KR102218221B1

KR102218221B1 - 후속적인 질량 분석 측정 및 평가를 위한 살아있는 미생물 샘플 및 미생물의 제조

Info

Publication number: KR102218221B1
Application number: KR1020197014594A
Authority: KR
Inventors: 예브게니 이델레비치; 카스텐 베커
Original assignee: 브루커 달토닉 게엠베하
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2021-02-22
Also published as: WO2018099500A1; EP3548895C0; US20220412987A1; DE112016007491A5; US20240319204A1; US20200291446A1; AU2016431213B2; JP6886514B2; CA3054334C; AU2016431213A1; US11480579B2; EP3548895B1; CA3054334A1; KR20190073466A; EP4417975A1; CN110023761A; CN110023761B; JP2020501137A; EP3548895A1; CN116243006A

Abstract

본 발명은 후속적인 질량 분석 측정 및 평가를 위한 살아있는 미생물 샘플 및 미생물의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 측정으로부터 유래될 수 있는 결과는 특히, 종/아종에 따른 미생물 샘플 내 미생물의 더 빠른 동정 및/또는 미생물의 항균물질에 대한 내성/감수성의 빠른 결정 및/또는, 예를 들어, 병원성(pathogenicity), 병독성(virulence), 및 물질대사에 대한 미생물의 추가 특징화를 제공할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 이 제조는 특히 질량 분석 샘플 지지대 바로 위에서 일어날 수 있다.

Description

후속적인 질량 분석 측정 및 평가를 위한 살아있는 미생물 샘플 및 미생물의 제조

감염성 질병은 여전히 의학분야에서 주요 문제들 중 하나를 대표한다. 감염은 독립적으로 발생할 수 있으나, 특히, 다른 질병의 합병증(complications) 또는 환자에서 면역억제성 치료 및/또는 이물질(foreign material) 이용의 결과로서 발달할 수 있다. 최근, 현대 의학분야에서 진전이 있었고, 복잡한 외과적 수술과 면역억제성 치료의 관련된 증가 및 이물(foreign body)의 이용은 감염율 (rate of infection)의 증가에 대한 원인이 되는 요인에 속해왔다. 이와 관련해서 언급될 것은, 예를 들어, 실질 기관(solid organ)의 이식 및 골수이식이다.

다내성 병원체(multi-resistant pathogen)의 증가는, 특히 우려할 만한 원인을 제공하며, 그 예로는, 세균 [메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA); 반코마이신 내성 장내구균(vancomycin-resistant enterococci, VRE); 시프로플록사신, 메로페넴, 또는 토브라마이신 내성 녹농균(ciprofloxacin-, meropenem- or tobramycin-resistant Pseudomonas aeruginosa)을 포함] 또는 진균 [플루코나졸, 또는 보리코나졸 내성 칸디다 알비칸스(fluconazole- or voriconazole-resistant Candida albicans)를 포함]이 있다. 이러한 병원체에 의해 야기된 감염은 항균물질로 치료하는 것이 특히 어렵다. 항균제(antimicrobial drug)가 소위 "경험적(empirical)" 치료 또는 "계산된(calculated)" 치료-이들의 작용 스펙트럼(activity spectrum)에 대개 다내성 병원체를 포함하지 않는-의 일환으로 처음에 투여되었기 때문에, 초기단계에서 내성이 검출되는 것은 치료의 성공에 매우 중대하다. 내성 미생물의 빠른 동정은 이러한 병원체에 대해서 효과적인 항균물질로의 시기 적절한 전환을 허용한다. 간소화를 위해서, 아래에서 이들은 항생제(antibiotics)로 일컬어진다; 이 용어는 세균에 대해서 효과적인 물질 뿐만 아니라, 진균 및 다른 미생물에 대해서도 효과적인 약제를 의미하기 위해 이용한다. 이러한 초기단계에서의 올바른 항균 치료로의 전환은 치료의 성공에 매우 중대할 수 있다.

현재, 단지 수 시간 이내에 감수성 테스트 결과를 제공할 수 있는 표현형 (즉, 배양에 기초함) 테스트 시스템 또는 개별적인 테스트가 특히 부족하다. 표현형 내성(phenotypic resistance)은 항생제의 존재에도 불구하고 미생물이 성장하는 것을 의미한다. 항생제가 충분한 농도로 투여되는 경우에, 테스트하에서, 항생제의 존재에서, 성장은 표현형 항생제 감수성으로 인해 저해된다. 표현형 감수성 테스트는 최적 표준(gold standard)을 대표한다. 테스트 결과가 근본적인 내성 메커니즘과 상관없이 생성된다는 것이 한 이유이다. 특정 내성 유전자가 짧은 시간 내에 분자 생물학의 도움으로, 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 검출될 수 있으나, 이 검출은 내성 메커니즘의 일부에만 가능하고; 다른 내성 메커니즘은 검출되지 않는다. 더욱이, 이러한 분자적인 테스트는 이미 공지된, 유전학적으로 암호화된 내성 메커니즘만을 검출한다. 따라서, 특정한 내성 유전자가 검출되지 않는 한, 항생제에 대한 병원체의 감수성에 대한 신뢰할만한 진술(reliable statement)을 하는 것은 불가능하다. 또한, 내성 유전자가 검출된 경우에, 이러한 방법이 표현형 내성에 대해서 신뢰할 만한 예측이 행해지는 것을 결코 항상 허용하지는 않는다. 이는 유전자 발현의 소견(manifestation)이 다양할 수 있고; 유전자의 존재에도 불구하고, 미생물이 항생제에 대한 표현형 감수성과 반응할 수 있기 때문이다.

더욱이, 매우 많은 내성 메커니즘에 대해서 유전자 검출이 가능하지 않다. 이들의 표현형 덕분에 특정한 내성 메커니즘을 빠르게 검출할 수 있는 방법은, 예를 들어, 일부 세균에 의해 생성된 β-락타마제의 검출을 포함한다. β-락타마제는 β-락탐 항생제를 절단하여 이들을 효과적이지 못하도록 만들 수 있는 세균 효소이다. 검출은 β-락탐 절단을, 예를 들어, 색상을 변화시키는 pH 지시약에 의해서 또는 MALDI-TOF MS [매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI); 비행시간형(time-of-flight, TOF); 질량 분석법(mass spectrometry, MS)]의 도움으로 검출함으로써 행해질 수 있다. MALDI-TOF MS는 절단되지 않은 β-락탐 및/또는 이의 절단 생성물의 질량 분석적 측정을 수반한다. 이러한 방법이 특정 상황에서는 이로울 수 있으나, 이들은 단 하나의 특정한 내성 메커니즘만이 검출되고, 병원체의 감수성 또는 내성에 대해서 일반적인, 명확한 진술을 할 수 없는 일반적인 불리한 점을 가진다.

그러므로, 한편으로는 보통의 테스트 방법을 이용하는 경우에, 성장에 기초한, 표현형 감수성 테스트를 허용함에 따라 일반적인 진술을 허용하는 방법에 대한 시급한 필요성이 존재하나, 반면에, 보통의 방법보다 현저하게 더 빠른 방법에 대한 시급한 필요성도 존재한다. 이러한 빠른 테스트에 대한 일반적인 목표는 단지 수 시간 이내, 즉, 예를 들어, 1-4시간 이내에 결과를 제공하는 것일 수 있다. 이러한 표적 시간(target time)의 달성 가능성은, 첫째, 테스트 방법에 달려있고, 둘째, 테스트될 미생물의 특징, 예를 들어, 이들의 성장 속도에 달려있다.

최근에 개발된 MALDI-TOF MS에 기초한 감수성 테스트 방법인, 미생물 성장의 정량을 위한 내부 표준(internal standard)을 이용하는 "MBT ASTRA"는 MALDI-TOF MS에 의한 일반적인 성장에 기초한 감수성 테스트가 실현 가능하다는 것을 입증한다 (Lange et al., Journal of Clinical Microbiology, December 2014, Volume 52, Number 12, p. 4155-4162; 및 K. Sparbier et al. / Methods 104 (2016) 48-54). 그러나, 현재까지 기술된 형태의 방법은 몇몇 처리 단계들을 필요로 하는데, 이는 많은 양의 실험실 작업을 의미한다. 이 노력은 방법의 수용을 감소시킬 수 있고, 따라서, 통상적인 진단에서, 기본적으로 환자에게 이롭거나, 또는 심지어는 이를 모두 예방할 수 있는 이 방법의 도입을 방해할 수 있다.

상기 설명을 고려하면, 후속적인 질량 분석 측정을 위한 살아있는 미생물 샘플의 제조가 간소화 및 가속화될 수 있는 방법을 제공하는 것에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명에 의해 달성될 추가의 목적은 아래 개시를 읽는 것으로부터 통상의 기술자에게 즉각 명백하다.

본 명세서에 기술된 방법은 매우 빠르고 간단한 MS에 기초한 미생물 측정에 대한 대안적인 방법, 예를 들어, 종/아종의 동정 및 또는 내성/ 감수성 테스트 및/또는 추가의 병원체 특징화를 제시한다. 본 개시는 특히, 샘플 처리/제조방법 및 또한 데이터 평가 알고리즘에 관한 것이다.

제1 바람직한 측면에 따르면, 본 개시는 후속적인 질량 분석 측정(mass spectrometric measurement)을 위한 살아있는 미생물 샘플의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 몇몇 샘플 스팟(sample spot)을 함유하는 평편한 샘플 지지대(sample support)를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 상기 살아있는 미생물 샘플을 상기 샘플 스팟 중 적어도 하나 상의 영양 배지의 액적(droplet)에 침적시키는 단계(depositing); (c) 상기 샘플 지지대를 정의된 분위기의 배양 챔버(incubation chamber)로 소정 시간 동안에 위치시켜 미생물의 성장을 촉진시키는 단계; (d) 상기 소정 시간 이후에 상기 영양 배지의 액적으로부터 잔류액을 제거하여 상기 샘플 스팟 상에 미생물의 침적물을 노출시키는 단계; (e) 상기 샘플 스팟을 탈착 이온화(desorbing ionization)에 대해서 준비하는 단계; (f) 상기 샘플 지지대를 질량 분석계의 탈착 이온 공급원(desorption ion source)으로 옮기고, 상기 준비된 샘플 스팟으로부터 이온을 생성하며, 적어도 하나의 대응하는 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 획득하는 단계; 및 (g) 상기 획득된 질량 스펙트럼을 참조 데이터 세트(reference data set)와 비교하여 상기 미생물 샘플의 적어도 하나의 특징을 결정하는 단계.

본 개시의 제1 바람직한 측면은 특히, 적합한 이온 공급원에서 처리된 샘플의 이온화를 위한 기판(substrate)의 역할을 하는 평편한 질량 분석 샘플 지지대가 이전 단계에서 미생물의 성장-촉진 배양을 위한 기판의 역할을 이미 할 수 있다는 새롭고 놀라운 결과에 기초한다. 이러한 이중 기능(dual function)은 실험실에서의 워크플로우(workflow)를 훨씬 더 용이하게 만들 수 있고, 복잡하고 오류 발생이 쉬운 수동 샘플 이동 단계(manual sample transfer step)가 회피될 수 있고, 마이크로 적정 플레이트와 같은 별도의 준비 용기(preparation vessel)를 가질 필요가 없기 때문에, 진단 절차에 필요한 시간을 단축시킬 수 있다. 이 절차의 간소화는 빠르고, 신뢰할 수 있으며, 철저히 검증된(validated) 미생물의 질량 분석 측정이 임상 진단학에서 정착되는 것을 도울 수 있다.

다양한 양태에서, 참조 데이터 세트는 이전에 획득된 질량 스펙트럼의 라이브러리로부터 얻어진 참조 스펙트럼(reference spectrum)을 포함할 수 있다. 여기서, 동정의 과정(process of identification)을 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 미생물 샘플 내 미생물의 종 또는 아종을 포함할 수 있다. 이 간단한 버전에서, 영양 배지의 액적은 질량 분석 샘플 지지대 상에서 순수 성장 반응기(pure growth reactor)로 작용한다. 당해 분야의 전문가들은 다른 인자들 중에서도, 미생물이 모든 면(all sides)에서 영양 배지로 배씽(bathing)될 수 있기 때문에, 이들이 페트리 디쉬 안의 한천 층(agar layer)과 같은 평편한 영양 배지 상에서 보다 액체배지에서 더 빠르게 증식할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 제안된 방법은 임상 환경에서 환자의 생존에 중대한 것으로 증명될 수 있는 시간상의 이점(time advantage)을 제공한다.

