CN114829621A - 细菌对抗生素的敏感性或抗性的质谱法测定 - Google Patents

Abstract

一种用于测定至少一种鉴定的细菌对至少一种抗生素的敏感性或抗性的方法，所述方法包括下述步骤：a)使包含所述细菌的样品与所述至少一种抗生素接触，当所述细菌对至少一种抗生素“敏感”时，所述抗生素诱导细菌壁和/或细胞质膜的破裂并且引起所述细菌的细胞内化合物的释放，b)使所述样品与所述至少一种抗生素一起温育，c)通过去除完整的细菌和细胞碎片来纯化所述样品，d)通过质谱法分析纯化的样品，e)检测所述细菌的至少一种特征性蛋白的至少一个峰的存在或不存在，和f)测定所述细菌群体对所述抗生素的敏感性或抗性。

Description

细菌对抗生素的敏感性或抗性的质谱法测定

技术领域

本发明涉及微生物学领域，并且更具体而言，涉及细菌对诱导其壁和/或其细胞质膜破裂的抗生素的敏感性或抗性的质谱法测定。

背景技术

在19世纪，微生物的存在及其在传染病中的作用的发现使得能够设想后者的治疗。针对细菌的斗争始于1907年开发的胂凡纳明，其成功地用于治疗梅毒。然而，正是青霉素，随后为众多其它抗生素的发现，导致了其使用的广泛化。抗生素已使得能够挽救生命且改善患者健康，并且无疑是现代医学的最伟大成就之一。

抗生素的显著功效已导致其在人和动物健康中的大量和重复使用。因此，它们已不幸地成为其自身成功的牺牲品：它们的反复施用以及有时的过度施用，已导致对其抗性的细菌菌株的出现。因此，在细菌群体中，可能天然存在通过各种机制部分或完全抵抗抗生素作用的部分。因此，当细菌经受抗生素时，对其敏感的那些细菌被破坏，仅留下存活下来的细菌，其可能增殖。抗生素的应用构成了有利于抗性细菌的选择压力。细菌可以通过遗传突变自发地获得其抵抗给定抗生素的能力，但也可以通过DNA片段从一种细菌到另一种细菌的传递来获得这种能力，所述传递加速抗性的传播。

起初孤立的这些抗性已变得大量且令人担忧。某些菌株是多药抗性的，即对几种抗生素抗性。其它菌株甚至变得完全抗性，即对几乎所有可用的抗生素抗性。这种现象在法国仍是罕见的，但一直在增加，使医生陷入治疗僵局，因为他们不再具有用于对抗感染的任何解决方案。

根据世界卫生组织(World Health Organization)，“对抗生素的抗性目前构成了对世界健康的最严重威胁之一”。由于这些医药产品的滥用，抗生素抗性被认为是法国每年12500例死亡的原因，并且在2050年可能成为全世界死亡率的主要原因。

此外，重要的是要注意，用抗生素治疗对于患者并非总是小事。事实上，抗生素具有一些不期望的效应，其取决于分子而变。大多数是轻微的，但有些可能是严重的，或甚至是重度的。因此，某些抗生素可能由于不期望的副作用(特别是神经毒性和肾毒性)而增加患者的发病率或死亡率(Poirel L等人，2017)。这特别是作用于某些细菌的细菌壁和/或质膜的某些抗生素的情况。例如，粘菌素，作用于细菌细胞质膜的多粘菌素组中的一种抗生素，将其自身附着至肾单位的肾小管细胞的膜表面，其以蛋白尿性间质性肾炎反映。通过阻断乙酰胆碱的突触前释放且减少突触后受体的敏感性，粘菌素还具有神经肌肉阻断效应(Spapen，2011)。

尤其是在以高剂量的治疗期间，必须特别监测这些效应，尤其是神经毒性效应。因此，这些抗生素保留用于极端情况，例如当细菌对所有其它抗生素抗性时，以及用于局部使用，例如皮肤、粘膜、眼或耳感染的局部治疗。在中耳炎的情况下，必须牢记在穿孔的鼓膜上施用多粘菌素可能导致不可逆的耳蜗和前庭毒性。

由于上文提到的所有原因，只有在一种或多种致病菌对抗生素敏感时才必须使用抗生素，并且其中一些抗生素只保留用于最后手段的治疗。

在这个上下文中，优选在起始治疗之前或否则尽快地，所鉴定细菌对抗生素的敏感性或抗性的快速测定是必不可少的。

目前，临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)(CLSI)和欧洲抗菌药物敏感性测试委员会(European Committee onAntimicrobial Susceptibility Testing)(EUCAST)，均推荐肉汤中的微量稀释或微量稀释肉汤(MDB)的表型方法，特别是用于测定对在细胞质膜水平上起作用的抗生素多粘菌素的抗性。该方法可以被视为参考方法，但它花费很长的时间，相当难以实施，并且不适合于临床微生物实验室的限制条件(Poirel L等人，2017)。此外，对于作用于细胞质膜的某些抗生素特别是粘菌素的敏感性的测定，已描述了无法重现且无法解释的结果，很可能是由于对粘菌素的异质抗性的现象(Landman D等人，2013)。最后，包含赋予质粒抗性的质粒的菌株并非总是被检测到。

其它经典方法包括在琼脂中稀释或者从盘或梯度扩散，没有被CLSI和ECAST明确地推荐用于某些抗生素，如多粘菌素。这可以通过其聚阳离子性质来解释，这促进了其在表面上的吸附及其形成胶束的能力，所述胶束具有在琼脂中正确扩散方面的困难(HindlerJA等人，2013)。此外，异质抗的现象似乎使这些方法的使用更加复杂(Landman D等人，2013)。

特别是在申请WO 2015/48696中，还提出了替代表型方法的其它方法。该申请描述了通过以下用于测定敏感性的方法：与浓度接近于最小抑菌浓度(MIC)的抗生素接触，随后为机械或化学裂解，然后为裂解程度的测定。通过将该裂解程度诊断阈值的比较来测定敏感性。裂解程度特别使用裂解的细菌细胞外存在的标记细胞内化合物来测定。因此，已提出使用由考马斯蓝的染色、ATP发光的测量、或与核酸杂交的具有荧光标记的肽核酸(PNA)探针的使用。

然而，除使用抗生素之外，这些方法还需要特别是借助于去污剂裂解细菌壁的条件。目前，去污剂的使用被视为与MALDI-TOF质谱法不相容。事实上，去污剂生成掩盖来自蛋白质的信号的离子。此外，细菌含有具有生物化学结构的壁，所述生物化学结构可能从一个物种到另一个物种改变。相应地，不同物种可能或多或少对裂解条件抗性，并且如果要避免假阴性或假阳性，则这些裂解条件的选择可能很棘手。

在与抗生素接触且未培养后，通过MALDI-TOF用于检测抗性机制的方法是已知的。特别地，在由Bruker Daltonik GmbH公司提交的申请WO 2018/099500和WO 2011/154517中，检测到其中β-内酰胺抗生素通过β-内酰胺酶的作用的水解。在这些申请中，在与细菌样品的β-内酰胺酶反应后，检测到抗生素质量的变化。这些方法需要在β-内酰胺酶作用一定时间后测量活性抗生素和水解抗生素的水平。对于β-内酰胺酶如KPC，这个时间可能为1到2小时，但对于细胞中较低活性或较不丰富的β-内酰胺酶，这个时间一般必须长得多(Mirande等人，2015)。在这些方法中并未直接观察到细菌蛋白质。并未调查在抗生素的作用下的细菌裂解。

此外，在抗生素存在下培养微生物后，用于在MALDI-TOF中检测抗性的方法是已知的，并且例如在申请WO 2014/187517、US 2008/009029和EP 2 801 825中进行描述。

