DE102017119868B4

DE102017119868B4 - Feuchtestabilisierung bei der Präparation von Proben für die Spektrometrie

Info

Publication number: DE102017119868B4
Application number: DE102017119868.7A
Authority: DE
Inventors: Martin Schürenberg; Alice Ly; Sören-Oliver Deininger
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2021-05-27
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: CN111183346A; US20210404916A1; US11519828B2; US20230089846A1; WO2019011746A2; DE102017119868A1; CN111183346B; EP3652517A2; US11781952B2; WO2019011746A3

Abstract

Verfahren zur Vorbereitung von biologischen Proben, die Zellstrukturen und/oder ganze Zellen von Eukaryoten und/oder Prokaryoten umfassen, für deren spektrometrische Untersuchung, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbereitung in einem Gasraum stattfindet, in dem die relative Luftfeuchte durch Deliqueszenz konstant gehalten wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Stabilisierung der relativen Luftfeuchte im Umgebungsgas bei der Präparation von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Proben für spektrometrische Untersuchungen, beispielsweise Gewebeproben für Untersuchungen mit bildgebender Massenspektrometrie. Um ein Beispiel zu geben, bedarf eine Präparation mit enzymatischem Verdau der vernetzten Proteine in Gewebedünnschnitten mit chemischer Fixierung (z.B. Formaldehyd-Fixierung) einer hohen Luftfeuchte für eine Quellung des Gewebes, die zur Wirksamkeit der Enzyme benötigt wird. Dabei sollte aber so wenig Kondensation wie möglich auftreten, damit die Bildschärfe nicht über die Quellung hinaus beeinträchtigt wird.
Einführung
In der Pathologie ist es üblich, Gewebeproben mit Formaldehyd zu fixieren, um sie vor Selbstverdau zu schützen, und zum Schutz vor Bakterien in eine wasserunlösliche Masse, meist Paraffin, einzubetten. In pathologischen Instituten und Abteilungen lagern Millionen von gut charakterisierten FFPE-Gewebeproben, die in dieser Weise lagerfähig gemacht wurden (FFPE = Formalin-fixiert und in Paraffin eingebettet).
Diese Proben stellen eine unerschöpfliche Quelle für selbstlernende Kategorisierungsprozesse und andere Analysen von Gewebedünnschnitten dar, insbesondere unter Verwendung von Verfahren der bildgebenden Massenspektrometrie. Dazu ist es allerdings notwendig, die Vernetzungen der Proteine in den Gewebedünnschnitten wieder aufzubrechen und auch große Proteine zu fragmentieren, um sie überhaupt nachweisbar zu machen. Das kann beispielsweise durch enzymatischen Verdau geschehen, wobei aber laterale Transporte der Verdaumoleküle durch Diffusion in überschüssigen Flüssigkeiten im Gewebe vermieden werden sollten, um die Ortstreue der Proteine und damit die Bildschärfe zu erhalten.
Das übliche Verfahren der Präparation eines FFPE-Gewebedünnschnittes besteht in folgenden Schritten: (a) Aufbringen des Schnittes auf den Objektträger oder Probenträger; (b) Entparaffinieren; (c) „Antigen-retrieval“, im Prinzip eine Hitzebehandlung oder sonstige Energieeinwirkung, um Formalin-induzierte Quervernetzungen zum Teil aufzubrechen; (d) Aufsprühen des Enzyms (in einem Verdaupuffer, üblicherweise Ammoniumbicarbonat); (e) Inkubation in feuchter Atmosphäre; (f) Trocknen; (g) Aufsprühen der Matrix; und (h) Messung, (siehe beispielsweise EP 1 695 062 B1 ; „Analysis of chemically crosslinked tissue samples by mass spectroscopy“, C. Conklin und P. J. Parks).
Ein enzymatischer Verdau eines Gewebedünnschnittes beispielsweise durch Trypsin bedarf eines bestimmten Feuchtigkeitgehalts des Dünnschnitts, also einer bestimmten Quellung, um das aufgebrachte Enzym in den Dünnschnitt hinein diffundieren und das Enzym wirken zu lassen. Das kann durch eine hohe relative Luftfeuchtigkeit in der Umgebungsluft erreicht werden, die aber unterhalb des Taupunkts bleiben sollte, da das unkontrollierte Auskondensieren von Flüssigkeit auf dem Gewebedünnschnitt sofort zu Quertransporten von Molekülen führt und die Ortsauflösung der bildgebenden Massenspektrometrie drastisch herabsetzen kann. Das Feuchteniveau muss gegebenenfalls über Stunden erhalten bleiben, wobei je nach Temperatur, die üblicherweise zwischen 37 °C und 50 °C eingestellt wird, für optimale Ergebnisse Verdauzeiten bis zu 20 Stunden erforderlich sein können.