특정한 경우에서, 참조 데이터 세트는 상기 단계 (f)에서 획득된 질량 스펙트럼 중에 함유된, 미생물로부터 유래된 것이 아닌 질량 시그널로부터 유래될 수 있다. 제조중인 미생물 샘플로서 추가되고, 정량에 이용될 수 있는 하나의(또는 하나 이상의) 참조 물질(들) (내부 표준)의 질량 시그널이 예시로서 명시된다.

바람직한 양태에서, 상기 단계(b)에서, 동일한 미생물 샘플이 몇몇 샘플 스팟으로 동시에 적용된다. 영양 배지의 액적은 때로는 항균물질을 함유하고 때로는 이를 함유하지 않는다. 질량 분석 샘플 지지대가 상이한 항균물질(또는 상이한 농도의 동일한 항균물질)이 존재하는 경우에 미생물의 성장을 동시에 모니터링하기에 충분한 공간을 제공할 수 있기 때문에, 이는 광범위한 내성/감수성 테스트(resistance/sensitivity test)에 특히 적합하다. 그러므로, 미생물이 특정한 항균물질에 대한 감수성 반응(sensitive reaction) (또는, 그렇게 반응하기 시작하는 농도)-예를 들어, 이의 약물로서의 유효성을 나타낼 수 있는-을 보일지에 대한 의문이 매우 빠르고 확실하게 규명될 수 있다.

상기 방법의 특정한 양태에서, 항균물질이 존재하는 영양 배지의 몇몇 액적들은 때로는 효소 억제제를 함유할 수 있고, 때로는 이를 함유하지 않을 수 있다. β-락타마제 억제제가 효소 억제제로서 이용되는 경우는 대단한 임상 및 치료학적 관심사일 수 있다. 연구하에서, 미생물의 성장이 β-락탐 항생제의 존재에 의해 억제되지 않으나, β-락탐 항생제와 β-락타마제 억제제의 조합물이 존재하는 경우에는 억제되는 경우, 내성/감수성 테스트의 연장(extension)은 β-락타마제에 기초한 내성에 대하여 유익하다.

다양한 양태에서, 참조 데이터 세트는, 상기 단계 (b)에서 임의의 항균물질 또는 효소 억제제가 존재하지 않는 영양 배지의 액적이 적용된 샘플 스팟의 매우 최근에 획득된 질량 스펙트럼일 수 있고; 특징화의 목적을 위한, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 미생물 샘플 내 미생물의 항균물질 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물에 대한 내성/감수성을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 단계(b)에서, 각각 상이한 농도의 항균물질(및/또는 해당되는 경우에, 억제제)이 존재하는 영양 배지의 몇몇 액적들을 적용하고, 일련의 증가하거나 또는 감소하는 농도에 따른 유효성의 정도(degree of effectiveness)를 평가함으로써, 특히 미생물에 대한 항생제의 최소 억제 농도를 결정하는 것이 가능하다.

추가의 양태에서, 참조 데이터 세트는, 참조 데이터 세트로 이용되는 질량 스펙트럼을 위한 미생물이 더 짧은 시간 동안에 배양되거나, 또는 아마도 전혀 배양되지 않는, 제2 샘플 지지대 상의 샘플 스팟의 질량 스펙트럼일 수 있다. 여기서, 미생물 샘플은 바람직하게는, 임의의 항균물질이 존재하지 않거나 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물이 존재하지 않는 영양 배지의 액적 중의 샘플 스팟으로 적용된다. 미생물 샘플의 질량 스펙트럼을 위한 샘플 스팟에 초기에 적용된 미생물 세포의 양(quantity) 및 참조 데이터 세트는 바람직하게는 동일하다.

상기 단계(g)에서의 적어도 하나의 특징이, 획득된 질량 스펙트럼 중의 미생물에 특정한 질량 시그널 시그니처(mass signal signature)의 강도 또는 소견(manifestation)에 반영되는 미생물 성장의 차이로부터 유래되는 것이 바람직하며, 이는 항균물질 단독으로 또는 효소 억제제와 조합물에 의해 야기되는 성장 저해를 밝히는 것이 가능한지 또는 가능하지 않은지에 대한 여부에 달려있다. 간단한 버전에서, 배양 전에 측정된 미생물 샘플 내 미생물의 양이 신뢰할 수 있는 동정에 충분하지 않은 경우에, 미생물 성장은 종의 성공적인 동정에 기초하여 평가될 수 있다. MALDI 바이오타이퍼® 알고리즘 (MALDI Biotyper® algorithm)은 공지된 동정 방법의 예시로서 명시될 수 있으며, 이는 계산된 유사도 지수(similarity index) (소위 "log(점수)")가 1.7 이상인 한, 허용 가능하게 신뢰할 수 있는 미생물의 종의 동정을 확증한다. 높은 신뢰도(degree of reliability)는 2.0 이상의 유사도 지수로 달성된다.

다양한 양태에서, 양(quantity)이 질량 분석 측정의 검출 한계 약간 이하에 있도록, 상기 단계 (b)에서의 미생물 샘플이 영양 배지의 액적에 투여될 수 있다. 특히, 샘플 지지대가 배양 챔버에서 유지되어 미생물 성장을 촉진시키는 기간(length of time)이 이로써 최소한으로 감소될 수 있다. 검출 한계에 이르거나, 이를 약간 초과하는 성장은 백그라운드 시그널(background signal) 외에 정보를 주는 데이터를 함유하지 않는 측정과 비교하여, 그 자체에서 미생물의 특징 또는 존재에 대한 징후로 해석될 수 있다.

다양한 양태에서, 상기 단계(c)에서의 배양 챔버 내 온도는 약 36°C로 설정되고(이는 감수성 테스트 또는 배양에 아마도 필요하거나 심지어 규정된 것이다), 배양 챔버 내 습도는 포화에 가깝게 설정되어, 연구하에서 미생물에 최적인 또는 필수적인 성장 조건을 형성할 수 있다. 목적은 일반적으로, 성장의 차이가 가장 명백하게 드러나도록 야기할 수 있는 배양 챔버 내 조건을 형성하는 것이 되어야 한다. 36°C의 온도는 대략적으로 인간의 체온에 대응하고, 미생물의 숙주로서 인간에 특화된(specializing) 미생물에 적합하다. 수의학적인, 음식물 또는 환경적인 진단에서, 예를 들어, 다른 온도가 가장 적합한 것으로 밝혀지는 것은 꽤 가능한 것이며, 이는 미생물이 어떤 숙주 또는 주변 환경을 선호하는가에 달려있다. 샘플 지지대가 배양 챔버에 있는 동안에(일반적으로 1-18시간), 미생물의 성장에 이용 가능한 액체의 부피가 대개 수 시간에 달하는 소정 시간이 지나도 대략적으로 동일하게 유지할 수 있도록, 100%에 가까운 높은 공기 습도는 특히 영양 배지의 액적이 너무 이르게 증발되는 것을 예방하는 역할을 한다.

다양한 양태에서, 잔류액의 제거 (배양 단계 후에)는 액적 상청액을 흡수성 물질로 살짝 눌러 제거하거나, 또는 이를 피펫팅하여 제거하는 것을 수반할 수 있다. 이러한 버전은, 영양 배지의 액적 중에 존재하는 물질의 잔류물이 샘플 스팟으로부터 액체와 함께 크게 제거되는 이점을 가지며, 이는 후속적인 질량 분석 측정에서 화학적인 백그라운드(chemical background)를 감소시킬 수 있다. 그러나, 단기간에, 예를 들어, 뜨거운 송풍기(air blower)를 이용해서 액체를 증발시키는 것도 또한 가능하다. 이 경우에, 액체 영양 배지 중의 물질이 미생물 침적물 상에서 침적되고, 후속적으로 이와 함께, 적어도 부분적으로, 후속적인 질량 분석 측정을 위해 제조된다.

다른 양태에서, 상기 단계(e)에서의 준비는 미생물 침적물로부터 미생물 단백질/펩티드의 예비 추출(preparatory extraction) 및/또는 미생물 침적물의 세척 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)에 의한 후속적인 이온화의 목적을 위한 레이저 빛-흡수 매트릭스 물질(laser light-absorbing matrix substance)에 미생물 침적물을 내장(embedding)시키는 것을 수반할 수 있다. 추출의 경우에, 획득된 질량 스펙트럼 중의 미생물에 특정한 질량 시그널의 수가 증가될 수 있고, 따라서, 측정의 유용한 값이 강화된다; 이는, 목표가 연구하에서 미생물의 종/아종에 의한 동정인 경우에, 특히 사실이다. 하나 이상의 세척 단계는 미생물 침적물로부터 거의 편재하는 염(omnipresent salt)의 제거에 특히 적합하며, 이는 그렇지 않으면 이온화 효율을 약화시킬 수 있다. 따라서, 제조방법은 더 최적화될 수 있다. 매트릭스 물질에 대한 예시는 2,5-디하이드록시벤조산(2,5-dihydroxybenzoic acid), 시나핀산(sinapic acid) 또는 α-시아노-4-하이드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)이다. 미생물의 이온에 기초한 연구에서, MALDI 방법은 매우 중요하고 믿을 수 있는 도구로 입증되었다. 동시에, 이는 비행시간형 분산의 질량 스펙트럼의 획득에 이상적인 펄스식 이온 형성(pulsed ion generation)을 허용한다.

그러나, 매트릭스 물질의 적용을 필요로 하지 않는 다른 유형의 탈착 이온화가 기술된 방법으로 이용될 수 있는 것이 또한 있음직하며, 그 예로는 탈착 전기 분무 이온화 (desoprtion electrospray ionization, DESI) 또는 이차이온 질량분석법 (secondary ion mass spectrometry, SIMS)을 이용한 이온화가 있다. 매우 특정한 경우에, 상기 단계(e)에서의 준비는, 예를 들어, 임의의 미생물 침적물의 추가의 처리 없이, 수 분의 짧은 대기 시간만을 포함할 수 있다.

유리하게는, 상기 단계(f)에서의 질량 스펙트럼이 비행시간형 분산으로 획득된다. 현재, 비행시간형 질량 분석계는 미생물의 임상적인 분석 및 비임상적인 분석 모두에서, 이들의 높은 분해능(high resolution), 빠른 측정시간, 및 넓은 질량 수용(mass acceptance)으로 인해 "최적 표준(gold standard)"으로 보여질 수 있다. 비행시간형 원리에 따라 작동하는 질량 분석계의 예시는 브루커 달토닉 GmbH(Bruker Daltonik GmbH)가 시판중인 microflex® series에서의 이들이다.

다양한 양태에서, 미생물 샘플은 (i) 상기 단계(b)에서, 적어도 하나의 샘플 스팟 상의 영양 배지의 액적 중의 현탁액으로 분배될 수 있거나, 또는 (ii) 적어도 하나의 샘플 스팟 상에 세포 형태로 먼저 침적되고, 분배된 영양 배지의 액적으로 후속적으로 액침(immersing)된다. 추가의 버전에서, 항균물질(또한, 적합한 경우에 효소억제제)은 미생물 샘플 및/또는 영양배지와 함께 또는 이들과 별도로 샘플 스팟 상으로 적용될 수 있다. 원칙적으로, 액적이 먼저 분배되고 나서 미생물 샘플이 도입되도록, 침적 및 분배의 순서를 반전시키는 것도 또한 있음직하다.

