CN113495106B - 样品检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及样品检测方法，具体涉及一种检测含BoNT或疑似含BoNT的样品的方法，其包括以下步骤：(1)将所述样品在BoNT酶切体系中孵育，而后进行处理，得酶切产物样品；(2)将步骤(1)所得酶切产物样品进行质谱分析，提取BoNT酶切产物肽的特征离子对；(3)根据步骤(2)的提取结果获取下述至少一种信息：1)所述样品是否含BoNT；2)所含BoNT的血清型；以及，3)所含BoNT血清型的量。本发明的方法可实现对复杂临床样本中A、B和E型肉毒毒素的同步捕获、血清型分型、活性鉴定和/或准确定量。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和临床中毒检测领域，涉及一种样品检测方法，具体涉及基于内切酶质谱定量技术(Endopep-MS)对肉毒毒素血清型进行鉴定的方法。本发明的方法可实现对复杂临床样本中A、B和E型肉毒毒素的同步捕获、血清型分型、活性鉴定和/或准确定量。
背景技术
肉毒毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是肉毒梭状芽胞杆菌在生长繁殖过程中产生的一种神经毒素，通过抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡释放，阻断神经肌肉接头处的冲动传导，引起肌肉麻痹而致病。BoNT是已知对人类毒性最强的天然蛋白质毒素，能够引起人和动物中毒，对人的半数致死量(LD50)为0.1-1ng/kg。
BoNT从肉毒杆菌中以复合物的形式释放，复合物中包含有毒素和保护毒素免受水解蛋白和胃肠道酸性环境降解的非毒性蛋白。BoNT分子量约150kDa，由四个结构域组成三维空间结构。肉毒毒素在内源或外源性蛋白水解酶的作用下被切割为重链(HC，～100kDa)和轻链(LC，～50kDa)而发挥其毒性。至今已发现有8种血清型BoNT：A-G型和FA型。引起人类中毒的主要是A、B和E型，偶尔由F型引起。BoNT/A是最早被确定晶体结构的血清型全毒素，C型和D型主要引起禽畜和动物中毒，FA型是2016年新发现的血清型。BoNT通过酶切可溶性亚酰胺敏感因子吸附蛋白受体(SNAREs)，阻止转运小泡中的乙酰胆碱递质释放，导致肌肉麻痹。SNARE蛋白家族是神经递质释放所必需的蛋白，其能够催化膜融合，该家族主要包括位于转运小泡膜上的VAMP、位于突触前膜上的SNAP-25和syntaxin，以及一些胞质蛋白。各血清型BoNT的底物及肽键切割位点各不相同：A/E型主要作用于SNAP-25；B/D/F/G型主要作用于VAMP；C型毒素有两种底物，分别是syntaxin和SNAP-25。
食源性肉毒中毒、婴儿肉毒中毒和创伤性肉毒中毒是三种最常见的肉毒中毒形式。食源性肉毒中毒通常由A、B和E型肉毒毒素引起，因不当的食品加工包装引发的食源性肉毒中毒最常见。近来，吸毒者创伤性肉毒中毒亦处于上升趋势。另一方面，近年来BoNT被逐步应用于临床领域，例如美容整形和神经肌肉失调疾病的治疗等。因注射不合格的肉毒美容产品而中毒的事件时有发生。因此，建立针对BoNT的灵敏且特异的血清型分型与活性鉴定方法，尤其是针对复杂基质样品同时分析鉴定BoNT不同血清型显得尤为重要，其具有重要的医学和军事意义。
发明内容
质谱技术由于其强大的定性定量分析能力，已经被越来越多的应用到毒素检测领域。肽链内切酶质谱法(Endopeptidase-mass spectrometry assay)作为一种快速灵敏的检测方法，不仅能测定毒素的活性，还可以确定BoNT的血清型，被越来越广泛的应用于BoNT检测中。该方法基于毒素的蛋白水解酶活性，不同血清型BoNT酶切位点不同，例如BoNT/A在SNAP-25蛋白的Q197和R198两个氨基酸之间特异性酶切，BoNT/B在VAMP蛋白的Q76和F77两个氨基酸之间特异性酶切，BoNT/E在SNAP-25蛋白的R180和I181两个氨基酸之间特异性酶切。不同血清型毒素的酶切产物经液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)或基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测，能实现不同血清型BoNT的分型及活性鉴定，克服了传统体外检测方法中不同血清型易呈现交叉反应的缺点。
针对前述现有技术的不足以及满足实际需求，本发明提供一种基于BoNT蛋白水解酶活性的内切酶质谱检测法，设计各血清型BoNT特异性底物肽，针对不同血清型BoNT酶切其特异性底物肽后的产物肽段，采用LC-MS/MS(MRM)进行检测，以实现对BoNT的准确分型及精确定量，并应用于实际临床样本检测。
因此，在一个方面，本发明涉及一种检测含BoNT或疑似含BoNT的样品的方法，其包括以下步骤：
(1)将所述样品在BoNT酶切体系中孵育，而后进行处理，得酶切产物样品；
