signal corresponding to the number of ionized molecules of the same mass to charge [m/z], as a function of the m/z ratio of the molecules which strike the detector.
  • the mass to charge ratio [m/z] is expressed in Thomson [Th],
  • a MALDI-TOF mass spectrometry method may in particular comprise the following successive steps for obtaining the mass spectrum: having a characterization zone comprising the population of microorganism(s) to be studied and at least one antimicrobial agent in a matrix suitable for MALDI spectrometry, possibly obtaining the crystallization of the matrix in which the population of microorganism(s) and the antimicrobial agent are arranged, ionizing the population of microorganism(s)/antimicrobial agent/matrix mixture, using a laser beam, accelerating the ionized molecules obtained by means of a potential difference, allowing the ionized and accelerated molecules to move freely in a tube under reduced pressure, detecting at least some of the ionized molecules at the outlet of the tube, so as to measure the time they took to travel the tube under reduced pressure and to obtain a signal corresponding to the number of ionized molecules reaching the detector at a given instant, calculate the mass-to-charge ratio [m/z] of the molecules detected,
  • the calculation of the m/z ratio is obtained, taking into account a prior calibration of the mass spectrometer used, in the form of an equation linking the mass-to-charge ratio [m/z] and the travel time in the tube under reduced pressure of the ionized molecules.
  • Calibration consists of using a set of molecules or a microorganism that will provide ionized molecules covering the mass range corresponding to the characterization envisaged.
  • the m/z ratios of these ionized molecules will serve as standards, in order to allow the apparatus to measure the masses in an adequate manner.
  • the calibration can be carried out using a strain of bacteria possessing ionized molecules having m/z ratios covering the range of masses used for the identification (typically in the range going from 2000 to 20000 Da in the case of yeasts, moulds, bacteria or parasites).
  • any type of MALDI-TOF mass spectrometer can be used for the elaboration of the mass spectrum.
  • Such spectrometers comprise: i) an ionization source (in general, a UV laser) intended to ionize the population of microorganism(s)/antimicrobial agent/matrix mixture; ii) an accelerator of ionized molecules by application of a potential difference; iii) a tube under reduced pressure in which the ionized and accelerated molecules move; iv) a mass analyzer intended to separate the molecular ions formed, according to their mass to charge ratio (m/z); v) a detector intended to measure the signal produced directly by the molecular ions.
  • an ionization source in general, a UV laser
  • an accelerator of ionized molecules by application of a potential difference iii)
  • a tube under reduced pressure in which the ionized and accelerated molecules move iv
  • a mass analyzer intended to separate the molecular
  • the analysis by MALDI-TOF is, preferably, an analysis by linear MALDI-TOF, although an analysis by MALDI-TOF-TOF, MALDI-TOF with reflectron, or any type of mass analyzer linked to a MALDI source is not excluded.
  • the invention is compatible with the use of instruments with a MALDI source linked to an ion trap (MALDI-IT) or to multiple analyzers of the quadripole (Q) type, ion traps (IT), orbitrapes ( O), ion mobility tube (IM)...
  • Such instruments can thus have hybrid configurations of the MALDI-Q-IT-TOF, MALDI-QQQ, MALDI-Q-TOF, MALDI-IT-Q-TOF, MALDI-Q-IT-O...
  • the mass spectrometry analysis step makes it possible to conclude whether the population of a microorganism resistant to the antimicrobial agent is present in the analysis zone.
  • resistance is meant a phenomenon whereby a microorganism does not exhibit a decrease in its viability, or a stagnation or a decrease in its growth or reproduction, when it is exposed to a concentration of an antimicrobial agent which is recognized as being clinically effective against said microorganism in the absence of resistance.
  • the identification of the resistance, from the mass spectrum obtained for a considered characterization zone can be done by the detection, on the mass spectrum obtained, of a given mass peak, or of a change in peak of mass with respect to a reference mass spectrum, in particular, thanks to the mass spectrum of the sample incubated on the reference zone not comprising any antimicrobial.
  • the microorganism can also be done by detecting the growth of the microorganism in the presence of the antimicrobial agent.
  • This growth can be characterized by an increase in the bacterial biomass during the culture. More particularly, the increase in biomass can be determined by comparing the signal of the characteristic peaks of the microorganism to be analyzed with respect to a reference substance added in dosed form as in the method of Idelevich et al, cited above.
  • the quantity of microorganisms deposited before the incubation step can be adjusted so as to generate an insufficient signal to identify the microorganism with confidence.
  • the duration of the incubation step can then be optimized so that the growth of sensitive microorganisms in the absence of antimicrobial or of resistant microorganisms in the presence or absence of antimicrobial generates a sufficient signal to confidently identify said microorganism.
  • a method was used by T. Horseman et al. which have shown, using an instrument marketed by the applicant, the possibility of characterizing as not sensitive to an antibiotic the microorganisms identified with a probability greater than or equal to 90% and as sensitive the unidentified microorganisms (Horseman et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2020, 97(4):115093, Rapid Qualitative Antibiotic Resistance Characterization using VITEK MS).
  • the method comprises a step of determining the resistance of said microorganism to said antimicrobial agent by observing the presence of proteins of the microorganism in such quantity that it is possible to conclude that the microorganism has grown despite the presence of said antimicrobial agent during the incubation step.
  • the method according to the invention may in particular be implemented to determine the minimum inhibitory concentration for the population of at least one microorganism to be characterized by using an increasing range of antimicrobial deposited on different sample areas of the plate of to analyse.
  • the minimum inhibitory concentration, or MIC is the lowest concentration of antimicrobial agent capable of inhibiting in vitro any visible growth of the population of microorganisms studied at a given temperature and for a period of time. defined. This value characterizes the bacteriostatic effect of an antibiotic on a bacterium and more generally of an antimicrobial on a microorganism.
  • the MIC is specific to an antimicrobial agent/microorganism pair, each strain having its own value, depending on the natural and/or acquired resistance for the molecule tested.
  • the characterization method allows the identification of the genus, or, preferably, of the species of a population of a microorganism deposited on the analysis zone.
  • the microorganisms which can be identified by the process of the invention are any type of microorganism, pathogenic or not, encountered both in industry and in the clinic, which can experience phenomena of resistance to antimicrobial agents. It can preferably be bacteria, moulds, yeasts or parasites.
  • the invention is particularly suitable for the study of bacteria. By way of example of such microorganisms, mention may be made of Gram-positive and Gram-negative bacteria and Mycobacteria.
  • Gram-negative bacteria By way of example of Gram-negative bacteria, mention may be made of those of the genera: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Acinetobacter, Citrobacter, Aeromonas, Stenotrophomonas, Morganella and Providencia, and in particular Escherichia coli , Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Proteus mirabilis, Sertia sen
  • the identification of a population of a microorganism present may therefore include the following steps: a) having a reference mass spectrum, for at least one microorganism and most often for a series of microorganisms, b) subjecting the population of microorganism(s) and the antimicrobial agent deposited on the analysis zone and placed in the presence of the matrix (corresponding to a characterization zone according to the invention), to ionization, c) acquiring a spectrum of mass obtained following this ionization, in the mass range of interest for the identification of the micro-organism, d) comparing the mass spectrum obtained in step c) with the reference spectrum and deducing the genus therefrom, or , preferably, the species of at least one microorganism.
  • a calibration is carried out in a mass range corresponding to high masses, typically in the range going from 2000 to 20000 Da, and preferably in the range going from 3000 to 17000 Da.
  • the mass spectrum obtained in step c) is also included in this mass range.
  • the calibration can be carried out by placing a population of a reference microorganism in a reference analysis zone present on the analysis plate and by carrying out its analysis by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • a reference microorganism could be, for example, an E. coli bacterium.
  • MALDI-TOF mass spectrometry
  • the method implements a single analysis by mass spectrometry using a MALDI ionization technique by a single ionization of an analysis zone, and using for the analysis a only calibration.
  • Figure 1 is a schematic top view of an analysis plate according to the invention.
  • Figure 2 is a cross section along the B-B axis of the analysis plate according to the invention during the incubation step.
  • Figure 3 is a cross-sectional view along the B-B axis of the analysis plate according to the invention during the excess liquid removal step according to a first embodiment
  • Figure 4 is a cross-sectional view along the B-B axis of the analysis plate according to the invention during the excess liquid removal step according to a second embodiment
  • Figure 5 is a cross-sectional view along the B-B axis of the analysis plate according to the invention after the excess liquid removal step regardless of the embodiment,
  • Figure 6 is an exploded perspective view of a system according to the invention comprising a cassette containing an analysis plate according to the invention
  • FIG. 1 represents a model of analysis plate 10 according to the invention adapted to analysis by mass spectrometry.
  • Said analysis plate 10 comprising 48 analysis zones 11 and three reference analysis zones 12.
  • the analysis zones 11 are spaced apart and are arranged so that they are distinct from one another.
  • the reference analysis zones 12 are positioned between the rows of analysis zones 11. More particularly in the example illustrated in FIG. 1, the analysis plate 10 comprises four columns (1-4) of twelve rows (AL ) of analysis zones 11.
  • Each analysis zone 11 is circular in shape and is configured to circumscribe one or more drops of previously sampled microorganism populations.
  • the analysis plate 10 according to the invention is made of at least two distinct materials: one for the analysis zones 11, 12 and one adapted to MALDI ionization and forming the analysis plate 10 .
  • the analysis plate 10 according to the invention is placed on an incubation support 40 moistened either by an incubation element 42 or by the culture medium 41 allowing the growth of microorganisms and placed on each analysis zone 11, 12.
  • the culture medium 41 is deposited on an analysis zone 11 on which a microbial agent (not shown) and a population of microorganisms 20 are already deposited.
  • the culture medium 41 as well as the previous deposits are circumscribed to the analysis zone 11 thanks to the porous material of said analysis zone 11.
  • This configuration illustrated in FIG. 2 therefore illustrates the system 1 according to the invention during the step of incubation.
  • FIGS. 3 and 4 the incubation support 40 or the incubation element 42 is removed and a suction device 50, 51 is positioned in its place, below the analysis plate 10, allowing the removal of excess liquid.
  • the suction device 50, 51 can be either in the form of a vacuum suction device 50 (FIG. 3) or else in the form of a blotting paper 51 (FIG. 4).
  • FIG. 5 is illustrated the analysis plate 10 according to the invention once the excess liquid has been eliminated: the microorganisms 20 are naturally retained on the surface of the analysis zone 11, without being able to cross it thanks to the pore size the surface. The underside of the analysis plate 10 thus remains free of any potentially infectious microorganism.
  • the cassette 100 comprises a lid 101, a perforated seal 102 on which the analysis plate 10 is positioned and a container 103 having an internal volume 104 for receiving open on the underside of the analysis plate 10.
  • Said internal volume 104 of the container 103 is shaped to totally or partially receive an incubation support 40 or an incubation element 42 or even a suction device 50, 51.
  • the protocol for using this cassette can be described by the following steps: remove the lid of the cassette, position a moist porous material inside the container place the perforated seal above the container, position an analysis plate on the perforated seal, deposit 2 pl of an inocula comprising at least one population of microorganism on each area of analysis carrying the antibiotic, replace the lid by clipping it on the perforated seal incubate the cassette at 37°C for 2 hours (or more), remove the assembly formed by the lid, the perforated seal and the analysis plate and place it on a second container containing a dry absorbent porous material, such as an absorbent blotting paper, let the blotting paper suck by capillarity all the drops of liquid present on the analysis plate, remove the lid, add 1 pl of an HCCA matrix to the analysis areas carrying both the antibiotic and the bacteria , remove the pla analysis and finalize its drying in the open air introduce the analysis plate into a MALDI ionization source for analysis by mass spectrometry.
  • the examples below make it possible to illustrate the invention but have no limiting character.
  • the analyzes were carried out with the VITEK MS apparatus marketed by the company bioMérieux.
  • the analyzes were carried out, in each of the examples below, at the end of the acquisition.
  • the spectra were acquired on all the characterization zones and then analyzed: for the identification, the spectrum analysis was carried out using the VITEK MS calculation engine and the V3.2.0 database.
  • Example 1 Isolation of bacterial microorganisms and identification using VITEKMS
  • VITEK MS analysis plate reference 410893, bioMérieux
  • VITEK MS - CHCA alpha-cyano 4 hydroxycinnamic acid
  • the analysis plates are left to dry according to the supplier's recommendations.