추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 개시는 후속적인 질량 분석 측정을 위한 미생물의 제조방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다: (a) 몇몇 샘플 스팟(sample spot)을 함유하는 평편한 샘플 지지대(sample support), 예를 들어, 브 루커 달토닉 GmbH로부터의 MSP 48/96 표적 연마 강철 BC(MSP 48/96 target polished steel BC)를 제공하는 단계; (b) 상기 샘플 지지대로부터 배양되고/되거나 분리되어 나오는, 온전한 미생물을 상기 평편한 샘플 지지대의 샘플 스팟 중 적어도 하나 상의 영양 배지의 액적에, 바람직하게는 나노피펫 또는 마이크로피펫을 이용하여 침적시키는 단계로서, 옮겨진 상기 액적의 양은 1 내지 10 마이크로리터에 달할 수 있는, 단계; (c) 상기 평편한 샘플 지지대를 소정 휴지기(resting period) 동안, 바람직하게는 10분 내지 60분 동안 유지시켜 미생물 침적물이 상기 샘플 스팟 상에 형성하는 것을 허용하는 단계; (d) 상기 소정 휴지기 후에 상기 영양 배지의 액적으로부터 잔류액을 제거하여 상기 미생물의 침적물을 노출시키는 단계; (e) 상기 샘플 스팟을 탈착 이온화에 대해서, 바람직하게는, MALDI 매트릭스 물질을 이용하여 준비하는 단계; (f) 상기 샘플 지지대를 질량 분석계의 탈착 이온 공급원(desorption ion source)으로 옮기고, 상기 준비된 샘플 스팟으로부터 이온을 생성하며, 적어도 하나의 대응하는 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및 (g) 상기 획득된 질량 스펙트럼을 참조 데이터 세트(reference data set)와 비교하여 상기 미생물 샘플의 적어도 하나의 특징을 결정하는 단계.

본 발명의 발명자들은, 일종의 "생물막"으로, 평편한 표면에서 침강된(sedimented) 미생물이 잔류액으로부터 약하게 벗어날 수 있고(gently freed), 후속적인 질량 분석 측정에 의해 확실하게 측정되도록, 평편한 표면 상의 미생물 침적이 최대 1시간의 상대적으로 짧은 휴지기 후에만 형성할 수 있다는 것을 확인했다. 이 놀라운 발견을 활용하여, 질량 분석 측정을 위한 제조 및 성장 촉진의 목적을 위한, 본 개시의 제1 측면에 따른 동일한 질량 분석 샘플 지지대에서 수행되는 미생물의 배양 (cultivation 또는 incubation)이 제2 측면에 따른 상이한 기판 상에서 수행될 수 있다. 임상적인 환경에서, 자동화된 배양 프로토콜이 아마도, 표준 마이크로 적정 플레이트(standardized microtitration plate)의 웰과 같은 용기에서, MALDI-TOF MS 지지대와 같은 평편한 표면 상에서 보다 더 용이하게 수행될 수 있기 때문에, 이 공간적인 분리는 가능한 적용, 특히 워크플로우의 자동화를 가능하게 한다. 원칙적으로, 제1 측면에 따른 이 방법의 설명과 제2 측면에 따른 방법이 이와 상용성이 있도록 될 수 있는 경우에, 제1 측면에 따른 이 방법의 설명이 또한 제2 측면에 따른 방법에 적용된다.

다양한 양태에서, 참조 데이터 세트는 이전에 획득된 질량 스펙트럼의 라이브러리로부터 얻어진 참조 스펙트럼을 가질 수 있고, 동정을 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 미생물의 종 또는 아종을 포함한다.

다양한 양태에서, 상기 단계 (b)에서 적용되기 전에, 미생물은 평편한 샘플 지지대로부터 떨어져 있는 적어도 하나의 용기(vessel)내 액체 영양 배지에서 배양되고, 이 용기로부터 샘플 스팟 상으로 옮겨질 수 있으며; 배양은 바람직하게는, 조절된/온도가 제어된 배양기에서, 약 4 내지 24시간이 걸린다. 배양은 특히 미생물의 감수성 테스트-상기 기술된 대로, 바람직하게는, 항생제가 존재하는 경우 및 존재하지 않는 경우 모두에서 유용하다. 특정 병독성 인자 또는 다른 미생물 특징을 시사할 수 있는 질량 스펙트럼 중의, 특정한 단백질의 동정 또는 결정을 위해, 배양이 절대적인 것은 아니므로, 보호되는 방법의 일부가 될 필요가 없다. 이미 존재하는 미생물 현탁액, 예를 들어, 실험실에서 다른 처리의 결과로서 생성된 것을 이용하는 것이 가능하다. 예를 들자면: 세균의 현탁액이, 예를 들어, 한천 플레이트 상에 존재하는 세균 콜로니를 액체에 용해시킴으로써 생성되고; 이는, 콜로니가 성장하도록 하는 한천과 같은 고체 배지 상에서 세균의 배양에 의해 진행될 수 있다(여러 날 동안, 이들은 이미 이 형태로 이용 가능했을 수 있다). 추가 예시: MALDI Sepsityper® 키트는 패혈증 환자(septic patient)의 혈액 및 액체 배지, 및 양성인 경우에 배양된 병원체를 또한 함유하는 양성 혈액 배양 바틀(positive blood culture bottle)로부터의 액체를 이용한다. 키트는 후속적인 단백질 추출 및 이 단백질의 MALDI 측정을 수반한 용해/원심분리 방법을 더 이용하여 이 양성 액체로부터 병원체를 농후화시킨다. 대안적으로는, 수 마이크로리터(sevral microliters)의 양성 혈액 배양물 용액이 스팟 상으로 적용될 수 있다. 추가된 열(added heat)의 이용 없는 간단한 실온에서의 배양에서도, 미생물 세포는 지지대의 표면에 (i)침강 및 (ii) 부착할 것이고; (iii) 또한, 대부분의 종은 실온에서 조금이라도 증식할 것이다.

다양한 추가의 양태에서, 동일한 미생물이 몇몇 (외부의) 용기에서 배양될 수 있고, 일부 경우에서 항균물질이 액체 영양 배지로 추가될 수 있으나, 다른 경우에서는 그렇지 않을 수 있다. 게다가, 효소 억제제는 때로는 추가된 항균물질이 존재하는 상이한 용기 내 액체 영양 배지에 추가될 수 있고, 때로는 그렇지 않다. 한 예시는 β-락타마제 억제제이다.

다양한 양태에서, 참조 데이터 세트는, 항균물질 또는 효소 억제제가 존재하지 않는 액체 영양 배지로부터 유래된 미생물 침적이 존재하는 샘플 스팟의 최근에 획득된 질량 스펙트럼일 수 있고, 특징화의 목적을 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 미생물의 항균물질 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물에 대한 감수성을 포함할 수 있다. 특정한 버전에서, 동일한 미생물은 각 경우에서 상이한 농도의 액체 영양 배지가 존재하는 상이한(외부의) 용기에서 배양될 수 있고, 특징화의 목적을 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 항균물질의 미생물에 대한 최소 억제 농도를 포함할 수 있다.

상기 단계(g)에서의 적어도 하나의 특징이 미생물 성장의 차이로부터 유래되는 것이 바람직하며, 이는, 예를 들어, MALDI 바이오타이퍼® 알고리즘을 이용한 신뢰할 수 있는 동정 및 실패한 동정 사이의 차이에서 이 자체로 분명해질 수 있다.

배양의 초기에, 양(quantity)이 질량 분석 측정의 검출 한계, 예를 들어, 영양 배지의 밀리리터당 약 10⁵ cfu 약간 이하가 되도록 미생물이 투여될 수 있는데, 이는 특히 스팟당 적어도 약 100의 미생물(100 microorganisms per spot) 농도를 초래한다.

다양한 양태에서, 상기 단계(d)에서의 평편한 샘플 지지대로부터의 잔류액의 제거는 액적 상청액을 흡수성 물질로 살짝 눌러 제거(dabbing off)하거나 이를 피펫팅하여 제거하는 것을 수반할 수 있다.

상기 단계(e)에서의 준비는 평편한 샘플 지지대 상의 미생물 침적물로부터 미생물 단백질/펩디드의 예비 추출 및/또는 미생물 침적물의 세척 및/또는 미생물 침적물을 상기 단계(f)에서의 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)에 의해 후속적으로 이온화되기 위한 레이저 빛-흡수 매트릭스 물질로 내장시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 단계(f)에서의 질량 스펙트럼은 바람직하게는 비행시간형 분산으로 (비행시간형 질량분석계에서) 획득된다.

다양한 양태에서, 미생물은 (i) (외부의)용기로 액체 영양 배지 중의 현탁액으로서 분배될 수 있거나, 또는 (ii) 세포 형태로 (외부의)용기로 먼저 도입된 후에, 액체 영양 배지가 추가될 수 있다; 영양 배지의 양은, 예를 들어, 10 내지 100 마이크로리터일 수 있다.

다양한 양태에서, 마이크로 적정 플레이트 내 웰(또는 몇몇 웰들)이 (외부의)용기(들)로서 배양에 이용될 수 있다. 대안으로서, 상기 단계(a)로부터의 샘플 지지대 플레이트가 평편한 샘플 스팟이 존재하는 제1 평편한 섹션 및 웰이 표면 상에 존재하는 제2 섹션으로 나뉠 수 있다. 이 웰은 (외부의)용기(제1 평편한 섹션으로부터 떨어져 있는)로서 이용되고, 이 용기에서 성장한 상기 단계(b)에서의 온전한 미생물이 이로부터, 제1 평편한 섹션 내 평편한 샘플 스팟 상으로 옮겨진다.

본 발명은 아래 도시를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 이 도시 내 요소는 축척(scale)에 필요하지 않으나, 본 발명의 원리를 도시하는 것을 주로 의도한다(대체로 개략적으로). 이 도시에서, 동일한 참조 번호는 다른 뷰 내 대응하는 요소를 지칭한다.
도 1은 검출부 (4)에서 끝나는 선형축 비행경로 (2) 및 상류 이온 공급원 (6)이 있는, 미생물 세포의 질량 분석에서 보통 이용되는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)용 질량 분석계 (10)에 대한 양태의 개략도이다.
도 2a 내지 도 2g는 한 예시로서 동정 목적의 미생물 샘플 내 미생물의 제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 3a 내지 도 3h는 미생물 샘플의 내성/감수성 테스트를 위한 가능한 방법의 개략적 도시이다.
도 4a 및 도 4b는 본 명세서에서 제시된 방법의 원리에 따른 내성/감수성 테스트의 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5i는 한 예시로서 본 개시의 제2 바람직한 측면에 따른 미생물의 제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 6은 한 말단의 평편한 섹션과 복합 샘플 지지대-그러므로, 질량 분석 샘플 지지대로 이용될 수 있는(이의 제조에 필요한 경우)- 및 액체 영양 배지에서 미생물의 배양(cultivation/incubation)을 위한, 다른 말단에 내장된 용기가 있는 섹션의 양태를 도시한다.

본 발명이 많은 양태를 참고하여 도시 및 설명된 동안에, 통상의 기술자는 동봉된 청구항에 정의된 기술적 교시의 범위를 벗어나지 않고, 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 이에 만들어 질 수 있음을 인식할 것이다.

본 개시의 제1 바람직한 측면에 따라, 놀랍게도, 미생물의 배양을 위한 질량 분석 샘플 지지대 바로 위에서 살아있는 미생물 샘플의 제조가 그 자체로 이용되어 충분한 수의 미생물을 질량 분석 검출을 위한 샘플 스팟 상에 생성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 간단하지만, 그럼에도 놀랍도록 효율적인 양태에서, 살아있는 미생물 세포가 현탁되거나 액침된 영양 배지의 액적은 이를테면, 증식로(breeder reactor)역할을 한다.

도 2a 내지 도 2g는 샘플 지지대 바로 위 액적에서의 이러한 배양방법과 함께 후속적인 질량 분석 측정의 개략적 도시이다.

평편한 샘플 지지대 (12)는 상이한 부위("스팟")의 미생물 현탁액의 액적(14)들로 코팅된다. 이 액체는 양이온-조절 뮬러-힌튼 배양 배지(cation-adjusted Mueller-Hinton culture broth) 또는 이소-센시테스트 배양 배지(Iso-Sensitest culture broth)와 같은 영양 배지를 함유한다. 요건에 따라서, 액적(14)들은 1-10 마이크로리터, 예를 들어, 2, 4, 6 또는 8 마이크로리터의 부피를 가질 수 있다. 샘플 스팟은 지지대 표면 상에 표지(labeling)될 수 있거나, 또는 그외에 지지대 (12)의 특색없는 표면 상의 충분히 분리된 위치에 적용될 수 있다. 96개의 표지된 스팟이 있는 앵커칩 플레이트(AnchorChip plate)는, 예를 들어, 지지대 (12)로 이용될 수 있다 [독일, 브레멘 소재의 브루커 달토닉 GmbH(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)]. 대안적으로, 샘플 스팟은 샘플 지지대 (12)의 표면이 충분히 소수성인 경우에 퍼질 수 없는, 적용된 영양 배지의 액적(14)에 의해 정의될 수 있다. 도 2a.