Ein enzymatischer Verdau von Proteinen oder anderen Molekülen eines Gewebedünnschnitts ist aber nicht nur auf Formaldehyd-fixierte Gewebeproben beschränkt. Ein Verdau von übergroßen Molekülen, die mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) oder anderen Nachweisverfahren untersucht werden sollen, kann auch für nicht fixierte Gewebedünnschnitte angebracht sein. Ebenso kann es sinnvoll sein, durch enzymatischen Verdau die Glykanreste von Proteinen abzulösen und im Anschluss daran die freigesetzten Glykanreste zu messen.
Wie in dargelegt, nimmt die massenspektrometrische Bildqualität mit steigender Luftfeuchtigkeit bei der Probenpräparation immer stärker zu, bis bei Erreichen des Taupunktes von 100% relativer Luftfeuchte ein drastischer Abfall der Bildqualität auftritt. Die Bildqualität ist komplex zusammengesetzt aus Bildkontrast, Bildschärfe und anderen Parametern, wobei der Abfall der Bildqualität hauptsächlich auf einen Verlust an Bildschärfe zurückzuführen ist. Der Abfall an Bildschärfe ist größtenteils auf den lateralen Transport von Analytmolekülen im oder auf dem Gewebedünnschnitt durch Diffusion in Flüssigkeit zurückzuführen. Um die im Gewebe enthaltenen Analytmoleküle umfassend und möglichst ortstreu zugänglich zu machen, kommt es also in diesem Beispiel sehr darauf an, mit einer relativen Luftfeuchte möglichst nahe an 100 Prozent zu arbeiten, ohne diese Grenze zu überschreiten. Dies ist bei den gegenwärtig benutzen Verfahren sehr schwer zu kontrollieren, weil bei einer Luftfeuchte von annähernd 100% kleinste Inhomogenitäten der Temperatur oder dynamische Einflüsse in der Feuchtekammer unbeherrschbar zu Kondensation führen können.
Der Bedarf an stabilen enzymatischen Verdauverfahren für die Präparation von Proben in der bildgebenden Massenspektrometrie wird auch dadurch deutlich, dass eine Firma (SunChrom GmbH, 61381 Friedrichsdorf) ein Gerät (SunDigest) auf den Markt gebracht hat, das eigens für diesen Zweck konstruiert wurde (www.sunchrom.de/suncollect/sundigest). Das Gerät misst und regelt die Luftfeuchte in einem aufwändigen Verfahren, bleibt dabei aber wegen der unvermeidlichen Regelschwingungen im Mittel unterhalb von 95 % Luftfeuchte.
Für die Inkubation von Objektträgern für die Mikroskopie oder Mikrotiterplatten unter feuchten Bedingungen lieferte die Firma Quantifoil Instruments GmbH (07749 Jena) eine Kassette namens µBOX, in der ein feuchter Schwamm oder feuchtes Papier für eine Befeuchtung sorgen kann, die wegen fehlender Temperatursteuerung allerdings ungeregelt ist.
Aber auch andere Arten von Proben für massenspektrometrische Untersuchungen können einer stabilen Luftfeuchtigkeit bedürfen. So muss beispielsweise für das gegebenenfalls mehrstündige Inkubieren von Mikroben in winzigen Tröpfchen einer Nährflüssigkeit auf dem massenspektrometrischen Probenträger durch eine hohe Luftfeuchte dafür gesorgt werden, dass die Tröpfchen nicht eintrocknen. Das Inkubieren dient insbesondere der Analyse der Wachstumsfähigkeit der Mikroben bei Anwesenheit bestimmter Antibiotika, womit deren Resistenz gegen diese Antibiotika festgestellt werden kann (siehe beispielsweise EP 3 081 652 A1 „Massenspektrometrischer Schnelltest von Resistenzen“, K. Sparbier und B. Wegemann).
Auch für die Infrarot-Spektrometrie an Proben von Geweben oder Mikroben kann es erforderlich sein, die Luftfeuchte konstant zu halten, hier jedoch bei einem festgelegen Wert im Bereich zwischen bevorzugt 10 und 30 % relativer Luftfeuchte. Nur bei einer genau eingestellten und eingehaltenen Luftfeuchte können die Spektren genau reproduziert und zuverlässig mit Referenzspektren abgeglichen werden.