(2)将步骤(1)所得酶切产物样品进行质谱分析，提取BoNT酶切产物肽的特征离子对；
(3)根据步骤(2)的提取结果获取下述至少一种信息：1)所述样品是否含BoNT；2)所含BoNT的血清型；以及，3)所含BoNT血清型的量。
在一些实施方案中，所述含BoNT或疑似含BoNT的样品选自人或动物的体液(例如，尿液或血液)、呕吐物或排泄物、食品、化妆品、药品和环境样品(例如，水或土壤)。在一些实施方案中，所述样品为人或动物的血清。
在一些实施方案中，步骤(1)中所述BoNT酶切体系包含下述成分：BoNT的底物肽、ZnCl2，Hepes，DTT，BSA和内标肽。在一些实施方案中，所述BoNT酶切体系包含下述成分：30～80μM ZnCl2，30～60mM Hepes(pH 7.4)，15～30mM DTT，0.5～2mg/mL BSA,0.02～0.07mMBoNT的底物肽和50～120ppb P9。在一些实施方案中，所述BoNT酶切体系包含下述成分：50μM ZnCl2，50mM Hepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，0.05mM BoNT的底物肽和100ppbP9。
在一些实施方案中，所述BoNT底物肽选自AP、BP和EP中任意1、2或3种，其中，AP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，BP的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，EP的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，P9的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
在一些实施方案中，在步骤(1)中，在30～40℃(优选35～38℃，更优选37℃)孵育所述样品。在一些实施方案中，在摇床上以100～500rpm(优选150-300rpm，更优选180～280rpm)孵育所述样品。在一些实施方案中，将所述样品孵育0.5～10小时(优选2～8小时，更优选3～5小时)。在一些实施方案中，孵育结束后加入甲酸溶液(例如10％甲酸溶液)终止反应。在一些实施方案中，终止反应后离心(例如10000～20000rpm离心1～10min)取上清液即得所述酶切产物样品。
在一些实施方案中，步骤(2)中所述质谱为LC-MS/MS(MRM模式)，其中，质谱参数选自下述的一种或多种：
1)离子源为ESI源(电喷雾离子源)；
2)扫描模式为正离子模式；
3)喷雾电压为4.5～5.5KV；
4)离子源温度为450～550℃；
5)DP值(去簇电压)为100V；
6)碰撞电压(CE值)为10～50V；和
7)质量扫描范围为100～1000；
液相色谱参数选自下述的一种或多种：
1)色谱柱为BioBasicTM C18色谱柱(5μm)；
2)柱温20～50℃；
3)上样量为2～10μL；
4)流速为0.05～0.3mL/min；和
5)流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相为B乙腈溶液；洗脱梯度为：0-1min，99％流动相A；1-7min，99％-75％流动相A；7-9min，75％-5％流动相A；9-12min，5％流动相A；12-12.1min，5％-99％流动相A。
在一些实施方案中，步骤(2)中所述BoNT酶切产物肽选自AP-N(氨基酸序列如SEQID No.2所示)、AP-C(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)、BP-N(氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)、BP-C(氨基酸序列如SEQ ID No.6所示)、EP-N(氨基酸序列如SEQ ID No.8所示)和EP-C(氨基酸序列如SEQ ID No.9所示)。
在一些实施方案中，AP-N的特征离子对为714.1→585.4m/z和/或714.1→261.2m/z，其中，各离子对中的母离子均带双电荷。
在一些实施方案中，AP-C的特征离子对为499.8→491.3m/z和/或333.5→288.2m/z，其中，母离子499.8带双电荷，母离子333.5带三电荷。
在一些实施方案中，BP-N的特征离子对为880.5→234.4m/z和/或880.5→433.5m/z，其中，各离子对中的母离子均带双电荷。
在一些实施方案中，BP-C的特征离子对为320.6→372.2m/z和/或426.8→501.9m/z，其中，母离子320.6带四电荷，母离子426.8带三电荷。
在一些实施方案中，EP-N的特征离子对为558.3→780.2m/z和/或558.3→573.5m/z，其中，各离子对中的母离子均带三电荷。