이 예시에서, 각각 상이한 미생물을 함유하는 5개의 액적(14)들로 코팅된 지지대 (12)는 36°C 및 거의 100% 상대 습도의 정의된, 제어된 분위기하에서, 예를 들어, 최대 약 18시간 동안 지지대가 유지될 수 있는 배양 챔버 (16)에 위치된다. 물론, 미생물 샘플의 적용이 배양 챔버 (16)에 위치될 수 있고; 따라서, 샘플 지지대 (12) 상으로 샘플을 침적시키고 배양 챔버 (16) 내에 샘플 지지대 (12)를 위치시키는 관련된 방법 단계가 이 개시에서 기술된 절차의 모든 있음직한 양태에서 순서를 반전시킬 수 있다는 것이 여기서 언급되어야 한다.

배양 챔버 (16) 내의 습도는, 예를 들어, 소듐 클로라이드 용액을 이용해서 설정될 수 있다. 배양 챔버 (16)에서 이들의 시간 동안에, 미생물이 액적(14)들 중의 영양 배지를 물질 대사함에 따라, 이들이 증식(multiplying)할 수 있다. 액적(14) 중의 본래 투명한 영양 배지가 수 시간 후에 흐려진다(미도시)는 사실 덕분에, 번식(propagation)이 가시적일 수 있다. 그러나, 질량 분석적으로 검출될 수 있는 미생물 성장에 대해서, 배지가 흐려지는 것이 필수적인 것은 아니나, 충분히 긴 배양 시간이 주어진다면, 이는 가시적인 처리 대조 마커(visual process control marker)의 역할을 할 수 있다. 도 2b. 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 증식된 미생물이 동시에 액적(14) 및 지지대 표면 사이의 경계에서 충분한 양으로 정착하는 것을 관찰했는데, 이는 후속적인 액체 감소(liquid reduction) (제습) 또는 건조를 대단히 용이하게 한다. 도 2c.

한 버전에서는, 지지대 표면 상의 미생물 세포들(20)의 침강된 덩어리(sedimented clump)가 거의 완전히 노출될 때까지, 액적의 상청액에서 잔류액이 마이크로피펫 또는 나노피펫 (18)을 이용하여 조심스럽게 덜어내질 수 있다(drawing off). 도 2d- 2e. 놀랍게도, 상기 기술된 침강 습성(sedimentation behavior)은 영양 배지의 잔류액이 이 방법으로 제거된 후에, 샘플 스팟 상에 충분한 미생물이 남아있고, 따라서 질량 분석계의 검출부에서 검출 가능한 질량 시그널의 생성의 근거가 유지된다는 것을 의미한다.

그 후에, 샘플 스팟 상의 노출된 미생물 침적물(20)은 샘플 지지대 (12) 바로 위에서 매트릭스-보조 레이저 탈착에 의한 이온화용 매트릭스 물질로 코팅될 수 있다 [타일 햇칭(tile hatching)이 있는 피펫 팁 (22)]. 도 2f. 게다가, 단백질/펩티드 추출 및/또는 세척 단계를 위한 물질의 추가와 같은 추가의 예비 단계(preparatory step)가 이전에 삽입될 수 있다 (미도시); 이들은 당해 분야 전문가에게 주지되어 있다. 따라서, 질량 분석계의 이온 공급원에서, 제조된 샘플 스팟은 레이저(24)로 충격을 받게 되고(bombarding), 이로써 샘플 스팟 상의 미생물(20)의 침강 및 제조된 필름으로부터 이온을 생성하며, 이는 측정될 연결된 질량 분석기로 넣어진다. 도 2g.

배양된 미생물의 종 또는 아종은 MALDI 바이오타이퍼® (독일, 브레멘 소재의 브루커 달토닉 GmbH)와 같은 공지된 평가 알고리즘을 이용해서 스펙트럼 데이터베이스로부터의 참조 스펙트럼과 비교하여, 획득된 질량 스펙트럼 중의 특정한 질량 시그널로부터 고도의 신뢰성을 수반하며 추론될 수 있다(deriving). 이러한 평가를 위한 절차는 당해 분야 전문가에게 공지되어 있고, 본 명세서에서 더 상세히 설명될 필요가 없다.

질량 분석 샘플 지지대 바로 위에서 미생물이 배양된 후의, 상기 기술된 순수 동정 측정 (pure identification measurement)외에도, 본 개시는 또한 내성/감수성 테스트를 위한 미생물 샘플을 제조하는 방법 및 테스트 키트를 제공하며, 이는 아래에서 설명될 것이다.

감수성 테스트를 위한 통상적인 장치는 보통, 많은 수의 항생제를 동시에 테스트하며 (예를 들어, 12 내지 18 종), 표준화된 소위 "패널"에 포함된다. 이들이 더 긴 배양 및 반응 시간-보통의 배양 기간: 10-24 시간 (소위 "밤새 배양")-을 필요로 하기 때문에, 결과는 대개 동일한 작업일에 입수 가능하지 않다. 실제 임상적 상황에서, 이는 특정 환자 및 그의 질병으로 특정하게 나타내어 지거나, 또는 특정 환자에게 이미 투여된 단 하나 또는 몇 가지의 항생제의 테스트에 충분할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 항생제 투여하에서, 관찰될 수 있는 임상적인 개선이 존재하지 않는 경우에, 유효성의 확인에 대한 시급한 필요성이 존재할 수 있다. 본 명세서에서, 특히 패혈증(sepsis)과 같은 생명을 위협하는 감염의 경우에, 이러한 테스트의 결과가 환자를 치료하는 의사(physician)에게, 다음날이 아닌, 단 수 시간의 현저한 단기간 내에 입수 가능해지는 것, 예를 들어, 그가 치료에 대해 결정하는 것을 돕는 것은 매우 중요하다.

이런 이유로, 특히 이 기술은 개별적인 빠른 테스트, 즉, 특정 미생물 또는 미생물 집단에 대한 특정한 항생제의 테스트 수행을 위한 방법 및 장치(테스트 키트, 소모품 및 다른 도구)에 초점이 맞춰져 있다. 이는 필요한 경우에 많은 수의 항생제의 동시 또는 즉각적인 테스트를 위한 몇몇 항생제의 동시의 테스트에 조정된 동일한 또는 비슷한 또는 유래된 원리의 이용을 불가능하게 하지 않는다.

제1 바람직한 측면에 따라 기술된 방법의 특징 중 하나는 내성/감수성 테스트, 또는 필요한 절차적인 단계 중 적어도 대부분이 MALDI-TOF MS 지지대와 같은 질량 분석 샘플 지지대, 즉, 예를 들어, 질량 분석계의 이온 공급원에서 측정 동안에 이온화의 기판 역할을 하는, 연마된 강철(polished steel) 또는 세라믹으로 만들어진, 이 목적에 적합한 평편하고 전도성인 플레이트 바로 위에서 수행된다는 사실이다. 기술된 방법에서, 감수성 테스트는 성장에 기초하는데 (배양에 기초함), 즉, 방법은 표현형 감수성 테스트이고, 따라서 근본적인 내성 메커니즘(존재하는 경우에)과 독립적이다.

항생제와 함께 또는 항생제가 존재하지 않는 미생물의 성장은 (후자는 성장 대조군을 특성화 함) MALDI-TOF MS 지지대 바로 위에서 비슷하게 일어날 수 있으며, 이 위에서 측정도 또한 후속적으로 일어난다. 이는 제1 바람직한 측면에 따라 기술된 방법을 미생물이 MALDI-TOF MS 지지대로부터 떨어져서 배양되는 기존의 MALDI-TOF MS에 기초한 방법으로부터 근본적으로 구분한다. 이러한 방법으로, 항생제와 함께 및 항생제가 존재하지 않는 배양 (성장 대조군에 대한)은 마이크로 적정 플레이트(microtitration plate)의 웰 또는 배양 용기에서 먼저 일어나고(이후 미생물 또는 미생물 단백질이 이러한 용기 또는 웰에서 분리됨), 후속적으로 MALDI-TOF MS 지지대 상으로 옮겨진 다음에 측정된다. 그러나, 이는 일련의 노동 집약적인 수동 단계(manual step)를 필요로 하는데, 이는 이러한 방법을 통상적인 진단 작업으로 통합시키는 것이 어려운 것을 의미한다. 그러나, 제1 측면에 따라 제안된 방법은 매우 더 간소화되고 빠른 샘플의 제조를 허용한다.

도 2a 내지 도 2g와 유사한 방식으로, 본 명세서에서 기술된 처리 단계가 한 예로서 이들의 가능한 수단을 개략적으로 도시하는 역할을 하는 도 3a 내지 도 3h에 도시된다. 그러나, 당해 분야의 전문가는 특정 처리 단계가 변형된 형태로 실행될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 통상의 기술자는 오리엔테이션(orientation)에 대한 도움으로서 본 명세서에서 제안된 워크플로우(workflow)를 취할 것이고, 그들에게 필요하거나 유용한 것 같은 경우에, 이들의 통상적인 기술 및 지식에 따라서 적절한 워크플로우로부터 벗어날 것이다.

항생제 (예를 들어, 액체 영양 배지 중 항생제 용액)는 MALDI-TOF MS 지지대 (12)의 스팟 바로 위에서 [햇칭된(hatching) 액적(14*)] 또는 배양 용기에서 미생물 현탁액과 혼합될 수 있다. 더욱이, 이는 MALDI-TOF MS 지지대의 상이한 섹션 상의 성장 대조군, 즉, 항생제의 추가가 없는 영양 배지에서 미생물 현탁액의 배양 (햇칭되지 않은 액적(14))이 일반적으로 동반된다. 이는 스팟에 적용될 매우 소량, 예를 들어, 1-10 마이크로리터의 현탁액에 바람직하다. 따라서, 감수성 테스트는, 바람직하게는 약 4-8 마이크로리터 부피의 마이크로액적(14) 및 마이크로액적(14*)에서 일어난다. 심지어 더 작은 부피, 예를 들어, 나노액적의 형태의 이용도 또한 원칙적으로 가능하다. 액적(14) 및 액적(14*) 중의 초기 미생물 농도는 선형 비행 경로를 수반한 통상적인 MALDI 비행시간형 질량 분석계의 검출 한계 약간 이하일 수 있고, 따라서, 예를 들어, 밀리리터당 약 5Х10⁵ cfu (cfu - 콜로니 형성 유닛)에 이를 수 있다. 도 3a.

제시된 예시에서, 테스트 용액과 MALDI-TOF MS 지지대 (12)는 이른바 "습도 챔버(humidity chamber)"(16)에서, 높은 습도의 배양기에서 후속적으로 배양된다. 습도 챔버 (16)의 목적은 액적(14) 및 액적(14*)을 배양 동안에 이른 증발로부터 예방하는 것이고, 이는 플라스틱으로 만들어진 뚜껑이 있는 박스의 형태-예를 들어, MALDI-TOF MS 지지대가 용이하게 위치될 수 있는-를 취할 수 있다. 이 습도 챔버 (16)는 시판중인 MALDI-TOF MS 지지대 (독일, 브레멘 소재의 브루커 달토닉 GmbH)용의 통상적인 수송 또는 보관 컨테이너의 형태와 유사한 형태를 가질 수 있고, 바람직하게는 본 명세서의 MALDI-TOF MS 지지대 (12)가 이의 내부에 충분히 깊게 위치될 수 있어서, 뚜껑이 MALDI-TOF MS 지지대 (12)의 표면 상의 액적(14) 및 액적(14*)과 접촉되지 않도록 설계된다. 영양 배지의 액적 (14) 및 액적(14*) 자체의 증발이 예방되도록, 소량의 액체, 예를 들어 0.1 내지 5 밀리리터의 물 또는 NaCl 용액이 습도 챔버 (16)에 넣어져서 습도 챔버(16) 내 분위기를 가습하고, 따라서 높은 주변 습도(ambient humidity) (거의 100%)를 설정할 수 있다. 도 3b.