在申请WO 2014/187517中，当微生物对抗生素抗性时，该方法测量细菌生物量的增加。然而，在申请US 2008/009029中，当微生物对抗生素抗性时，该方法描述了在培养过程中蛋白质细菌模式的变化。因此，这些方法需要足够长的培养时间，以确保细菌通过繁殖，任选地在潜伏期后或不再分裂(WO 2014/187517)，或者通过改变或不改变其蛋白质模式(US 2008/009029)来响应抗生素的作用。此外，在某些物种中并且对于某些类型的抗性，不存在蛋白质模式的变化。

在这个上下文中，本发明的目的是提出用于测定至少一种鉴定的细菌对至少一种抗生素的敏感性或抗性的方法，其允许克服现有技术方法的缺点，即供应廉价的方法，而不使用去污剂，无需对每个物种特异性的试剂，在短时间内(小于一小时)给出结果，并且可用于常规临床实践中，无需高素质的人员。

发明内容

为此，本发明提出了用于测定至少一种鉴定的细菌对至少一种抗生素的敏感性或抗性的新方法，其包括下述步骤：

a)使包含所述细菌的样品与所述至少一种抗生素接触，如果所述细菌被认为对所述至少一种抗生素“敏感”，所述抗生素诱导细菌壁和/或细胞质膜的破裂并且引起所述细菌的细胞内化合物的释放，

b)使所述样品与所述至少一种抗生素一起温育，

c)通过去除完整的细菌和细胞碎片来纯化所述样品，

d)通过质谱法分析纯化的样品，

e)检测所述细菌的至少一种特征性蛋白的至少一个峰的存在或不存在，

f)测定所述细菌群体对所述抗生素的敏感性或抗性。

在本发明的方法的上下文中，样品可以来自不同的来源。例如，我们可以提到具有生物起源，特别是动物或人的样品。此类样品可以对应于生物流体的样品，例如全血、血清、血浆、尿、脑脊液、有机分泌物，组织样品或分离的细胞。该样品可以按原样使用，或者优选地，在它与抗生素接触之前，经历通过本领域技术人员已知的方法的富集或培养类型的制备、浓缩和/或提取或纯化步骤。然而，所述制剂不能对应于裂解步骤，其导致在与抗生素接触之前的微生物分解及其内容物的损失。样品可以以接种物的形式使用。

最经常地，样品可能已预先在肉汤中或在琼脂上培养，以便使其富含细菌。所述培养基、琼脂或肉汤是本领域技术人员熟悉的。

样品将优选包含单一细菌种类。然而，不排除包含几种细菌的样品的使用。在这种情况下，优选的是细菌已知很可能发展不同的抗性机制，以便知道哪些呈现将被鉴定的抗性。

可以通过本发明的方法表征的细菌是在工业和临床实践中遇到的所有细菌，致病的或非致病的两者。

在本发明的意义上，术语细菌涵盖革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

有利地，细菌是革兰氏阴性菌，优选地选自下述种和亚种：大肠杆菌(Escherichiacoli)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、肠道沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella enteriticaserotype Enteritidis)、肠道沙门氏菌副伤寒B血清型爪哇变种(Salmonella enteriticaserotype Paratyphi B variant Java)、肠道沙门氏菌阿贡纳血清型(Salmonellaenteritica serotype Agona)、肠道沙门氏菌肠炎血清型、肠道沙门氏菌海法血清型(Salmonella enteritica serotype Haifa)、肠道沙门氏菌纽波特血清型(Salmonellaenteritica serotype Newport)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

“至少一种鉴定的细菌对至少一种抗生素的敏感性”意指这种抗生素足以杀死或抑制这种细菌的生长的能力。

“敏感性的测定”意指测定被杀死的细菌或其生长被抗生素抑制的细菌的敏感性。

“至少一种鉴定的细菌对至少一种抗生素的抗性”意指当细菌在不存在抗性的情况下暴露于公认为针对这种细菌有效的抗生素浓度时，细菌保留其活力、其生长或其繁殖的一些或全部的现象。这种抗性可能由对这种抗生素天然敏感的细菌物种的一种或多种菌株获得。这种抗性也可能是先天或天然的。

在本发明的上下文中，对抗生素的抗性可能是染色体和/或染色体外抗性，也称为质粒抗性。

与抗生素抗性机制相关的细菌遗传学在文献中，特别是在参考文献ANTIBIOGRAMME(P.Courvalin和R.Leclercq，2012，第3版，第3章.GENETIQUE DE LARESISTANCE[genetics of resistance])中得到广泛描述。

“对至少一种抗生素的抗性的测定”意指当细菌暴露于它对其天然敏感的抗生素时，细菌的繁殖能力的测定。

根据本发明的方法也适用于表达异质抗性的细菌菌株，即只有一定比例(无论是否很小)的细菌克隆群体表达这种抗性。

“抗生素”意指对细菌具有特定作用的任何化学物质，天然或合成的。

在本发明的上下文中，抗生素诱导细菌壁和/或细胞质膜的破裂，因此当细菌对该抗生素敏感时，引起细菌的细胞内化合物的释放。诱导细菌壁破裂的抗生素和诱导细胞质膜破裂的抗生素在其对细菌的作用方式方面不同。在本发明的上下文中，重要的是细菌壁和/或细胞质膜的破裂由抗生素诱导，而不是由溶剂或酸的作用诱导。事实上，在通过质谱法的分析中，使用溶剂如乙腈或醇(乙醇、甲醇等)和/或酸如甲酸来提供细菌裂解是常规的。该裂解步骤的目的是释放细胞内蛋白质，以便通过光谱法观察它们并且例如鉴定微生物。在本发明的上下文中，重要的是不进行该裂解步骤，使得细菌的细胞内化合物的释放只是由于当细菌对该抗生素敏感时抗生素的作用，而不是由于溶剂或酸的作用，以免干扰结果。

在作用于细菌壁的抗生素中，存在诱导壁前体合成的抑制的抗生素，诱导壁前体转移到脂质载体上的抑制的抗生素，通常允许其跨越质膜转运，以及诱导壁前体聚糖单元的插入和转肽作用的抑制的抗生素。

壁合成的阻断极大地削弱了细菌的外包膜，所述细菌变得对诱导细胞裂解的外部应激(渗透压、温度、机械应力)非常敏感，并且因此引起细胞内化合物的释放。

作为诱导壁前体合成的抑制的抗生素的实例，我们可以提到D-环丝氨酸或磷霉素。

作为抑制壁前体转移到脂质载体上的抗生素的实例，我们可以提到杆菌肽。

作为作用于壁前体聚糖单元的插入和转肽作用的抗生素的实例，我们可以提到β-内酰胺抗生素，其抑制涉及壁合成的转肽酶或者与肽聚糖合成中的中间体结合的糖肽。

完整的细胞质膜的存在是细菌存活所必需的。它具有双重作用，一方面它允许必要的代谢物和离子在细胞质内的隔离，而另一方面它使得能够维持由呼吸链和克雷布斯循环生成的细胞内部和外部之间的质子梯度，其允许细胞能量的贮存。这种质子梯度供应制造ATP的ATP合酶。对膜的不渗透性的任何干扰都打破这些限制，化学渗透能量消散，并且细胞质内容物逃逸到细胞外液内。存在一定数目的作用于细胞的细胞质膜的抗生素分子，或者通过充当瓦解脂质的去污剂，或者通过在细胞质膜中形成孔，其引起细胞化合物的释放。

作为在细胞质膜的水平上起作用的抗生素的实例，我们可以提到多粘菌素或者短杆菌肽。多粘菌素充当阳离子去污剂：由于其两亲特性，它们渗透到细菌细胞内并且变得插入壁的磷脂中，从而扰乱膜渗透性。短杆菌肽是进入膜的肽，形成允许阳离子逃逸的圆柱形孔。

有利地，抗生素选自多粘菌素、β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、喹诺酮和糖肽；所述抗生素优选为多粘菌素并且选自粘菌素和多粘菌素B。