Die Druckschrift US 2014/0318959 A1 betrifft elektrochemische Sonden zur Korrosionsüberwachung in Öl-Wasser-Gemischen und schwefelwasserstoffhaltigen Gassystemen, die die Bildung von elektronenleitenden Ablagerungen auf den Messelektroden bewirken und zum Kurzschluss zwischen benachbarten Elektroden führen.
Das Gebrauchsmuster CN205301034U erläuterte das chemisch-thermodynamische Prinzip unterschiedlich konfigurierter gesättigter Salzlösungen, um eine Umgebung mit konstanter Luftfeuchtigkeit herzustellen, anhand einer Kammer zur Aufbereitung von Fels- und Gesteinsproben.
Angesichts der vorstehenden Erläuterungen besteht nach wie vor Bedarf für einfache Verfahren und Geräte für die Präparation von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Proben in der Spektrometrie, insbesondere Gewebedünnschnitte und andere organische Proben, die eine stabile Luftfeuchte liefern.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Unter dem Begriff „Proben“ sollen hier ausschließlich biologische Proben verstanden werden, die Zellstrukturen und/oder ganze Zellen von Eukaryoten und/oder Prokaryoten umfassen, beispielsweise Gewebedünnschnitte oder Anhäufungen von Mikroorganismen, und sich damit von einzelnen Zellbausteinen auf molekularer Ebene (z.B. künstlich synthetisierten Nukleinsäuresträngen, wie sie als Gensonden in Hybridisierungsreaktionen eingesetzt werden) abgrenzen. Diese biologischen Proben sind dadurch charakterisiert, dass sie je nach Umweltbedingungen mehr oder weniger aufquellen oder austrocknen können. Bei der Präparation solcher Proben ist es daher in der Regel wichtig, die Feuchtigkeit in der Probenumgebung konstant und oft sogar auf einem genau reproduzierbaren Wert zu halten. Eine Zellstruktur eines Eukaryoten bezeichnet beispielsweise angeschnittene Gewebezellen, die an den Schnittflächen eines Gewebedünnschnitts liegen.
Die Erfindung macht von einer physikalisch-chemischen Erscheinung Gebrauch, die sich „Deliqueszenz“ nennt. Die Deliqueszenz äußert sich darin, dass die relative Feuchtigkeit in einem Gasraum über einer Sättigungslösung einer geeigneten Substanz bei Einhaltung einer vorgegebenen Temperatur sehr präzise konstant gehalten wird. Bei den Substanzen handelt es sich meist um Salze. So wird beispielsweise über einer Sättigungslösung von Kaliumsulfat (K₂SO₄) in Wasser bei 37 °C etwa 98,0 % Luftfeuchte eingehalten, bei 50 °C etwa 97,2 %. Aber auch Substanzen, die keine Salze sind, können Deliqueszenz zeigen. Reine Bernsteinsäure zeigt zum Beispiel Deliqueszenz bei ca. 99 % relativer Luftfeuchte. Im Weiteren werden der Einfachheit halber häufig die Begriffe „Salz“ oder „Salzlösung“ verwendet. Es versteht sich aber, dass auch solche Deliqueszenz-fähigen Substanzen gemeint sein sollen, die keine Salze sind.
In der Erfindung wird nun vorgeschlagen, Präparationen von Proben für die Spektrometrie, die eine stabile Luftfeuchtigkeit benötigen, in einem temperierten Gasraum vorzunehmen. Der Gasraum kann sich über einer gesättigten Salzlösung befinden, oder er kann mit einem feuchten Gasstrom versorgt werden, welcher durch Wechselwirkung mit einer gesättigten Salzlösung (z.B. in einer vorgeschalteten Kammer) auf eine vorbestimmte relative Feuchte gebracht worden ist. Die Präparationen können beispielsweise den enzymatischen Verdau von chemisch fixierten (z.B. formaldehyd-fixierten) Gewebedünnschnitten betreffen, die mit bildgebender Massenspektrometrie untersucht werden sollen, oder allgemein den Verdau großer Moleküle in Gewebeproben, z.B. mit dem Ziel der Abspaltung von Glykanresten (eukaryotische Proben), oder das Inkubieren von Mikroben in Nährflüssigkeitstropfen auf Probenträgerplatten (prokaryotische Proben). Soll die relative Feuchtigkeit beispielsweise über 97 % liegen, so eignet sich im gewöhnlich benutzten Temperaturbereich zwischen 37 °C und 50 °C eine gesättigte Lösung von Kaliumsulfat oder Bernsteinsäure. Da es eine ungemein große Vielfalt an Salzen gibt, kann für jede gewünschte relative Feuchtigkeit das geeignete Salz gefunden werden, gegebenenfalls unter Anpassung der Temperaturbedingungen.