액적(14) 및 액적(14*)에서는, 작은 부피의 용액에서 높은 농도의 미생물이 배양 동안에 빠르게 달성된다(항균물질에 의해 성장이 저해되지 않는 한). 충분한 시간 후에, 습도 챔버 (16)는 MALDI-TOF MS 지지대 (12)와 함께 배양 캐비닛(incubation cabinet) (미도시)으로부터 제거될 수 있다. MALDI-TOF MS 지지대 (12)는 이어서 습도 챔버 (16)로부터 제거되고, 지지대 상의 액적(14) 및 액적(14*)은 건조된다. 건조는, 예를 들어, 공기중에서 소극적(passive)일 수 있거나, 또는 예를 들어, 적극적으로 생성된 공기 흐름, 열(heat)의 효과, 둘 모두의 조합, 또는 다른 방법에 의해 가속될 수 있다. 액적(14) 및 액적(14*) 중의 매우 작은 부피(나노리터 내지 마이크로리터)의 액체로 인해 건조가 매우 빠르게 일어난다. 그러나, 액적의 이러한 간단한 건조 (예를 들어, 뜨거운 공기를 이용한)는 미생물 세포 뿐만 아니라, 액체 영양 배지의 다른 성분 및 단백질도 또한 MALDI-TOF MS 지지대 (12)의 스팟 상에 농후해지고, MALDI-TOF MS 측정을 방해하는 불리한 점을 가질 수 있다. 이 잠재적인 문제점은 MALDI-TOF MS 지지대 (12) 바로 위의 영양 배지로부터 미생물 세포를 분리시킴으로써 개선될 수 있다.

건조 및 분리의 경우 모두에서, 목적은 영양 배지의 액적(14) 및 액적(14*)의 잔류액을 크게 제거해서 후속적인 제조를 위한 샘플 스팟을 준비하는 것이다. 상기에서 공표된 바와 같이, 본 발명의 발명자들의 연구 동안에, 이들은 미생물 세포가 몇 시간이 걸릴 수 있는 배양 동안에 침강하는 경향을 가지는 것으로 보이며, 이후 대부분 MALDI-TOF MS 지지대 (12)의 표면 바로 위에 축적(accumulation) 된다는 것을 확인했다. 액체 성분이 지지대 (12)의 표면 위에 위치하는 "상청액"을 형성하는데 반해, 어느 정도까지는, 세포는 심지어 이에 부착하고 ("붙는다"), 일종의 "미생물 생물막"을 형성한다. 이 습성에 대한 완전한 과학적 설명을 제공하려는 것은 아니나, 평편한 플레이트 상의 액적에서 미생물이 성장함에 따라, 플레이트 표면과 미생물 세포 사이의 물리적 상호작용, 및 미생물 세포 표면의 생물화학적 및 생물물리학적 특성으로부터 야기된 부착 과정이 현저한 침적 형성에 원인이 되는 것으로 추정된다. 도 3c.

이 새로운 발견을 활용하여, 다른 문맥 내 도 2d를 참조하여 이미 기술된 바와 같이, 상청액 액체 영양 배지 (잔류액)는 MALDI-TOF MS 지지대 (12) 상의 액적(14) 및 액적(14*)으로부터 피펫팅하여 제거될 수 있다. 대안적으로, 액체는 간단히 살짝 눌러 제거되서 액체로부터 미생물 침적물을 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 흡수성, 저보풀 와이프(26), 예를 들어, KimWipes™가 생물학/화학 실험실에서 통상적으로 이용됨에 따라, 이 목적에 이용될 수 있다. 본 명세서의 분리는, 다른 인자들 중에서도 모세관 효과(capillary effect)에 의해 설명될 수 있고, 즉시 일어난다. 분리는, 예를 들어, 접힌 천(cloth) (흡수성 종이, 압지(blotting paper), 민감한 표면을 닦기 위한 부드러운 천과 같은) 또는 특정한 장치를 이용하여 수동으로 살짝 누름으로써 (manually dabbing) 수행될 수 있다. 이러한 장치는, 예를 들어, 흡수성 물질의 시트 또는 패드를 가질 수 있는데, 이는 특히, 균일하고, 빠르며 표준화된 살짝 누르는 것(dabbing)을 위해, 유체 접촉(fluid contact)이 액적(14) 및 액적(14*)과 확립되는 것을 허용하기에 충분히 가깝게 MALDI-TOF MS 지지대 (12) 위에 간단히 배치되고, 수 초의 상대적으로 짧은 흡수 시간 후 다시 제거된다. 도 3d-3f.

살짝 누르는 것(dabbing)의 대안적인 양태에서, 액적 및 흡수성 직물(absorbent fabric) 사이의 접촉은 수직 방향(도 3d-3f에 제시된 샘플 지지대 표면에 수직)으로는 확립되지 않으나, 샘플 지지대의 표면에 가까운 액적 또는 액적의 측면 가장자리(lateral edge)에서는 가능하다. 의도하지 않은 세포 제거의 위험이 감소되도록, 이는 (i) 영양 배지의 잔류액이 더 빠르게, 더 완전히 흡수되고, (ii) 표면에 있는 스팟의 중앙에 우선적으로 축적(accumulation) 되는 세포가 흡수성 직물과 결코 접촉하지 않는 것을 보장하는 것을 가능하게 한다. 액체 흡수의 이러한 변형은 질량 스펙트럼 중의 백그라운드(background)를 더 감소시킬 수 있고, 따라서 측정의 질을 더욱 더 개선시킬 수 있다.

또한, 상기에서 설명된 잔류액 제거의 이러한 버전은 크게 제습된(또는 잔류액이 고갈된, 노출된) 미생물 침적물(20)을, 대응하는 샘플 스팟 상의 영양 배지를 잠재적으로 방해하는 적은 잔여물과 함께 야기한다. 이 침적물은 후속적인 질량 분석 측정에 대한 근거의 역할을 한다.

본원에 기술된, 액체를 살짝 눌러 제거 또는 피펫팅하여 제거함으로써 액체 영양 배지로부터 세포를 분리하는 것은 고품질의 MS 스펙트럼을 수반한 매우 효과적인 측정을 야기한다. 액적의 (소극적) 건조에 비해서 이 분리의 추가의 이점은 분리가 극도로 빠르게(즉각 또는 즉시) 일어나는 것으로, 이는 확실한 시간 절약을 제공하고, 샘플의 추가 처리가 즉각 발생하는 것을 허용한다. 그럼에도, 어떤 양태에서 살짝 누르는 것(dabbing)은 가열된, 건조한 공기 흐름을 동반하여 잔류액을 더 더욱 철저하게 고갈시킬 수 있다.

액체 배지로부터 세포를 분리하는 기술된 방법은 상청액의 후속적인 제거를 수반하는 원심분리와 비슷하게 효과적이나, 임의의 추가의 시간을 소비하지 않고 MALDI-TOF MS 지지대 바로 위에서 수행될 수 있다. 분리 효과는, 예를 들어, 앵커 지지대 (브레맨 소재의 브루커 달토닉 GmbH, 앵커칩) 또는 평편해진 원뿔(flattened cone) 형태의 개별적인 샘플 스팟이 있는 MALDI-TOF MS 지지대와 같은 특정한 MALDI-TOF MS 지지대를 이용함으로써 여전히 더 강화될 수 있다. 얕지만, 약간 원뿔모양인 웰이 세포 침강 효과(cell sedimentation effect)를 강화할 수 있다. 또한, 지지대 바로 위의 액체 샘플을 세척하는 다른 방법이 이용될 수 있다.

성장기 (growth phase) 동안에 샘플 지지대 표면 상에 미생물 침적(부착)의 형성을 강화하기 위해, 스팟 표면은 상이한 부착-촉진 물질(adhesion-promoting substance), 예를 들어, 단백질 또는 당으로 코팅될 수 있다. 이러한 물질은 바람직하게는 이들이 미생물 질량 스펙트럼과 참조 데이터 세트의 비교 및/또는 측정을 방해하지 않도록 선택된다. 이는, 예를 들어, 이러한 물질의 질량 시그널이, 대개 m/z 2,000 내지 m/z 20,000m/z인, 예를 들어, 3,000 내지 m/z 15,000과 같은 평가될 질량 범위 밖에 있도록 함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로는, 동시에 표준 물질(standard substance), 즉, 좋은 품질의 측정을 위한 마커 및/또는 강도 마커로 이용될 수 있는, 부착-촉진 특성이 있는 물질 (예를 들어, 단백질)이 선택될 수 있다. 이 경우에, 이러한 표준 물질의 질량 시그널이 평가될 질량 범위에 속할 수 있다. 더욱이, 강화된 부착 특징 및/또는 강화된 표면 마감(surface finish)이 있는 물질은 MALDI-TOF MS 지지대의 제조를 위한 물질로서 시작부터 이용될 수 있다.

상기에서 이미 설명된 바와 같이, 대응하는 스팟 상의 액체 영양 배지의 액적을 건조 또는 분리시킨 후에, 예를 들어, 지지대가 MALDI-TOF MS 기구로 도입되기 전에 및 미생물 생체분자, 예를 들어, 단백질 또는 펩티드가 측정되기 전에, 스팟은 MALDI-TOF MS 분석용 매트릭스로 코팅된다 (타일 햇칭이 있는 피펫팁(22)). 도 3g-3h.

매트릭스 물질이 적용되기 전에 또는 이와 동시에, 상이한 물질, 예를 들어 포름산 또는 아세토니트릴이 추가되어 미생물 단백질의 추출을 개선할 수 있고, 이러한 물질은 측정을 돕는다 (미도시). 액적을 세척함에 따라, 탈이온수의 액적이 또한 미생물 침적물에 적용되고, 다시 제거되어 염을 제거할 수 있다. 측정 후에, 결과는 아래에서 더 상세히 설명되는 알고리즘에 따라 평가될 수 있다. 이는 항생제의 존재하에서 미생물의 성장을 평가(assessing) 및 등급을 부여하는 것(rating)을 수반한다. 본 명세서의 근본적인 원리는 내성 미생물이 항생제에도 불구하고 성장이 가능한 반면에, 감수성 미생물의 성장은 항생제의 존재하에서 억제되는 것이다. 성장 대조군, 즉, 동일한 MS 샘플 지지대 상에서 항생제가 존재하지 않는 미생물 현탁액 테스트의 포함은 평가 및 대응하는 평가 알고리즘에 도움이 될 수 있다. 도 3b 및 도　3c는 비교로서, 감수성(실선) 및 내성 (파선)에 대한 성장 및 침강 습성(sedimentation behavior)을 개략적으로 제시한다.

방법의 한 버전에서, MALDI-TOF MS 지지대와 같은 평편한, 평면 질량 분석 샘플 지지대가 관통홀(through-hole)을 포함하는 제거 가능한 상부와 함께 바닥(bottom)을 형성하고, 격자무늬의 웰(grid of well)을 제공하는-특허 출원 CA　제2 467 131 A1호 (이 특허 출원에서, 도 10)에 기술된-복합 마이크로 적정 플레이트(composite microtitration plate) 상에서 미생물은 항생제와 함께 및 항생제 없이 배양될 수 있다. 제공된 반응 용기 또는 웰은 (예를 들어, 테스트 키트로서), 예를 들어, 미생물 현탁액이 추가되기 전에, 용액, 파우더, 또는 동결건조된 형태의 항생제를 이미 함유할 수 있다. 미생물 성장을 동반하는, 또는 미생물 성장 대신의 충분한 배양 기간 후에, 액적의 잔류액이, 예를 들어, 건조에 의해 제거되고, 상부는 MALDI-TOF MS 플레이트로부터 제거된다. 이 후에 상기에 기술된 MALDI 매트릭스 제조 및 MALDI-TOF MS 측정이 이어질 수 있다.

추가의 양태에서, MALDI-TOF MS 지지대는 별도의 배양기에서 배양되지 않으나, 배양기 기능이, 예를 들어, 배양 유닛 또는 배양 모듈의 형태로 MALDI-TOF 질량 분석계 또는 완전한 시스템으로 직접 통합될 수 있다. 이는 자동화(automation) 및 필요한, 수동 제조 단계의 추가 감소를 허용한다. 추가의 양태는 습도 챔버 자체에 가열 장치(heating device)의 통합을 제공하는데, 이는 배양기의 기능을 지닐 수 있어서 별도의 배양기 제공에 대한 필요성을 배제할 수 있다.

