CN114137114A - 特立帕肽同位素内标及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测技术领域，本发明涉及特立帕肽同位素内标及其制备方法与应用。采用本发明特立帕肽同位素内标物做内标，运用LC‑MS/MS法，可定量测定10.0～400pg/mL范围内人血浆中特立帕肽的浓度，对于特立帕肽的质量进行准确评价具有重要意义。

Description

特立帕肽同位素内标及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，本发明涉及特立帕肽同位素内标及其制备方法与应用。

背景技术

特立帕肽，英文名为：Teriparatide，CAS号为：99294-94-7，其氨基酸序列组成为：SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，即H-D-Ser-D- Val-D-Ser-D-Glu-Ile-D-Gln-Leu-D-Met-D-His-D-Asn-D-Leu-Gly-D-Lys-D-His-D-L eu-D-Asn-D-Ser-Met-Glu-D-Arg-Val-Glu-Trp-D-Leu-Arg-D-Lys-Lys-D-Leu-Gln-D- Asp-Val-D-His-Asn-D-Phe-OH。

具体信息可参见：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/134693519。

特立帕肽临床应用于刺激骨形成和骨吸收，可减少绝经后妇女骨折的发生率，根据给药方式的不同，还能提高或降低骨密度。

目前，现有技术多采用ELISA和MSD的方法进行特立帕肽血药浓度检测，但实际准确性不好，另外，目前尚无廉价且可精确分析特立帕肽的内标物，本发明则解决这样的技术难题。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种结构新颖的特立帕肽同位素内标及其制备方法与应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供了一种特立帕肽同位素内标物，其氨基酸序列组成为： SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，氨基酸组成中3个以上的亮氨酸上的氢进行同位素取代。

作为本发明的一种优选技术方案，从Ser作为第一个氨基酸计，分别于第7， 11，15位的亮氨酸上的氢进行同位素取代，优选进行氘取代。

作为本发明的一种优选技术方案，第7，11，15位的亮氨酸的13个氢部分被氘所取代。

优选作为本发明的一种优选技术方案，第7，11，15位的亮氨酸的13个氢，除-NH₂和-COOH外的10个氢均被氘代。

作为本发明的一种优选技术方案，其氨基酸序列组成为： SVSEIQL(D10)MHNL(D10)GKHL(D10)NSMERVEWLRKKLQDVHNF。

作为本发明的一种优选技术方案，所述特立帕肽同位素内标物的结构式如下：

本发明进一步提供了所述内标物的制备方法，包括，采用氘代亮氨酸和其他 PTH组成的氨基酸采用液相或者固相合成方法制备得到。

本发明进一步提供了特立帕肽的LC-MS/MS分析方法，包括，采用所述特立帕肽同位素内标物作为内标。

优选作为本发明的一种优选技术方案，优选的分析条件包括：

色谱条件：

质谱条件：

离子对和参数：

如PTH等多肽类化合物方法开发难度系数大，非特异性吸附、残留、仪器响应低等是方法的关注点。

本发明初步筛选比较不同类型填料的SPE板，数据显示μElution HLB plate 和μElution MCX plate效果较优。

通过优化不同的上样条件、清洗溶剂和洗脱溶剂，以回收率和基质效应为指标，获得了最佳灵敏度，定量下限为10.0pg/mL。

为减少分析物在样品处理过程中的残留，选用低吸附的聚丙烯材料可以最大程度减少吸附；通过比较不同型号的色谱柱和不同溶剂比例的洗针液，将色谱柱和系统残留减少在可接受范围内；系列预验证数据显示，优化的方法可满足法规生物样品分析的要求。

目前，该方法以回收率、基质效应、基线干扰为指标已验证完毕，并成功应用于临床生物样本的定量分析检测。

本发明相对于现有技术的有益效果包括：

通过的实验研究发现，采用此特立帕肽同位素内标具有良好的准确度和精密度，并有良好的检测稳定性，然而，当氘代亮氨酸少于3个达不到所需的检测要求，多于3个未有表现更好的检测效果，但内标物的制备将大幅增加成本。