  • analysis plates having the same geometry as the VITEK MS targets (reference 410893, bioMérieux), but having analysis zones made of a porous material. More specifically, 48 analysis zones, made of porous material, divided into 3 groups of 16 zones. These areas are arranged in 4 columns of 12 rows. Each column is identified by a number from 1 to 4. Each row is identified by a letter from A to L. Thus the analysis zone 13 is located at the intersection of the 9th row and the 3rd column.
  • the analysis plate also has 3 calibration positions, respectively in the center of the 3 groups of 16 analysis zones. Unlike the zones intended for the samples, these calibration zones are not made of porous material.
  • antibiotic solutions were prepared in water: Oxacillin solution (Sigma reference 28221) at 0.125 pg/ml, 0.25 pg/ml, 0.5 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, 4 ⁇ g/ml, 8 ⁇ g/ml, 16 ⁇ g/ml, 32 ⁇ g/ml, 64 ⁇ g/ml, 128 ⁇ g/ml and 256 ⁇ g/ml; Amoxicillin solution (Sigma reference A8523) at 2 ⁇ g/ml; Ceftriaxone solution (Sigma reference C5793) at 24 ⁇ g/ml; Meropenem solution (Sigma reference M2574) at 2 ⁇ g/ml.
  • Example 3 optimization of the characterization of resistance to antibiotics according to the invention
  • Analysis plates were placed in a cassette, as illustrated in FIGS. 3 to 5, to allow their handling.
  • This cassette includes a perforated gasket so that the analysis plate can be placed on a sponge soaked to saturation with Muller-Hinton culture medium.
  • the sponge soaked in a culture medium acts as a support, it is made of porous material as described in the description.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC in pg/ml) was determined by microdilution in broth, a technique very widely used by those skilled in the art.
  • RA resistance to Amoxicillin
  • RC resistance to Ceftriaxone
  • RM resistance to Meropenem
  • RO resistance to Oxacillin
  • SA susceptible to Amoxicillin
  • SC susceptible to Ceftriaxone
  • SM means sensitive to Meropenem
  • SO sensitive 0 to Oxacillin.
  • Reference strains Nos. 1 to 7 were diluted to 0.5 McFarland (McF) in Muller-Hinton medium (bioMérieux AEB reference 110699), then rediluted to 1/10°, 1/50° and 1/100°, still in Muller-Hinton middle. 5 For each dilution of microorganisms, drops of 2 ⁇ l were deposited on 4 analysis zones of an analysis plate according to the invention. The dilutions of E. coli and K. pneumoniae were analyzed on analysis plates with 16 deposits of Amoxicillin, 16 deposits of Ceftriaxone and 16 deposits of Meropenem. Dilutions of S. aureus were analyzed on assay plates with 2 ⁇ g/ml Oxacillin.
  • Control analysis plates that is to say non-functionalized (without antibiotic), were also prepared.
  • the negative controls were processed as explained below, omitting the oven incubation step. In other words, the drops were sucked up immediately after deposition.
  • the positive controls were treated at all points as explained below.
  • a lid was placed on the cassette containing the assay plate so as to clip onto the cassette and close the device without touching the top of the drops.
  • the analysis cassettes thus prepared were incubated in an oven at 37° C. for 2, 3, 4 or 5 hours.
  • the analysis plates are placed on dry highly absorbent blotting paper, having an absorption capacity of 25 ⁇ L.cm ⁇ 2 . In such a way that the drops present on the analysis plate are sucked up by capillarity through the analysis zones made of porous material.
  • the cover is then unclipped.
  • a calibrator E. coli strain ATCC 8739 cultured on Columbia blood agar, reference 43041, bioMérieux
  • VITEK MS-CHCA alpha-cyano 4 hydroxycinnamic acid
  • the assay plate is then dried and analyzed with the VITEK MS as described in Example 1.
  • the dilution of the microorganisms was chosen to lead to a probability of identification less than or equal to 60% on the negative control plates, or even, most often, to an absence of identification (whatever the reason indicated by VITEK MS). No identification to a species other than those studied was observed, otherwise it would have been considered an invalid result. Dilutions of 1/100° and 1/10° were retained respectively for the Gram-negative strains and for the Gram-positive strains.
  • the incubation period was chosen to lead to an identification probability greater than 80% on the positive control targets. In general, such a probability was observed after 2 hours of incubation for Gram-negative strains and after 4 hours for Gram-positive strains. However, consistent results were obtained for all the strains after 4 hours of incubation and it seemed simpler to use the same incubation period for all the microorganisms.
  • identifications with a probability greater than or equal to 90% were observed for at least 3 deposits out of 4 when the reference microorganism was resistant to the antibiotic. Conversely, absences of identification or identifications with a probability of less than 90% have been observed. for at least 3 deposits out of 4 when the reference microorganism was sensitive to the antibiotic tested.
  • Example 1 The isolates identified in Example 1 were diluted to 0.5 McFarland (McF) in Muller-Hinton medium (bioMérieux reference AEB 110699), then rediluted to 1/100° for Gram-negative bacteria and to 1/10° for Gram-positive bacteria, still in Muller-Hinton medium.
  • McF McFarland
  • Muller-Hinton medium bioMérieux reference AEB 110699
  • this zone When no sample deposit has been planned on an analysis zone, this zone is covered with a plastic film Parafilm M (Bemis North America) before placing the analysis plate in the cassette. In this way, the analysis zone was not brought into contact with the culture medium contained in the sponge soaked to saturation. The positions not used in the first analysis thus remained usable for a subsequent analysis.
  • Parafilm M Billemis North America
  • Example 3 The analysis was carried out according to the same procedure as in example 3 with a 4 hour incubation for all the microorganisms. Similarly, the results were interpreted as in Example 3, i.e. with an identification probability threshold greater than or equal to 90% for at least 3 deposits out of 4.
  • isolate 1 is characterized as resistant to Amoxicillin, but sensitive to Ceftriaxone and Meropenem.
  • Isolate 2 is sensitive to all three antibiotics.
  • Isolate 3 is resistant to Amoxicillin and Ceftriaxone but sensitive to Meropenem.
  • isolate 4 is resistant to the three antibiotics.
  • Isolate 5 is thus characterized as an isolate of E. coli resistant to Amoxicillin, but susceptible to Ceftriaxone and Meropenem.
  • Isolate 6 is an isolate of K. pneumoniae resistant to 3 antibiotics.
  • Isolate 7 is an isolate of K. pneumoniae resistant to Amoxicillin, but sensitive to Ceftriaxone and Meropenem.
  • Isolate 8 is an isolate of K. pneumoniae resistant to Amoxicillin and Ceftriaxone, but susceptible to Meropenem.
  • the inventors have characterized the resistance of several microorganisms, including of different species, vis-à-vis several antibiotics, on the same analysis plate. It is also possible to characterize several microorganisms on a partially used target, as presented in Table 5 below.
  • Isolate 9 is thus characterized as an isolate of S. aureus resistant to oxacillin, whereas isolates 10 and 11 of S. aureus and isolate 12 of S. epidermidis are sensitive to it.
  • positions E1 to L4 were not used in this analysis. They were protected by a Parafilm M plastic film and can be used for a new analysis (cf. TABLE 6).
  • Example 5 Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) according to the invention
  • the dilutions of Staphylococci of the reference strains and of the isolates were analyzed on the analysis plates according to the invention with 4 deposits of Oxacillin at 0.125 pg/ml, 4 deposits of Oxacillin at 0.25 pg/ml, 4 deposits of 'Oxacillin at 0.5 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 1 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 2 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 4 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 8 pg/ml ml, 4 depots of Oxacillin at 16 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 32 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 64 pg/ml, 4 depots of Oxacillin at 128 pg/ml, 4 depots of Ox
  • the reference strain No. 6 was identified with a probability of more than 99.9% as S. aureus in 3 deposits out of 4 with an Oxacillin concentration of 0.125 pg/ml, for one deposit out of 4 for a concentration of 0.25 pg /ml but was not identified for higher concentrations of Oxacillin.
  • This strain has an MIC of 0.25 pg/ml (cf. TABLE 2), which corresponds to the lowest growth inhibitory concentration observed by the method of the present invention.
  • Isolates 9 to 12 were analyzed in the same way and an MIC of 16 pg/ml was observed for isolate 9, of 0.25, 0.5 and 0.125 respectively for isolates 10 to 12. These observations are consistent with the predictions of resistance to Oxacillin of Example 4, isolate 9 is resistant unlike isolates 10 to 12. They also allow a finer characterization of the resistance or sensitivity properties of the microorganisms by estimating the minimum inhibitory concentration (MIC) .
  • MIC minimum inhibitory concentration

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Abstract

La présente invention concerne une plaque d'analyse (10) configurée pour permettre une caractérisation de microorganismes (20) par spectrométrie de masse, ladite plaque d'analyse comprenant au moins une zone d'analyse (11) configurée pour un échantillon biologique contenant une population d'au moins un microorganisme, caractérisée en ce que tout ou partie de ladite zone d'analyse est réalisée en un matériau poreux, ladite zone d'analyse comprenant au moins un agent antimicrobien.

Description

Plaque d'analyse pour une analyse de spectrométrie de masse et procédé de caractérisation de microorganismes par spectrométrie de masse associé.
La présente invention concerne le domaine de la microbiologie. Plus précisément, l'invention concerne la caractérisation d'une population d'au moins un microorganisme en utilisant la spectrométrie de masse, et en particulier, la spectrométire de masse utilisant une technique d'ionisation MALDI (pour Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
La technique MALDI associée à un analyseur de masse de type temps de vol, dit TOF (pour Time of Flight), est utilisée depuis quelques années pour réaliser une identification rapide de microorganismes, au moins au niveau de l'espèce. Différents systèmes adaptés à une telle caractérisation sont commercialisés par la demanderesse, et également par les sociétés Bruker Daltonics, ASTA et Bioyang.
L'identification d'un microorganisme est réalisée à partir du spectre de masse MALDI- TOF des protéines les plus abondantes dans le microorganisme, par comparaison avec des données de référence permettant l'identification du genre et le plus souvent de l'espèce du microorganisme. En routine, le protocole mis en œuvre comprend le dépôt d'au moins une portion de colonie du microorganisme sur une plaque d'analyse, l'ajout d'une matrice adaptée à la technique MALDI, l'acquisition du spectre de masse et l'identification de l'espèce par comparaison avec des données de référence stockées dans une base de données (Welker M, Moore ER. Syst. Appl. Microbiol. 2011 Feb;34(l):2-ll, Applications of Whole-Cell Matrix- Assisted Laser-Desorption/lonization Time-Of-FHght Mass Spectrometry in Systematic Microbiology).
La technique MALDI-TOF a également été utilisée pour détecter la résistance d'un microorganisme à un antibiotique. Ainsi, des procédés de détection de la résistance en MALDI- TOF, après mise en contact avec un antibiotique avec ou sans culture, sont connues.
La demanderesse a proposé de fonctionnaliser la surface d'analyse par dépôt préalable de l'agent antimicrobien, ledit agent microbien étant séché après son dépôt. La surface d'analyse, dénommée cible également, peut ainsi comporter un ensemble de zones fonctionnalisées prêtes à recevoir un échantillon contenant potentiellement des microorganismes pour caractériser sa résistance. Cette fonctionnalisation permet de simplifier le mode opératoire de façon avantageuse pour l'utilisateur. Les cibles fonctionnalisées peuvent être préparées à l'avance, par exemple en usine, de façon à disposer d'un consommable prêt à l'emploi. L'échantillon contenant au moins un microorganisme est ensuite simplement déposé sous forme liquide sur l'une des zones fonctionnalisées, incubé, séché et analysé par MALDI-TOF.