有利地，根据本发明，抗生素具有在对于待研究的细菌群体的最小抑菌浓度的两倍和最小抑菌浓度的十倍之间的浓度。

在一个特定实施方案中，抗生素具有的浓度是抗生素对于待研究的细菌群体的最小抑菌浓度的至少十倍。优选地，抗生素具有的浓度是抗生素对于待研究的细菌群体的最小抑菌浓度的至少一百倍。甚至更优选地，抗生素具有的浓度是抗生素对于待研究的细菌群体的最小抑菌浓度的至少一千倍。出乎所有人的意料，本发明人已证实根据本发明的方法在这些浓度下发挥作用。事实上，使用关于抗生素的这个浓度范围并非显而易见的，因为一方面，在通过质谱法分析的背景下，对应于抗生素的峰可以掩盖对应于细菌的特征性蛋白的峰。电离步骤实际上经受分子之间的竞争，一般有利于样品中最丰富的分子，即本文情况下的抗生素。因此，高浓度的抗生素将处于阻止蛋白质峰的检测的危险中。另一方面，如果它们被开处方，则此类浓度可能对患者有毒。

在本发明的上下文中，最小抑菌浓度或MIC是在给定温度下和对于限定的时间段，能够在体外抑制待研究菌株的任何可见培养物的最低抗生素浓度。该值表征抗生素对细菌的抑菌作用。MIC对于抗生素/细菌对是特异性的，根据对于待测试分子的天然和/或获得抗性，每个菌株具有其自身的值。

有利地，除抗生素之外，已知加速涉及所考虑的抗性机制的酶促反应的化合物也可以与样品接触。该化合物例如可以是锌化合物，特别是ZnCl₂或硫酸锌的形式，其是金属-β-内酰胺酶活性的重要辅因子。该化合物可以与抗生素组合或在样品制备中的任何其它时刻添加。

在本发明的上下文中，在使样品与抗生素接触的步骤之后，该方法包括温育步骤，以允许一个或多个细菌群体与一种或多种抗生素之间的相互作用。

本领域技术人员将根据待分析的群体调整温育条件和时间。可以将样品置于例如在15至100℃的范围内的温度下，且特别是室温(22℃)下。将其转移到例如在37℃下的恒温控制的外壳中也是可能的。

有利地，根据本发明，温育温度将为50℃或约50℃。令人惊讶的是，本发明人已显示了，对于细菌可能是致命的高温育温度(50℃左右)在本发明的上下文中是合适的。

在所选择的条件下，当细菌是敏感的时，温育时间应足以允许细菌的裂解，并且因此允许其细胞内化合物，特别是已释放的细胞内蛋白质的后续质谱法检测。温育一般进行45至90分钟，优选少于30分钟，更优选少于15分钟，且甚至更优选少于10分钟的时间。这代表了相对于现有技术的方法的优点，所述方法特别是申请US 2008/009029、WO 2014/187517中描述的那些方法，其中温育所需的时间超过两小时。这个长时间对于确保细菌已确实通过细菌生长或蛋白质模式的变化而响应抗生素的作用是必需的。在根据本发明的方法中不需要此类效应。因此，无需等待足够的时间以允许细菌细胞的分裂、或甚至其蛋白质的表达水平的变化。

在本发明的上下文中，发现除敏感性或抗性的测定之外，如果需要进行所述表征，则进行该温育步骤根本不干扰细菌的后续鉴定。

根据本发明的一个特定实施方案，本发明的方法可以包括在温育步骤后的匀浆化步骤。在本发明的上下文中，如果该方法包括匀浆化步骤，则该步骤必须特别是不通过空化(cavitation)来诱导细菌壁和/或细胞质膜的破裂。该步骤可以特别地通过技术如超声处理、机械或磁涡旋，使用热混合仪类型的热混合器来进行，条件是这些技术并不诱导细菌壁和/或细胞质膜的破裂。

该步骤允许抗生素和待分析的微生物的密切混合，以及抗生素在壁和/或膜附近扩散所需的温育时间减少。

根据本发明，超声处理技术由在超声波浴中的微管温育组成。

根据本发明的一个优选实施方案，超声处理进行5至90分钟的时间。

根据本发明的一个优选实施方案，机械涡旋进行5至90分钟的时间。

根据本发明的一个优选实施方案，磁涡旋进行5至90分钟的时间。

在本发明的上下文中，该方法包括通过去除完整的细菌和细胞碎片来纯化所述样品的步骤。该步骤由以下组成：当细菌与它对其敏感的抗生素接触时，在样品中仅保留由所分析的细菌释放的细胞内化合物。因此，从待分析的样品中去除完整的不敏感的细菌以及在裂解之后的细胞碎片。

有利地，纯化样品的该步骤可以特别地通过技术如离心、过滤、层析或电泳来进行。

这些分离技术可以单独使用或彼此组合使用，以获得多维分离。例如，多维层析可以通过将经由离子交换层析的分离与反相层析组合而使用，如通过用于分析蛋白型蛋白质肽的T.Fortin等人(2009)或H.Keshishian等人(2007)描述的。在这些工作中，层析介质可以作为柱或筒(固相提取)。蛋白质型肽的电泳或层析级分(或者一维或多维层析中的保留时间)是每种肽的特征，并且因此这些技术的应用使得能够选择待测定的一种或多种蛋白质型肽。所生成的肽的这种分级使得能够增加通过质谱法的后续测定的特异性。特别是通过如Donnelly等人(Nature Methods，2019)合成的所谓“自上而下”技术，处理整个蛋白质也是可能的。在这些工作中，蛋白质的电泳或层析级分(或者一维或多维层析中的保留时间)是每种蛋白质的特征，并且因此这些技术的应用使得能够选择待测定的一种或多种蛋白质。

根据本发明的一个优选实施方案，离心在300g至30000g的转速下进行1至60分钟的时间。

在本发明的上下文中，过滤由在孔隙率为0.02至0.22μm的过滤器上的过滤组成。

在本发明的上下文中，电泳由在电场的作用下的分离技术组成。许多技术及其变体对于本领域技术人员是熟悉的。作为非限制性实例，电泳可以选自等速电泳、在十二烷基硫酸钠的存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦(IEF)或者其是IEF和SDS-PAGE的组合的二维电泳。

在本发明的上下文中，层析由借助固定相分离流动相中存在的分子组成。许多技术及其变体对于本领域技术人员是熟悉的。作为非限制性实例，层析可以选自薄层层析、在固相提取(SPE)筒上的层析或在层析柱上的层析。筒或柱可以含有层析化合物，用于确保方法根据目的分子的物理化学性质的选择性。作为非限制性实例，该化合物可以允许反相层析(C18、C8或C4)、血清排阻层析、离子交换层析或亲和层析。

待在本发明的方法中进行的质谱法一般作为用于分析和检测不同类型分子的有力工具被本领域技术人员所知。一般地，任何类型的电离分子都可以使用质谱仪根据其分子量进行检测。取决于待检测分子的性质、蛋白质的性质或代谢起源，某些质谱法技术可能是更合适的。然而，无论用于检测的质谱法方法如何，它都包括将靶分子电离成所谓的分子离子的步骤，在本文情况下是至少一种细菌的蛋白质的电离步骤，以及根据其质量分离所获得的分子离子的步骤。

因此，所有质谱仪都包括：

-预期用于电离待分析的样品中存在的分子的电离源，即赋予这些分子正电荷或负电荷；

-根据其质荷比(m/z)，预期用于分离电离的分子或分子离子的质量分析器；

-预期用于测量由分子离子直接产生的信号或由分子离子产生的离子产生的信号的检测器，如下文详述的。

对于进行质谱法所必需的电离步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。电离源使得能够将待测定的分子达到电离的气态。电离源可以以正模式使用以用于研究正离子，或以负模式使用以用于研究负离子。存在几种类型的来源，并且将根据所需的结果和分析的分子来使用。我们可以特别提到：