采用此特立帕肽同位素内标运用LC-MS/MS法，可定量测定10.0～400 pg/mL范围内人血浆中特立帕肽的浓度，对于特立帕肽的质量进行准确评价具有重要意义。

附图说明

图1，特立帕肽化学结构式，其中，7、11和15对应的氨基酸为亮氨酸；

图2，本发明特立帕肽内标物化学结构式，其中D为氘；

图3，氘代亮氨酸(Leu(D10))化学结构式；

图4，特立帕肽T1二级离子质谱图；

图5，特立帕肽T2二级离子质谱图。

图6，样品的HPLC谱图，其中6(a)为特立帕肽的HPLC谱图和6(b) 为特立帕肽内标物HPLC谱图，特立帕肽样品RT:2.93min，特立帕肽内标物质 RT:2.91min。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进一步解释说明，但本发明不局限于此。

实施例1PTH内标物的制备

合成方法为下述步骤：

1、N端第1个氨基酸Fmoc-Ser-Wang树脂的脱保护

(a)称取Fmoc-Ser-Wang树脂置于硅烷化的玻璃反应器中，每10mg树脂加5ml左右DMF，使树脂完全浸入其中，溶胀30-60min。

(b)抽滤掉DMF，在树脂中加入约5ml浓度为20％哌啶/DMF溶液，轻微震荡下反应10min，抽滤掉反应液后，再加入约5ml浓度为20％哌啶/DMF 溶液，轻微震荡下反应10min，抽滤掉反应液。

(c)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，取出0.1mg树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，100-110℃下反应4-6min，溶液和树脂呈深蓝色，说明脱除Fmoc完全。

反应式：

称取原料：Fmoc-Glu(But)-OH：是树脂负载量的2-5倍。

DIC：是树脂负载量的2-5倍。

HOBt：是树脂负载量的2-5倍。

(a)将称取的Fmoc-Glu((But)-OH和HOBt溶于5ml DMF中，加入到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应1-2h。

(b)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，取出0.1mg树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，100-110℃下反应4-6min，溶液和树脂均呈浅黄色，说明偶联反应完全。

3、N端第3-34个氨基酸的偶联

按照以下氨基酸序列：

D-Ser-D-Glu-Ile-D-Gln-Leu(D10)-D-Met-D-His-D-Asn-D-Leu(D10)-Gly-D-Lys-D-His-D-Leu(D10)-D-Asn-D-Ser-Met-Glu-D-Arg-Val-Glu-Trp-D-Leu-Arg-D-Lys-L ys-D-Leu-Gln-D-Asp-Val-D-His-Asn-D-Phe-OH

重复上述1、2步骤，完成了全部34个氨基酸的偶联反应。

3-34个氨基酸的称取量均为树脂负载量的2-5倍。

其中，Leu(D10)为如图3所示的氘代亮氨酸。

4、最终产物34肽Fmoc保护的脱除

(a)将上述34肽产物用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，向反应管中加入5ml浓度为20％哌啶/DMF溶液，室温下轻轻振荡反应10min，抽去反应液，再加入5ml浓度为20％哌啶/DMF溶液反应10-20min。

(b)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂后，取0.1mg树脂进行茚三酮检测，溶液和树脂呈深蓝色，说明脱除Fmoc完全。

5、脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解

(a)将上述产物用DMF×2、MeOH×2、DCM×4洗涤后，在真空下抽空干燥30-60min。

(b)选择95％TFA:2.5％H₂O:2.5％Anisol(v:v:v)作为裂解剂。

(c)取出50mg干燥好的树脂，配制50ml裂解液，加入到反应管中，在室温下反应2-4个小时后，将反应液滤到100ml的离心管中，分别用少量TFA洗涤两次树脂，与滤液合并。

(d)滴加50ml预先冰浴的乙醚，这时有白色沉淀物析出，充分振荡，使裂解产生的副产物溶解在乙醚中，在冰浴中放置15-30min，然后离心，倾掉上层乙醚，再加入5-50ml冰浴的乙醚，使沉淀物充分悬浮，离心，反复5次。

(e)真空干燥除掉乙醚，得粗品。

将粗品进行质谱分析，主峰的分子量与理论分子量一致，为目的产物。

实施例2(PTH内标物)的D10同位素标记定位分析(LC-MS)