Vorzugsweise findet die Präparation der biologischen Probe unter Feuchte-regulierten Bedingungen auf dem gleichen Probenträger statt, der anschließend als Substrat für eine massenspektrometrische oder infrarot-spektrometrische Messung dient und für die Massenspektrometrie beispielsweise als flache Stahlplatte oder leitfähig-beschichtete Keramikplatte/Glasplatte ausgeführt sein kann.
Des Weiteren kann unter Verwendung der Deliqueszenz ein Luftstrom mit gewünschter Temperatur und gewünschter relativer Luftfeuchte hergestellt werden, der in eine Kammer zur Präparation einer biologischen Probe eingeführt wird und dort die gewünschten Bedingungen herstellt.
Ein Gerät für die Feuchtigkeit benötigende Präparation von Proben wie Gewebedünnschnitten kann eine Kammer mit einer großflächigen Schale für die gesättigte Salzlösung in einem abgeschlossenen Gasraum enthalten, mit einer Halterung für die Probe auf einem geeigneten Substrat über der Salzlösung, und einer Temperierungseinrichtung für die Salzlösung und für alle Wände der Kammer, um jede Kondensation von Wasser und jede Tropfenbildung zu vermeiden.
Ganz allgemein betrifft die Erfindung Verfahren zur Vorbereitung biologischer Proben wie zum Beispiel Gewebeproben für spektrometrische Untersuchungen und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbereitung in einem Gasraum stattfindet, in dem die Luftfeuchte durch Deliqueszenz konstant gehalten wird.
Insbesondere kann die Vorbereitung chemische oder enzymatische Umsetzungen von Molekülen in Gewebedünnschnitten für Untersuchungen mit bildgebender Massenspektrometrie betreffen, wobei eine eingestellte Luftfeuchte einen gewünschten Quellungsgrad des Gewebes erzeugt, der für die chemischen bzw. enzymatischen Umsetzungen günstig ist und dabei die Ortstreue der Moleküle weitgehend erhält. Die Quellung des Gewebes kann durch eine dosiert aufgebrachte wasseranziehende Substanz (z.B. Glycerin) unterstützt werden. Das Gewebe kann als Gewebedünnschnitt auf einem Probenträger vorliegen, der für die Massenspektrometrie geeignet sein kann (z.B. eine Metallplatte oder eine mit einer leitfähigen Schicht belegte Keramikplatte), und chemisch (z.B. durch Formaldehyd) fixiert sein. Die bildgebende Massenspektrometrie kann mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) in einem Flugzeit-Massenspektrometer, mit desorbierender Elektrosprüh-Ionisierung (DESI) oder auch mit Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) arbeiten.
Die Vorbereitung kann ganz allgemein darin bestehen, dass große Moleküle der Probe durch enzymatischen Verdau in Fragmente zerlegt werden. Sie kann aber auch lebende Mikroben betreffen, die auf einer Probenträgerplatte in Tröpfchen einer Nährflüssigkeit inkubiert werden, siehe zum Beispiel die internationale Anmeldung WO 2018/099500 A1 .
Mit dem Verfahren kann eine hohe Luftfeuchte kurz unter dem Taupunkt erzeugt werden, beispielsweise mit einer gesättigten Lösung von Kaliumsulfat K₂SO₄ oder Bernsteinsäure C₄H₆O₄. Als hohe Luftfeuchte kurz unter dem Taupunkt soll hier insbesondere mehr als 95% verstanden werden. Niedrigere Feuchteniveaus für spezielle Anwendungen sind auch möglich, zum Beispiel unter Verwendung von Magnesiumchlorid Hexahydrat MgCl₂-6H₂O.
Eine Vorbereitung von Mikrobenproben für eine Analyse durch Infrarot-Spektrometrie, die die Bestimmung mikrobieller Subspezies oder Varietäten zum Ziel hat, benötigt ebenfalls eine genau eingestellte relative Luftfeuchte für die Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit der Infrarot-Spektren, die durch Deliqueszenz eingestellt und eingehalten werden kann.