-电子电离(EI)、化学电离(CI)和解吸-化学电离(DCI)；

-用快原子(FAB)、亚稳原子(MAB)或离子(SIMS、LSIMS)的轰击；

-电感耦合等离子体(ICP)；

-大气压化学电离(APCI)和大气压光电离(APPI)；

-电喷雾电离(ESI)；

-由表面(SELDI)或硅(DIOS)激活的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)；

-例如通过解吸-电喷雾电离(DESI)、纳米解吸-电喷雾电离(nDESI)、激光消融电喷雾电离(LAESI)、快速蒸发电离MS(REIMS)或纸喷雾的大气压电离；

-通过与亚稳态物质(DART)的相互作用的电离/解吸。

对于进行质谱法所必需的质量分析步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。质量分析器使得能够以与其质荷比(m/z)相关的电离的气态分离待测定的分子。存在几种类型的质量分析器，并且将根据所需的结果和分析的分子来使用。我们可以提到四极杆或四极杆类型(Q)、离子迁移率、3D离子阱(IT)或线性离子阱(LIT)(也称为离子阱)的低分辨率分析仪和高分辨率分析仪，使得能够测量分析物的精确质量，并且特别使用磁或电扇形区、飞行时间(TOF)、回旋加速器共振或轨道阱。

一般而言，适合于检测至少一种细菌分子的任何质谱法方法都可以用于本发明的上下文中。

根据一个特定实施方案，所使用的质谱法是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法，其特别提供了相对简单实施的优点。

MALDI电离源使得能够从以固态的样品起始电离分子。在电离之前，优选使样品与基质接触。

使用的基质有利地含有选自3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(即芥子酸(sinapicacid)或芥子酸(sinapinic acid))；α-氰基-4-羟基肉桂酸(即α-氰基、α基质或CHCA)、阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸(即DHB)的化合物。

存在可以在本发明的上下文中用于使样品与基质接触的几种沉积技术：沉积在干基质层上，称为“薄层”沉积，用一滴基质沉积，称为“干燥滴”沉积，沉积在基质层上，然后再加入一滴基质，称为“夹心”沉积。

一般地，基质是光敏的，并且在样品的存在下结晶，同时保存分子的完整性。特别适合于MALDI-TOF技术的这类基质是众所周知的并且选自：3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸；a-氰基-4-羟基肉桂酸、阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸。许多其它化合物是本领域技术人员已知的。甚至还存在液体基质，其在大气压下或甚至在真空下都不结晶(Tholey和Heinzie2006)。可以使用允许样品的分子在激光束的效应下电离的任何其它化合物。特别地，靶，即样品在其上沉积的载体，可以直接发挥基质的作用，如在“纳米辅助激光解吸/电离”(NALDI)或“硅上解吸/电离”(DIOS)技术的情况下。激光束可以具有有利于基质升华或汽化的任何类型的波长。优选地，将使用紫外或甚至红外波长。

在基质中，所述化合物最经常溶解于优选“超纯”级的水中，或溶解于水和有机溶剂的混合物中。作为常规使用的有机溶剂的实例，我们可以提到丙酮、乙腈、甲醇或乙醇。有时可以添加三氟乙酸(TFA)。例如，基质的一个实例由在50/50/0.1(v/v)乙腈/水/TFA混合物中的20mg/mL芥子酸组成。有机溶剂允许样品中存在的疏水分子溶解于溶液中，而水允许亲水分子的溶解。酸例如TFA的存在通过质子(H+)捕获促进样品分子的电离。

然后例如通过使样品置于例如在17至30℃的范围内的温度下，且特别是室温(22℃)下几分钟，例如1分钟到2小时，使基质中存在的溶剂蒸发。这种溶剂蒸发允许样品分布在其中的基质的结晶。然后使置于结晶基质中的样品经受软电离。这种电离将优选用发射以337.1nm的UV束的氮激光器进行。

在电离过程中，使样品经受激光激发。然后基质的晶体吸收光子能量，并且这种能量的恢复导致基质升华、样品解吸和以描述为等离子体的状态的物质出现。在这种等离子体内，电荷交换在基质的分子和样品的分子之间发生。例如，质子可以从基质中提取并转移到样品的蛋白质和肽上。该步骤允许生物分子的软电离而不引起其破坏。因此，样品释放各种大小的离子。后者然后被电场加速并在减压下的管(称为飞行管)中自由飞行。在电离过程中以及在所生成的离子加速过程中施加的压力最经常在10^-6至10^-9毫巴(mbar)的范围内。然后，最小的离子将比更大的离子“移动”得更快，允许其被分离。探测器位于飞行管的最末端处。离子的飞行时间用于计算其质量。因此获得了根据撞击检测器的分子的m/z比的质谱，其代表与具有相同质荷比(m/z)的电离分子的数目相对应的信号强度。m/z比以汤姆逊(Th)表示。一旦将其引入质谱仪内，就非常快速地，一般在小于一分钟内获得样品的谱。

根据其m/z比的分子离子分离可以仅进行一次(单质谱法或MS)，或者可以进行几次连续的MS分离。当进行两次连续的MS分离时，分析称为MS/MS或MS²。当进行三次连续的MS分离时，分析称为MS/MS/MS或MS³，且更一般而言，当进行n次连续的MS分离时，分析称为MSⁿ。

根据另一个特定实施方案，本发明的方法中使用的质谱法是串联质谱法(MS²、MS³、MS⁴或MS⁵)，其中几个质量分析器联接在一起。例如，第一分析仪分离离子，碰撞池允许离子碎裂，而第二分析仪分离碎片离子。某些分析仪，例如离子阱或FT-ICR，将几个分析仪构成一体，并且使得能够将离子碎裂并直接分析碎片。这种技术允许在两个质量分析器中的连续分离，其通过在第一分析仪中选择离子，使其碎裂并在第二分析仪中分析其子离子，特别具有给出极佳特异性的优点。

有利地，可以在MALDI-TOF-TOF中进行分离，所述MALDI-TOF-TOF包括两个飞行时间分析仪以及与MALDI-TOF相同的使用简单性。

可替代地，电离源可以是本领域技术人员已知的任何类型的来源，并且质量分析器可以是本领域技术人员已知的任何类型的质量分析器。

根据另一个特定实施方案，质谱法是串联质谱法并且使用电喷雾源和至少两个上述分析仪的组合。

特别地，电离可以如下进行：将含有靶分子的样品引入电喷雾电离源内，所述电喷雾电离源使得能够电离分子，同时促使其从液态变为气态。分子因此被转化成对应于初始分子的分子离子。然后，所获得的分子离子对应于最初存在于液体样品中的分子，在正模式下具有一个、两个或甚至三个或更多个另外的质子，并且因此带有一个、两个或甚至三个或更多个电荷。例如，当靶分子是液相中的蛋白质时，通过以正模式发挥作用的电喷雾源的电离导致以气态的离子，具有一个、两个或甚至三个或更多个另外的质子，并且因此带有一个、两个或甚至三个或更多个电荷。当靶分子例如蛋白质已预先通过反相液相层析分离时，这种类型的来源是特别合适的。

在使用几次连续分离的技术中，在检测或测定单一靶分子的情况下的模式SRM(选择反应监测)、在检测或测定几种靶分子的情况下的MRM(多反应监测)模式、或者PRM(平行反应监测)是MS²分离的特定用途。类似地，MRM³模式是MS/MS/MS分离的特定用途(WO2010136706)。SRM、MRM、PRM和MRM³技术是靶向质谱法技术，其意味着待检测的分子的离子被特异性地靶向进行分析。