Des méthodes de détection de mécanismes de résistance par MALDI-TOF de tout type d'antibiotique sont également connus après mise en culture des microorganismes en présence de l'antibiotique. Ces procédés mesurent, une altération du paterne protéique bactérien, ou une augmentation de la biomasse bactérienne au cours de la culture lorsque le germe est résistant à l'antibiotique. Plus particulièrement, l'augmentation de biomasse peut être déterminée par comparaison de spectres de masse obtenus après croissance avec et sans antibiotique, l'une des conditions de croissance ayant été effectuée en milieu de culture avec isotopes lourds ou encore, par comparaison du signal des pics caractéristiques du microorganisme à analyser par rapport à une substance de référence ajoutée sous forme dosée. Cette dernière méthode est utilisée dans le procédé MBT-ASTRA décrit par Sparbier et al. (Sparbier et al., 2016, Methods, 104 : 48-54, MBT-ASTRA : a suitable tool for fast antibiotic susceptibility testing ?). En pratique, 200pl de microorganismes à 0,5 McFarland sont cultivés à 37°C avec ou sans antibiotique durant un temps prédéterminé. Après incubation, les cellules sont culotées par centrifugation et lavées successivement avec 150pl d'eau pure puis lOOpl d'éthanol 70%. Elles sont ensuite lysées avec lOpl d'acide formique à 70% puis lOpl d'acétonitrile pur contenant la substance de référence. La solution de cellules lysées est déposée sur la plaque d'analyse MALDI-TOF pour acquérir un spectre de masse et comparer l'intensité des pics des protéines du microorganisme à celui de la substance de référence. Un algorithme permet finalement de classer le microorganisme comme résistant ou sensible à l'antibiotique en fonction d'un certain seuil.
Idelevich et al. ont récemment simplifié ce procédé en réalisant l'incubation de la solution de microorganismes avec ou sans antibiotique directement sur la cible. Le nouveau procédé a été dénommé DOT-MGA pour direct-on-target microdroplet growth assay (Idelevich et al., Clin Microbiol Infect. 2018 Jul;24(7):738-743, Rapid Detection of Antibiotic Resistance by MALDI-TOF Mass Spectrometry Using a Novel Direct-On-Target Microdroplet Growth Assay). Il présente néanmoins plusieurs désavantages rédhibitoires, notamment la nécessité d'incuber une goutte de liquide ne devant pas sécher et la nécessité d'éliminer l'excès de liquide par buvardage. L'étape d'incubation de l'échantillon, comportant éventuellement des microorganismes avec ou sans antibiotique, doit impérativement être réalisée en milieu liquide en maîtrisant la composition du milieu. Cette incubation peut durer plusieurs heures. Or une goutte de quelques microlitres sèche d'autant plus rapidement à l'air libre que la température est élevée et que l'air est sec. Lorsque la goutte sèche, la composition du milieu liquide change : la concentration en sels et en nutriments augmente et peut finir par inhiber la croissance du microorganisme à caractériser. Un isolat résistant pourrait ainsi ne pas pousser et donner l'illusion que le microorganisme est sensible à l'antibiotique testé. Il est donc impératif de réaliser l'incubation sous atmosphère humide, et si possible sous atmosphère saturée en humidité, pour limiter au maximum l'évaporation.
La société Bruker a tenté de résoudre cette difficulté en proposant une chambre humide, conservant l'humidité par déliquescence d'une substance appropriée (WO 2019/011746 A2). Néanmoins, maintenir une atmosphère humide présente l'inconvénient de favoriser le développement de moisissures sporulantes qui vont contaminer l'air et toutes les surfaces de la chambre humide ou de l'étuve. Les spores ainsi formées vont contaminer les gouttes pendant leur incubation et fausser le résultat de l'analyse, soit en perturbant la croissance des microorganismes à caractériser, soit en contribuant à l'apparition de pics artefactuels sur le spectre de masse.
L'étape de buvardage de la goutte de liquide présente sur la cible à l'issue de l'étape d'incubation est également une opération délicate. Elle demande une grande application pour ne pas contaminer deux puits adjacents, généralement très proches. Le buvard ne doit pas toucher la surface pour ne pas risquer de retirer pargrattage ou essuyage les microorganismes pouvant s'y trouver. Faute de quoi, le buvard peut entrainer une partie des microorganismes, ce qui fausse l'analyse quantitative de leur taux de croissance. De plus, le buvard peut être contaminé par des microorganismes pathogènes. Il doit donc être manipulé et éliminé comme potentiellement souillé par des microorganismes infectieux, ce qui est potentiellement dangereux pour la sécurité des opérateurs.
Par ailleurs, l'étape de buvardage est actuellement réalisée à la main, sa reproductibilité est donc insuffisante d'un opérateur à l'autre pour généraliser son utilisation en routine dans les laboratoires cliniques. En outre, en cas d'automatisation, les buvards potentiellement infectieux peuvent contaminer le robot, en laissant tomber des gouttelettes ou si leur décharge crée des aérosols. La société Bruker a tâché de résoudre ces difficultés en proposant un procédé d'extraction utilisant un matériaux absorbant comprenant un motif d'indentation ou de trous, dans la demande de brevet EP 3 376 202 Al. La disposition de ceux-ci correspond aux positions prédéfinies des gouttelettes d'échantillons sur la cible. De cette façon les bords des indentations ou des trous sont supposés rentrer en contact avec les gouttelettes de façon à les buvarder progressivement par l'un des côtés des gouttelettes. Ce procédé reste néanmoins délicat à mettre en œuvre. Les gouttelettes ne se positionnent pas nécessairement de façon parfaitement identiques d'une zone de réception à l'autre. Elles peuvent être légèrement décentrées, ce qui rend difficile un contact correct entre le matériau absorbant et la gouttelette. Par conséquent le buvardage peut être inhomogène et peu reproductible.
L'invention a pour but de remédier à tout ou partie des inconvénients précités et notamment à faciliter la caractérisation de microorganismes présents dans des échantillons biologiques en limitant les transferts d'un support à un autre et en fonctionnalisant la plaque d'analyse.
À cet effet, l'invention a pour objet une plaque d'analyse configurée pour permettre une caractérisation de microorganismes par spectrométrie de masse, ladite plaque d'analyse comprenant au moins une zone d'analyse configurée pour un échantillon biologique contenant une population d'au moins un microorganisme, caractérisée en ce que tout ou partie de ladite zone d'analyse est réalisée en un matériau poreux, ladite zone d'analyse comprend au moins un agent antimicrobien.
La plaque d'analyse ainsi configurée permet de s'affranchir d'utiliser des supports différents pour l'incubation et la ionisation. De plus, grâce à sa fonctionnalisation de par le dépôt d'un agent microbien préalable, il est possible de caractériser un microorganisme et d'en connaître sa résistance. Enfin, la au moins une zone d'analyse poreuse permet la filtration de l'excès de liquide tout en retenant les microorganismes au sein de la zone de d'analyse et de maintenir une humidité favorable à l'incubation. En effet, quelques microlitres de liquide contenant éventuellement des microorganismes et au moins un agent antimicrobien peuvent être incubés plusieurs heures sur la plaque d'analyse selon l'invention sans sécher.
De surcroît, l'utilisation d'une plaque d'analyse comportant un ensemble de zones d'analyse en matériau poreux permet de réaliser les étapes d'incubation et de filtration de façon conjointe pour l'ensemble des échantillons analysés sur les zones d'analyse, ce qui est particulièrement avantageux d'un point de vue ergonomique pour assurer une grande cadence d'analyse.
Selon une caractéristique de l'invention, la plaque d'analyse selon l'invention comprend plusieurs zones d'analyse.
Avantageusement, chaque zone d'analyse forme un « spot » ou une cible, préférentiellement forme circulaire. selon une caractéristique de l'invention, la surface de la plaque d'analyse est conductrice, afin de favoriser l'ionisation ultérieure, au moins au niveau de la ou des zones d'analyse.
Par exemple, la plaque d'analyse selon l'invention, est formée d'un polymère tel que le polypropylène, ledit polymère étant recouvert d'une couche d'acier inoxydable. En outre, le polymère peut contenir un matériau conducteur tel que le noir de charbon.
Selon une caractéristique de l'invention, la plaque d'analyse selon l'invention comprend entre 48 et 96 zones d'analyse.
Selon une caractéristique de l'invention, la plaque d'analyse selon l'invention comprend en outre au moins une, voire deux ou trois zones d'analyse de référence, qui peuvent être de taille différente par rapport à des zones d'analyse. Ces zones d'analyse de référence servent de zone de calibration et/ou de zone de validation des analyses.
Dans le cadre de l'invention, on nomme « zone d'analyse » une zone destinée à recevoir un échantillon biologique à analyser, ladite zone étant réalisée en un matériau poreux et comprend au moins un agent antimicrobien.
Par « matériau poreux », on entend une matrice renfermant des pores ou des cavités de petite taille et pouvant contenir un ou plusieurs fluides (liquide ou gaz).
Selon une caractéristique de l'invention, le matériau poreux peut être « ouvert » c'est- à-dire que les pores sont reliés entre eux, formant des canaux très fins.
Selon une caractéristique de l'invention, le matériau poreux de la ou les zones d'analyse est un matériau capillo-poreux, hygroscopique et perméable à l'air, qui permet de filtrer au moins partiellement les substances déposées sur la zone d'analyse. Avantageusement, Le matériau poreux selon l'invention rend ainsi possible l'absorption d'eau ou de vapeur d'eau et le passage de l'air.
Selon une caractéristique de l'invention, le matériau poreux de l'au moins une zone d'analyse est un matériau filtrant. Selon une caractéristique de l'invention, la taille des pores du matériaux poreux de la zone d'analyse est inférieure à la taille dudit au moins un microorganisme à caractériser. Ainsi, ledit au moins un microorganisme ne risque pas de passer à travers les pores de la zone d'analyse et reste donc dans la zone d'analyse afin d'être caractériser. En effet, grâce au choix de la porosité de chaque zone d'analyse, les microorganismes se trouvent naturellement retenus à la surface, sans pouvoir la traverser, le dessous de la plaque d'analyse restant ainsi dépourvu de tout microorganisme potentiellement infectieux.
Dans le cadre de la présente invention par « taille » de pore on entend le diamètre du pore. Tous les pores d'une même zone d'analyse peuvent être de même taille ou de taille différente. Ainsi, dans le cadre de l'invention, le pore dont la taille est la plus élevée dans une zone d'analyse est inférieure à la taille du microorganisme à caractériser.
Selon l'invention, Lorsqu'un agent antimicrobien est déposé sur ladite zone d'analyse de la plaque d'analyse, la zone d'analyse est dite « fonctionnalisée ».
Par « agent antimicrobien », on entend un composé capable de diminuer la viabilité d'un microorganisme et/ou d'en diminuer la croissance ou la reproduction. De tels agents antimicrobiens peuvent être des antibiotiques, lorsqu'ils sont dirigés contre des bactéries. Néanmoins, l'invention est applicable à tout type de microorganisme du type bactéries, levures, moisissures ou parasites et donc, aux agents antimicrobiens correspondants.
Dans le cadre de l'invention, l'agent antimicrobien peut être sélectionné de manière à permettre l'identification de la résistance à tout agent antimicrobien, par exemple un antibiotique ou un antifongique.
Selon une caractéristique de l'invention, lorsque la plaque d'analyse comporte plusieurs zones d'analyse, au moins deux zones, voire plus, seront porteuses d'un agent antimicrobien différent. Il est ainsi possible de caractériser plusieurs populations de microorganisme(s) avec une même plaque d'analyse lors d'une seule analyse.
Avantageusement, selon l'invention, chacune des zones d'analyse pourra être porteuse d'un agent antimicrobien différent.
Selon une caractéristique de l'invention, un même agent antimicrobien peut être présent sur au moins deux zones d'analyse distinctes, afin d'effectuer les caractérisations en duplicata.
Avantageusement, les plaques d'analyse selon l'invention, pourront être directement fournies à l'utilisateur, qui n'aura donc plus qu'à y déposer la population de microorganisme(s) à analyser, puis après une étape d'incubation, d'y déposer une matrice. Lesdites plaques d'analyse pourront être commercialisées, dans un emballage individuel ou comprenant plusieurs plaques.
La présente invention a également pour objet un système comprenant : une plaque d'analyse selon l'invention, sur laquelle une population d'au moins un microorganisme et un milieu de culture sont déposés sur au moins une zone d'analyse et un élément d'incubation configuré pour maintenir l'humidité la au moins une zone d'analyse, ledit élément d'incubation étant positionné sous la plaque d'analyse.
Grace à cette configuration, l'élément d'incubation permet d'éviter que la ou les gouttes de liquide de milieu de culture, de population de microorganisme et d'agent antimicrobien ne sèchent ou ne soient aspirées par capillarité par le matériau poreux de la au moins zone d'analyse et on évite également d'avoir recours à une chambre humide qui complexifie le procédé.