在一些实施方案中，EP-C的特征离子对为344.8→575.3m/z和/或344.8→227.2m/z，其中，各离子对中的母离子均带双电荷。
在一些实施方案中，设置空白和/或阳性对照组，并采用与处理所述样品相同的条件处理所述对照组。
在一些实施方案中，当经所述质谱分析后确定任意产物肽的信噪比超过空白对照组信噪比的三倍，则判断所述样品中含相应BoNT血清型，具体对应关系如下：
产物肽AP-N和AP-C对应BoNT/A；
产物肽BP-N和BP-C对应BoNT/B；
产物肽EP-N和EP-C对应BoNT/E。
在一些实施方案中，在步骤(1)前，还包括用表面偶联有特异性结合BoNT的抗体或其抗原结合片段的免疫磁珠对所述样品中BoNT富集的操作。
在一些实施方案中，所述富集包括以下步骤：将所述样品加入所述免疫磁珠中，30-48℃(优选35～38℃，更优选37℃)孵育1～5小时(优选1～3小时)，用PBST洗涤，备用。
在一些实施方案中，所述富集包括以下步骤：取1mL含BoNT/A的复杂基质样本加入60μL上述偶联抗体的免疫磁珠中，于37℃旋转孵育2.5h，富集结束，磁珠采用500μL PBST(含0.05％Tween 20的1×PBS)洗涤，备用。
在一些实施方案中，所述免疫磁珠表面偶联有蛋白G。在一些实施方案中，所述免疫磁珠为Dynabeads Protein G。
在一些实施方案中，所述特异性结合BoNT的抗体或其抗原结合片段为分别或同时特异性结合BoNT不同血清型(例如，BoNT/A、B或E)的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述特异性结合BoNT的抗体或其抗原结合片段为市售可得的商品，例如，Anti-BoNT/A(KBA211)鼠单抗，Anti-BoNT/A(KBA468)鼠单抗，BoNT/A多克隆抗体(重链结合域)，宿主Chicken/IgY，货号：AHCA，Thermo Fisher Scientific；BoNT/B多克隆抗体，宿主Chicken/IgY，货号：AHCB，Thermo Fisher Scientific；BoNT/E多克隆抗体(轻链)，宿主ChickenIgY，货号：ACBNELC，Thermo Fisher Scientific。在一些实施方案中，也可根据常规的杂交瘤技术获得，例如通过重组表达的BoNT/A、B或E毒素蛋白免疫Balb/c小鼠，经杂交瘤融合制备筛选获得单克隆抗体，并对其特异性结合能力经体外结合实验进行验证，从而得到对相应血清型具有特异性结合能力的抗体。
在另一个方面，本发明涉及前述第一方面任一项的方法在定性或定量检测样品中BoNT血清型中的用途。
在一些实施方案中，所述样品选自人或动物的体液(例如，尿液或血液)、呕吐物或排泄物、食品、化妆品、药品和环境样品(例如，水或土壤)。
发明的有益效果
本发明基于内切酶质谱检测技术，提供一种检测含BoNT或疑似含BoNT的样品的方法，所述方法至少能实现下述一种技术效果：
(1)本发明的方法能够实现对复杂基质样品(例如临床样品)中各BoNT血清型(尤其是BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E)的同步分析鉴定；
(2)本发明的方法具有较高的灵敏度，在一些实施方案中，应用本发明的方法对PBS缓冲液中BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E的检测限分别为0.6U/mL、1.8U/mL和2.5U/mL；在一些实施方案中，应用本发明的方法对人血清样品中BoNT/A的检测限为0.5U/mL。
附图说明
图1-1(1)显示P1-P4相应的酶切产物肽与内标峰面积比值随BoNT/A浓度变化曲线。
图1-1(2)显示P1-P4在水溶液与孵育体系中(37℃，4h)非特异断裂产物肽与内标峰面积比值。
图1-1(3)依次显示P2、P4、P5为底物时BoNT/A酶切产物质谱相应标准曲线。
图1-2(1)显示BoNT/A酶切产物肽AP-N和底物肽AP的色谱峰面积比值随酶切缓冲体系中ZnCl2浓度变化曲线。
图1-2(2)显示BoNT/A酶切产物肽AP-N和底物肽AP色谱峰面积比值随酶切缓冲体系中BSA浓度变化曲线。
图2显示BoNT/A、B和E的酶切产物肽的提取离子色谱图；其中图2a为BoNT/A酶切产物肽提取离子色谱图；图2b为BoNT/B酶切产物肽提取离子色谱图；图2c为BoNT/E酶切产物肽提取离子色谱图；图2d为BoNT/A、B和E酶切产物肽提取离子色谱叠加图。
图3显示缓冲体系中BoNT/A/B/E检测限酶切产物肽色谱图；其中图3a-3b为0.6U/mL BoNT/A酶切氨基端和羧基端产物肽提取离子色谱图；图3c-3d为1.8U/mL BoNT/B酶切氨基端和羧基端产物肽提取离子色谱图；图3e-3f为2.5U/mL BoNT/E酶切氨基端和羧基端产物肽提取离子色谱图。
图4显示PBS缓冲体系中BoNT/A酶切产物肽的质谱响应峰面积值。
图5显示PBS缓冲体系中BoNT/A酶切产物肽的质谱响应标准曲线。
