CN105572265A - 一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，属于蛋白质组学的技术领域。采取的技术方案是，选取经胰酶水解Bevacizumab获得的特异性肽段，其中特异性是指肽段只由Bevacizumab经胰酶水解产生，其他蛋白质及蛋白质类药物经胰酶水解并不能产生该肽段；基于液相色谱-串联质谱技术，利用平行反应监测模式对特异性肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。本发明具有高通量、灵敏度高、重现性好等特点；所用试剂及药品更廉价易得，配制方法简单，利于方法推广；样品处理过程和定量方法简单易行，对其他蛋白类药物和多肽药物的定性和定量研究具有指导借鉴意义。

Description

一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法
技术领域
本发明属于蛋白质组学的技术领域，涉及一种治疗性单克隆抗体药物贝伐珠单抗(Bevacizumab)的药代动力学质谱分析方法。
背景技术
单克隆抗体药物是以γ型免疫球蛋白(ImmunoglobulinG)结构为基础的一类具有特殊治疗效果的蛋白质药物,已成功应用于癌症、自身免疫疾病、病毒感染和中枢神经紊乱等多种疾病的临床治疗。同传统的小分子药物或中药制剂相比，单克隆抗体药物有着明确的药理活性和优异的药动学性质；单克隆抗体在体内代谢程度较低，可在体液中长期保持较高浓度，血清消除半衰期平均长达数周至数月。因此，及时建立规范可靠的分析方法并开展单克隆抗体药物药代动力学研究对于支持单克隆抗体药物研发具有十分重要的意义。目前，蛋白类药物药代动力学研究多采用酶联免疫吸附方法(enzyme-linkedimmunosorbentassays，ELISA)和放射性免疫标记方法(radioimmunoassay，RIA)。其中ELISA因其较高灵敏度和适合批量测定等优点，已成为最为常用的蛋白多肽类药物生物样品分析方法。然而，在单克隆抗体药动学实验中，ELISA方法定量范围较窄(通常为一至两个数量级)，不能对不同形态的单抗(即，单克隆抗体)药物进行同时分析，且存在开发周期长(半年至数年)，成本高(数十万至百万/目标药物)，无法区分内源性蛋白的干扰等问题，大大影响了ELISA定量的可靠性和实用性。对于RIA方法而言，有些放射性标记分子的目标抗体会表现出与原型药物不同的吸收，分布和代谢特征；另外含有放射性标记的单克隆抗体通常只能稳定存在2～3周，无法适应中长期单克隆抗体药代动力学研究。因此建立规范可靠的分析方法对单克隆抗体药物研发具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有的蛋白类药物药代动力学分析方法影响定量的可靠性和实用性的缺点，建立一种单克隆抗体药物Bevacizumab的药代动力学质谱分析方法。
本发明采取的技术方案是，选取经胰酶水解Bevacizumab获得的特异性肽段，其中特异性是指肽段只由Bevacizumab经胰酶水解产生，其他蛋白质及蛋白质类药物经胰酶水解并不能产生该肽段。基于液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)技术，利用平行反应监测(PRM)模式对特异性肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。采取上述方法即可实现利用正常肽段定量Bevacizumab水平。正常肽段即是待测肽段。
本发明的具体技术方案如下所述。
一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，所述的单克隆抗体药物为贝伐珠单抗(Bevacizumab)；按如下7步骤进行血浆样品中单抗浓度的测定；
(1)血浆样品的还原：于聚乙烯管中加入2μL大鼠的血浆样品，加入96μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2μL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1小时，得到反应液；
(2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃避光孵育40min；
(3)血浆样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到血浆样品酶解液，加入5μL甲酸终止反应；
(4)内标的引入：于酶解液中加入10μL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到血浆样品的反应液；
(5)血浆反应液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完；取血浆样品的反应液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，3遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
(6)血浆样品的浓缩复溶：将血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，涡流混匀，得到血浆样品的复溶液；
(7)血浆样品的质谱分析：取血浆样品复溶液2μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将所选的特异性肽段峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线y＝0.000239987+0.0684449x，其中，x为特异性肽段峰面积与内标峰面积比值，y为以ng/μL为单位的单抗浓度，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应血浆样品中Bevacizumab浓度。
所述的标准曲线y＝0.000239987+0.0684449x，建立过程有标准系列溶液的配置和大鼠血浆标准曲线样品的制备；
所述的单抗标准系列溶液的配置，是利用去离子水将单抗标准溶液储备液(25μg/μL)分别稀释至5、10、40、100、500、1000、1200ng/μL；
所述的大鼠血浆标准曲线样品的制备，有如下7步骤，
(1)大鼠血浆标准曲线样品的还原：于聚乙烯管中分别加入2μL上述步骤中的单抗标准系列溶液；加入2μL大鼠的空白血浆，涡流混匀；加入94μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2μL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1h，得到反应液；