Selon une caractéristique de l'invention, l'élément d'incubation est un gaz saturé en humidité ou un liquide par exemple de l'eau ultra-pure ou de l'eau physiologique, c'est-à-dire de l'eau contenant des sels pour assurer une pression osmotique et un pH adaptés à la physiologie du microorganisme à caractériser.
Selon une caractéristique de l'invention, le système comprend un support formé d'un matériaux poreux, ledit support étant positionné sous la plaque d'analyse.
Selon une caractéristique de l'invention, l'élément d'incubation est contenu dans le support et est configuré pour humidifier ledit support. Alternativement ou en complément, le support est humidifié par le milieu de culture, tel que le milieu de culture Muller-Hinton ou de tout autre milieu de culture bien connu de l'homme du métier. Cette humidification par un milieu de culture permettra de favoriser la croissance microbienne lors de l'incubation de la plaque d'analyse selon l'invention.
Selon l'invention, le matériau poreux du support d'incubation peut avoir un porosité équivalente ou différente de celle du matériau poreux de la au moins une zone d'analyse.
Dans le cadre de la présente invention, le support réalisé en un matériau poreux est capable d'absorber par capillarité une certaine quantité de liquide. A titre d'exemple de support réalisé en un matériau poreux, nous pouvons citer une éponge naturelle ou synthétique, un papier buvard, de la mousse synthétique, de la fibre de verre, du coton, du sable, de la sciure. Ainsi parmi les matériaux synthétiques nous pouvons citer, à titre d'exemple, les polyéthylènes, les polyesters, tel que le polytéréphtalate d'éthylène (PET), ou encore les polyamides. Il peut s'agir également de copolymères, tels que des polymères de polyéthylène/polyester, tel qu'un copolymère de polyéthylène/ PET. Lorsqu'il s'agit d'un matériau fibreux, les fibres peuvent être constituées d'un matériau mono-composant ou bi- composant. Une fibre bi-composant peut être par exemple constituée d'un cœur en PET et d'une gaine en polyéthylène. Des matériaux poreux naturels peuvent également être utilisés comme par exemple des fibres de coton, des fibres de papier.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le support d'incubation est un papier buvard.
Dans la présente invention, on entend par « papier buvard », un matériau fibreux constitué en partie ou en totalité de fibres. Ces fibres peuvent être assemblées de manière ordonnée ou aléatoire (c'est-à-dire un tissé ou un non-tissé). Ce matériau qui a la capacité d'absorber les liquides aqueux peut être composé d'un seul type de fibre, d'un mélange de fibres appartenant ou non à la même classe. Les fibres peuvent être classées selon leur composition chimique (minérale ou organique) et leur origine (naturelle ou artificielle). A titre d'exemple on peut citer la fibre de verre comme fibre minérale artificielle ou encore la fibre cellulosique (issue de coton ou encore de bois) comme fibres organiques naturelles d'origine végétale.
Selon une caractéristique de l'invention, le système comprend une chambre d'incubation. Dans la présente invention, par « chambre d'incubation », on entend une enceinte fermée dans laquelle l'étape d'incubation peut avoir lieu sans que les dépôts d'échantillon ou population de microorganisme ne sèchent de façon néfaste à l'analyse. L'enceinte fermée est configurée pour maintenir un taux d'humidité suffisant pour que les au moins une population de microorganisme puisse se développer, c'est-à-dire se diviser et croître, sans se déshydrater.
Avantageusement, l'enceinte fermée est thermostatée.
Selon une caractéristique de l'invention, l'enceinte fermée peut également être disposée à l'intérieur d'une autre enceinte, elle-même thermostatée.
Selon une caractéristique de l'invention, l'enceinte fermée peut se présenter sous forme de cassette, dans laquelle la plaque d'analyse vient s'insérer. Selon une caractéristique de l'invention, le système comprend un dispositif d'aspiration configuré pour permettre l'élimination de l'excédent de liquide à la surface de la zone d'analyse.
Selon une caractéristique de l'invention, Le dispositif d'aspiration 50, 51 pouvant se présenter soit sous la forme d'un dispositif d'aspiration sous vide 50 (figure 3) ou bien sous la forme d'un support poreux tel qu'un papier buvard par exemple.
Selon une caractéristique de l'invention, le dispositif d'aspiration lorsqu'il est sous forme de support en matériau poreux peut être identique au support d'incubation.
L'invention a également pour objet un procédé de caractérisation d'une population d'au moins un microorganisme, la caractérisation comprenant au moins la détermination de la présence éventuelle d'une résistance dudit microorganisme à au moins un agent antimicrobien agencé la plaque d'analyse selon l'invention.
Selon l'invention, le procédé de caractérisation d'une population d'au moins un microorganisme, la caractérisation comprenant au moins la détermination de la résistance éventuelle d'une population d'un microorganisme à au moins un agent antimicrobien, est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : une étape consistant à fournir une plaque d'analyse ou un système selon l'invention, pour une caractérisation de ladite population d'au moins un microorganisme, une étape de dépose de la population dudit au moins un microorganisme sous forme liquide sur ladite au moins une zone d'analyse au contact de l'agent antimicrobien préalablement déposé sur ladite zone d'analyse, une étape d'incubation, consistant à conserver ladite plaque d'analyse, dans des conditions et pendant une période suffisante, pour permettre l'interaction dudit au moins un agent antimicrobien et dudit au moins un microorganisme présent, une étape d'élimination du liquide contenant la population dudit au moins un microorganisme par aspiration à travers les pores de la zone d'analyse, une étape de dépose sur ladite au moins une zone d'analyse, d'une matrice adaptée à la technique d'ionisation MALDI, par exemple de type HCCA, connue pour tuer les microorganismes présents sur la surface de la cible, une étape d'analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d'ionisation MALDI, d'une population dudit au moins un microorganisme déposée sur ladite zone d'analyse permettant de conclure si une population d'un microorganisme résistant à l'agent antimicrobien est présente sur la zone d'analyse.
Dans le cadre de ce procédé, la population de microorganisme(s) est déposée sur une zone d'analyse d'une plaque d'analyse selon la présente invention, pour ensuite procéder à sa caractérisation.
Selon une caractéristique de l'invention, le dépôt est réalisé de manière à ce que la population de microorganisme(s) soit déposée de manière homogène sur la zone d'analyse. Pour cela, on pourra utiliser les procédures décrites pour la réalisation de l'identification standard de microorganismes, dans les manuels d'utilisation de systèmes ou d'instruments utilisant la technologie MALDI-TOF. La vérification qu'une population d'au moins un microorganisme soit bien déposée peut se faire au préalable par un test adapté, notamment sur gélose. De manière préférée, on déposera sur la zone d'analyse une seule population d'un seul microorganisme.
Avantageusement, la population de microorganisme(s) pourra provenir de différentes sources. A titre d'exemple de source de microorganisme(s), on peut citer les échantillons d'origine biologique, notamment animale ou humaine. Un tel échantillon peut correspondre à un prélèvement de fluide biologique, du type sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, à un prélèvement tissulaire ou à des cellules isolées. Ce prélèvement pourra être déposé tel quel, ou sera, de préférence, soumis préalablement au dépôt sur la zone d'analyse concernée, à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d'extraction ou de purification selon des méthodes connues de l'homme du métier. Néanmoins, une telle préparation ne peut pas correspondre à une étape de lyse qui entraine la désintégration des microorganismes et une perte de leur contenu avant le dépôt sur la zone d'analyse. La population de microorganisme(s) pourra être déposée sous la forme d'un inoculum. Dans le cadre de l'invention, la population de microorganisme(s) déposée sur la zone d'analyse sera, de préférence, une population de microorganisme(s) vivant(s), bien qu'il ne soit pas exclu de réaliser une extraction de la population de microorganisme(s) à partir d'un échantillon biologique, en utilisant un détergent ce qui pourra affecter la viabilité. Dans un tel cas, il pourra être judicieux d'allonger l'étape d'incubation. En outre, la source de la population de microorganisme(s) peut également être un produit de l'agro-alimentaire tel que la viande, le lait, le yaourt et tout autre produit consommable susceptible d'être contaminé, ou encore un produit cosmétique ou pharmaceutique. Là encore, un tel produit pourra être soumis à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d'extraction ou de purification, afin d'obtenir la population de microorganisme(s) à déposer.
Avantageusement, la source de microorganisme(s) pourra au préalable avoir été mise en culture dans un bouillon ou sur une gélose de manière à l'enrichir en microorganismes. De tels milieux, gélosés ou en bouillon, sont bien connus de l'homme de l'art. L'enrichissement sur gélose est particulièrement favorable puisqu'il permet d'obtenir des colonies de microorganismes qui pourront directement être déposées sur la zone d'analyse. Dans le cadre de l'invention, on pourra déposer sur la zone d'analyse, de préférence, un milieu cellulaire comprenant une population bactérienne. De préférence, la population de microorganismes déposée contient au moins 105 UFC de microorganismes. A titre d'exemple, on pourra déposer de 105 à 109 UFC d'un microorganisme. Il est, par exemple, possible de procéder directement au dépôt d'une biomasse, d'une goutte d'une suspension de microorganismes, dans de l'eau ultra-pure, ou un tampon, ou un milieu de culture. On pourra déposer une colonie ou une fraction de colonie d'un microorganisme.
La population déposée, comprendra, de préférence, une seule espèce de microorganisme. Il n'est cependant pas exclu de déposer sur la zone d'analyse une population comprenant différents microorganismes. Dans ce cas, il sera préférable que les microorganismes soient connus pour être susceptibles de développer des mécanismes de résistance différents, de manière à savoir lequel présenterait la résistance qui serait identifiée.
Dans le cadre de l'invention, il n'est pas utile de procéder à une préparation particulière d'une population de microorganisme(s) qui serait déposé. En particulier, la population de microorganisme(s) est déposée, sans avoir été préalablement mise en contact avec un agent antimicrobien. En effet, dans le cadre de l'invention, il n'est pas nécessaire de procéder à une préparation longue et fastidieuse d'un échantillon à déposer, la population de microorganisme(s) déposée pouvant être préparée sans étape de centrifugation.
Préférentiellement, le dépôt est de l'agent antimicrobien est réalisé à partir d'une solution aqueuse de l'agent antimicrobien. On obtient ainsi une zone d'analyse porteuse d'un agent antimicrobien, dite fonctionnalisée. Selon l'invention, un tampon adapté à la solubilité de l'agent antimicrobien, ainsi qu'à une activité optimale du mécanisme à l'origine de la résistance ciblée, pourra également être utilisé pour préparer la solution de l'agent antimicrobien.
Selon l'invention, une goutte, par exemple d'environ 1 à 2 microlitres, de la solution antimicrobienne pourra être déposée, de telle sorte que toute la zone d'analyse soit recouverte.
Selon une caractéristique de l'invention, le dépôt de l'agent microbien est suivi d'une opération de séchage. Par exemple, l'eau contenue dans la solution est ensuite évaporée, par exemple par simple séchage à l'air ambiant et à température ambiante. La plaque d'analyse peut être laissée à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 40°C, et notamment à température ambiante (22°C). Il est également possible de la transférer dans une enceinte thermostatée, par exemple à 37°C, pour accélérer le séchage.
Selon une caractéristique de l'invention, il est également possible que l'agent antimicrobien soit immobilisé sur la zone d'analyse par des liaisons covalentes ou des liaisons de forte affinité.
Selon une caractéristique de l'invention, l'agent antimicrobien est lié à la zone d'analyse par des liaisons électrostatiques, ioniques, covalentes, avec ou non l'utilisation d'un bras ou d'un partenaire de liaison spécifique (anticorps, protéines recombinantes de phage) ou non, par l'utilisation d'interaction biotine/streptavidine préalablement greffée à la surface de la zone d'analyse et à l'antibiotique, ou par tout type de liaison adaptée à la nature de l'agent antimicrobien et à la surface de la zone d'analyse.