图6显示血清中BoNT/A酶切产物肽的质谱响应峰面积值。
图7显示血清中BoNT/A/B/E酶切产物肽的提取离子色谱图，其中图7a为空白血清中酶切产物肽提取离子色谱图；图7b为中毒病人血清中酶切产物肽提取离子色谱图。
图8显示血清中BoNT/A酶切后氨基端产物肽质谱响应标准曲线。
图9显示血清中BoNT/A酶切后羧基端产物肽质谱响应标准曲线。
图10显示肉毒美容针剂及阴性和阳性对照样品的BoNT/A酶切产物提取离子色谱图。
图11显示中毒病人血清中BoNT/A/B/E酶切产物肽的提取离子色谱图；其中图11a为空白血清中酶切产物肽提取离子色谱图；图11b为中毒病人血清中酶切产物肽提取离子色谱图。
图12显示尿液中BoNT/A/B/E酶切产物肽的提取离子色谱图；其中图12a为空白尿液中酶切产物肽提取离子色谱图；图12b为中毒病人尿液中酶切产物肽提取离子色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
表1序列信息简表
a X代表norleucine(正亮氨酸)。
上述各多肽序列为生工生物工程(上海)有限公司合成，也可通过常规多肽合成技术合成。
实施例1：优化实验
(一)BoNT/A酶切底物肽优化
1.选取候选底物肽
选取五条BoNT/A的底物肽P1-P5，序列信息如表1中所示。
2.候选底物肽酶解效率考察
对于各候选底物肽，平行配制6组酶切体系，每组总体积为80μL，含50μM ZnCl2，50mM Hepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，100μg/L P9以及0.05mM底物肽。P9为内标肽段，具体序列信息见表1。
取BoNT/A分别加入上述各组酶切体系中，对P1-P4底物肽的酶切效率进行考察(P5为后来入选的产物肽，未检测其酶切效率)，其中各候选底物肽每组加入BoNT/A浓度分别为0、0.01、0.02、0.1、0.5和1ppm。另设空白对照组，用相应体积的PBS代替毒素加入体系。混匀后于37℃摇床，280rpm孵育5h。孵育结束后分别加入5μL10％甲酸，于14000rpm转速下离心5分钟，取上清液进样。
将P1-P4的产物肽P1-1，P1-2……P4-1，P4-2(P1-1为底物肽P1被BoNT/A酶切后形成的-NH2端产物肽，P1-2为-COOH端产物肽，P2-P4的产物肽命名以此类推，各产物肽具体序列信息见表1)分别溶于50％乙腈水溶液中，配制成浓度1μg/mL的产物肽溶液，采用三重四级杆-线性离子阱串联质谱仪5500结合超高效液相色谱仪ACQUITY UPLC建立LC-MS/MS(MRM)方法，提取各产物肽特异的MRM离子对并进行保留时间匹配。所述三重四级杆串联离子阱质谱系统的离子源为电喷雾离子源(ESI源)，扫描模式为正离子，喷雾电压为5.5KV，离子源温度为500℃。所述液相色谱的色谱柱为BioBasicTM C18色谱柱(5μm,ThermoScientificTM，美国)，柱温40℃，上样量为10μL，流速为0.25mL/min。所述液相色谱的A流动相为0.1％甲酸水溶液，B流动相为乙腈溶液。所述液相色谱的分析梯度为：0-1min，99％A流动相；1-7min，99％-75％A流动相；7-9min，75％-5％A流动相；9-12min，5％A流动相；12-12.1min，5％-99％A流动相。如无特别说明，后续试验中所用LC-MS/MS(MRM)方法同此。
所挑选出的各产物肽特征离子对、去簇电压(DP值)和碰撞电压(CE值)如表2所示，检测结果详见图1-1(1)。其中，P2-1、P3-1和P4-1产物肽量较多，可认为P2、P3和P4底物效率较高。
表2候选底物肽P1-P5特征离子对信息
3.候选底物肽稳定性考察
底物肽段在孵育体系中由于自身稳定性，会有不同程度的水解，将0.1mM P1-P4在水溶液中与孵育体系中37℃放置4h，底物肽非特异断裂产物肽与内标峰面积比值如图1-1(2)，结果显示P3非特异断裂产物较多，表明其稳定性较差，其余底物肽均较P3稳定。综合考虑底物肽的酶解效率和肽段自身稳定性，选取P2、P4及新入选的底物肽P5进一步比较BoNT/A的底物酶切效率。
4.候选底物肽对缓冲液中BoNT/A检测限与线性的影响
分别以P2、P4和P5为底物肽，评价其对BoNT/A检测限的影响。设置BoNT/A浓度梯度为0.25U/mL,0.625U/mL,1.25U/mL,6.25U/mL和12.5U/mL，以产物肽响应超出空白S/N三倍时BoNT/A的浓度定义为检测限。P2为底物肽时，检测限为0.625U/mL；P4为底物肽时，检测限为1.25U/mL；P5为底物肽，检测限为0.625U/mL；但P5为底物时酶切产物仅-NH2端产物成线性。三条底物肽检测线性如图1-1(3)所示，结合其线性程度优选P2(即AP)为BoNT/A最优底物肽。
(二)酶切体系优化
1.酶切体系配制