Figurenliste

stellt die Bildqualität massenspektrometrischer Bilder von Gewebeschnitten in Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchte bei der Präparation der Gewebeschnitte durch enzymatischen Verdau dar. Die beste Bildqualität wird bei hoher relativer Luftfeuchte kurz vor dem Taupunkt (>95%) erhalten, insbesondere weil hier die notwendigen Verdauzeiten relativ kurz und damit der Radius der lateralen Materialtransporte, die die Bildschärfe verschlechtern, klein gehalten werden kann.
gibt die relativen Luftfeuchten (DRH - deliquescence relative humidity) über gesättigten Lösungen für verschiedene Salze als bevorzugten Deliqueszenz-fähigen Substanzen wieder (entnommen aus Salzwiki).
zeigt schematisch eine thermisch isolierte Kammer (16) mit Deckelheizung (14) und Bodenheizung (15), deren Boden mit kristallinem Salz (10) und einer Schicht Wasser (11) bedeckt ist, für die Präparation einer eine bestimmte Feuchte erfordernden, eukaryotischen oder prokaryotischen Probe (13) auf einem Probenträger (12). Die Probe (13) kann ein Gewebedünnschnitt und der Probenträger (12) kann tauglich für die Massenspektrometrie (z.B. MALDI-Flugzeit-Massenspektrometrie) sein.

Ausführungsformen
Die Erfindung beruht auf der „Deliqueszenz“, einer relativ wenig bekannten physikalisch-chemischen Erscheinung. Die Deliqueszenz äußert sich darin, dass in einem Gasraum über einer gesättigten Salzlösung eine relative Feuchtigkeit herrscht, die bei Einhaltung einer vorgegebenen Temperatur sehr präzise konstant gehalten wird. Steigt die relative Luftfeuchte im Gasraum, so kondensiert Wasser in die gesättigte Lösung hinein, deren Verdünnung aber durch Lösung von weiterem Salz wieder ausgeglichen wird. Fällt die relative Luftfeuchte im Gasraum, so verdunstet Wasser aus der gesättigten Lösung, wobei die so entstehende Übersättigung durch Rekristallisierung von Salz wieder abgebaut wird.
Die Deliqueszenz grenzt sich von der Hygroskopie ab. Hygroskopische Materialien reduzieren die Luftfeuchte, indem sie der Umgebungsluft Wasser entziehen, das aber durch die Materialien gebunden wird, beispielsweise als Kristallwasser oder in Poren. Dieser Vorgang ist also nicht ohne weiteres umkehrbar und damit störanfällig, wenn die Einstellung und Aufrechterhaltung konstanter Feuchtebedingungen notwendig ist.
Die Deliqueszenz spielt in der mit dem Gebiet der vorliegenden Offenbarung keinerlei Berührungspunkte aufweisenden Baustoff-Industrie eine Rolle, da sie besonders bei Frost Feuchtigkeitsschäden an Bauwerken verursachen kann. Die zeigt die relativen Deliqueszenzfeuchten (DRH) für einige Salze in Abhängigkeit von der Temperatur.
In der Erfindung wird nun vorgeschlagen, eine Probenvorbereitung, die eine konstante relative Luftfeuchtigkeit benötigt, in einem temperierten Gasraum vorzunehmen, in dem die Luftfeuchte durch Deliqueszenz auf einem konstanten Wert gehalten wird, beispielsweise in einem Gasraum über einer gesättigten Salzlösung. Da es eine ungemein große Vielfalt an Salzen und anderen geeigneten (wasserlöslichen) Substanzen gibt, kann für fast jede gewünschte relative Feuchtigkeit die geeignete Substanz gefunden werden, gegebenenfalls unter Verwendung bestimmter Temperatureinstellungen.