此外，DDA(数据依赖性采集)或DIA(数据非依赖性采集)技术使用几次连续分离。然而，它们并非特别靶向至少一种离子。例如，DDA方法由以下组成：i)获取MS谱，ii)连续选择在MS谱上观察到的具有强信号的每个前体离子，iii)使每个前体离子连续碎裂并获取其MS/MS谱，iv)借助于软件如Mascot(Matrix Science，London，英国)或SEQUEST(ThermoScientific，Waltham，美国)，查询数据库如SWISS-PROT或NCBI，以鉴定具有对应于观察到的MS/MS谱的高概率的分子。这种方法可能导致鉴定微生物特征性的分子，而无需先验地靶向其分析。DIA方法不包括步骤ii)。一组离子在步骤iii)中不依赖于其相对强度进行碎裂且分析。换言之，代替根据i)中进行的采集一个一个地使离子碎裂，在第一质量分析器中选择任选地包含几种前体离子的质量窗口。将这几种上述前体离子转移到下一个或多个分析仪，以便同时进行碎裂且分析。当使用高分辨率质谱仪时，这种技术是特别有利的，能够非常准确地鉴定分别对应于同时选择的不同前体离子的碎片离子组。

在以单MS模式检测的情况下，与待检测的靶分子相关联的是所获得的分子离子的质荷比。

在以MS/MS模式检测的情况下，相对于MS测定，基本上增加了两个步骤，其是：

随后称为前体离子的分子离子的碎裂，以给出称为碎片离子的子离子，和

根据其质量/电荷(m/z)₂，称为碎片离子的子离子的分离，比率(m/z)₁对应于前体离子的比率(m/z)。

然后是因此获得的与待检测的靶分子相关联的碎片离子的质荷比。碎片离子意指在碎裂步骤之后衍生自前体离子，并且其质荷比m/z与前体离子不同的离子。

(m/z)₁和(m/z)₂对被称为跃迁，并且代表待检测的特征性离子。

就与靶分子相关联进行检测的特征性离子的选择由本领域技术人员常规地进行，以便有利地导致依据再现性和可靠性最灵敏、最特异性和最稳固地可靠的测定。

SRM模式或MRM模式的原理是特异性地选择前体离子，使其碎裂，然后特异性地选择其碎片离子之一。对于此类应用，一般使用具有离子阱的三重四极杆或混合三重四极杆类型的装置(WO 2011/045544)。PRM模式的原理与SRM和MRM模式的不同之处在于最终高分辨率分析仪的使用。后者允许以足够的分辨率平行检测一组碎片离子，以确保方法的特异性(PetersonAC等人，2012)。对于PRM分析，一般使用四极杆飞行时间类型(Q-TOF)或离子阱和轨道阱类型、或者四极杆和轨道阱的混合装置。

在PRM模式中使用的四极杆和轨道阱装置(Q1 q2 Orbitrap)的情况下，为了测定或检测靶蛋白，第一四极杆(Q1)使得能够过滤与其质荷比(m/z)相关的、待测定蛋白质特征性的分子离子。仅具有所需蛋白质的质荷比(称为(m/z)_i1的比率)的离子传输到第二四极杆(q2)内，并且发挥前体离子的作用用于后续碎裂。分析仪q2使得能够将具有质荷比(m/z)_i1的离子碎裂成碎片离子。一般通过前体离子与q2中的惰性气体例如氮或氩的碰撞来获得碎裂。将碎片离子传输到测定其m/z比的轨道阱内。然后检测或甚至定量具有所需第i种蛋白质特征性的片段的质荷比(m/z)i₂的片段离子。

这种操作模式具有双重选择性，一方面与前体离子的选择相关，而另一方面与至少一种碎片离子的选择相关。

以SRM、MRM或PRM模式的质谱法有利于定量，只要它定量地检测待检测或定量的分子特征性的碎片离子。

通过MS的检测方法的使用是有利的，因为它可以在几分钟内进行，并且需要具有单个分析仪的质谱仪，即比MS/MS中使用的串联质谱仪更简单的仪器。

通过MS/MS的检测的方法的使用也是有利的，因为它使得能够生成待检测分子的特定片段，并且因此对于根据本发明的方法提供极大的特异性。

根据本发明的一个实施方案，MS/MS光谱法是MRM，其具有在质谱仪中使用几十毫秒的分析周期时间的优点，这使得能够以极大的灵敏度且以多重模式检测大量不同的分子。

根据本发明的另一个实施方案，MS/MS光谱法是PRM，其具有使用几种碎片离子用于表征靶分子的检测的优点。

有利地，根据本发明的方法可以使用MALDI-TOF进行，如通过Claydon等人以及通过T.Krishnamurthy和P.Ross描述的。该分析组合了质谱的采集和通过专业软件的解释。它是非常简单的，并且可以在几分钟内进行。

在层析分离后，如通过Vaidyanathan等人或通过R.Everley等人描述的，根据本发明的方法也可以用电喷雾源对粗制样品进行。不同的m/z范围使得能够鉴定待分析微生物特征性的蛋白质。S.Vaidyanathan等人使用200至2000Th的窗口，并且R.Everley等人使用620至2450Th的窗口。质谱还可以进行解卷积，以不依赖于其电荷状态找到蛋白质的质量。R.Everley等人以这种方式利用约5000至50000Da的质量。

通过申请人在申请WO 2011/045544中描述了通过经由MRM以靶向模式检测样品中存在的其蛋白质的细菌鉴定。以非靶向模式的鉴定也已被许多团队广泛地应用。例如，我们可以引用Manes N.等人的工作，其研究了肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的肽组，或者R.Nandakumar等人或L.Hernychova等人的工作，其研究了在用胰蛋白酶消化蛋白质后细菌的蛋白质组。

因此，在本发明的上下文中，当细菌群体对诱导其细菌壁和/或其细胞质膜破裂并因此释放其细胞内化合物的抗生素敏感时，通过质谱法生成的谱将具有该细菌群体特征性的至少一种蛋白质的至少一个峰。

在本发明的上下文中，“细菌群体特征性的蛋白质的峰”意指使得能够将细菌群体与任何其它类型的分子样品区分开来的峰。

相反地，当细菌群体对抗生素抗性时，抗生素并不引起其细菌壁或其细胞质膜的破裂，并且因而并不释放细胞内化合物，并且因此通过质谱法生成的谱并不具有这个细菌群体特征性的蛋白质峰。

对于给定的细菌，通过质谱法技术特别是MALDI-TOF获得的对应于其占优势和特征性蛋白的参考谱，是可获得的并且在用商业设备可获得的数据库中记录，并且对于比较，允许测定这种细菌对它与之接触的抗生素的敏感性。

有利地，根据本发明，至少一种特征性蛋白选自核糖体蛋白和DNA结合蛋白。

更有利地，当细菌是大肠杆菌时，至少一种特征性蛋白选自静止期诱导的核糖体相关蛋白(SPIRAP)，酸应激伴侣蛋白(HdeB)，以及50S核糖体蛋白L29、L31、L32、L33和L35。

更有利地，当细菌是肺炎克雷伯氏菌时，至少一种特征性蛋白选自DNA结合蛋白H-NS，以及核糖体蛋白L29、L31、L34和US9。

在本发明的一个特定实施方案中，在检测所述细菌特征性的蛋白质峰的存在或不存在的步骤e)之后，该方法包括计算细菌特征性的至少一个蛋白质峰的强度/所使用的抗生素特征性的至少一个峰的强度的比率。

在前一段落中所述的实施方案的上下文中，当存在几个特征性蛋白峰时，用细菌特征性的蛋白质峰的强度总和进行比率的计算。以等同的方式，当存在几个粘菌素特征性的峰时，用所使用的抗生素特征性的峰的强度总和进行比率的计算。

在前两个段落中所述的实施方案的上下文中，该方法包括在比率计算的步骤后，根据所获得的比率以及每个物种的固定阈值，测定细菌群体对抗生素的敏感性或抗性的步骤。本领域技术人员使用其知识将完全知道如何确定允许将抗性细菌与敏感细菌区分开的阈值。

有利地，根据本发明的方法另外包括鉴定细菌群体的科、属或优选种的步骤。

附图说明

本发明的方法及其优点根据本说明书的其余部分将变得清楚，所述其余部分呈现了进行本发明的方法的各种非限制性实施例。本发明的其它目的、特征和优点根据下文给出的描述和下文参考附图呈现的实施例可见，在所述附图中：