分别配制7组酶切体系，每组总体积为80μL，含ZnCl2，50mM Hepes(pH 7.4)，10mMDTT，1mg/mL BSA，0.05mM AP，0.05mM BP，0.05mM EP和100μg/L P9，其中所述7组中ZnCl2浓度分别为0、10、25、50、100、200和500μM。
AP、BP、EP分别为BoNT/A，B和E的底物肽，P9为内标肽段，具体序列信息见表1。
2.酶切
分别取1U BoNT/A、2U BoNT/B和2U BoNT/E加入80μL酶切体系中，分别混匀后于37℃摇床，280rpm孵育5h。孵育结束后分别加入5μL10％甲酸，于14000rpm转速下离心5分钟，取上清液进样。另设空白组，用相应体积的PBS代替毒素加入体系。
3.LC-MS/MS(MRM)分析
选取BoNT/A，B和E的产物肽AP-N，AP-C，BP-N，BP-C，EP-N和EP-C(AP-N为底物肽AP被BoNT/A酶切后形成的-NH2端产物肽，AP-C为-COOH端产物肽，BP和EP的产物肽命名以此类推，各产物肽具体序列信息见表1)，分别溶于50％乙腈水溶液中，配制成浓度1μg/mL的产物肽溶液，采用三重四级杆-线性离子阱串联质谱仪5500结合超高效液相色谱仪ACQUITY UPLC建立LC-MS/MS(MRM)方法，提取各血清型BoNT/A，B和E酶切产物肽特异的MRM离子对并进行保留时间匹配。
挑选各产物肽特异的母离子与子离子建立MRM离子对，如表3所示。
表3 BoNT的底物肽和产物肽特征离子对信息表
4.检测结果
提取BoNT/A，B和E酶切产物肽特异的离子对，各组BoNT/A及其酶切产物AP-N峰面积比值随ZnCl2浓度变化如图1-2(1)所示。结果显示，当酶切体系中ZnCl2浓度为50μM时具有更好的酶切效果。
按照相似方法，考察了BSA浓度对BoNT/A酶切的影响，结果如图1-2(2)所示。结果显示，当酶切体系中BSA浓度为1mg/mL时具有更好的酶切效果。
在后续试验中，如有涉及，均采用优化后的酶切体系进行酶切实验：即，80μL酶切体系中含50μM ZnCl2，50mM Hepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，0.05mM AP，0.05mMBP，0.05mM EP和100μg/L P9。
实施例2：BoNT/A，B和E的检测
按照实施例1中优化的酶切体系以及底物肽，及所建立的酶切及LC-MS/MS(MRM)分析方法对BoNT/A，B和E进行检测。
提取BoNT/A，B和E酶切产物肽特异的离子对，色谱图如图2所示。提取相应血清型的酶切产物离子对可得到其明显的色谱峰。图2a为提取BoNT/A产物肽的离子对，产物肽AP-N保留时间为3.08min，AP-C保留时间为3.07min；图2b为提取BoNT/B产物肽的离子对，BP-N保留时间为4.93min，BP-C保留时间为3.17min；图2c为提取BoNT/E产物肽的离子对，AP-N保留时间为4.07min，AP-C保留时间为2.95min；图2d为提取BoNT/A、B和E酶切产物肽提取离子色谱叠加图。
实施例3：缓冲液中BoNT/A、B和E检测限考察
(1)按实施例1的实验步骤，在酶切孵育体系中(80μL)加入不同浓度的BoNT/A、B或E，同时设置1xPBS空白对照平行操作。
(2)本发明所述的BoNT检测限定义为，分别加入一定量BoNT/A、B或E到混合底物肽酶切体系后，体系中任意氨基端(-N)或羧基端(-C)产物肽的信噪比(S/N)超过空白酶切体系中产物肽信噪比的三倍，此时该BoNT浓度定义为检测限。
(3)逐级稀释毒素，当加入0.05U BoNT/A时，产物AP-C的S/N超过空白对照中AP-C的三倍，因此缓冲液中BoNT/A的检测限为0.6U/mL；加入0.15U BoNT/B时，产物BP-N的S/N超过空白对照中BP-N的三倍，因此缓冲液中BoNT/B的检测限为1.8U/mL；加入0.2U BoNT/E时，产物EP-N的S/N超过空白对照中EP-N的三倍，因此缓冲液中BoNT/E的检测限为2.5U/mL。缓冲体系中BoNT/A/B/E检测限酶切产物肽色谱图如图3所示。
实施例4：缓冲液中BoNT/A定量范围考察
(1)空白对照为1xPBS加入酶切体系中，所有操作与加入BoNT/A组相同。
(2)BoNT/A采用1xPBS稀释，加入系列浓度梯度的BoNT/A分别至优化的80μL酶切体系中，并按实施例1的步骤孵育及液质进样分析。
所述BoNT/A的检测线性范围：0.6-62.5U/mL。图4为PBS缓冲体系中BoNT/A酶切产物肽的质谱响应峰面积值，图5为PBS缓冲体系中BoNT/A定量标准曲线。
实施例5：血清中BoNT/A定量范围考察
试剂：
BoNT/A多克隆抗体(重链结合域)，宿主Chicken/IgY，货号：AHCA，Thermo FisherScientific。
BoNT/B多克隆抗体，宿主Chicken/IgY，货号：AHCB，Thermo Fisher Scientific；