(2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃避光孵育40min；
(3)大鼠血浆标准曲线样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液，后加入5μL甲酸终止反应；
(4)内标的引入：于单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液中加入10μL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液；
(5)单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完；取步骤(4)得到的单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液加入到固相萃取柱中，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
(6)单抗大鼠血浆标准曲线样品的浓缩、复溶：将单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液；
(7)单抗大鼠血浆标准曲线样品的质谱分析：
取2μL单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以初始单抗标准系列溶液中单抗浓度为横坐标，所选的酶解后特异性肽段峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W＝1/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。
本发明的治疗性单克隆抗体药物的质谱分析方法，所述的含有变性剂的pH缓冲液，是含有8M尿素的50mMHEPES缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)；所述的还原剂，是1M的二硫苏糖醇溶液；所述的半胱氨酸封闭剂，是固体碘乙酰胺试剂；所述的消化缓冲液，是50mM的HEPES缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)；所述的胰酶溶液，是1mg/mL的胰酶水溶液；所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸＝100/0.1的溶液；所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸＝80/20/0.1的溶液。
在大鼠血浆标准曲线制备及血浆样品单抗浓度测定过程中，
色谱条件为：美国赛默飞世尔公司Ultimate3000系列高效液相色谱系统；色谱柱：自制peptideC18毛细管色谱柱，15cm×75μmI.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；流速300nL/min；进样量2μL；
质谱条件为：Q-ExactiveOrbitrap四级杆-轨道阱液相色谱-串联质谱仪，配有纳升级电喷雾离子化源和Xcalibur2.1数据处理软件；离子源：纳升级电喷雾离子化源；正离子方式检测；扫描方式为平行反应监测；全扫分辨率为70000，目标扫描分辨率为35000，最大注入时间为200ms。
本发明的一种治疗性单克隆抗体药物的质谱分析方法的色谱条件中，所述的梯度洗脱程序，过程见表1，
表1梯度洗脱程序
其中A是甲酸体积百分数占0.1％的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1％的乙腈溶液。
本发明的优势在于：
1、对单抗的酶解特异性肽段进行分析和定量，具有高通量、灵敏度高、重现性好等特点。2、本发明所用试剂及药品较现有技术更廉价易得，且配制方法简单，利于方法推广。3、本发明的样品处理过程和定量方法简单易行，不仅适用于本发明中所述的单抗药物Bevacizumab，对其他蛋白类药物和多肽药物的定性和定量研究也具有指导借鉴意义。
附图说明
图1是单抗酶解后特异性肽段标准品的典型色谱图。
图2是合成的稳定同位素的内标肽段的典型色谱图。
图3是实施例1得到的血浆样品中特异性肽段的典型色谱图。
图4是实施例1得到的血浆样品中内标肽段的典型色谱图。
图5是实施例1得到的大鼠血浆样品中单抗药物Bevacizumab的药时曲线。
具体实施方式
实施例1：大鼠血浆样品中单抗药物的分析
第一部分：大鼠静脉给药
A、大鼠静脉给药过程
(1)选取体重为200g±10g一只雄性大鼠，自由饮食；
(2)购买市售单克隆抗体药物Bevacizumab注射液，浓度为25mg/mL；
(3)按照临床给药剂量折算，采用静脉注射方式按50mg/kg给药量给予大鼠单克隆抗体药物；
B、大鼠血浆样品的制备
分别选择不同的时间点(0，30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，32h)，自静脉采集大鼠全血，在13000g下离心分离血清5min，-80℃冰箱保存。
第二部分：大鼠血浆样品中单抗药物Bevacizumab的含量测定
A、血浆样品预处理
(1)血浆样品的还原，
于聚乙烯管中加入2μL大鼠的血浆样品，
加入96μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀，
加入2μL还原剂，涡流混匀，
60℃孵育1小时，得到反应液；
(2)半胱氨酸的封闭，
于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；
25℃孵育40min；
(3)血浆样品的胰酶消化，
经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到血浆样品酶解液，加入5μL甲酸终止反应(图3是本实施例得到的血浆样品中特异性肽段的典型色谱图，与图1给出的单抗酶解后特异性肽段标准品的典型色谱图相同)；
(4)内标的引入
于酶解液中加入10μL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到血浆样品的反应液(图4是本实施例得到的血浆样品中内标肽段的典型色谱图，与图2合成的稳定同位素的内标肽段的典型色谱图相同)；
(5)血浆反应液的固相萃取，
于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完，