[图1]显示了以10μg/ml的硫酸粘菌素在100至4000Th之间的MALDI-TOF谱。横坐标：质荷比(m/z或Th)。纵坐标：以具有最高强度的峰的百分比表示的相对强度的％Int；

[图2]显示了以10μg/ml的硫酸粘菌素在2000至4500Th之间的MALDI-TOF谱。横坐标：质荷比(m/z或Th)。纵坐标：以具有最高强度的峰的百分比表示的相对强度的％Int；

[图3]显示了根据实施例II处理的EC_S菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱；

[图4]显示了根据实施例II处理的EC_R菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱；

[图5]显示了根据实施例III处理的S菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱；

[图6]显示了根据实施例III处理的R16菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱；

[图7]显示了根据实施例IV处理的S菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱；

[图8]显示了根据实施例IV处理的R16菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱；

[图9]显示了根据实施例V处理的下述大肠杆菌菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱：EC_R16、EC_R17、EC_S10和EC_S15；

[图10]显示了根据实施例V处理的下述肺炎克雷伯氏菌菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱：KP_S10、KP_S15、KP_R9和KP_R16；

[图11]显示了根据实施例V处理的下述鲍氏不动杆菌菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱：AB_S044、AB_S045、AB_S046和AB_R-E105；

[图12]显示了根据实施例V处理的下述铜绿假单胞菌菌株在4500至10000Th之间的MALDI-TOF谱：PA_S062、PA_SE64、PA_RE66和PA_RE68。

具体实施方式

这些实施例预期使得本发明、其实施及其用途更易于理解。给出这些实施例是用于解释的目的，而不是限制本发明的范围。

实施例

I.纯粘菌素的MALDI-TOF概况

粘菌素(或多粘菌素E)是多粘菌素类抗生素，其由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)subsp.colistinus(Benedict RG等人，1947)天然产生。五类多粘菌素(A、B、C、D、E)是已知的，但仅多粘菌素B和E(或粘菌素)在治疗上使用(Dortet L等人，2016)。

在此提醒，粘菌素是多粘菌素组中的抗生素，其作用于细菌细胞质膜。由于其两亲特性，就像阳离子去污剂一样，它们将渗透到细菌细胞内并且变得插入壁的磷脂中，因此干扰膜渗透性。

在由多重抗性细菌感染的情况下，粘菌素用作最后手段的抗生素。当肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)或不动杆菌属物种(Acinetobacter spp.)的菌株同时对碳青霉烯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类的抗生素抗性(Hancock RE，1997)时，就是这种情况。这些多重抗性的现象在某些国家例如希腊或意大利显示了令人担忧的增加，并且使得医生有必要开出粘菌素。这种更频繁的使用不幸地伴随着对粘菌素抗性的病菌的出现(Dortet L等人，2016)。这种趋势在对粘菌素天然抗性的细菌如沙雷氏菌属(Serratia)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)或普罗威登斯菌属(Providencia)，以及通常敏感但已发展出染色体或质粒抗性机制的物种(克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠杆菌属(Enterobacter)、志贺氏菌属(Shigella)等)两者中均可见。最近在中国首次描述了通过水平传递赋予针对粘菌素的抗性的质粒基因(mcr-1)(Liu Y-Y等人，2016)。从那时起，它在人和动物两者中的传播以及几种变体的存在已得到记录(Chen L等人，2018)。这些令人不安的观察是担心对粘菌素的抗性出现加速的原因(Dortet L等人，2016)。

具有经验式C₅₂H₉₈N₁₆O₁₃的粘菌素，具有1154.750Da的理论单同位素质量和1155.434Da的理论平均化学质量。在用质子电离后，它可在MALDI-TOF质谱法中以同位素分布的形式(其第一峰(单同位素峰)具有1155.758Da的质量)、或以顶点在1156.442Da处的未分辨分布的形式检测到。检测单同位素峰或仅同位素分布的顶点的可能性取决于质谱仪的分辨率。高分辨率仪器一般能够检测到单同位素峰，而低分辨率仪器只能检测到同位素分布的顶点。

先前的实验用由bioMérieux公司销售的

MS Plus仪器(MALDI-TOF类型的仪器)检测粘菌素来进行。这些实验使用下述步骤进行：

-将在水中稀释至10μg/ml的1μl硫酸粘菌素(Sigma参考号C4461)沉积到一次性使用的靶(bioMérieux参考号410893)上，

-将1μl HCCA基质(bioMérieux，参考号411071)沉积到粘菌素上，

-使靶干燥，

-将靶放入仪器中，和

-对于2至20000Th的测量范围，用正离子模式电离进行分析。

脉冲提取对于2000Th的质量进行优化，并且激光功率固定在85。累积来自十次发射的一百个概况以形成质谱。在基线扣除和信号平滑后检测到峰。

图1给出了在100到4000Th的质量范围上获得的质谱，并且显示了在1156.46m/z处的簇和在1170.56m/z处的另一个簇。第一个对应于天然粘菌素，而第二个对应于甲基化粘菌素(+14Da)。事实上，粘菌素包含可以进行甲基化的4个胺官能团。

在1178.68m/z处的峰对应于具有钠加合物的单荷电的粘菌素离子(+22Da)，而在1192.70m/z处的峰对应于具有钠加合物的单荷电的甲基化粘菌素离子(14+22＝+36Da)。

这项工作使得随后能够将粘菌素特征性的峰与待研究的细菌特征性的蛋白质峰区分开。

图2是在质量范围2000-4500m/z内观察到的谱。在2283；2987、3439和4143m/z附近观察到四个明确限定的峰。这些峰对应于粘菌素聚合物。在2283和3439m/z处的峰之间的质量差为1156m/z，即粘菌素的质量。这同样适用于在4143和2987m/z处的峰之间的差异。

对于所有测试的粘菌素浓度(10、5和2.5mg/ml)，使用或不使用敏感或抗性菌株，不管温育时间如何(从10分钟到4小时)，获得了这个相同的谱轮廓(未示出)。因此，这些峰对应于已来自所使用的硫酸粘菌素溶液(Sigma参考号C4461)的分子，而不是细菌样品特征性的分子。

II.在4小时内测定大肠杆菌对粘菌素的敏感性或抗性

使用根据本发明的方法进行这种测试，以便测定革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)对粘菌素的敏感性或抗性。这种细菌，也称为大肠杆菌(colibacillus)，缩写为大肠杆菌(E.coli)，是在人中共生的哺乳动物中的肠道细菌(革兰氏阴性)。某些大肠杆菌菌株可能是致病性的，在这种情况下导致胃肠炎、泌尿系统感染、脑膜炎或败血症。大肠杆菌是通常对粘菌素敏感的物种，但已知某些菌株已发展出染色体或质粒抗性机制。

在这种测试的背景下，分析了两种菌株：将被称为EC_S的粘菌素敏感的大肠杆菌菌株、以及将被称为EC_R的抗性菌株。

这种测试使用下述步骤进行：

-在水中制备以1McFarland(McF)的大肠杆菌菌株EC_S和EC_R的悬浮液(悬浮介质，bioMérieux参考号70700)，

-在纯水中制备浓度为5mg/ml的硫酸粘菌素(Sigma，参考号C4461)溶液(考虑到由制造商指示的粘菌素滴度)，

-将250μl每种悬浮液与250μl粘菌素混合，以获得以0.5McF的微生物和浓度为2.5mg/ml的粘菌素的溶液，

-使用涡旋匀浆化5秒，

-使混合物在37℃下温育4小时，

-使用涡旋匀浆化5秒，

-以4700转/分钟(1500g)离心5分钟，

-将1μl上清液沉积到一次性使用的靶(bioMérieux参考号410893)上，

-将1μl HCCA基质(bioMérieux，参考号411071)沉积到一滴上清液上，

-用适合于微生物学的方法，即采用正电离模式和2000至20 000Th的质量范围，在VITEK-MS Plus(bioMérieux)上，通过MALDI-TOF光谱法分析样品。