Selon l'invention, le mode de liaison ou de dépôt de l'agent antimicrobien sera néanmoins choisi de manière à ne pas gêner l'éventuelle interaction de l'agent antimicrobien avec un microorganisme. En particulier, on préférera réaliser l'immobilisation de l'agent antimicrobien par utilisation d'un agent adhésif, plutôt que par liaison covalente ou d'affinité pour éviter des changements de conformation de l'agent antimicrobien et assurer une bonne accessibilité de ce dernier au site actif de l'enzyme qui serait générée par le microorganisme. Dans le cas de l'utilisation d'un agent adhésif, c'est-à-dire d'un agent qui va adhérer à la plaque d'analyse et donc améliorer l'immobilisation de l'agent antimicrobien sur cette dernière, on déposera alors un mélange de l'agent adhésif et de l'agent antimicrobien en solution aqueuse. L'agent adhésif sera, notamment, un polymère soluble dans l'eau. A titre d'exemple d'agent adhésif pouvant être utilisé pour l'immobilisation de l'agent antimicrobien sur la ou les zones d'analyse, on peut citer l'heptakis(2,6-di-O-méthyl)-|3- cyclodextrine. L'agent adhésif sera choisi en fonction de l'agent antimicrobien à immobiliser sur la zone d'analyse. En particulier, il sera sélectionné en fonction de sa masse, de manière à ce que sa présence ne fausse pas la détection ultérieure par spectrométrie de masse MALDI-TOF visant à déterminer la présence ou l'absence du microorganisme. L'homme du métier ajustera la quantité d'agent adhésif utilisé pour assurer l'accessibilité de l'agent antimicrobien par la population de microorganisme(s) lorsque celle-ci aura été déposée. Par exemple, dans le cas de l'heptakis(2,6-di-O-méthyl)-|3-cyclodextrine, on pourra choisir un rapport massique heptakis(2,6-di-O-méthyl)-|3-cyclodextrine/agent antimicrobien de 1/20 à 1/2, de préférence de 1/10 à 1/5.
Selon l'invention, la quantité d'agent antimicrobien déposée sur une zone d'analyse sera adaptée par l'homme du métier, en fonction de l'agent antimicrobien en question. En effet, l'agent antimicrobien est testé à une concentration, ou avec une gamme de concentrations, adaptée à son usage thérapeutique. Cette concentration, ou cette gamme de concentration, est propre à chaque agent antimicrobien et est généralement choisie selon les recommandations de l'European Commitee on Antimicrobial Suceptibility Testing (EUCAST, cf. https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/) ou du Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI, cf. https://clsi.org/meetings/microbiology/clsi-and-ast/).
Selon une caractéristique de l'invention, le procédé comprend une étape supplémentaire de dépôt d'un composé différent de l'agent antimicrobien.
Selon une caractéristique de l'invention, le composé peut être configuré pour accélérer la croissance des microorganismes. Ce composé peut par exemple être un milieu nutritif contenant des peptones. Ce composé peut être déposé au préalable sur la zone d'analyse en combinaison avec l'agent antimicrobien ou à tout autre moment dans la préparation de la zone d'analyse.
Par exemple, dans le cas des bêta-lactamines, il peut être déposé un inhibiteur des bêta- lactamases, afin de caractériser un phénomène BLSE (bêta-lactamase à spectre étendu). En particulier, on pourra déposer une combinaison d'une bêta-lactamine avec un inhibiteur de bêta-lactamase tel que l'acide clavulanique, le sulbactam ou le tazobactam.
Après dépôt de la population de microorganisme(s), la zone d'analyse porteuse à la fois de l'agent antimicrobien et de la population d'un microorganisme à caractériser, est soumise à une étape d'incubation pour permettre l'interaction entre le microorganisme et l'agent antimicrobien et donc dans le cas de la présence d'une population de microorganismes, résistants à l'agent antimicrobien, permettre au phénomène à l'origine de la résistance de se produire. En particulier, le phénomène de résistance permettra la croissance du microorganisme, c'est-à-dire sa division et sa multiplication. Il en résultera un accroissement de la biomasse du microorganisme, ce qui après une période d'incubation approprié permettra sa détection par analyse en spectrométrie de masse avec une source d'ionisation MALDI-TOF.
Dans le cadre de l'invention, le phénomène responsable de la résistance à un agent antimicrobien a donc lieu directement sur la plaque d'analyse. Le phénomène responsable de la résistance à un agent antimicrobien se produit dans un volume minimal correspondant à la zone de caractérisation.
Les conditions et la période d'incubation seront adaptées par l'homme du métier en fonction du phénomène de résistance à caractériser. La plaque d'analyse peut être laissée à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 40°C, et notamment à température ambiante (22°C). Il est également possible de mettre à incuber la plaque d'analyse, par exemple à 37°C, pour favoriser la croissance et les phénomènes à l'origine de la résistance.
Dans les conditions sélectionnées, la période d'incubation devra être suffisant pour permettre la détection ultérieure par spectrométrie de masse du phénomène de résistance à détecter. L'incubation est, le plus souvent, réalisée pendant au moins 2 heures, plus préférentiellement pendant au moins 4 heures, et encore plus préférentiellement pendant une durée de 4 à 12 heures.
Il a été constaté, dans le cadre de l'invention, que la réalisation d'une telle étape d'incubation ne gênait en rien une identification du microorganisme. Une telle caractérisation est même particulièrement avantageuse lorsqu'elle est associée à la détection du phénomène de résistance. En effet, dans le cadre d'une population composée de plusieurs espèces de microorganismes, il est possible qu'une partie de la population, par exemple l'espèce A, soit résistante à l'antibiotique X, alors qu'une autre partie de la population, par exemple l'espèce B, soit résistante à l'antibiotique Y. La réalisation du procédé selon l'invention permettra d'identifier la dite espèce A sur les zones d'analyse contenant l'antibiotique X et la dite espèce B sur celles contenant l'antibiotique Y. Il sera ainsi possible de conclure que l'échantillon contient une population hétérogène de microorganismes formée de sous-populations appartenant à plusieurs espèces dont au moins une espèce est résistante à l'antibiotique X et au moins une autre espèce est résistante à l'antibiotique Y. Selon le contexte clinique, le microbiologiste pourra alors décider s'il s'agit d'un échantillon d'origine polymicrobienne ou d'un échantillon contaminé, par exemple lors de son prélèvement. Dans ce dernier cas les résultats ne sont pas fiables et le prélèvement doit être répété.
Selon une caractéristique de l'invention, l'étape d'incubation est réalisée dans une chambre d'incubation.
Selon une caractéristique de l'invention, suite à l'étape d'incubation une étape d'élimination du liquide excédant contenant la population dudit au moins un microorganisme est réalisée.
Avantageusement, l'étape d'élimination du liquide excédant est réalisée par aspiration à travers les pores de la zone d'analyse, un dispositif d'aspiration étant positionné sous la plaque d'analyse.
Selon une caractéristique de l'invention, le procédé comprend une étape de séchage de la zone d'analyse. Avantageusement, l'élimination de liquide excédent participe au séchage.
Selon une caractéristique de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de dépôt d'une matrice adaptée à la technique d'ionisation MALDI est nécessaire pour l'analyse Ladite étape de dépôt étant réalisée sur ladite au moins une zone d'analyse,.
Généralement, les matrices utilisées dans la technique MALDI sont photosensibles et cristallisent en présence de la population de micro- organisme(s), tout en préservant l'intégrité des molécules et micro- organismes présents. De telles matrices, notamment adaptées à la technique spectrométrie de masse MALDI, sont bien connues et, par exemple, constituées à partir d'un composé choisi parmi : l'acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique; l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique, l'acide férulique et l'acide 2,5- dihydroxybenzoîque. De nombreux autres composés sont connus de l'homme du métier. Il existe également des matrices liquides qui ne cristallisent ni à pression atmosphérique, ni même sous vide. Tout autre composé qui permettra d'ioniser les molécules présentes dans la zone d'analyse sous l'effet d'un rayon laser pourra être utilisé.
Pour la constitution de la matrice, un tel composé est mis en solution, le plus souvent dans l'eau, de préférence de qualité « ultra-pure », ou dans un mélange eau/solvant(s) organique(s). A titre d'exemple de solvants organiques classiquement utilisés, on peut citer, l'acétone, l'acétonitrile, le méthanol ou l'éthanol. L'acide formique, l'acide acétique, l'acide trifluoroacétique (TFA) peut parfois être ajouté. Un exemple de matrice est, par exemple, constituée de 20 mg/mL d'acide sinapique dans un mélange acétonitrile/eau/TFA de 50/50/0,1 (v/v). Le solvant organique permet aux molécules hydrophobes présentes de se dissoudre dans la solution, alors que l'eau permet la dissolution des molécules hydrophiles. La présence d'acide, tel que le TFA, favorise l'ionisation des molécules par captation d'un proton (H+).
La solution constitutive de la matrice est directement déposée sur la zone d'analyse et recouvre alors la population de microorganisme(s) et l'agent antimicrobien présents sur cette dernière.
De façon optionnelle, le procédé selon l'invention comprend en outre, avant l'étape d'ionisation de la zone de caractérisation, une étape de cristallisation de la matrice présente. Le plus souvent, la cristallisation de la matrice est obtenue en laissant sécher la matrice à l'air ambiant le solvant présent dans la matrice est ainsi évaporé, parexemple, en laissant la plaque d'analyse à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 30°C, et notamment à température ambiante (22°C) pendant quelques minutes, par exemple de 5 minutes à 2 heures. Cette évaporation du solvant permet la cristallisation de la matrice dans laquelle la population de micro- organisme(s) et l'agent antimicrobien sont répartis. La plaque d'analyse ainsi préparée est ainsi suffisamment sèche pour ne pas provoquer d'éclaboussure ou de projection de gouttelettes lors de sa mise sous vide au sein de la source d'ionisation MALDI.
La population de microorganisme(s) et l'agent antimicrobien, placés au sein de la matrice MALDI, formant la zone de caractérisation, sont soumis à une ionisation douce. Le rayon laser utilisé pour l'ionisation pourra avoir tout type de longueur d'onde favorable à la sublimation ou à la vaporisation de la matrice. De préférence, une longueur d'onde ultraviolette ou même infrarouge sera utilisée. Cette ionisation pourra, par exemple, être réalisée avec un laser à azote émettant un rayon UV à 337.1 nm.
Lors de l'ionisation, la population de microorganisme(s) et l'agent antimicrobien sont soumis à une excitation par laser. La matrice absorbe alors l'énergie photonique et la restitution de cette énergie entraîne la sublimation de la matrice, la désorption des molécules présentes dans la population de microorganisme(s) et de l'agent antimicrobien et l'apparition de matière dans un état qualifié de plasma. Au sein de ce plasma, il se produit des échanges de charges entre molécules de matrice, des micro- organismes et d'agent antimicrobien. Par exemple, des protons peuvent être arrachés à la matrice et transférés aux protéines, peptides et composés organiques présents au niveau de la zone de caractérisation. Cette étape permet une ionisation douce des molécules présentes sans induire leur destruction. La population de microorganisme(s) et l'agent antimicrobien libèrent ainsi des ions de différentes tailles. Ces derniers sont alors analysés dans un analyseur de masse. Cet analyseur peut être, par exemple, un analyseur de type « temps de vol » (ou TOF pour « Time Of flight» en anglais). Dans un TOF, les ions sont accélérés par un champ électrique et volent librement dans un tube sous pression réduite, nommé tube de vol. La pression appliquée lors de l'ionisation et lors de l'accélération des ions générés appartient le plus souvent à la gamme allant de 10-6 à 10-9 millibars [mbar]. Les ions les plus petits vont alors « voyager » plus rapidement que les ions plus gros permettant ainsi leur séparation. A l'extrémité terminale du tube de vol est situé un détecteur. Le temps de parcours (ou temps de vol) des ions est utilisé pour calculer leur masse. Ainsi, un spectre de masse est obtenu, représentant l'intensité du signal correspondant au nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge [m/z], en fonction du rapport m/z des molécules qui frappent le détecteur. Le rapport masse sur charge [m/z] est exprimé en Thomson [Th], Une fois la cible introduite dans le spectromètre de masse, le spectre d'une zone de caractérisation est obtenu très rapidement, le plus souvent en moins d'une minute.
Un procédé de spectrométrie de masse MALDI-TOF selon l'invention peut notamment comprendre les étapes successives suivantes pour l'obtention du spectre de masse : disposer d'une zone de caractérisation comprenant la population de microorganisme(s) à étudier et au moins un agent antimicrobien dans une matrice adaptée à la spectrométrie MALDI, éventuellement obtenir la cristallisation de la matrice dans laquelle la population de microorganisme(s) et l'agent antimicrobien sont disposés, ioniser le mélange population de microorganisme(s)/agent antimicrobien/matrice, grâce à un rayon laser, accélérer les molécules ionisées obtenues grâce à une différence de potentiel, laisser se déplacer librement les molécules ionisées et accélérées dans un tube sous pression réduite, détecter au moins une partie des molécules ionisées en sortie du tube, de manière à mesurer le temps qu'elles ont mis pour parcourir le tube sous pression réduite et à obtenir un signal correspondant au nombre de molécules ionisées atteignant le détecteur à un instant donné, calculer le rapport masse sur charge [m/z] des molécules détectées, de manière à obtenir un signal correspondant au nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge [m/z], en fonction du rapport m/z des molécules détectées.