Wie aus hervorgeht, ist eine hohe relative Luftfeuchte kurz unter dem Taupunkt besonders wichtig für die Präparation von Gewebedünnschnitten mit enzymatischem Verdau für die bildgebende Massenspektrometrie. Im gewöhnlich für den Verdau benutzten Temperaturbereich zwischen 37 °C und 50 °C eignet sich beispielsweise eine gesättigte Lösung von Kaliumsulfat (K₂SO₄), die bei 37 °C etwa 98,0 % relative Luftfeuchte einhält, bei 50 °C etwa 97,2 % (siehe Kurve 6 in ). Die Zeitdauern für einen Verdau, die zu einem quasi-optimalen Bild führen, liegen bei einigen Stunden. Dabei sind bei höheren Temperaturen, die an sich höhere (schädliche) Diffusionsraten für lateralen Molekültransport mit sich bringen, kürzere Zeitdauern möglich. Die optimalen Temperaturen und Verdauzeiten werden vorzugsweise experimentell ermittelt.
zeigt ein grobes Schema einer thermisch isolierten Kammer (16) für die Präparierung einer eine bestimmte Feuchte erfordernden, eukaryotischen oder prokaryotischen Probe (13) auf einem Probenträger (12). Die Probe (13) kann ein Gewebedünnschnitt und der Probenträger (12) für die Massenspektrometrie (z.B. MALDI-Flugzeit-Massenspektrometrie) tauglich sein. Alle Halterungen für Probenträger und Kammer und alle Möglichkeiten zur Öffnung der Kammer sind zur besseren Klarheit weggelassen. In dieser Ausführungsform heizen zwei Heizelemente (14) und (15) den Deckel und den Boden der Kammer. Der Boden ist mit kristallinem bzw. auskristallisiertem Salz (10) und einer gesättigten wässerigen Lösung (11) des Salzes bedeckt. Dabei schadet es nicht, wenn Salz aus der Lösung herausragt. Es ist von Vorteil, wenn die Grenzflächen von Salzlösung zu Luft und von festem Salz zu Salzlösung möglichst groß sind. Die wässerige Lösung sollte nur eine verhältnismäßig dünne Schicht bilden, um den Ausgleich für Verdunstung oder Kondensation durch weitere Lösung oder Rekristallisation von Salz schnell zu ermöglichen, ohne dass lange Diffusionswege der Salzmoleküle in der Flüssigkeit zurückzulegen sind. Es ist auch möglich, die Lösung beständig (wenngleich sachte) zu agitieren, zum Beispiel umzurühren, vorzugsweise derart, dass die Bildung von Salzaerosol vermieden wird. Aus einem analogen Grund kann auch das Gas in der Kammer vorsichtig bewegt werden, beispielsweise durch einen kleinen Ventilator (nicht gezeigt).
Durch die Deliqueszenz wird der Gasraum über der gesättigten Lösung auf konstanter Feuchte gehalten, wobei es praktisch keine messbaren Regelschwingungen gibt. Um die relative Luftfeuchtigkeit bei Einführung und Entnahme des Probenträgers möglichst wenig aus dem Gleichgewicht zu bringen, ist es günstig, den auf Temperatur gebrachten Probenträger (12) durch eine entsprechend konstruierte Schleuse in die Kammer (16) einzubringen bzw. herauszuholen, wobei die Schleuse hier ebenfalls nicht eingezeichnet ist.
Wird eine Schleuse für die Einführung des Probenträgers benutzt, so wird der Probenträger mit der Probe zunächst vorzugsweise auf eine Temperatur gebracht, die etwas über der Temperatur des Gasraums liegt, um jede Kondensation von Wasser auf der Probe zu vermeiden. Das kann beispielsweise in der Schleuse geschehen. Wird keine Schleuse benutzt, sondern ein Deckel oder eine Tür der Kammer geöffnet, so wird zunächst das Feuchtegleichgewicht unvermeidlich gestört. Das gestörte Feuchtegleichgewicht kann aber genutzt werden, um den Probenträger, der auf eine massive Halterung mit der Zieltemperatur gelegt wird, auf Temperatur zu bringen bevor die Luftfeuchte wieder hergestellt ist. Es ist beispielsweise möglich, die Kammer mit einem Deckel oder einer Tür auszustatten, die sich gesteuert langsam schließen. Auf diese Weise lässt sich Kondensation ebenfalls vermeiden.
Statt der thermisch isolierten Kammer kann auch eine Kammer (16), die keine Heizungen und keine äußere Isolierung enthält, einfach in einen Brutschrank gestellt werden (angedeutet durch die äußere, schraffierte Wandung).