-累积来自10次发射的100个概况，并且将该数据与数据库中包含的关于大肠杆菌的数据进行比较，

-观察大肠杆菌特征性的蛋白质峰的存在或不存在。

-如果检测到大肠杆菌特征性的蛋白质，则测定对粘菌素的敏感性，或者如果未检测到大肠杆菌的蛋白质，则测定对粘菌素的抗性。

图3显示了对于EC_S菌株获得的质谱。在4500至10 000Th之间的质量窗口中，观察到与来自粘菌素的峰不同的低强度峰的存在。这些峰主要在4650.01、4666.55、6258.69、6318.33、6414.85、7176.22、7276.56和7871.90m/z处。在5370m/z附近也可见弱分辨的簇。

质量6318.33、7162.22、7276.56和7871.90分别对应于大肠杆菌的峰6316.14、7158.68、7274.39和7872.02，其被鉴定为分别对应于核糖体蛋白L32、L35、L29和L31(Arnold RJ和Reilly JP.1999；Wilcox SK等人，2001；Ryzhov V和Fenselau C，2001；JonesJJ等人，2003；Kallow W等人，2010；Welker M和Moore ERB，2011；Momo RA等人，2013)。因此，这些蛋白质是大肠杆菌的特征。这一观察指示了，细菌细胞已经历其细胞质膜的破裂，在2.5mg/ml粘菌素的存在下，在37℃下的4小时温育的过程中，引起核糖体蛋白释放到上清液内。因此，根据本发明的方法使得能够显示EC_S菌株对粘菌素敏感。

注意到粘菌素浓度(2.5mg/ml)对应于最小抑菌浓度(MIC)的1250倍，超出所述最小抑菌浓度，菌株被视为抗性的。

图4显示了对于EC_R菌株获得的质谱。仍检测到在5313m/z处的簇以及在4649和4666m/z的峰，但无法看到特征分别在于峰6316.14、7158.68、7274.39和7872.02m/z的大肠杆菌的蛋白质L32、L35、L29和L31。因此没有可检测到的细菌蛋白质。因此，在2.5mg/ml粘菌素(远高于MIC的浓度)的存在下，在37℃下的4小时温育过程中，该细菌似乎没有经历其细胞质膜的破裂。因此，该方法使得能显示EC_R菌株对粘菌素抗性。

III.在37℃下在30分钟内测定大肠杆菌对粘菌素的敏感性或抗性

进行这种测试，以证实本发明的方法使得能够在30分钟内测定敏感性或抗性。

除了在37℃下30分钟的温育时间之外，用与实施例II中相同的方案来分析大肠杆菌菌株S和R16。S菌株对粘菌素敏感，而R16菌株对粘菌素抗性。

图5显示了对于S菌株获得的质谱。该谱具有在6257.2、6318.7、7275.4和7871.6m/z处的强度峰。这些峰分别是大肠杆菌的核糖体蛋白L33、L32、L29和L31的特征。因此，在2.5mg/ml粘菌素的存在下，在37℃下的30分钟温育过程中，S菌株已经历其细胞质膜的破裂。因此，它对粘菌素敏感的特性已得到确认。

图6显示了对于R16菌株获得的质谱。与S菌株的谱(图5)形成对比，该谱没有在6000至10000m/z之间的任何强度峰。因此，在2.5mg/ml粘菌素的存在下，在37℃下的30分钟温育过程中，它并未经历裂解。该方法确认了该菌株对粘菌素的抗性。

IV.在50℃下在30分钟内测定大肠杆菌对粘菌素的敏感性或抗性

除了在50℃下温育之外，用与实施例III中相同的方案来分析相同的大肠杆菌菌株R16和S。

图7显示了对于S菌株获得的质谱。S菌株明确地显示了在6256.4、6316.9、7274.1和7870.2m/z处的强度峰。这些峰分别是核糖体蛋白L33、L32、L29和L31的特征。因此，在2.5mg/ml粘菌素的存在下，在50℃下的30分钟温育过程中，S菌株的细胞质膜已被裂解。因此确认了S菌株对粘菌素的敏感性。

图8显示了对于R16菌株获得的质谱。该谱没有在6000至10000m/z之间的任何强度峰。因此，在2.5mg/ml粘菌素的存在下，在50℃下的30分钟温育过程中，该菌株并未裂解。因此确认了该菌株对粘菌素的抗性。

出乎意料的是，对于敏感菌株，在50℃下温育后的蛋白质峰L33、L32、L29和L31比在37℃下温育后更强烈，而对于抗性菌株，它们保持几乎无法检测。

V.测定不同细菌对粘菌素的敏感性或抗性

用本发明的方法进行这些测试，以测定几种不同菌株的几种细菌的敏感性或抗性，以便证实该方法对不同细菌和不同菌株的再现性。这些测试也使用在50℃下的10分钟温育来进行，以显示使用非常短的温育时间是可能的。使用下述步骤进行测试：

-在水中制备以2McF的微生物的悬浮液(悬浮介质，bioMérieux参考号70700)，

-在纯水中制备浓度为2X的硫酸粘菌素(Sigma参考号C4461)溶液(考虑到由制造商指示的粘菌素滴度)。对于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌，X＝2.5mg/ml，而对于鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌，X＝20μg/ml。

-将200μl微生物悬浮液与200μl粘菌素2X混合，以获得以1McF的微生物和浓度为X的粘菌素的溶液，

-通过将来自步骤3的微生物溶液在纯水(不含粘菌素)溶液中稀释，平行进行阴性对照。

-使用涡旋匀浆化5秒，

-使混合物在50℃下温育10分钟，伴随使用热混合器以1400转/分钟的搅拌。

-使用涡旋匀浆化5秒，

-用孔隙率为0.22μm的过滤器(Centricon，Merck-Millipore)的过滤。

-将1μl滤液沉积到一次性使用的靶(bioMérieux参考号410893)上。

-将1μl HCCA基质(bioMérieux，参考号411071)沉积到滤液上。

-用微生物学中常规使用的方法，即采用正电离模式和2000至20000Th的质量范围，通过MALDI-TOF光谱法分析样品。

-累积来自10次发射的100个概况，并且将该数据与数据库中包含的关于所调查物种的数据进行比较，

-观察所调查物种特征性的蛋白质峰的存在或不存在。

-如果检测到所调查物种特征性的蛋白质，则测定对粘菌素的敏感性，或者如果未检测到所调查物种的蛋白质，则测定对粘菌素的抗性。

-如果阴性对照没有微生物的蛋白质峰，则验证测定结果。

如下表1中呈现的，用上述方案分析了大肠杆菌(EC_S10、EC_S15、EC_R16、EC_R17)和肺炎克雷伯氏菌(KP_S10、KP_S15、KP_R9、KP_R16)的不同菌株。

为了能够评估根据本发明的方法的功效，预先通过肉汤中的微量稀释分析不同菌株，以便测定其状态(敏感性或抗性)。该方法被CLSI和EUCAST视为参考方法。

[表1]

因此，在所分析的菌株中，一些对粘菌素是敏感的，而其它是抗性的，并且在抗性菌株中，一些展示染色体抗性，而其它展示质粒抗性。

物种肺炎克雷伯氏菌特征性的蛋白质是DNA结合蛋白H-NS，核糖体蛋白L29、L31、L34和US9，含有CsbD结构域的冷休克蛋白(含CsbD结构域蛋白质)，以及具有m/z 6290和8308的未表征蛋白质。这些蛋白质的特征分别在于在7705(DNA结合蛋白H-NS)、7274(L29)、7743(L31)、5381(L34)、7384(US9)、8309(CsbD)处的峰，或多或少百万分之1000(ppm)。对于其部分，假设蛋白质的特征在于在6290和7678处的峰，或多或少百万分之1000(ppm)。