스팟 상에 건조상태 파우더, 또는 다른 형태의 항생제로 이미 전처리된 질량 분석 샘플 지지대의 이용은 추가적으로 사용자로 하여금 감수성 테스트의 수행을 더 용이하게 만들 수 있다.

도 4a는 조건 혐기성, 그람 음성의 막대균인 (facultatively anaerobic, gram-negative, rod bacterium)인 폐렴막대균의 카바페넴 그룹으로부터 β-락탐 항생제 메로페넴에 대한 예시를 이용한 내성/감수성 테스트의 결과를 제시한다. 도 3a-3h에서 개략적으로 기술된 바와 같이, 샘플 제조를 샘플 지지대 바로 위에서 수행하였다. 분배된 액적의 부피는 6 마이크로리터였고; 항생제의 농도는 밀리리터당 2 마이크로그램이었으며; 적절하게 조절된 배양 챔버에서의 체류시간(dwell time)은 4시간이었다. MALDI 비행시간형 질량 스펙트럼은 시판중인 제품 MALDI 바이오타이퍼®의 소프트웨어 모듈로 평가했다. 박테리아 중, 한 메로페넴-내성 균주 (상단에 있는 질량 스펙트럼) 및 한 메로페넴-감수성 균주 (하단에 있는 질량 스펙트럼)를 각각 테스트하였다. 동일한 MALDI 샘플 지지대 플레이트 상에서 제조된, 임의의 항생제가 존재하지 않는 성장 대조군은 각 경우가 우측 스펙트럼에서 제시된다.

내성 균주의 경우에, 두 개의 상단 스펙트럼에 있는 특정 질량 시그널의 시그니처(signature)가 거의 다르지 않다는 것이 분명히 보여질 수 있다. 따라서, 세균 성장이 메로페넴의 존재에서 분명히 억제되지 않았고, 종의 신뢰할 수 있는 동정이 가능하기 때문에, 이 균이 내성이라는 것을 결론 내리는 것이 가능하다. 반면, 감수성 균주의 경우에, 특정한 질량 시그널 시그니처는 성장 대조군의 스펙트럼 (우측 하단)에서만 볼 수 있다. 그러나, 메로페넴의 존재에서 (좌측 하단의 스펙트럼), 폐렴막대균 세포는 분명히 증식할 수 없다 (또는 가까스로 증식한다). 좌측 하단의 스펙트럼에서 두드러진 개별적인 질량 스펙트럼은 미생물 정량의 목적을 위한 영양 배지의 액적에 추가된 참조 물질(reference substance)에 속하나, 본 명세서에서 구체적으로 기술된 연구에서 고려되지 않는다. 성장이 결여된 이러한 조건하에서, 평가 소프트웨어는 데이터의 부족으로 인해 미생물의 종을 결정할 수 없다; 특히, 미생물 바이오매스(microbial biomass)의 초기의 양이 질량 분석 검출 한계 이하인 경우에, 이는 사실이다. 이는 이 폐렴막대균 균주가 이 특정한 항균물질에 감수성으로 반응한다는 결론이 도출되는 것을 허용한다.

도 4b는 막대 차트(bar chart)를 이용해서, 2, 4, 6, 8 및 10 마이크로리터의 5개의 상이한 액적 크기에 대한 도 4a의 실험으로부터 메로페넴이 존재하는 경우의 폐렴막대균의 성장 습성의 통계치를 도시한다. 보다시피, 내성 균주의 상대 성장은 0.4의 성장 역치를 훨씬 초과하는 반면에(중앙값이 0.4보다 현저히 크나, 측정이 이 이하에서 종종 발생하는, 4 마이크로리터의 액적의 한 예외가 존재함), 감수성 균주의 상대 성장은 확실히 0.4의 현저한 성장 역치(growth threshold) 이하이다.

내성/감수성 테스트는 배양물로부터 수득되거나 또는 생물학적 물질로부터 직접적으로 수득된 미생물 샘플상에서 수행될 수 있다. 선행기술에서, 한천과 같은 고체 배지상에서 16-24 시간 동안에 배양된 성숙한 배양물 (mature cultures)이 감수성 테스트에 통상적으로 이용되고, 이러한 배양 시간 후에 발달된 콜로니(developed colony)의 형태로 존재한다. 액체 영양 배지에서 배양된 성숙한 배양물로부터의 테스트도 또한 가능하다.

그러나, 많은 상황에서, 결과가 입수 가능하기까지의 시간을 현저히 감소시키기 위해, 분석될 물질로부터 직접 감수성 테스트를 이전에 수행하는 것이 이롭다. 양성 혈액 배양물(Positive blood culture)은 빠른 병원체 진단이 중대하게 중요한 이러한 물질에 대한 예시로서 인용될 수 있다. 요즘, 혈액 배양물 진단의 절차는, 보통, 환자로부터 채취된 혈액 샘플을 먼저 액체 영양 배지가 있는 특정한 혈액 배양 바틀로 넣는 것이다. 이러한 바틀은, 예를 들어, 이산화탄소를 측정함으로써 일어날 수 있는 임의의 미생물의 성장에 대해서 바틀을 지속적으로 모니터링하는 자동 배양기로 후속적으로 판독된다. 혈액 배양 바틀로부터의 양성 결과가 존재하는 경우에, 이로부터의 액체를 고체 배지상으로 도말하고(smearing), 이후에 이를 보통 16-24시간 동안 배양한다. 이로부터 야기되는 콜로니를 동정 및 항생제 감수성 테스트에 이용한다. 또한, 콜로니는 다른 것 중에서도, 본 명세서에 기술된 감수성 테스트의 방법에 적합하다.

그러나, 양성인 것으로 보고되는 혈액 배양물로부터 직접적인 동정 및 감수성 테스트는 고체 배지상에서 배양에 필요한 시간을 절약하고, 이로써 결과가 거의 하루 일찍 획득되는 것을 허용한다. 이를 달성하기 위해, 샘플은 미생물을 농후하게 하는 전처리(preparatory processing)를 거쳐야 한다. 이는, 예를 들어, 용해(lysis)/원심분리(centrifugation) 방법 또는 용해/여과 방법에 의해 달성될 수 있다. 용해/원심분리 방법을 이용하여, 미생물이 원심분리에 의해 농축되기 전에, 혈액 세포는 예를 들어, 텐사이드(tenside)를 비롯한 용해제(lysing agent)를 추가하여 먼저 용해된다. 선택적 세척 단계에서, 세척 버퍼를 추가하고, 미생물을 원심분리에 의해 다시 농축시킨다. 이어서, 동정을 즉각 또는 단백질 추출 후에 수행한다. 동정에 대한 이러한 방법은 MALDI Sepsityper® 동정 키트 (독일, 브레맨 소재의 브루커 달토닉 GmbH)로 개발되었으며, 시판중이다 (N. G. Morgenthaler et al., International Journal of Microbiology Volume 2015, Article ID 827416, 10 pages).

이 방법 또는 비슷한 방법이 마찬가지로 본 명세서에 기술된 MALDI-TOF MS를 이용한 내성/감수성 테스트를 위한 샘플의 전처리(미생물의 농후화)로 이용될 수 있다. 이는 결과가 획득되기까지의 시간을 현저히 감소시킬 수 있다.

대안적으로, 고체 배지상에서 매우 잠시 배양된 양성 혈액 배양물 또는 다른 물질로부터의 계대 배양(sub-culture)은 본 명세서에 기술된 MALDI-TOF MS에 기초한 감수성 테스트에 이용될 수 있다. 고체 배지상에서 매우 잠시 배양된 양성 혈액 배양물로부터 계대 배양의 이용은 동정 테스트(Idelevich et al., Clin Microbiol Infect. 2014; 20:1001-1006) 및 감수성 테스트 (Idelevich et al., J Clin Microbiol. 2014; 52:4058-4062)에 대해서 최근 입증되었다. 여기서, 고체 배지는 계대 배양 (도말) 후 잠시 동안에만, 대개 1.5 내지 6시간 배양되고, 따라서 생성된 "어린" 미생물 바이오매스가 동정 및 감수성 테스트에 이용된다. 혈액 배양물이 양성으로 기록된 직후에, 이 과정이 직접적인 테스트를 허용하는 것은 아니나, 그럼에도 이는 16-24시간 동안 배양된 성숙한 콜로니로부터의 통상적인 검사에 비해서 매우 빠르다. 이 방법의 이점은 필요한 추가의 소모품 또는 추가의 작업이 없다는 사실에 있다; 고체 배지는 초기 단계에서 간단히 관찰되어야 하고, 테스트는 "어린" 바이오매스로부터 수행된다.

특히 이로운 것은, 혈액 배양기에서 혈액 샘플의 사전 배양 없이, 혈액으로부터 직접적인 감수성 테스트이다. 미생물을 번식시키기 위한 샘플의 전처리는 양성으로 기록된 혈액 배양물로부터의 테스트를 위해 상기에 기술된 대로 수행될 수 있다.

사전 배양 없이는 혈액 중의 미생물 세포의 낮은 농도로 인해 미생물이 농축된 후라도, 혈액으로부터 직접적인 직접 MALDI-TOF MS에 기초한 동정(direct MALDI-TOF MS-based identification)이 현재 수행되기 어려운 반면에, 혈액으로부터 직접적인 직접 MALDI-TOF MS에 기초한 감수성 검사는 본원에 기술된 방법을 이용함으로써 가능하다. 혈액으로부터 미생물을 분리한 후에, 미생물 현탁액은 감수성 테스트에서 대개 그렇듯이 액체 영양 배지에서 제조되고, 항생제와 혼합된다. 이어서, 이 현탁액 및 이용되는 경우에 성장 대조군은 바로 배양되는 MALDI-TOF MS 지지대 상으로 액적의 형태로 적용된다. 혈액 중의 매우 낮은 초기의 미생물 세포 수에도, 미생물은 특정 배양 기간 후에 적어도 성장 대조군, 또는 표현형 내성이 존재하는 경우에, 샘플 및 항생제의 혼합물에서도 또한 증식할 것이다. 이는 MALDI-TOF 질량 분석계에 의해 검출될 수 있다. 그러므로, 감수성 검사는 사실상 이 개시의 제1 바람직한 측면에 대하여 기술된, 동일한 원리에 따라 수행된다.

고체 배지상에서 배양된 성숙한 콜로니로부터 미생물은 MALDI-TOF를 이용하여 용이하게 동정될 수 있다. 그러나, 연구하에서(예를 들어, 양성 혈액 배양물로부터), 샘플은 물질로부터 직접 동정을 위한 전처리를 거쳐야 한다. 이는, 예를 들어, 상기 기술된 용해/원심분리 방법으로 가능하다. 그러나, 이 방법은 시간을 소모하고, 이를 통상적인 실험실 진단으로 통합하기 더 어렵게 만드는 추가의 처리 단계를 필요로 한다.

제1 바람직한 측면에 따른 MALDI-TOF MS 지지대 바로 위의 액적으로부터 검출 및 동정, 또는 액적에서의 감수성 테스트를 위한 이 출원에 기술된 방법은 분리되어서 뿐만 아니라, 조합으로도 수행될 수 있다. 예를 들어, 테스트가 연구하에서, 물질로부터, 양성 혈액 배양물로부터 직접적인 경우에, 이러한 조합은 특히 타당하다. 감수성 테스트를 이러한 방식의 동정과 조합함으로써, MALDI-TOF MS 측정은 감수성 테스트에 대한 기술된 알고리즘에 따른 항생제가 추가된 샘플의 성장과 대조군 측정의 성장을 비교할 뿐만 아니라, 대조군 측정에서 억제되지 않은 미생물 성장이 추가로 보통의 MALDI-TOF MS 동정에 이용될 수 있다. 배양 기간이 충분히 길지만, 여전히 16-24 시간의 보통 배양 기간에 비해서 매우 짧은 경우에, 미생물 바이오매스의 양이 동정에 충분하다. 이 조합된 방법의 이점은 (i) 예를 들어, 용해/원심분리 방법에 대한 추가의 처리 단계를 삼가하는 것이 가능하다는 것, (ii) 감수성 테스트 및 동정의 결과가 즉시 및 동시에 입수 가능하다는 것, 및 (iii) 감수성 테스트 및 동정이 완료되기까지의 시간이 성숙한 콜로니로부터의 통상적인 테스트에 비해서 더 짧다는 것이다.