BoNT/E多克隆抗体(轻链)，宿主Chicken IgY，货号：ACBNELC，Thermo FisherScientific。
(1)免疫磁珠偶联抗体
取100μL磁珠(Dynabeads Protein G，Catalog Nos.10004D，Invitrogen(NY,USA))，200μL 1×PBS洗三遍；取10μg BoNT/A、B和E的特异性单抗400μL 1×PBS中混匀，加入上述磁珠中，于37℃摇床、280rpm偶联作用2h；偶联后的免疫磁珠经200μL 1×PBS洗三遍，于200μL 1×PBS中4℃保存待用。
(2)富集血清中BoNT/A
取500μL健康人血清样品，加入BoNT/A后稀释成系列浓度梯度，将不同浓度BoNT/A加入60μL上述偶联抗体的免疫磁珠中；样品放置室温轻柔旋转作用2.5h后，磁力架分离弃上清，磁珠采用500μL PBST(含0.05％Tween 20的1×PBS)洗涤三遍，然后转移至新管中。
(3)肉毒毒素底物酶切体系配制
配置底物酶切溶液，体系中含50μM ZnCl2，50mM Hepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，0.05mM AP，0.05mM BP和0.05mM EP，100μg/L P9，涡旋混匀。
(4)酶切
分别取上述酶切体系80μL加入富集BoNT处理后的磁珠中，轻柔混匀后于37℃摇床、280rpm孵育5h。
(5)样品处理与检测
选取本发明建立的针对BoNT/A的LC-MS/MS(MRM)方法，提取BoNT/A产物肽特异的MRM离子对并进行保留时间匹配。
(6)检测结果
所述血清中BoNT/A检测线性范围：0.5-10U/mL BoNT/A；血清中BoNT/A检测限为0.5U/mL。图6为血清中BoNT/A酶切产物肽的质谱响应峰面积值，图7为血清中0.5U/mLBoNT/A酶切氨基端和羧基端产物肽色谱图，图8-9为血清中BoNT/A定量标准曲线。
实施例6：可疑肉毒毒素美容注射针剂检测
(1)样本基本信息
本例中所述可疑肉毒毒素美容注射针剂的瓶身标识为Purified Botulinum Toxin Type A complex(100units)，病人在注射该美容产品后出现眼睑下垂、吞咽困难等典型肉毒中毒症状。
(2)样品准备
a)待测样品：取上述一瓶未开封的可疑肉毒毒素美容注射针剂冻干粉，加入200μL 1×PBS溶解使之呈澄清透明状，浓度按其标识应为0.5units/μL。取20μL即10units待测；
b)阳性对照：0.05U BoNT/A，0.1U BoNT/A，1U BoNT/A；
c)空白对照：1×PBS
(3)肉毒毒素底物酶切体系配制：配置底物酶切溶液，体系中含50μM ZnCl2，50mMHepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，0.05mM AP，0.05mM BP和0.05mM EP，100μg/L P9。
(4)酶切
取待测样品加入80μL酶切体系中，分别轻轻吹打混匀后于37℃摇床，280rpm转速下孵育5h。孵育结束后分别加入5μL10％甲酸，于14000rpm转速下离心5分钟，取上清液进样。
(5)LC-MS/MS(MRM)分析
选取本发明建立的针对BoNT/A，B和E的LC-MS/MS(MRM)方法，提取各血清型BoNT产物肽特异的MRM离子对并进行保留时间匹配。
(6)检测结果
当待测样品中各血清型产物肽质谱响应峰的S/N值超过空白对照中对应产物肽S/N值的三倍，判定样品为相应血清型BoNT阳性。
分别提取可疑肉毒毒素美容针剂中BoNT/A，B和E的所有产物肽的MRM离子对，结果显示可疑肉毒美容针剂样品呈BoNT/A阳性，BoNT/B和E均阴性。采用单点校正法，所标识的1unit美容针剂酶切氨基端产物肽峰面积为41,900，而阳性对照0.1U BoNT/A酶切氨基端产物肽峰面积为41,200，由此推算所标识的1unit相当于0.1U BoNT/A阳性对照。图10为1unit可疑样品与阳性对照0.1U BoNT/A及阴性对照1×PBS样品中的AP-N提取离子色谱图。
实施例7：食源性肉毒中毒病人临床血清样本检测
(1)免疫磁珠偶联抗体：取100μL磁珠(Dynabeads Protein G)，200μL 1×PBS洗三遍；取10μg BoNT/A、B和E的特异性单抗(见实施例5)于400μL 1×PBS中混匀，加入上述磁珠中，于37℃摇床、280rpm偶联作用2h；偶联后的免疫磁珠经200μL 1×PBS洗三遍，于200μL 1×PBS中4℃保存待用。
(2)富集待测样品中BoNT
a)待检样品：取1mL病人血清样品加入60μL上述偶联抗体的免疫磁珠中；
b)空白对照：取500μL健康人血清，加入免疫磁珠60μL作为空白富集对照；
c)阳性对照：取500μL健康人血清，加入2U BoNT/A混匀，加入免疫磁珠60μL中作为阳性富集对照。