图9和10分别显示了对于表1中呈现的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌菌株获得的质谱。关于菌株EC_S10、EC_S15、KP_S10和KP_S15的谱具有其物种特征性的峰，并且因此对粘菌素敏感。相反地，菌株EC_R16、EC_R17、KP_R9和KP_R16没有其物种特征性的峰，并且因此对粘菌素抗性。

因此，通过参考方法(肉汤中的微量稀释)获得的结果已通过根据本发明的方法得到确认。事实上，使用本发明的方法，对于每种菌株，通过在肉汤中的微量稀释获得了相同的状态。

仍然为了证实根据本发明的方法的再现性，下表2显示了鲍氏不动杆菌(AB_S044、AB_S045、AB_S046、AB_R-E105)和铜绿假单胞菌(PA_S062、PA_SE64、PA_RE66、PA_RE68)的不同菌株，其根据上述方案进行分析。

如以前，通过肉汤中的微量稀释预先分析不同菌株，以测定其状态(敏感或抗性)。

[表2]：

用实施例V中描述的方案来分析鲍氏不动杆菌(AB_S044、AB_S045、AB_S046、AB_R-E105)和铜绿假单胞菌(PA_S062、PA_SE64、PA_RE66、PA_RE68)的菌株。因此，它们在20μg/ml粘菌素的存在下进行温育。

图11显示了对于表2中呈现的鲍氏不动杆菌菌株获得的质谱。在这些谱上，菌株AB_S044、AB_S045、AB_S046具有特别是在约5748和5770Th处的其物种特征性的蛋白质峰，并且因此对粘菌素是敏感的。相反地，菌株AB_R-E105没有其物种特征性的蛋白质峰，并且因此对粘菌素是抗性的。

图12显示了对于表2中呈现的铜绿假单胞菌菌株获得的质谱。在这些谱上，菌株PA_S062和PA_SE64具有特别是在约5449、5469、5793和6975Th处的其物种特征性的峰，并且因此对粘菌素是敏感的。相反地，菌株PA_RE66和PA_RE68没有其物种特征性的蛋白质峰，并且因此对粘菌素是抗性的。

如以前，这些结果显示了根据本发明的方法使得能够测定每种菌株的状态。这些结果通过所谓的参考方法得到确认。

VI.计算用于测定细菌对抗生素的敏感性或抗性的比率

在该实施例的上下文中，用本发明的方法进行测试，以测定几种菌株的几种细菌的敏感性或抗性，所述方法例如在实施例V中并且包括下述步骤：

-测量所观察到的每个峰的强度，

-找到微生物的蛋白质峰强度总和与粘菌素的至少1个峰之间的比率。

-根据所获得的比率和对于每个物种固定的阈值的总和，测定对粘菌素的状态，抗性或敏感。

-抗性微生物将具有低比率，而敏感微生物将具有高比率。

在本发明的上下文中，阈值通过结果的观察凭经验进行固定。本领域技术人员使用其知识将知道如何毫无困难地测定该阈值。测定该阈值的方式将在下文给出的实施例中进行说明。

大肠杆菌菌株的分析

首先，研究了先前使用的相同大肠杆菌菌株(EC_S10、EC_S15、EC_R16、EC_R17)，并且分析了物种大肠杆菌特征性的蛋白质。它们是下述蛋白质：固定相诱导的核糖体相关蛋白(SPIRAP)，酸应激伴侣HdeB，以及50S核糖体蛋白L29、L31和L33。

下表3显示了对于粘菌素和大肠杆菌特征性的每种蛋白质观察到的峰强度。

[表3]：

下表4呈现了对于每种蛋白质观察到的峰强度/对于粘菌素观察到的峰强度的比率，以及关于每个物种的这些比率的总和。

[表4]：

表4中呈现的结果显示了菌株EC-S10和EC-S15具有高于0.3的比率总和，而菌株EC-R16和EC-R17具有零的比率总和。根据这些结果的观察，本发明人将阈值的值固定在0.30。因而，在这种情况下，其比率总和严格低于0.30的菌株被视为抗性的，并且相反地，其比率总和大于或等于0.30的菌株被视为敏感的。因此，菌株EC-S10和EC-S15被分类为敏感的，而菌株EC-R16和EC-R17被分类为抗性的。

肺炎克雷伯氏菌菌株的分析

还研究了肺炎克雷伯氏菌株KP S10-1、KP S10-2、KP S15-1、KP S15-2、KP R9-1、KP R9-2、KP R16-1和KP R16-2，并且分析了物种肺炎克雷伯氏菌特征性的蛋白质。这些特征性蛋白是DNA结合蛋白H-NS，核糖体蛋白L29、L31、L34和US9，含有CsbD结构域的冷休克蛋白(含CsbD结构域蛋白质)，以及具有m/z 6290和8308的未表征蛋白质。

下表5呈现了对于粘菌素和肺炎克雷伯氏菌的每种特征性蛋白观察到的峰强度。

[表5]：

下表6呈现了对于每种蛋白质观察到的峰强度/对于粘菌素观察到的峰强度的比率，以及关于每个物种的这些比率总和的结果。

[表6]：

表6中呈现的结果显示了，菌株KP-S15和KP-S10具有高于0.45的比率总和，而菌株KP-R16和KP-R9具有低于0.11的比率总和。因此，根据结果的观察，本发明人将阈值的值固定在0.45。因而，在这种情况下，其比率总和严格低于0.45的菌株被视为抗性的，并且相反地，其比率总和大于或等于0.45的菌株将被视为敏感的。因此，菌株KP-S15和KP-S10被分类为敏感的，而菌株KP-R16和KP-R9被分类为抗性的。

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Claims (11)

1.一种用于测定至少一种鉴定的细菌对至少一种抗生素的敏感性或抗性的方法，所述方法包括下述步骤：

a)使包含所述细菌的样品与所述至少一种抗生素接触，如果所述细菌被认为对所述至少一种抗生素“敏感”，所述抗生素诱导细菌壁和/或细胞质膜的破裂并且引起所述细菌的细胞内化合物的释放，

b)使所述样品与所述至少一种抗生素一起温育，

c)通过去除完整的细菌和细胞碎片来纯化所述样品，

d)通过质谱法分析纯化的样品，

e)检测所述细菌的至少一种特征性蛋白的至少一个峰的存在或不存在，和

f)测定所述细菌群体对所述抗生素的敏感性或抗性。

2.如权利要求1的方法，其中所述质谱法是MS类型、MS/MS类型或MS随后为MS/MS类型的光谱法。

3.如权利要求2的方法，其中所述MS类型的质谱法是MALDI-TOF类型的质谱法。

4.如权利要求2的方法，其中所述MS/MS类型的质谱法是类型PRM、SRM、MRM、DDA(数据依赖性采集)或DIA(数据非依赖性采集)的质谱法。

5.如前述权利要求中任一项的方法，其中纯化所述样品的步骤通过下述技术中的至少一种进行：离心、过滤、电泳或层析。

6.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗生素选自多粘菌素、β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、喹诺酮和糖肽。

7.如权利要求6的方法，其中所述抗生素是多粘菌素并且选自粘菌素和多粘菌素B。

8.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗生素具有的浓度是所述抗生素对于所述细菌群体的最小抑菌浓度的至少十倍。

9.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述细菌群体是革兰氏阴性菌。

10.如权利要求9的方法，其中所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、肠道沙门氏菌(Salmonella enteritica)、副伤寒B沙门氏菌爪哇变种(Salmonella paratyphi Bvar.Java)、沙门氏菌阿贡纳血清型(Salmonella ser.Agona)、沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella ser.Enteritidis)、沙门氏菌海法血清型(Salmonella ser.Haifa)、沙门氏菌纽波特血清型(Salmonella ser.Newport)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

11.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述温育步骤花费少于30分钟。

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