于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，
取血浆样品的反应液，至液体自然流完，
于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗，
于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
(6)血浆样品的浓缩、复溶，
将上述步骤中得到的血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，涡流混匀，得到血浆样品的复溶液。
(7)血浆样品的质谱分析，
取血浆样品复溶液2μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将所选的特异性肽段峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线(参见实施例2)，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应血浆样品中Bevacizumab浓度。
上述步骤中涉及溶液配方如下：
含有变性剂的pH缓冲液，是含有8M尿素的50mMHEPES缓冲溶液；
还原剂，是1M的二硫苏糖醇溶液；
半胱氨酸封闭剂，是固体碘乙酰胺试剂；
消化缓冲液，是50mM的HEPES缓冲溶液；
胰酶溶液，是1mg/mL的胰酶水溶液；
淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸＝100/0.1的溶液；
洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸＝80/20/0.1的溶液。
B、血浆样品中单抗药物含量测定
分别取经由A步骤处理后不同时间点复溶液2μL进行LC/MS/MS分析，记录色谱图，血浆样品酶解后特异性肽段典型色谱图如图3，血浆样品酶解后内标肽段典型色谱图如图4，将特异性肽段峰面积与内标肽段峰面积的比值代入标准曲线，求得肽段浓度，即为血浆样品中单抗药物浓度，得到的大鼠血浆样品中单抗药物Bevacizumab的药时曲线如图5。
上述步骤中涉及单克隆抗体Bevacizumab特异性肽段及内标肽段测定的条件如下：
1、色谱条件为：美国赛默飞世尔公司Ultimate3000系列高效液相色谱系统；色谱柱：自制peptideC18毛细管色谱柱，15cm×75μmI.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；流速300nL/min；进样量2μL；
所述的梯度洗脱，其程序可参见表1。
2、质谱条件为：Q-ExactiveOrbitrap四级杆-轨道阱液相色谱-串联质谱仪，配有纳升级电喷雾离子化源和Xcalibur2.1数据处理软件；离子源：纳升级电喷雾离子化源；正离子方式检测；扫描方式为平行反应监测；全扫分辨率为70000，目标扫描分辨率为35000，最大注入时间为200ms。
表3肽段平行反应监测设定值
本发明所述的一种单克隆抗体药物的质谱分析方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，可用于上述单克隆抗体药物Bevacizumab的药代动力学分析测定。
实施例2大鼠血浆标准曲线样品制备
首先配置单抗标准系列溶液：利用去离子水将单抗标准溶液储备液(25μg/μL)分别稀释至5、10、40、100、500、1000、1200ng/μL。
再制备大鼠血浆标准曲线样品：分下列7步进行，
(1)大鼠血浆标准曲线样品的还原，
于聚乙烯管中分别加入2μL单抗标准系列溶液，
加入2μL大鼠的空白血浆，涡流混匀，
加入94μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀，
加入2μL还原剂，涡流混匀，
60℃孵育1h，得到反应液；
(2)半胱氨酸的封闭，
于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；
25℃避光孵育40min；
(3)大鼠血浆标准曲线样品的胰酶消化，
经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到单抗大鼠血浆标准曲线样品的酶解液，后加入5μL甲酸终止反应；
(4)内标的引入
于酶解液中加入10μL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品的反应液；
(5)单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液的固相萃取，
于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完，
于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，
取单抗大鼠血浆标准曲线样品的反应液，至液体自然流完，
于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗，
于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
(6)单抗大鼠血浆标准曲线样品的浓缩、复溶，
将上述步骤中得到的单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品的复溶液。
(7)单抗大鼠血浆标准曲线样品的质谱分析，
取2μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以初始单抗标准系列溶液中单抗浓度为横坐标，所选的酶解后特异性肽段峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W＝1/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。液相色谱-串联质谱条件同实施例1。
表2单抗大鼠血浆的标准曲线
回归方程中，x为特异性肽段峰面积与内标峰面积比值，y为单抗浓度。

Claims (5)

1.一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，所述的单克隆抗体药物为贝伐珠单抗；按如下7步骤进行血浆样品中单抗浓度的测定；
(1)血浆样品的还原：于聚乙烯管中加入2μL大鼠的血浆样品，加入96μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2μL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1小时，得到反应液；