이 조합된 방법은 물질, 예를 들어, 양성 혈액 배양물 또는 혈액으로부터 직접적인 테스트 뿐만 아니라, 성숙한 콜로니 또는 어린 콜로니로부터의 테스트에 적용될 수 있다.

본원에 기술된 방법의 추가의 양태는 내성 메커니즘의 미생물의 빠르고 간단한 검출을 가능하게 한다. 이는, 예를 들어, 복합 테스트(combination test)에 의해 달성된다. 다시 말해서, 미생물, 항생제 및 항생제에 대한 미생물 유기체의 가능한 내성을 특정하게 상쇄시키는(즉, 특정한 내성 메커니즘에 기초함) 물질을 포함하는 현탁액이 미생물 및 항생제를 포함하는 현탁액, 및 미생물만을 포함하는 현탁액(항생제가 존재하지 않는 성장 대조군) 외에도 테스트된다.

이에 대한 한 예시는 세균에 의한 β-락타마제의 형성의 검출이다. β-락타마제는 세균 효소로, β-락탐 항생제를 절단해서 이들을 유효하지 않게 만든다. β-락타마제의 예시는 ampC-β-락타마제, 광범위 β-락타마제(Extended Spectrum β-lactamase, ESBL), 카바페네마제(carbapenemase) 등이다. β-락타마제의 각 유형은 특정 범위의 항생제를 절단하고, 또한 상이한 정도로 치료에 이용 가능한 항생제의 범위를 제한하고, 세균 균주가 상이한 번식 속도를 가지는 것을 허용하는, 상이한 특성(예를 들어, 플라스미드 또는 염색체상의 유전자의 편재화(localization))을 가진다. 따라서, 근본적인 내성 메커니즘의 빠른 결정은 매우 중요할 수 있고, 특히, 도입될 필요가 있을 수 있는 병원위생(hospital hygiene) 및 위생조치(hygiene measures)에 대한 연구의 문맥에서, 그러하다.

특정한 β-락타마제 억제제 [예를 들어, ESBL에 대한 클라불란산(clavulanic acid), 또는 메로페넴에 대한 바보르박탐(vaborbactam)]를 추가함으로써, β-락타마제의 효과가 특이적으로 중화될 수 있다. 이 원리는 치료학적으로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 내성의 기저를 이루는 β-락타마제의 검출에 대해서 진단학적으로도 활용될 수 있다. 예를 들어, 항생제로 함침된 테스트 디스크 및 β-락타마제 억제제를 더한 항생제로 함침된 테스트 디스크가 시판 중이다. 세균 배양물이 한천 플레이트와 같은 고체 배지상에 도말된 후에, 이러한 테스트 디스크를 적용하고; 16-24 시간 후, 억제 구역(zone of inhibition)이 측정된다 (한천 확산 테스트). 항생제가 함침된 테스트 디스크와 β-락타마제 억제제를 더한 항생제로 함침된 테스트 디스크 사이에서, 억제 구역의 직경의 특정한 차이에 도달되는 경우에, 이는 특정한 β-락타마제의 형성을 시사한다.

더 간단한 수행을 제외하고, 특히, 복합 테스트에 대한 본원에 기술된 방법의 이점은, 예를 들어, 12시간보다 훨씬 더 긴 시간을 필요로 해서 훨씬 나중에, 다음날에 입수 가능한 한천 확산 방법의 결과에 비해서, 결과가 단지 수 시간 후에 준비된다는 것이다. 첫째, 액체 영양 배지에서 미생물의 성장이 고체 배지에서의 성장보다 현저히 빠르고, 둘째, 적은 부피의 용액으로 인해 높은 미생물 농도가 액적에서 빠르게 달성되며, 셋째, 한천 확산 방법을 이용한 경우에 고체 배지상에서 성장의 가시적인 관찰에 의해 달성될 수 있는 성장 검출보다, 예를 들어, MALDI-TOF MS에 의한 질량 분석 측정이 더 민감하며 더 빠른 성장 검출을 보장한다는 사실로부터 본원에 기술된 방법의 속도상의 이점(speed advantage)이 기인한다.

초반에 기술된 MALDI-TOF MS (절단되지 않은 β-락탐 또는 절단 생성물의 질량 시그널)를 이용한 β-락탐 절단의 검출에 의한 β-락타마제의 동정에 비해서, 복합 테스트를 이용한 본원에 기술된 MALDI-TOF MS에 기초한 방법은 중요한 이점을 가진다: β-락탐 절단의 검출이 간접적인 방법이다, 즉, 양성인 경우에, β-락탐 항생제가 절단되는 것이 나타나며, 이로부터 항생제가 이 세균 균주에 효과적이지 않을 것이라는 결론이 내려진다. 그러나, 유효성은 또한 항생제의 투여량과 같은 다른 인자들에 의해서도 좌우될 수 있다. 게다가, 본원에 기술된 복합 테스트에 대해서, 미생물의 성장에 대한 β-락타마제 억제제의 효과는 직접적으로, 즉, 내성의 중화 여부에 상관없이 측정된다. 이러한 결과는 상당히 크게 임상적으로 관련된다.

이전의 설명에 따라서, 본원에 기술된 복합 테스트는 성숙한 콜로니 또는 어린 콜로니로부터의 테스트에 이용될 수 있고, 또한 물질, 예를 들어, 양성 혈액 배양물 또는 혈액으로부터 직접적으로 테스트에 이용될 수 있다.

개별적인 고속 테스트의 형태, 즉, 특정 미생물에 대한 특정 항생제의 테스트인, 기술된 방법의 적용 외에, 몇몇 항생제를 동시에 테스트하는 것 [다중 테스트(multiplex testing)] 역시 가능하다. 이는 미생물 샘플에서 미생물에 대한 완전한 안티바이오그램(antibiogram)이 동시에 형성될 수 있는 이점을 가진다. 또한, 각 항생제에 대한 몇몇 농도를 동시에 테스트하는 것이 가능하며, 이는 최소 억제 농도(MIC)가 결정되는 것을 허용한다. MIC는 미생물의 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도이다. MIC는 미생물의 항생제에 대한 감수성의 측정치이다. 첫째, MIC는 미생물의 "감수성(sensitive)", "중간등급(intermediate)" 또는 "내성(resistant)" 카테고리로의 카테고리화(categorization)를 허용한다; 둘째, MIC는 미생물의 특정 항생제에 대한 "감수성의 정도"에 대한 정보를 제공한다. 다중 테스트의 경우에, MALDI-TOF MS 지지대의 많은 스팟이 동시에 코팅될 수 있다. 예를 들어, 96, 384 또는 1536개의 스팟이 있는 지지대가 이용될 수 있다.

미생물의 성장이 상이한 평가 알고리즘으로 측정될 수 있다. 항생제가 존재하는 미생물의 성장은 항생제가 존재하지 않는 미생물의 성장(성장 대조군)과 비교될 수 있다.

미생물 바이오매스의 검출이 가능한 알고리즘으로 제안된다. 특정한 더 낮은 검출 한계, 즉, 질량 스펙트럼 중의 인식 가능한 질량 시그널을 형성하는 의미에서 검출을 허용하는 미생물 바이오매스의 최소량 (스팟당 약 10⁴ 또는 10⁵개의 미생물 세포)이 MALDI-TOF MS 방법에 대한 특징이다. 이러한 더 낮은 검출 한계는 기구 특징 및 설정을 포함하는 많은 인자들에 의해 좌우된다. 본원에 기술된 알고리즘에 따르면, 액체 영양 배지 중의 미생물은 MALDI-TOF MS 측정 방법의 더 낮은 검출 한계 이하인 농도 (양)의 스팟에 적용될 수 있다. 다시 말해서, 이 미생물 샘플의 추가의 처리 없이 MALDI-TOF MS 측정이 수행된 경우에, 편재하는 백그라운드(omnipresent background) 이상의 질량 스펙트럼 중의 임의의 미생물 시그니처를 검출하는 것은 불가능할 것이다. 이로부터 직접적으로, 결과적으로 더 낮은 검출 한계가 초과되지 않기 때문에, 미생물이 테스트 중인 항생제에 감수성인 경우, 성장이 억제되고 배양 기간 후에도 미생물 바이오매스는 거의 검출되지 않을 것이다. 반면에, 미생물이 테스트 중인 항생제에 내성인 경우, 미생물은 배양 동안에 성장 대조군 (항생제가 존재하지 않음)에서 이들이 할 수 있는 것과 똑같이 성장할 수 있고, 미생물 질량이 검출될 수 있다, 즉, 질량 스펙트럼 중에서 대응하는 특정한 미생물 질량 시그널이 검출된다.

방법의 정확도를 증가시키고, 심지어 소량의 미생물 바이오매스(일반적으로 검출 한계 이하인)에 대해서도 특정한 미생물 질량 시그널 시그니처와 비슷한 질량 스펙트럼 중의 "무작위로" 발생하는 시그니처를 잘못 해석할 확률을 회피하기 위해, 미생물 바이오매스량(amount of microbial biomass)의 정량 (아마도, 게다가 조합으로) 또는 상대정량이 이용될 수 있다. 이는, 예를 들어, 내부 표준(독일, 브레맨 소재의 브루커 달토닉 GmbH, "MBT-ASTRA")을 이용한 소위 "곡선하 면적(Area Under the Curve, AUC)" 및/또는 피크 강도 (peak intensity)의 비교에 의해, 또는 당해분야의 전문가에게 주지되어 본원에서 더 상세히 설명될 필요가 없는 다른 통계적 방법에 의해 달성될 수 있다. 특히, 획득된 질량 스펙트럼 중의 미생물 질량 시그니처와의 비교를 위한 참조 데이터 세트는 내부 표준의 질량 시그널 또는 동일한 질량 스펙트럼 중의 참조 물질로부터 유도될 수 있거나 또는 측정될 수 있다.

공간 분해능(spatial resolution)의 알고리즘은 다른 가능한 버전으로 제공된다. 여기서, MALDI-TOF MS 방법이 이용되어 정확히 정의된 공간 그리드(spatial grid) 내에 레이저 샷(laser shot)을 발사한다(firing)- 예를 들어, 정의된 영역의 MALDI-TOF MS 지지대의 준비된 스팟 위에 분배된 1,000번의 샷. "성공적인" 샷, 즉, 검출 가능한 미생물 시그니처가 존재하는 질량 스펙트럼이 생성된 샷의 수는, 예를 들어, 항생제가 존재하는 미생물 샘플 및 항생제가 존재하지 않는 미생물 샘플 (성장 대조군)사이에서 비교된다.

예를 들어, 이 알고리즘은 미생물 바이오매스의 측정을 위한 상기 기술된 알고리즘에 대한 보충물로서 또한 이용되어, 검출 방법의 정확도를 증가시키고, 심지어 소량의 미생물 바이오매스(일반적으로 검출 한계 이하인)에 대해서도 질량 스펙트럼 자체 중의 "무작위로" 발생하는 시그니처가 현저한 성장으로 잘못 해석되는 확률을 감소시킬 수 있다. 다시 말하면, 예를 들어, 적은 수의 성공적인 샷은 성장으로 해석될 수 없으나, 무작위적이며 현저하지 않은 것으로 간주된다.

도 5a 내지 도 5i는 본 개시의 제2 바람직한 측면에 따른 방법의 양태를 설명한다. 많은 단계들이 상기 언급된 방법의 단계와 비슷하므로, 이러한 방법에 관한 설명이 이 예시에도 또한 적용될 수 있기 때문에, 하기 설명은 본 개시의 제1 바람직한 측면에 따른 방법으로부터의 본질적인 차이에 대한 모든 당연한 간결함(brevity)에 한정된다.

본질적인 차이는 질량 분석 측정을 위한 미생물의 배양(cultivation/incubation) 및 준비가 질량 분석 샘플 지지대와 같은 동일한 평편한 기판(substrate)에서 수행되지 않고, 별도의 기판 (또는 기판 섹션)에서 수행된다는 것이다. 액체 영양 배지 중의 미생물 현탁액이 용기(28)들, 예를 들어, 마이크로 적정 플레이트(30) 내 웰에 추가된다. 접종물은 밀리리터당 약 10⁶ cfu일 수 있고; 영양 배지의 부피는 약 50 내지 250 마이크로리터, 바람직하게는 100 마이크로리터이다. 내성/감수성 테스트의 경우, 웰(28)들은 (예를 들어, 테스트 키트로서) 미생물 현탁액이 추가되기 전에, 예를 들어, 용액, 파우더 또는 동결건조된 형태의 항균물질을 이미 함유할 수 있다. 대안적으로는, 이러한 항생제는 나중의 단계에서 영양 배지로 또한 추가될 수 있다. 도 5a.