Bei einem enzymatischen Verdau der Proteine eines Gewebedünnschnitts kommt es darauf an, den Gewebedünnschnitt in vorgegebener Weise aufgequollen zu halten, um das Enzym in den Dünnschnitt eindringen und wirken zu lassen. Die Quellung wird durch die Luftfeuchte erzeugt, kann aber auch noch durch weitere Maßnahmen verbessert werden. So kann das dosierte Aufbringen von wasseranziehenden Substanzen, beispielsweise Glycerin, das auch in der Kosmetik als Feuchtemittel bekannt ist, den Wassergehalt des Dünnschnitts erhöhen. Das Glycerin kann zum Beispiel in hoher Verdünnung zusammen mit dem Enzym als Bestandteil des Enzympuffers aufgesprüht werden. Das Glycerin kann aber auch getrennt vom Enzym in einem schnell verdunstenden Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, in vorsichtiger Dosis auf den Dünnschnitt aufgesprüht werden.
Senkt man die Temperatur des den Gewebedünnschnitt tragenden Probenträgers unter den Taupunkt ab, so bilden sich nicht sofort Tröpfchen, sondern stattdessen ein geschlossener Feuchtigkeitsfilm auf der Oberfläche des bereits gequollenen Gewebes. Das kann man ausnutzen, um die Feuchte im Gewebe zu erhöhen: Das Verfahren senkt gelegentlich für kurze Zeit die Temperatur des Probenträgers etwas ab, kehrt aber sofort wieder zur Ausgangstemperatur zurück. Das kann beispielsweise durch ein Peltier-Element unter der Probenträgerplatte erreicht werden. Dadurch wird praktisch etwas Feuchtigkeit in das Gewebe hineingepumpt. Die optimalen Parameter werden vorzugsweise experimentell erkundet.
Aber auch andere Arten von Probenvorbereitungen für spektrometrische Untersuchungen können einer stabilen Luftfeuchtigkeit bedürfen. So muss beispielsweise für das gegebenenfalls mehrstündige Inkubieren von Mikroben in winzigen Tröpfchen einer Nährflüssigkeit auf dem (flachen) massenspektrometrischen oder infrarot-spektrometrischen Probenträger durch eine hohe Luftfeuchte dafür gesorgt werden, dass die Tröpfchen nicht eintrocknen. Andererseits soll auch unkontrollierte Kondensation von Wasser in die Tröpfchen hinein vermieden werden. Auch hier erweist sich die Deliqueszenz über einer gesättigten Lösung einer geeigneten Substanz, z.B. Kaliumsulfat, als günstig und geeignet. Das Inkubieren kann der Analyse der Wachstumsfähigkeit der Mikroben bei Anwesenheit bestimmter antimikrobieller Substanzen wie Antibiotika dienen, womit sich deren Resistenz gegen diese antimikrobiellen Substanzen feststellen lässt.
Neben diesem bevorzugten stationären Verfahren zur Stabilisierung der Luftfeuchte kann man sich auch andere Verfahren unter Verwendung der Deliqueszenz vorstellen, beispielsweise ein dynamisches Verfahren, bei dem kontinuierlich etwas Wasserdampf in den Gasraum geführt wird, wobei die überschüssige Feuchte beständig von der gesättigten Lösung aufgenommen wird.
Ein weiteres, nicht-stationäres Verfahren beinhaltet, einen Gasstrom unter Verwendung der Deliqueszenz auf eine konstante relative Gasfeuchtigkeit zu bringen und diesen Gasstrom einer Kammer zuzuführen, in der die konstante Gasfeuchtigkeit für die Präparation von biologischen Proben benötigt wird. Der Gasstrom kann beispielsweise eine Kammer mit einer gesättigten Lösung durchstreichen, wie sie oben geschildert wurde. Der Gasstrom kann aber auch langsam und kleinperlig durch eine Waschflasche mit gesättigter Lösung einer Deliqueszenz-fähigen Substanz geblasen werden, wobei ein Filter den Gasstrom bevorzugt von etwaig mitgerissenen Partikeln oder Lösungströpfchen reinigt. Eine Impaktor-Anordnung in der Gasleitung kann ebenfalls geeignet sein, das angefeuchtete Gas von etwaigen schweren Substanz-Schwebeteilchen zu trennen.