(2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃避光孵育40min；
(3)血浆样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到血浆样品酶解液，加入5μL甲酸终止反应；
(4)内标的引入：于酶解液中加入10μL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到血浆样品的反应液；
(5)血浆反应液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完；取血浆样品的反应液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，3遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
(6)血浆样品的浓缩复溶：将血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，涡流混匀，得到血浆样品的复溶液；
(7)血浆样品的质谱分析：取血浆样品复溶液2μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将所选的特异性肽段峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线y＝0.000239987+0.0684449x，其中，x为特异性肽段峰面积与内标峰面积比值，y为以ng/μL为单位的单抗浓度，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应血浆样品中贝伐珠单抗浓度。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的标准曲线y＝0.000239987+0.0684449x，建立过程有标准系列溶液的配置和大鼠血浆标准曲线样品的制备；
所述的单抗标准系列溶液的配置，是利用去离子水将单抗标准溶液储备液(25μg/μL)分别稀释至5、10、40、100、500、1000、1200ng/μL；
所述的大鼠血浆标准曲线样品的制备，有如下7步骤，
(1)大鼠血浆标准曲线样品的还原：于聚乙烯管中分别加入2μL上述步骤中的单抗标准系列溶液；加入2μL大鼠的空白血浆，涡流混匀；加入94μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2μL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1h，得到反应液；
(2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃孵育避光40min；
(3)大鼠血浆标准曲线样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液，后加入5μL甲酸终止反应；
(4)内标的引入：于单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液中加入10μL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液；
(5)单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完；取步骤(4)得到的单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液加入到固相萃取柱中，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
(6)单抗大鼠血浆标准曲线样品的浓缩、复溶：将单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液；
(7)单抗大鼠血浆标准曲线样品的质谱分析：
取2μL单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以初始单抗标准系列溶液中单抗浓度为横坐标，所选的酶解后特异性肽段峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W＝1/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的含有变性剂的pH缓冲液，是含有8M尿素的50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；所述的还原剂，是1M的二硫苏糖醇溶液；所述的半胱氨酸封闭剂，是固体碘乙酰胺试剂；所述的消化缓冲液，是50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；所述的胰酶溶液，是1mg/mL的胰酶水溶液；所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸＝100/0.1的溶液；所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸＝80/20/0.1的溶液。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的液相色谱-串联质谱分析，色谱条件为：美国赛默飞世尔公司Ultimate3000系列高效液相色谱系统；色谱柱：自制peptideC18毛细管色谱柱，15cm×75μmI.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；流速300nL/min；进样量2μL；质谱条件为：Q-ExactiveOrbitrap四级杆-轨道阱液相色谱-串联质谱仪，配有纳升级电喷雾离子化源和Xcalibur2.1数据处理软件；离子源：纳升级电喷雾离子化源；正离子方式检测；扫描方式为平行反应监测；全扫分辨率为70000，目标扫描分辨率为35000，最大注入时间为200ms。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的梯度洗脱，过程见表1，
表1梯度洗脱程序
其中A是甲酸体积百分数占0.1％的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1％的乙腈溶液。
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