웰 플레이트(30)는 배양기(16)에 위치되고, 예를 들어, 4 내지 18시간의 특정한 배양 시간 동안에 배양기에서 유지되어 미생물 성장을 촉진시킨다. 이미 설명된 대로, 미생물은 침적물 ("미생물 생물막")을 웰(28)들의 바닥 및 측벽(sidewall)의 하부에 형성하는 경향을 가진다. 도 5b-5c.

웰 플레이트(30)는 배양기(16)로부터 제거된다. 웰(28)들로부터의 거의 균일한 미생물 분포로부터 온전하고 성장한 미생물의 충분한 양이 존재하는 영양 배지의 부피를 제거하기 위해, 미생물이 더 큰 농도로 샘플링될 수 있고, 영양 배지의 액체와 균일하게 분포되도록, 제거 직전에 침적물이, 예를 들어, 팁(18)을 피펫팅하는 몇몇 위 및 아래의 움직임에 의해 또는 웰 플레이트(30)의 부드러운 교반에 의해 교반될 수 있다. 제거되는 용액의 양은 1 내지 10 마이크로리터일 수 있다. 도 5d-5e.

이 절차에 대한 대안으로서, 배양 동안에 웰(28)들에서 미생물 침적물의 형성은 배양기(16) (미도시)에서 이 시간 동안에 웰 플레이트(30)를 조심스럽게 교반시킴으로써 시작부터 방해될 수 있거나 예방될 수 있다. 이는 피펫 팁(18) 및/또는 후속적인 교반을 이용한 분산의 필요성을 배제할 수 있다.

제거된 용액과 이 용액에 함유된 온전한 미생물이 함께 평편한 질량 분석 샘플 지지대 (12)의 스팟 상에 액적(14)으로 침적된다. 도 5f.

이어서, 액적 용액과 지지대 표면 사이의 경계면(interface)에서 축적 (accumulation) 또는 침강(sedimentation)할 기회를 미생물에 주는 약 10 내지 60분의 지속기(standing period) 또는 휴지기가 이어진다. 근본적인 원리는 샘플 지지대 (12)상의 액적(14) 중의 미생물 농도가 증가할수록, 휴지기가 짧아질 수 있다는 것이다; 달리 말하면: 높은 농도에서는, 휴지기가 바람직한 범위의 하위에 있을 수 있고; 낮은 농도에서는, 더 긴 시간 동안 기다리는 것이 이로울 수 있다. 도 5g.

다른 문맥에서 상기 설명된 대로, 영양 배지의 잔류액이 휴지기 후에 샘플 스팟으로부터, 예를 들어, 지지대 표면에 있는 스팟 상의 액적(14)과 유체 접촉을 비스듬히 야기하여 액체의 많은 부분을 간단히 흡수하는 흡수성 직물(천 (26))을 이용해서 제거될 수 있다. 물론, 상기에서 기술된 피펫팅하여 제거하는 것을 비롯한 다른 유형의 액체 제거가 이용될 수 있다. 도 5h.

이제, 이 방법으로 노출된 미생물 침적물(20)은 상기 기술된 대로 더 제조될 수 있고 질량 분석계에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 미생물의 펩티드/단백질이 추출될 수 있고/있거나 침적물(20)이 세척될 수 있고/있거나 침적물(20)이 MALDI 매트릭스 물질로 내장될 수 있다. 도 5i.

도 6은 미생물이 배양될 수 있는 웰(34) (다수의 웰을 나타낼 수 있음) 및 질량 분석 샘플 제조를 위한 기판으로 이용될 수 있는 이로부터 떨어진 샘플 스팟이 있는 한 평편한 섹션(36)이 존재하는 복합 웰/샘플 지지대 플레이트(32)를 예시로서 개략적으로 도시한다. 질량 분석계의 이온 공급원에서, 웰(34)이 전기장(electric field)에 야기하는 교란(disturbance)은, 예를 들어, 웰(34)을 미리 평편하게 커버링함 (flush covering)으로써 (미도시) 감소될 수 있다.

본 명세서에 기술된 원리가 MALDI-TOF MS 측정 방법으로 반드시 제한될 필요는 없으나, 다른 질량 분석 검출 방법 또는 고유 형광(intrinsic fluorescence)을 측정하는 방법과 같은 다른 검출 또는 구별 방법으로도 본질적으로 시행될 수 있다.

예시로서 기술된 양태 외에도, 본 발명의 추가의 양태가 있음직하다. 이 개시를 숙지하고 있는 통상의 기술자는 청구항의 보호 범위에 의해 보장될 것인 살아있는 미생물 샘플 및 미생물에 대한 추가의 이로운 전처리 방법 및 질량 분석 측정 방법을 용이하게 설계할 수 있다.

Claims

후속적인 질량 분석 측정(mass spectrometric measurement)을 위한 살아있는 미생물 샘플의 제조방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인, 방법:
(a) 몇몇 샘플 스팟(sample spot)을 함유하는 평편한 샘플 지지대(sample support)를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 살아있는 미생물 샘플을 상기 샘플 스팟 중 적어도 하나 상의 영양 배지의 액적(droplet) 중에 침적시키는 단계(depositing);
(c) 상기 샘플 지지대를 정의된 분위기의 배양 챔버(incubation chamber)로 소정 시간 동안에 위치시켜 미생물의 성장을 촉진시키는 단계;
(d) 상기 소정 시간 이후에 상기 영양 배지의 액적의 잔류액을 제거하여 상기 샘플 스팟 상에 미생물의 침적물을 노출시키는 단계;
(e) 상기 샘플 스팟을 탈착 이온화(desorbing ionization)를 위해 준비하는 단계;
(f) 상기 샘플 지지대를 질량 분석계의 탈착 이온 공급원(desorption ion source)으로 옮기고, 준비된 샘플 스팟으로부터 이온을 생성하며, 적어도 하나의 대응하는 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 획득하는 단계; 및
(g) 획득된 질량 스펙트럼을 참조 데이터 세트(reference data set)와 비교하여 미생물 샘플의 적어도 하나의 특징을 결정하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 참조 데이터 세트는 이전에 획득된 질량 스펙트럼의 라이브러리로부터 얻어진 참조 스펙트럼(reference spectrum)을 가지며, 동정을 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 상기 미생물 샘플 내 미생물의 종 또는 아종을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
동일한 미생물 샘플이 상기 단계(b)에서 몇몇 샘플 스팟 상으로 동시에 적용되고, 상기 영양 배지의 액적은 때로는 항균물질, 및 항균물질과 효소 억제제의 조합물 중 하나를 함유하고 때로는 이를 함유하지 않는 것인, 방법.
제3항에 있어서,
상기 참조 데이터 세트는, 상기 단계 (b)에서 항균물질 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물이 존재하지 않는 영양 배지의 액적이 적용된 샘플 스팟의 최근에 획득된 질량 스펙트럼이고; 특징화를 위한 상기 단계 (g)로부터의 적어도 하나의 특징은 상기 미생물 샘플 내 미생물의 항균물질 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물에 대한 감수성(sensitivity)을 포함하는 것인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 동일한 항균물질의 상이한 농도를 각각 갖는 영양 배지의 몇몇 액적들이 적용되고, 특징화를 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 상기 미생물에 대한 항균물질의 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration)를 포함하는 것인, 방법.
제3항에 있어서,
상기 단계 (g)에서의 적어도 하나의 특징은 미생물 성장의 차이로부터 유래되는 것인, 방법.
제3항에 있어서,
양(quantity)이 질량 분석 측정의 검출 한계 약간 미만(slightly below)이 되도록, 상기 단계 (b)에서의 미생물 샘플이 상기 영양 배지의 액적 중에 투여되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (d)에서의 잔류액의 제거는 액적 상청액(droplet supernatant)을 흡수성 물질로 살짝 눌러 제거(dabbing off)하거나 또는 이를 피펫팅하여 제거(pipetting off)하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 상기 미생물 샘플은 (i) 상기 적어도 하나의 샘플 스팟 상의 영양 배지의 액적 중의 현탁액으로 분배되거나 또는 (ii) 상기 적어도 하나의 샘플 스팟 상에 세포 형태로 먼저 침적되고, 분배된 영양 배지의 액적으로 후속적으로 액침(immersing)되는 것인, 방법.
후속적인 질량 분석 측정을 위한 미생물의 제조방법으로서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것인, 방법:
(a) 몇몇 샘플 스팟을 함유하는 평편한 샘플 지지대를 제공하는 단계;
(b) 상기 샘플 지지대로부터 배양되고/되거나 분리되어 나오는, 온전한 미생물을, 상기 평편한 샘플 지지대의 샘플 스팟 중 적어도 하나 상의 영양 배지의 액적 중에 침적시키는 단계;
(c) 상기 평편한 샘플 지지대를 소정 휴지기(resting period) 동안 유지시켜 미생물 침적물이 상기 샘플 스팟 상에 형성되도록 두는 단계;
(d) 상기 소정 휴지기 후에 상기 영양 배지의 액적의 잔류액을 제거하여 상기 미생물의 침적물을 노출시키는 단계;
(e) 상기 샘플 스팟을 탈착 이온화를 위해 준비하는 단계;
(f) 상기 샘플 지지대를 질량 분석계의 탈착 이온 공급원으로 옮기고, 준비된 샘플 스팟으로부터 이온을 생성하며, 적어도 하나의 대응하는 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및
(g) 획득된 질량 스펙트럼을 참조 데이터 세트와 비교하여 상기 미생물 샘플의 적어도 하나의 특징을 결정하는 단계.
제10항에 있어서,
상기 참조 데이터 세트는 이전에 획득된 질량 스펙트럼의 라이브러리로부터 얻어진 참조 스펙트럼을 가지며, 동정을 위해, 상기 단계(g)로부터의 적어도 하나의 특징은 상기 미생물의 종 또는 아종을 포함하는 것인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 (b)에서 적용되기 전에, 상기 미생물은 상기 평편한 샘플 지지대로부터 떨어져 있는 적어도 하나의 용기(vessel)에서, 액체 영양 배지에서 배양되고, 상기 용기로부터 상기 샘플 스팟 상으로 옮겨지는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
동일한 미생물이 몇몇 용기에서 배양되고, 항균물질, 및 항균물질과 효소 억제제의 조합물 중 하나가 때로는 상기 액체 영양 배지에 추가되고 때로는 추가되지 않는 것인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 참조 데이터 세트는, 항균물질 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물이 존재하지 않는 액체 영양 배지로부터 유래된 미생물 침적물이 위치된 샘플 스팟의 최근에 획득된 질량 스펙트럼이고, 특징화를 위한 상기 단계 (g)로부터 적어도 하나의 특징은 미생물의 항균물질 또는 항균물질과 효소 억제제의 조합물에 대한 감수성을 포함하는 것인, 방법.
제14항에 있어서,
동일한 미생물은 각각 상이한 농도에서, 액체 영양 배지가 존재하는 상이한 용기에서 배양되고, 특징화를 위해, 상기 단계 (g)로부터의 적어도 하나의 특징은 상기 미생물에 대한 항균물질의 최소 억제 농도를 포함하는 것인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (g)에서의 적어도 하나의 특징은 미생물 성장의 차이로부터 유래되는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
양이 질량 분석 측정의 검출 한계 약간 미만이 되도록, 상기 미생물이 배양(cultivation)의 시작에서 투여되는 것인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 (c)에서의 소정 휴지기는 10분 내지 60분인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 (d)에서의 평편한 샘플 지지대로부터 잔류액의 제거는 액적 상청액을 흡수성 물질로 살짝 눌러 제거하거나 또는 이를 피펫팅하여 제거하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
상기 미생물은 (i) 상기 용기에 액체 영양 배지 중의 현탁액으로서 분배되거나 또는 (ii) 상기 용기에 세포 형태로 먼저 위치된 후에 액체 영양 배지가 추가되는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
마이크로 적정 플레이트(microtitration plate) 내 웰(well)이 상기 용기로 이용되는 것인, 방법.
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