En général, le calcul du rapport m/z est obtenu, en tenant compte d'une calibration préalable du spectromètre de masse utilisé, sous la forme d'une équation liant le rapport masse sur charge [m/z] et le temps de parcours dans le tube sous pression réduite des molécules ionisées.
La calibration consiste à utiliser un ensemble de molécules ou un microorganisme qui va fournir des molécules ionisées couvrant la gamme de masse correspondant à la caractérisation envisagée. Les rapports m/z de ces molécules ionisées vont servir de standards, afin de permettre à l'appareillage de mesurer les masses de manière adéquate.
Pour l'identification du microorganisme, la calibration pourra être réalisée à partir d'une souche de bactéries possédant des molécules ionisées ayant des rapports m/z couvrant la gamme de masses utilisées pour l'identification (typiquement dans la gamme allant de 2000 à 20000 Da dans le cas des levures, moisissures, bactéries ou parasites).
Tout type de spectromètre de masse MALDI-TOF peut être utilisé pour l'élaboration du spectre de masse. De tels spectromètres comprennent : i) une source d'ionisation (en générai, un laser UV) destinée à ioniser le mélange population de microorganisme(s)/agent antimicrobien/matrice ; ii) un accélérateur des molécules ionisées par application d'une différence de potentiel ; iii) un tube sous pression réduite dans lequel se déplacent les molécules ionisées et accélérées ; iv) un analyseur de masse destiné à séparer les ions moléculaires formés, en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ; v) un détecteur destiné à mesurer le signai produit directement par les ions moléculaires.
Dans le cadre de l'invention, l'analyse par MALDI-TOF est, de préférence, une analyse par MALDI-TOF linéaire, bien qu'une analyse par MALDI-TOF-TOF, MALDI-TOF avec réflectron, ou tout type d'analyseur de masse lié à une source MALDI ne soit pas exclue. Atitre d'exemple, l'invention est compatible avec l'usage d'instruments à source MALDI liés à une trappe ionique (MALDI-IT) ou à des analyseurs multiples de type quadripoles (Q), trappes ioniques (IT), orbitrapes (O), tube de mobilité ionique (IM)... De tels instruments peuvent ainsi présenter des configurations hybrides de type MALDI-Q-IT-TOF, MALDI-QQQ, MALDI-Q-TOF, MALDI-IT- Q-TOF, MALDI-Q-IT-O... Une analyse par MALDI TOF-TOF, bien que plus complexe, pourra par exemple être envisagée dans certains cas, notamment pour fragmenter les ions produits et apporter une information sur la nature des dites molécules ionisées. Elle mettra en œuvre un appareillage adapté à une telle analyse.
L'étape d'analyse par spectrométrie de masse permet de conclure si la population d'un microorganisme résistant à l'agent antimicrobien est présente sur la zone d'analyse.
Par « résistance », on entend un phénomène selon lequel un microorganisme ne présente pas une diminution de sa viabilité, ou une stagnation ou une diminution de sa croissance ou de sa reproduction, quand il est exposé à une concentration d'un agent antimicrobien qui est reconnue comme étant cliniquement efficace vis-à-vis dudit microorganisme en l'absence de résistance.
L'identification de la résistance, à partir du spectre de masse obtenu pour une zone de caractérisation considérée, peut se faire par la détection, sur le spectre de masse obtenu, d'un pic de masse donné, ou d'un changement de pic de masse par rapport à un spectre de masse de référence, notamment, grâce au spectre de masse de l'échantillon incubé sur la zone de référence ne comportant pas d'antimicrobien.
Elle peut également se faire par détection de la croissance du microorganisme en présence de l'agent antimicrobien. Cette croissance peut être caractérisée par une augmentation de la biomasse bactérienne au cours de la culture. Plus particulièrement, l'augmentation de biomasse peut être déterminée par comparaison du signal des pics caractéristiques du microorganisme à analyser par rapport à une substance de référence ajoutée sous forme dosée comme dans le procédé de Idelevich ét al, cité précédemment. Préférentiellement, la quantité de microorganismes déposée avant l'étape d'incubation peut être ajustée de façon à générer un signal insuffisant pour identifier avec confiance le microorganisme. La durée de l'étape d'incubation peut ensuite être optimisée pour que la croissance des microorganismes sensibles en absence d'antimicrobien ou de microorganismes résistants en présence ou en absence d'antimicrobien génère un signal suffisant pour identifier avec confiance ledit microorganisme. Un tel procédé a été utilisé par T. Horseman et al. qui ont montré, à l'aide d'un instrument commercialisé par la demanderesse, la possibilité de caractériser comme non-sensibles à un antibiotique les microorganismes identifiés avec une probabilité supérieure ou égale à 90% et comme sensibles les microorganismes non-identifiés (Horseman ét al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2020, 97(4):115093, Rapid Qualitative Antibiotic Resistance Characterization using VITEK MS).
Ainsi avantageusement, pour obtenir une classification robuste selon le procédé de l'invention, plusieurs dépôts par conditions peuvent être réalisés. En particulier, lorsque 4 dépôts par condition sont utilisés, une probabilité d'identification supérieure ou égale à 90%, pour au moins 3 dépôts sur 4, permet de caractériser l'isolat comme résistant et comme sensible dans le cas contraire.
Dans un mode réalisation particulier de la présente invention, le procédé comprend une étape de détermination de la résistance dudit microorganisme audit agent antimicrobien par observation de la présence de protéines du microorganisme en quantité telle qu'il est possible de conclure à la croissance du microorganisme malgré la présence dudit agent antimicrobien durant l'étape d'incubation.
Alternativement le procédé selon l'invention pourra notamment être mis en œuvre pour déterminer la concentration minimale inhibitrice pour la population d'au moins un microorganisme à caractériser en utilisant une gamme croissante d'antimicrobien déposé sur différentes zones d'échantillon de la plaque d'analyse.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, est la plus faible concentration d'agent antimicrobien capable d'inhiber in vitro toute croissance visible de la population de microorganisme étudiée à une température donnée et pendant une période de temps définie. Cette valeur caractérise l'effet bactériostatique d'un antibiotique sur une bactérie et plus généralement d'un antimicrobien sur un microorganisme. La CMI est spécifique d'un couple agent antimicrobien/microorganisme, chaque souche ayant sa propre valeur, en fonction des résistances naturelles et/ou acquises pour la molécule testée.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé de caractérisation permet l'indentification du genre, ou, de préférence, de l'espèce d'une population d'un microorganisme déposée sur la zone d'analyse. Les microorganismes qui peuvent être identifiés par le procédé de l'invention sont tout type de microorganismes, pathogènes ou non, rencontrés tant dans l'industrie que dans la clinique, qui peuvent connaître des phénomènes de résistance aux agents antimicrobiens. Ce peut être, de préférence, des bactéries, des moisissures, des levures ou des parasites. L'invention est particulièrement adaptée à l'étude des bactéries. A titre d'exemple de tels microorganismes, on peut citer les bactéries Gram- positives, Gram-négatives et les Mycobacteria. A titre d'exemple de bactéries Gram-négatives, on peut citer celles des genres : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Acinetobacter, Citrobacter, Aeromonas, Stenotrophomonas, Morganella et Providencia, et notamment Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.. A titre d'exemple de bactéries Gram-positives, on peut citer celles des genres : Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria et Clostridium.
Des spectres de référence obtenus par MALDI-TOF pour de tels micro- organismes correspondant à leurs protéines majoritaires, sont disponibles et enregistrés dans des bases de données disponibles avec les appareils MALDI-TOF commerciaux, et permettent, par comparaison, l'identification de la présence de tels microorganismes.
L'identification d'une population d'un microorganisme présent pourra donc comprendre les étapes suivantes : a) disposer d'un spectre de masse de référence, pour au moins un microorganisme et le plus souvent pour une série de micro- organismes, b) soumettre la population de microorganisme(s) et l'agent antimicrobien déposés sur la zone d'analyse et mis en présence de la matrice (correspondant à une zone de caractérisation selon l'invention), à une ionisation, c) acquérir un spectre de masse obtenu suite à cette ionisation, dans la gamme de masse d'intérêt pour l'identification du micro- organisme, d) comparer le spectre de masse obtenu à l'étape c) avec le spectre de référence et en déduire le genre, ou, de préférence, l'espèce d'au moins un microorganisme. Dans le cas de l'identification de microorganismes, une calibration est réalisée dans une gamme de masse correspondant à des masses élevées, typiquement dans la gamme allant de 2000 à 20000 Da, et de préférence dans la gamme allant de 3000 à 17000 Da. Le spectre de masse obtenu à l'étape c) est également compris dans cette gamme de masse.
La calibration pourra être effectuée en plaçant une population d'un microorganisme de référence dans une zone d'analyse de référence présente sur la plaque d'analyse et en procédant à son analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Un tel microorganisme de référence pourra être, par exemple, une bactérie E. coli. Pour cette calibration, on pourra utiliser les procédures décrites pour la réalisation de l'identification standard de microorganismes, dans les manuels d'utilisation des instruments MALDI-TOF commerciaux, tels que l'appareillage VITEK MS commercialisé par la société bioMérieux.
Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention, le procédé met en œuvre une seule analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d'ionisation MALDI par une seule ionisation d'une zone d'analyse, et utilisant pour l'analyse une seule calibration.
La description ci-après, en référence aux figures annexées permet de mieux comprendre l'invention sans caractère limitatif sur l'objet de l'invention.
La Figure 1 est une vue schématique de dessus d'une plaque d'analyse selon l'invention.
La Figure 2 est une coupe transversale selon l'axe B-B de la plaque d'analyse selon l'invention pendant l'étape d'incubation.
La figure 3 est une vue en coupe transversale selon l'axe B-B de la plaque d'analyse selon l'invention pendant l'étape d'élimination de liquide excédant selon un premier mode de réalisation,
La figure 4 est une vue en coupe transversale selon l'axe B-B de la plaque d'analyse selon l'invention pendant l'étape d'élimination de liquide excédant selon un deuxième mode de réalisation,
La figure 5 est une vue en coupe transversale selon l'axe B-B de la plaque d'analyse selon l'invention après l'étape d'élimination de liquide excédant quel que soit le mode de réalisation,
La Figure 6 est une vue perspective éclatée d'un système selon l'invention comprenant une cassette renfermant une plaque d'analyse selon l'invention
La Figure 7 est une coupe transversale selon l'axe A-A du système selon l'invention représenté en figure 6. Dans un premier temps, la plaque d'analyse selon l'invention va être décrite en référence à la figure 1. La figure 1 représente un modèle de plaque d'analyse 10 selon l'invention adaptée à l'analyse par spectrométrie de masse. Ladite plaque d'analyse 10 comprenant 48 zones d'analyse 11 et trois zones d'analyse de référence 12. Les zones d'analyse 11 sont espacées et sont agencées de manière à ce qu'elles soient distinctes les unes des autres. Les zones d'analyse de référence 12 sont positionnées entre les rangées de zones d'analyse 11. Plus particulièrement dans l'exemple illustré en figure 1, la plaque d'analyse 10 comprend quatre colonnes (1-4) de douze rangées (A-L) de zones d'analyse 11. Chaque zone d'analyse 11 est de forme circulaire et est configurée pour circonscrire une ou plusieurs gouttes de populations de microorganisme préalablement prélevées. Selon l'invention, la plaque d'analyse 10 selon l'invention est réalisée au moins en deux matériaux distincts : un pour les zones d'analyse 11, 12 et un adapté à l'ionisation MALDI et formant la plaque d'analyse 10.
Dans un deuxième temps, en référence aux figures 2 à 5, nous allons décrire certaines étapes du procédé de caractérisation selon l'invention par la description de la plaque d'analyse 10 selon l'invention.