上述三份样品放置室温轻柔旋转作用2.5h后，磁力架分离弃上清，磁珠采用500μLPBST(含0.05％Tween 20的1×PBS)洗涤三遍，然后转移至新管中。
(3)肉毒毒素底物酶切体系配制：配置底物酶切溶液，体系中含50μM ZnCl2，50mMHepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，0.05mM AP，0.05mM BP和0.05mM EP，100μg/L P9，涡旋混匀。
(4)酶切
分别取上述酶切体系80μL加入待检样品、空白对照和阳性对照样品富集前处理后的磁珠中，轻柔混匀后于37℃摇床、280rpm孵育5h。
(5)样品处理与检测
孵育结束后，磁力架分离收集上清，14000rpm离心5分钟，取上清液进样，LC-MS/MS(MRM)分析。
(6)检测结果
分别提取样品中BoNT/A，B和E的所有产物肽的MRM离子对，空白血清和中毒病人血清检测结果如图11所示。结果表明，与空白血清相比，中毒病人血清中产物肽AP-N和EP-N峰面积明显超过空白对照，该血清样品显示BoNT/A和BoNT/E阳性，BoNT/B阴性。
实施例8：食源性肉毒中毒病人临床尿液样本检测
(1)免疫磁珠偶联抗体：取100μL磁珠(Dynabeads Protein G)，200μL 1×PBS洗三遍；取10μg BoNT/A、B和E的特异性单抗(见实施例5)于400μL PBS中混匀，加入上述准备好的100μL磁珠中，于37℃摇床、280rpm偶联作用2h；偶联后的免疫磁珠经200μL 1×PBS洗三遍，于200μL 1×PBS中4℃保存待用。
(2)富集待测样品中BoNT
a)待检样品：中毒病人尿样经14000rpm离心5min，取1mL上清加入60μL上述免疫磁珠。
b)空白对照：取500μL健康人尿样，加入免疫磁珠60μL作为空白富集对照；
c)阳性对照：取500μL健康人尿样，加入2U BoNT/A混匀，加入免疫磁珠60μL作为阳性富集对照。
上述三份样品放置室温轻柔旋转作用2.5h，磁力架分离弃上清，磁珠采用500μLPBST(含0.05％Tween 20的1×PBS)洗涤三遍，然后转移至新管中。
(3)肉毒毒素底物酶切体系配制：配置底物酶切溶液，体系中含50μM ZnCl2，50mMHepes(pH 7.4)，10mM DTT，1mg/mL BSA，0.05mM AP，0.05mM BP和0.05mM EP，100μg/L P9，涡旋混匀。
(4)酶切
分别取上述酶切体系80μL加入待检样品、空白对照和阳性对照样品富集处理后的磁珠中，轻柔混匀后于37℃摇床、280rpm孵育5h。
(5)样品处理与检测
孵育结束后，磁力架分离收集上清，于14000rpm离心5分钟，取上清液进样，LC-MS/MS(MRM)分析。
(6)检测结果
分别提取样品中BoNT/A，B和E的所有产物肽的MRM离子对，空白尿液和中毒病人尿液检测结果如图12所示。尿液样品检测结果显示BoNT/A，B和E均阳性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (15)
1.一种检测含BoNT或疑似含BoNT的样品的方法，其包括以下步骤：
(1)将所述样品在BoNT酶切体系中孵育，而后进行处理，得酶切产物样品，其中，
所述BoNT酶切体系包含下述成分：50μM ZnCl2，50mM pH 7.4的Hepes，10mM DTT，1mg/mLBSA，0.05mM BoNT的底物肽和100ppb P9，所述BoNT底物肽包括AP、BP和EP，其中，AP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，BP的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，EP的氨基酸序列如SEQID No.7所示，P9的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
(2)将步骤(1)所得酶切产物样品进行液相色谱-质谱分析，提取BoNT酶切产物肽的特征离子对；其中，
所述液相色谱-质谱为LC-MS/MS，MRM模式，质谱参数如下：
1)离子源为ESI源；
2)扫描模式为正离子模式；
3)喷雾电压为4.5～5.5KV；
4)离子源温度为450～550℃；
5)去簇电压DP值为100V；
6)碰撞电压CE值为10～50V；和
7)质量扫描范围为100～1000；
液相色谱参数如下：
1)色谱柱为BioBasicTMC18色谱柱，5μm；
2)柱温20～50℃；
3)上样量为2～10μL；
4)流速为0.05～0.3mL/min；和
5)流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相为B乙腈溶液；洗脱梯度为：0-1min，99％流动相A；1-7min，99％-75％流动相A；7-9min，75％-5％流动相A；9-12min，5％流动相A；12-12.1min，5％-99％流动相A；