1)实验材料：

采用实施例1制备得的内标物产品

质量比为10％NH₄HCO₃

Trypsin酶溶液厂家：Promega

配制过程：取2支，按40μl/瓶加入Resuspension Buffer溶解混匀，得0.5mg/ml 的酶溶液。

甲酸厂家：Sigma

流动相A：体积比0.1％甲酸水溶液

流动相B：体积比0.1％甲酸乙腈溶液

仪器：制冷加热金属浴

仪器：电子天平

仪器：超高效液相色谱仪(Agilent 1260)

仪器：质谱仪(AB SCIEX TripleTOF 5600+)

色谱柱：Symmetry 300^TM C18(Waters，3.9×150mm)

2)操作步骤：

2.1.样品制备

称取0.0016g实施例1制备得到粉末，用800μl超纯水溶解混匀，即为2mg/ml 样品溶液。

取上述样品溶液100μl(即200μg)，分别加入10％NH₄HCO₃ 20μl，Trypsin 酶溶液10μl，超纯水70μl，即至总体积200μl，混匀。于37℃酶切4h；加入1μl 甲酸终止反应，待上机进样分析。

2.2.色谱条件：

进样体积：80μl，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：214nm，梯度洗脱如下：

2.3.质谱条件：

3)结果

对该样品的肽段TOF MS、MS/MS信息进行确认，确认结果如下：

*质荷比理论值为未标记状态下质荷比，检测值为同位素标记物实际检测质荷比，鉴定得该同位素标记样品的亮氨酸(L)较未标记亮氨酸的分子量高约10Da。

即该PTH内标物的同位素标记位点为N端的3个亮氨酸(L@7，L@11， L@15)。

其中，T1二级离子如下表所示，T1二级离子质谱图如图4所示：

Residue	b#	b+(Theo)	b+(Obs)	y+(Theo)	y+(Obs)	y#
							S	1	88.0393	-	1455.7624	-	13
V	2	187.1077	-	1368.7304	-	12
							S	3	274.1397	-	1269.6620	-	11
E	4	403.1823	-	1182.6300	-	10
							I	5	516.2664	516.2656	1053.5874	1073.7144	9
Q	6	644.3250	644.3224	940.5033	960.6307	8
							L	7	757.4090	767.4690	812.4447	832.5705	7
M	8	888.4495	898.5083	699.3607	709.4243	6
							H	9	1025.5084	1035.5780	568.3202	578.3827	5
N	10	1139.5514	1149.6184	431.2613	441.3241	4
							L	11	1252.6354	1272.7653	317.2183	327.2815	3
G	12	1309.6569	1329.7879	204.1343	204.1348	2
							K	13	-	-	147.1128	147.1127	1

备注：(Theo)表示非氘代标记肽段理论二级离子，(Obs)表示氘代标记样品检测二级离子

T2二级离子如下表所示，T2二级离子质谱图如图5所示：

Residue	b#	b+(Theo)	b+(Obs)	y+(Theo)	y+(Obs)	y#
							H	1	138.0662	138.0649	886.4200	-	7
L	2	251.1503	261.2121	749.3611	759.4184	6
							N	3	365.1932	375.2535	636.2770	636.2727	5
S	4	452.2252	-	522.2341	522.2317	4
							M	5	583.2657	593.3255	435.2020	-	3
E	6	712.3083	722.3672	304.1615	-	2
							R	7	-	-	175.1190	-	1

备注：(Theo)表示非氘代标记肽段理论二级离子，(Obs)表示氘代标记样品检测二级离子

从而可以确定的是，其氨基酸序列组成为：

SVSEIQL(D10)MHNL(D10)GKHL(D10)NSMERVEWLRKKLQDVHNF，其结构式如下，并如图2所示：

实施例3

LC-MS/MS法定量测定人血浆中特立帕肽浓度的定量分析方法，检测范围为 10.0～400pg/mL。

1)仪器

2)试液的准备

1)流动相A：0.1％甲酸水溶液

配制方法举例：取1000mL的超纯水于1000mL试剂瓶中，加1.0mL甲酸，混合均匀。保存于室温条件下。

2)流动相B：0.1％甲酸的乙腈溶液

配制方法举例：取1000mL乙腈于1000mL试剂瓶中，加1.0mL甲酸，混合均匀。保存于室温条件下。

3)按照实施例2步骤2.1样品制备，配置以下浓度的特立帕肽内标物和特立帕肽对照品(来源Toronto Research Chemicals(TRC)，批号1-TGG-188-1)：