Plus particulièrement, en Figure 2, la plaque d'analyse 10 selon l'invention est disposée sur un support d'incubation 40 humidifié soit par un élément d'incubation 42 soit par le milieu de culture 41 permettant la croissance des microorganismes et disposé sur chaque zone d'analyse 11, 12. Comme on peut le voir, le milieu de culture 41 est déposé sur une zone d'analyse 11 sur laquelle un agent microbien (non représenté) et une population de microorganismes 20 sont déjà déposés. Le milieu de culture 41 ainsi que les dépôts précédents sont circonscrits à la zone d'analyse 11 grâce au matériau poreux de ladite zone d'analyse 11. Cette configuration illustrée en figure 2 illustre donc le système 1 selon l'invention pendant l'étape d' incubation.
En figures 3 et 4, le support d'incubation 40 ou l'élément d'incubation 42 est retiré et on positionne à la place, en dessous de la plaque d'analyse 10, un dispositif d'aspiration 50, 51 permettant l'élimination de liquide excédant. Le dispositif d'aspiration 50, 51 pouvant se présenter soit sous la forme d'un dispositif d'aspiration sous vide 50 (figure 3) ou bien sous la forme d'un papier buvard 51 (figure 4). En figure 5 est illustré la plaque d'analyse 10 selon l'invention une fois l'excédent de liquide éliminé : les microorganismes 20 se trouvent naturellement retenus à la surface de la zone d'analyse 11, sans pouvoir la traverser grâce à la taille des pores la surface. Le dessous de la plaque d'analyse 10 reste ainsi vierge de tout microorganisme potentiellement infectieux.
En référence aux figures 6 et 7, est décrite une cassette 100 dans laquelle est intégrée la plaque d'analyse 10 selon l'invention. La cassette 100 comprend un couvercle 101, un joint 102 ajouré sur lequel la plaque d'analyse 10 vient se positionner et un récipient 103 présentant un volume interne 104 de réception ouvert sur le dessous de la plaque d'analyse 10. Ledit volume interne 104 du récipient 103 est conformé pour recevoir totalement ou partiellement un support d'incubation 40 ou un élément d'incubation 42 ou encore un dispositif d'aspiration 50, 51.
Le protocole d'utilisation de cette cassette peut être décrit par les étapes suivantes : enlever le couvercle de la cassette, positionner un matériau poreux humide à l'intérieur du récipient placer le joint ajouré au-dessus du récipient, positionner une plaque d'analyse sur le joint ajouré, déposer 2 pl d'un inocula comprenant au moins une population de microorganisme sur chaque zone d'analyse porteuse de l'antibiotique, remettre le couvercle en le clipsant sur le joint ajouré incuber la cassette à 37°C pendant 2h (ou plus), retirer l'ensemble formé par le couvercle, le joint ajouré et la plaque d'analyse et le poser sur un deuxième récipient contenant un matériau poreux absorbant sec, tel qu'un papier buvard absorbant, laisser le papier buvard aspirer par capillarité l'ensemble des gouttes de liquides présentes sur la plaque d'analyse, enlevé le couvercle, ajouter 1 pl d'une matrice d'HCCA sur les zones d'analyse porteuses, à la fois, de l'antibiotique et des bactéries, retirer la plaque d'analyse et finaliser son séchage à l'air libre introduire la plaque d'analyse dans une source d'ionisation MALDI pour une analyse par spectrométrie de masse. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. Les analyses ont été effectuées avec l'appareillage VITEK MS commercialisé par la société bioMérieux. Les analyses ont été réalisées, dans chacun des exemples ci-après, à la fin de l'acquisition. Les spectres ont été acquis sur toutes les zones de caractérisation et ensuite analysés : pour l'identification, l'analyse du spectre a été réalisée à l'aide du moteur de calcul VITEK MS et de la base de données V3.2.0.
Exemple 1 : Isolement de microorganismes bactériens et identification à l'aide de VITEKMS
L'expérience a été réalisée en mettant en œuvre les étapes ci-dessous :
12 microorganismes ont été isolés sur gélose Columbia au sang (référence 43041, bioMérieux) après culture d'une nuit à 37°C,
Ces microorganismes ont été déposés sur les zones d'analyse d'une plaque d'analyse VITEK MS (référence 410893, bioMérieux) lpl de matrice HCCA, acide alpha-cyano 4 hydroxycinnamique (VITEK MS - CHCA, référence bioMérieux 411071) a été déposé sur les zones d'analyse comprenant déjà les microorganismes.
Les plaques d'analyse sont laissées sécher selon les recommandations du fournisseur.
Une analyse par spectromètre de masse MALDI-TOF a été réalisée avec un appareillage VITEK MS (référence 4700563, bioMérieux).
Les résultats ont été relevés dans Myla (bioMérieux) et reportés dans le TABLEAU 1.
TABLEAU 1 : Microorganismes identifiés
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Exemple 2 : Préparation de plaques d'analyse selon l'invention avec des antibiotiques à différentes concentrations
Différentes solutions d'antibiotique ont été déposées sur des plaques d'analyse ayant la même géométrie que les cibles VITEK MS (référence 410893, bioMérieux), mais ayant des zones d'analyse réalisées en un matériau poreux. Plus précisément, 48 zones d'analyse, réalisées en matériau poreux, réparties en 3 groupes de 16 zones. Ces zones sont disposées en 4 colonnes de 12 lignes. Chaque colonne est identifiée par un chiffre de 1 à 4. Chaque ligne est identifiée par une lettre de A à L. Ainsi la zone d'analyse 13 se trouve à l'intersection de la 9ème ligne et de la 3ème colonne. La plaque d'analyse comporte également 3 positions de calibration, respectivement au centre des 3 groupes de 16 zones d'analyse. Contrairement aux zones destinées aux échantillons, ces zones de calibration ne sont pas réalisées en matériau poreux.
Les solutions suivantes d'antibiotique ont été préparées dans de l'eau : solution d'Oxacilline (référence Sigma 28221) à 0.125 pg/ml, 0.25 pg/ml, 0.5 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, 4 pg/ml, 8 pg/ml, 16 pg/ml, 32 pg/ml, 64 pg/ml, 128 pg/ml et 256 pg/ml ; solution d'Amoxicilline (référence Sigma A8523) à 2 pg/ml ; solution de Ceftriaxone (référence Sigma C5793) à 24 pg/ml ; solution de Méropénème (référence Sigma M2574) à 2 pg/ml.
2 pi de chaque solution d'antibiotique ont été déposés sous la forme d'une goutte, sur les zones d'analyse de plaques d'analyse. Les plaques d'analyse ont été incubées à 37°C en atmosphère sèche, jusqu'à ce que les gouttes soient complètement sèches. Ces plaques d'analyse ainsi fonctionnalisées ont été conservée à 4°C dans un blister plastique à l'abris de l'humidité et de la lumière jusqu'à utilisation.
Certaines plaques d'analyse ont été entièrement fonctionnalisées uniquement avec de l'Oxacilline à 2 pg/ml.
D'autres plaques d'analyse ont été fonctionnalisées avec 4 dépôts d'Oxacilline à 0.125 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 0.25 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 0.5 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 1 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 2 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 4 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 8 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 16 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 32 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 64 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 128 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 256 pg/ml.
Enfin certains plaques d'analyse ont été fonctionnalisées avec 16 dépôts d'Amoxicilline à 2 pg/ml, 16 dépôts de Ceftriaxone à 24 pg/ml, 16 dépôts de Méropénème à 2 pg/ml.
Cette fonctionnalisation préalable des plaques d'analyse est ainsi particulièrement avantageux puisqu'elle permet de disposer d'une cible prête à l'emploi, préférablement fabriquée de façon industrielle.
Il est également possible de fabriquer à l'avance des plaques d'analyse comportant 48 zones activées avec le même antibiotique afin de tester plusieurs microorganismes simultanément. Il est même possible de fabriquer des plaques d'analyse fonctionnalisées avec des combinaisons et des concentrations d'antibiotique adaptées à la nature des microorganismes et/ou au contexte réglementaire et épidémique d'une région, voire d'un laboratoire donné, comme cela est classiquement pratiqué pour les cartes VITEK"^ de la demanderesse. Une plaque d'analyse avec une combinaison de différents antibiotiques permet ainsi de caractériser simultanément les propriétés de résistance/sensibilité d'un microorganisme à une pluralité d'antibiotique. De façon analogue, la présence de zones d'analyse avec différentes concentrations d'antibiotique permet de prédire la concentration minimale inhibitrice (CMI) d'un microorganisme.
Exemple 3 : optimisation de la caractérisation de la résistance aux antibiotiques selon l'invention
Des plaques d'analyse, fonctionnalisées selon l'exemple 2, ont été placées dans une cassette, telle qu'illustrée aux figures 3 à 5, pour permettre leur manipulation. Cette cassette comprend un joint ajourée de façon à pouvoir disposer la plaque d'analyse sur une éponge imbibée à saturation de milieu de culture Muller-Hinton. L'éponge imbibée d'un milieu de culture fait office de support, elle est en matériau poreux tel que décrit dans la description.
La concentration minimale inhibitrice (CMI en pg/ml) a été déterminée par microdilution en bouillon, technique très largement utilisée par l'homme du métier.
5 Les souches de référence figurant dans le Tableau 2 ont été analysées.
[TABLEAU 2] : Caractéristiques des souches de référence utilisées.
Figure imgf000030_0001
Dans la colonne Phénotype, RA signifie résistance à 'Amoxiciline, RC signifie résistance à la Ceftriaxone, RM signifie résistance à la Méropénème, RO résistance à l'Oxacilline, SA signifie sensible à l' Amoxiciline, SC signifie sensible à la Ceftriaxone, SM signifie sensible à la Méropénème, SO sensible 0 à l'Oxacilline.
Les souches de référence N°1 à 7 ont été diluées à 0.5 McFarland (McF) en milieu Muller- Hinton (référence bioMérieux AEB 110699), puis rediluées au 1/10°, 1/50° et 1/100°, toujours en milieu Muller-Hinton. 5 Pour chaque dilution de microorganismes, des gouttes de 2pl ont été déposées sur 4 zones d'analyse d'une plaque d'analyse selon l'invention. Les dilutions d'E. coli et de K. pneumoniae ont été analysées sur des plaques d'analyse avec 16 dépôts d'Amoxicilline, 16 dépôts de Ceftriaxone et 16 dépôts de Méropénème. Les dilutions de S. aureus ont été analysées sur des plaques d'analyse avec 2 pg/ml d'Oxacilline. 0 Des plaques d'analyse témoins, c'est-à-dire non fonctionnalisées (sans antibiotique), ont également été préparées. Les témoins négatifs ont été traités comme expliqué ci-dessous en supprimant l'étape d'incubation à l'étuve. Autrement dit, les gouttes ont été aspirées aussitôt après le dépôt. Les témoins positifs ont été traités en tout point comme expliqué ci-dessous.
Un couvercle a été placé sur la cassette contenant la plaque d'analyse de façon à se 5 clipser sur la cassette et à fermer le dispositif sans toucher le haut des gouttes. Les cassettes d'analyse ainsi préparées ont été mises à incuber à l'étuve à 37°C pendant 2, 3, 4 ou 5 heures.
A l'issue de l'étape d'incubation, les plaques d'analyse sont placées sur un papier buvard très absorbant sec, ayant une capacité d'absorption de 25 pL.cm-2. De telle sorte que les gouttes présentes sur la plaque d'analyse soient aspirées par capillarité à travers les zones d'analyse réalisées en matériau poreux.
Le couvercle est ensuite déclipsé.
Un calibrant (souche d'E. coli ATCC 8739 cultivée sur gélose Columbia au sang, référence 43041, bioMérieux) a été déposé sur les zones de calibration. lpl de matrice HCCA, acide alpha-cyano 4 hydroxycinnamique (VITEK MS -CHCA, référence bioMérieux 411071) a été déposé sur les zones d'analyse, comprenant les microorganismes et l'agent antimicrobien, et sur les zones de calibration comprenant le calibrant.
La plaque d'analyse est ensuite séchée et analysée avec le VITEK MS comme décrit dans l'exemple 1.
La dilution des microorganismes a été choisie pour conduire à une probabilité d'identification inférieure ou égale à 60% sur les plaques témoins négatifs, voir même, le plus souvent, à une absence d'identification (quelle qu'en soit la raison indiquée par VITEK MS). Aucune identification à une autre espèce que celles étudiées n'a été observée, sinon elle aurait été considérée comme un résultat invalide. Des dilutions au 1/100° et au 1/10° ont été retenues respectivement pour les souches à Gram négatif et pour les souches à Gram positif.