In der Patentschrift DE 10 2013 022 016 B4 , „Mikroben-Identifizierung durch Massenspektrometrie und Infrarot-Spektrometrie“, M. Kostrzewa, wird beschrieben, wie die IR-Spektrometrie für die Identifizierung von Mikroben-Unterarten oder Varietäten eingesetzt werden kann. Es hat sich inzwischen herausgestellt, dass es für die Aufnahme von Infrarot-Spektren von Proben mit Geweben oder Mikroben erforderlich ist, die Luftfeuchte konstant zu halten, hier jedoch bei einem für das Verfahren festgelegten Wert, bevorzugt im Bereich zwischen 10 und 30 % relativer Luftfeuchte. Nur bei dieser genau eingestellten Luftfeuchte können die Spektren genau reproduziert und zuverlässig mit Referenzspektren, die bei gleicher relativer Luftfeuchte aufgenommen wurden, abgeglichen werden. Ändert sich die Luftfeuchte, so ändert sich das Spektrum; kehrt man zur vorgegebenen Luftfeuchte zurück, so zeigt sich auch wieder das ursprüngliche IR-Spektrum. Hier kann man einen kleinen Luftstrom durch eine Kammer führen, in der eine großflächige, gesättigte Lösung einer geeigneten Substanz enthalten ist, siehe beispielweise Kurve 7 in (Magnesiumchlorid Hexahydrat, MgCl₂-6H₂O), und dann den Luftstrom mit eingestellter relativer Luftfeuchte zur Probe im Infrarot-Spektrometer leiten. Die Probe ist dabei in einem geeigneten Gefäß von der Außenluft abzuschließen. Diese Art der identifizierenden Analyse mikrobieller Subspezies und Varietäten ist von steigender Bedeutung.
Die hier geschilderten Anwendungs- und Ausführungsformen bilden aber nur einen Ausschnitt der möglichen Verfahren, die durch die Erfindung zur Verfügung gestellt werden. In Kenntnis dieser Offenbarung werden sich dem Fachmann ohne weiteres weitere vorteilhafte Ausführungsformen für Aufbereitungsverfahren von biologischen Proben, die Zellstrukturen und/oder ganze Zellen von Eukaryoten und/oder Prokaryoten enthalten, für eine spektrometrische Messung unter Einhaltung einer bestimmten, stabilen Luftfeuchte erschließen, die vom Schutzbereich der Patentansprüche unter Einschluss etwaiger Äquivalente umfasst sein sollen.

Claims

Verfahren zur Vorbereitung von biologischen Proben, die Zellstrukturen und/oder ganze Zellen von Eukaryoten und/oder Prokaryoten umfassen, für deren spektrometrische Untersuchung, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbereitung in einem Gasraum stattfindet, in dem die relative Luftfeuchte durch Deliqueszenz konstant gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Gasraum über einer gesättigten Lösung einer Deliqueszenz-fähigen Substanz befindet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gasraum mit einem Gasstrom versorgt wird, der durch Wechselwirkung mit einer gesättigten Lösung einer Deliqueszenz-fähigen Substanz auf eine vorbestimmte relative Feuchte gebracht worden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbereitung chemische oder enzymatische Umsetzungen von Molekülen in Gewebedünnschnitten für Untersuchungen mit bildgebender Massenspektrometrie umfasst, wobei eine eingestellte Luftfeuchte einen gewünschten Quellungsgrad des Gewebes erzeugt, der für die chemischen bzw. enzymatischen Umsetzungen günstig ist und dabei die Ortstreue der Moleküle weitgehend erhält.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Quellung des Gewebes durch eine dosiert aufgebrachte wasseranziehende Substanz unterstützt wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe chemisch fixiert ist, beispielsweise durch Formaldehyd.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass große Moleküle der Probe durch enzymatischen Verdau in Fragmente zerlegt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die bildgebende Massenspektrometrie mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption in einem Flugzeit-Massenspektrometer arbeitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbereitung der Probe lebende Mikroben betrifft, die auf einer Probenträgerplatte in Tröpfchen einer Nährflüssigkeit inkubiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine hohe Luftfeuchte kurz unter dem Taupunkt verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine gesättigte Lösung von Kaliumsulfat K₂SO₄ oder von Bernsteinsäure verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der biologischen Probe kurzzeitig unter den Taupunkt abgesenkt wird, damit sich kontrolliert ein geschlossener Feuchtigkeitsfilm auf der Oberfläche der Probe bildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorbereitung von Mikrobenproben eine Analyse durch Infrarot-Spektrometrie folgt und die Bestimmung von Subspezies oder Varietäten zum Ziel hat.
Verwendung einer Deliqueszenz-fähigen Substanz zur Einstellung und Aufrechterhaltung eines bestimmten Feuchteniveaus bei der Präparation von biologischen Proben, die Zellstrukturen und/oder ganze Zellen von Prokaryoten und/oder Eukaryoten enthalten, für eine anschließende spektrometrische Analyse.