4)测定样品：含K₂EDTA的特立帕肽人血浆样品，采用SPE法从血浆样品中提取分析物特立帕肽。

3)色谱条件

4)质谱条件

离子对和参数：

5)实验结果

其中，将特立帕肽内标物和特立帕肽对照品，采用前述色谱条件进行检测，谱图如图6所示，其中6(a)为特立帕肽的HPLC谱图和6(b)为特立帕肽内标物HPLC谱图，结果如下：

在前述验证结果下，将含有特立帕肽的血浆样品分别于不同时间进行检测，结果如下：

从上述实验结果可见，本发明实现了LC-MS/MS法定量测定人血浆中特立帕肽浓度的定量分析方法，并且，所述方法具有良好的准确度和精密度、稳定性，可以应用于血浆中特立帕肽检测范围为10.0～400pg/mL的检测。

采用前述检测方法发现，特立帕肽在人血浆中在-10～-30℃条件下放置48天保持稳定；在-60～-90℃条件下放置48天保持稳定。

实施例4(PTH内标物)的同位素标记筛选

1、PTH内标物的同位素标记位点为N端的3个亮氨酸(L@7，L@11，L@15)

1)使用6个不同来源的人个体空白血浆，外加1个溶血血浆和1个高脂血浆，配制成双空白样品(n＝1)。

2).分析物对内标的干扰

使用配制标准曲线样品相同批号的人空白混合血浆，配制ULOQ浓度的样品(n≥1)，除内标工作液由不含内标的相应溶液代替外，提取过程与正常方法一致。

接受标准：在该样品中，内标保留时间处，干扰峰的平均峰面积不大于所有符合接受标准的标准曲线样品和质控样品内标峰面积平均值的5.0％。

3)内标对分析物的干扰

内标对分析物的干扰通过零浓度样品考察，向6批来自不同个体的空白基质，1个溶血基质和1个高脂基质，加入内标提取处理成零浓度样品(Zero Blank，每个批号的个体空白基质n＝1)。

接受标准：在该样品中，分析物保留时间处，干扰峰的峰面积不大于该分析批中符合接受标准的LLOQ标准曲线样品中分析物峰面积平均值的20.0％。

2、PTH内标物的同位素标记位点为N端的2个亮氨酸(L@7，L@11)

1).分析物对内标的干扰

2)内标对分析物的干扰

3、PTH内标物的同位素标记位点为N端的4个亮氨酸(L@7，L@11，L@15， L@24)

1).分析物对内标的干扰

2)内标对分析物的干扰

从上述实验结果可见，当选择2个亮氨酸进行氘代时，分析物与内标之间会产生相互干扰，从而无法保证检测方法的准确性。当选择3个以上亮氨酸进行氘代时，分析物与内标之间的干扰为零。当选择4个亮氨酸进行氘代时与3个亮氨酸进行氘代的检测效果相当，但内标物的制备将大幅增加成本。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特立帕肽同位素内标物，其特征在于，其氨基酸序列组成为：SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，氨基酸组成中3个以上的亮氨酸上的氢进行同位素取代。

2.根据权利要求1所述一种特立帕肽同位素内标物，其特征在于，从Ser作为第一个氨基酸计，分别于第7，11，15位的亮氨酸上的氢进行同位素取代，优选进行氘取代。

3.根据权利要求1所述一种特立帕肽同位素内标物，其特征在于，第7，11，15位的亮氨酸的13个氢部分被氘所取代。

4.根据权利要求1所述一种特立帕肽同位素内标物，其特征在于，第7，11，15位的亮氨酸的13个氢，除-NH₂和-COOH外的10个氢均被氘代。

5.根据权利要求1所述一种特立帕肽同位素内标物，其特征在于，其氨基酸序列组成为：

SVSEIQL(D10)MHNL(D10)GKHL(D10)NSMERVEWLRKKLQDVHNF。

6.根据权利要求1所述一种特立帕肽同位素内标物，其特征在于，所述特立帕肽同位素内标物的结构式如下：

。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种特立帕肽同位素内标物的制备方法，其特征在于，包括，采用氘代亮氨酸和其他PTH组成的氨基酸采用液相或者固相合成方法制备得到。

8.一种特立帕肽的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括，采用权利要求1-6任一项所述的特立帕肽同位素内标物作为内标。

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