La période d'incubation a été choisie pour conduire à une probabilité d'identification supérieure à 80% sur les cibles témoins positif. En général, une telle probabilité a été observée après 2 heures d'incubation pour les souches à Gram négatif et après 4 h pour les souches à Gram positif. Cependant des résultats conformes ont été obtenus pour toutes les souches après 4h d'incubation et il a semblé plus simple d'utiliser la même période d'incubation pour tous les microorganismes.
Dans ces conditions, à savoir 4h d'incubation pour respectivement une dilution au 1/100° et au 1/10° des souches à Gram négatif et positif, des identifications avec une probabilité supérieure ou égale à 90% ont été observées pour au moins 3 dépôts sur 4 lorsque le microorganisme de référence était résistant à l'antibiotique. A l'inverse, des absences d'identification ou des identifications avec une probabilité inférieure à 90% ont été observées pour au moins 3 dépôts sur 4 lorsque le microorganisme de référence était sensible à l'antibiotique testé. Ces résultats indiquent que de façon avantageuse, une probabilité d'identification supérieure ou égale à 90% pour au moins 3 dépôts sur 4 peut être utilisé comme seuil pour différencier les souches résistantes des souches sensibles.
Il est cependant possible que certaines espèces aient un comportement différent et nécessitent une optimisation des conditions d'analyses (dilutions, période d'incubation) ou d'interprétation (probabilité d'identification) différentes de celles observées pour les espèces étudiées ici.
Exemple 4 : Caractérisation de la résistance aux antibiotiques selon l'invention
Les isolats identifiés dans l'exemple 1 ont été dilués à 0.5 McFarland (McF) en milieu Muller-Hinton (référence bioMérieux AEB 110699), puis redilués au 1/100° pour les bactéries à Gram négatif et au 1/10° pour les bactéries à Gram positifs, toujours en milieu Muller- Hinton.
Des gouttes de 2pl des dilutions finales ont été déposées sur les zones d'analyse des plaques d'analyse selon l'invention tel que décrit dans l'exemple 2. Comme précédemment, les dilutions d'E. coli et de K. pneumoniae ont été analysés sur les cibles avec 16 dépôts d'Amoxicilline, 16 dépôts de Ceftriaxone et 16 dépôts de Méropénème. Les dilutions de Staphylocoques ont été analysés sur les cibles avec 2 pg/ml d'Oxacilline.
Lorsque aucun dépôt d'échantillon n'a été prévu sur une zone d'analyse, cette zone est recouverte par un film plastique Parafilm M (Bemis North America) avant de placer la plaque d'analyse dans la cassette. De cette façon, la zone d'analyse n'a pas été mise en contact avec le milieu de culture contenu dans l'éponge imbibée à saturation. Les positions non utilisées dans la première analyse sont ainsi restées utilisables pour une analyse ultérieure.
L'analyse a été conduite selon le même mode opératoire que dans l'exemple 3 avec une incubation de 4h pour tous les microorganismes. De même, les résultats ont été interprétés comme dans l'exemple 3, c'est-à-dire avec un seuil de probabilité d'identification supérieure ou égale à 90% pour au moins 3 dépôts sur 4.
Les résultats sont reportés dans les TABLEAUX 3 à 6 ci-dessus. Ces résultats montrent, qu'une identification correcte des bactéries par MALDI-TOF a pu être obtenue à partir de la première série d'acquisitions pour toutes les zones d'analyse, avec un niveau de confiance de 99,9%, montrant que les conditions expérimentales permettent encore de discriminer les différentes espèces.
[TABLEAU 3] : Analyse des isolats 1 à 4 avec une cible Amoxicilline, Ceftriaxone et Méropénème
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Les résultats du Tableau 3 montrent que l'isolat 1 est caractérisé comme résistant à l'Amoxicilline, mais sensible au Ceftriaxone et au Méropénème. L'isolat 2 est, quant à lui, sensible aux trois antibiotiques. L'isolat 3 est résistant à l'Amoxicilline et au Ceftriaxone mais sensible au Méropénème. Enfin l'isolat 4 est résistant aux trois antibiotiques.
Ces résultats démontrent qu'il est possible de caractériser la résistance de plusieurs microorganismes, vis-à-vis de plusieurs antibiotiques, sur une même plaque d'analyse de l'invention.
[TABLEAU 4] : Analyse des isolats 5 à 8 avec une cible Amoxicilline, Ceftriaxone et Méropénème
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0001
L'isolat 5 est ainsi caractérisé comme un isolat d’E. coli résistant à l'Amoxicilline, mais sensible au Ceftriaxone et au Méropénème. L'isolat 6 est un isolat de K. pneumoniae résistant aux 3 antibiotiques. L'isolat 7 est un isolat de K. pneumoniae résistant à l'Amoxicilline, mais sensible au Ceftriaxone et au Méropénème. L'isolat 8 est un isolat de K. pneumoniae résistant à l'Amoxicilline et au Ceftriaxone, mais sensible au Méropénème.
Là encore, les inventeurs ont caractérisé la résistance de plusieurs microorganismes, y compris d'espèce différentes, vis-à-vis de plusieurs antibiotiques, sur une même plaque d'analyse. II est également possible de caractériser plusieurs microorganismes sur une cible partiellement utilisée, comme présenté dans le Tableau 5 ci-dessous.
[TABLEAU 5] : Analyse des isolats 9 à 12 avec une cible Oxacilline
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
L'isolat 9 est ainsi caractérisé comme un isolat de S. aureus résistant à l'Oxacilline, alors que les isolats 10 et 11 de S. aureus et l'isolat 12 de S. epidermidis y sont sensibles.
A noter que les positions El à L4 n'ont pas été utilisées dans cette analyse. Elles ont été protégées par un film plastique Parafilm M et sont utilisables pour une nouvelle analyse (cf. TABLEAU 6).
[TABLEAU 6] : Deuxième analyse des isolats 9 à 12 avec la même plaque d'analyse que pour le
TABLEAU 4.
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
Les mêmes résu tats ont été obtenus dans les Tableaux 5 et 6 dans deux analyses successives avec les mêmes isolats sur la même plaque d'analyse, ce qui prouve la possibilité de réutiliser une deuxième fois une zone d'analyse partiellement utilisée une première fois, ce qui est avantageux pour éviter de gaspillage les plaques d'analyse. Par la même occasion, cette expérience démontre la reproductibilité de la technique.
Exemple 5 : Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) selon l'invention Les dilutions de Staphylocoques des souches de référence et des isolats ont été analysées sur les plaques d'analyse selon l'invention avec 4 dépôts d'Oxacilline à 0.125 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 0.25 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 0.5 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 1 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 2 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 4 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 8 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 16 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 32 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 64 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 128 pg/ml, 4 dépôts d'Oxacilline à 256 pg/ml.
La souche de référence N°6 a été identifiée avec une probabilité de plus de 99.9% comme S. aureus dans 3 dépôts sur 4 avec une concentration d'Oxacilline de 0.125 pg/ml, pour un dépôt sur 4 pour une concentration de 0.25 pg/ml mais n'a pas été identifiée pour les concentrations supérieures d'Oxacilline. Cette souche a une CMI de 0.25 pg/ml (cf. TABLEAU 2), ce qui correspond à la plus faible concentration inhibitrice de croissance observée par le procédé de la présente invention.
De façon surprenante, un phénomène similaire a été observé avec la souche de référence N° 7. S. aureus a été identifié avec une probabilité de 99.9% de 0.125 à 64 pg/ml d'Oxacilline mais n'a pas été identifié pour les concentrations de 128 et 256 pg/ml. Une CMI de 128, conforme à celle du TABLEAU 2, est ainsi mise en évidence.
Les isolats 9 à 12 ont été analysés de la même façon et une CMI de 16 pg/ml a été observée pour l'isolat 9, de 0.25, 0.5 et 0.125 respectivement pour les isolats 10 à 12. Ces observations sont conformes aux prédictions de résistance à l'Oxacilline de l'Exemple 4, l'isolat 9 est résistant contrairement aux isolats 10 à 12. Elles permettent de surcroit une caractérisation plus fine des propriétés de résistance ou de sensibilité des microorganismes en estimant la concentration minimale inhibitrice (CMI).
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés aux figures annexées. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims

38
REVENDICATIONS
1 - Plaque d'analyse configurée pour permettre une caractérisation de microorganismes par spectrométrie de masse, ladite plaque d'analyse comprenant au moins une zone d'analyse configurée pour un échantillon biologique contenant une population d'au moins un microorganisme, caractérisée en ce que tout ou partie de ladite zone d'analyse est réalisée en un matériau poreux, ladite zone d'analyse comprenant au moins un agent antimicrobien.
2 - Plaque d'analyse selon revendication 1, caractérisée en ce que la taille des pores de ladite zone d'analyse est inférieure à la taille dudit au moins un microorganisme à caractériser.
3 - Plaque d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la plaque est au moins partiellement réalisée en polymère recouvert d'une couche d'acier inoxydable ledit polymère contenant préférentiellement un matériau conducteur.
4 - Plaque d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la plaque comporte une pluralité de zones d'analyse, chaque zone d'analyse étant porteuse d'au moins un agent antimicrobien.
5 - Plaque d'analyse selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'au moins une première zone d'analyse parmi la pluralité, est porteuse d'un premier agent antimicrobien, et une seconde zone d'analyse parmi la pluralité et distincte de la première zone d'analyse, est porteuse d'un second agent antimicrobien différent du premier agent antimicrobien.
6 - Système comprenant : une plaque d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, sur laquelle une population d'au moins un microorganisme et un milieu de culture sont déposés sur au moins une zone d'analyse et un élément d'incubation configuré pour maintenir l'humidité la au moins une zone d'analyse, 39 ledit élément d'incubation étant positionné sous la plaque d'analyse.
7 - Procédé de caractérisation d'une population d'au moins un microorganisme, la caractérisation comprenant au moins la détermination de la résistance éventuelle d'une population d'un microorganisme à au moins un agent antimicrobien, caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes successives suivantes : une étape consistant à fournir une plaque d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un système selon la revendication 7, pour une caractérisation de ladite population d'au moins un microorganisme, une étape de dépose de la population dudit au moins un microorganisme sous forme liquide sur ladite au moins une zone d'analyse au contact de l'agent antimicrobien préalablement déposé sur ladite zone d'analyse, une étape d'incubation, consistant à conserver ladite plaque d'analyse, dans des conditions et pendant une période suffisante, pour permettre l'interaction dudit au moins un agent antimicrobien et dudit au moins un microorganisme présent, une étape d'élimination du liquide contenant la population dudit au moins un microorganisme par aspiration à travers les pores de la zone d'analyse, une étape de dépose sur ladite au moins une zone d'analyse, d'une matrice adaptée à la technique d'ionisation MALDI, une étape d'analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d'ionisation MALDI, d'une population dudit au moins un microorganisme déposée sur ladite zone d'analyse permettant de conclure si une population d'un microorganisme résistant à l'agent antimicrobien est présente sur la zone d'analyse.
8 - Procédé de caractérisation selon la revendication 7, caractérisé en ce que le système comprend un support d'incubation, réalisé en matériau poreux.
9 - Procédé de caractérisation selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit support d'incubation est humidifié par un milieu de culture ou par l'élément d'incubation. 40
10 - Procédé de caractérisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'étape d'incubation est réalisée dans une chambre d'incubation.
11 - Procédé de caractérisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'étape d'incubation est réalisée pendant au moins 2 heures, de préférence pendant au moins 4 heures, et plus préférentiellement pendant une période de 4 à 12 heures.
12 - Procédé de caractérisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détermination de la résistance dudit microorganisme audit agent antimicrobien par observation de la présence de protéines du microorganisme en quantité telle qu'il est possible de conclure à la croissance du microorganisme malgré la présence dudit agent antimicrobien durant l'étape d'incubation.
13 - Procédé de caractérisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce qu'une population d'un seul microorganisme à caractériser est déposée.
14 - Procédé de caractérisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce que la population de microorganisme(s) est obtenue après une étape de concentration, enrichissement et/ou purification et/ou correspond à une colonie ou à une fraction de colonie obtenue après croissance sur un milieu adapté, notamment un milieu gélosé.
15 - Procédé de caractérisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisé en ce que la caractérisation comprend, en plus, l'identification du genre, ou de préférence, de l'espèce d'une population d'un microorganisme déposée sur la zone d'analyse.
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