所述BoNT酶切产物肽选自氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的AP-N、氨基酸序列如SEQID No.3所示的AP-C、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的BP-N、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的BP-C、氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的EP-N和氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的EP-C，并且，
AP-N的特征离子对为714.1→585.4m/z和/或714.1→261.2m/z，其中，各离子对中的母离子均带双电荷；
AP-C的特征离子对为499.8→491.3m/z和/或333.5→288.2m/z，其中，母离子499.8带双电荷，母离子333.5带三电荷；
BP-N的特征离子对为880.5→234.4m/z和/或880.5→433.5m/z，其中，各离子对中的母离子均带双电荷；
BP-C的特征离子对为320.6→372.2m/z和/或426.8→501.9m/z，其中，母离子372.2带四电荷，母离子501.9带三电荷；
EP-N的特征离子对为558.3→780.2m/z和/或558.3→573.5m/z，其中，各离子对中的母离子均带三电荷；
EP-C的特征离子对为344.8→575.3m/z和/或344.8→227.2m/z，其中，各离子对中的母离子均带双电荷；
(3)根据步骤(2)的提取结果获取下述至少一种信息：1)所述样品是否含BoNT；2)所含BoNT的血清型；以及，3)所含BoNT血清型的量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述含BoNT或疑似含BoNT的样品选自化妆品和人或动物的尿液或血液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于下述的一项或多项；
A.在步骤(1)中，在30～40℃孵育所述样品；
B.在步骤(1)中，在摇床上以100～500rpm孵育所述样品；
C.在步骤(1)中，孵育0.5～10小时；
D.在步骤(1)中，孵育结束后加入甲酸溶液终止反应；
E.在步骤(1)中，终止反应后离心取上清液即得所述酶切产物样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于下述的一项或多项：
a.在步骤(1)中，在35～38℃孵育所述样品；
b.在步骤(1)中，在摇床上以150-300rpm孵育所述样品；
c.在步骤(1)中，孵育2～8小时；
d.在步骤(1)中，孵育结束后加入10％甲酸溶液终止反应；
e.在步骤(1)中，终止反应后10000～20000rpm离心1～10min取上清液即得所述酶切产物样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于下述的一项或多项：
aa.在步骤(1)中，在37℃孵育所述样品；
bb.在步骤(1)中，在摇床上以180-280rpm孵育所述样品；
cc.在步骤(1)中，孵育3～5小时。
6.根据权利要求1所述的方法，设置空白和/或阳性对照组，并采用与处理所述样品相同的条件处理所述对照组。
7.根据权利要求1所述的方法，当经所述液相色谱-质谱分析后确定任意产物肽的信噪比超过空白对照组信噪比的三倍，则判断所述样品中含相应BoNT血清型，具体对应关系如下：
产物肽AP-N和AP-C对应BoNT/A；
产物肽BP-N和BP-C对应BoNT/B；
产物肽EP-N和EP-C对应BoNT/E。
8.根据权利要求1所述的方法，在步骤(1)前，还包括用表面偶联有特异性结合BoNT的抗体或其抗原结合片段的免疫磁珠对所述样品中BoNT富集的操作。
9.根据权利要求8所述的方法，所述富集包括以下步骤：将所述样品加入所述免疫磁珠中，30-48℃孵育1～5小时，用PBST洗涤，备用。
10.根据权利要求8所述的方法，所述富集包括以下步骤：将所述样品加入所述免疫磁珠中，35-38℃孵育1～3小时，用PBST洗涤，备用。
11.根据权利要求8所述的方法，所述富集包括以下步骤：取1mL含BoNT/A的复杂基质样本加入60μL上述偶联抗体的免疫磁珠中，于37℃旋转孵育2.5h，富集结束，磁珠采用500μL含0.05％Tween 20的1×PBS的PBST洗涤，备用。
12.根据权利要求8所述的方法，所述免疫磁珠表面偶联有蛋白G。
13.根据权利要求8所述的方法，所述免疫磁珠为Dynabeads Protein G。
14.权利要求1-13任一项的方法在定性或定量检测样品中BoNT血清型的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述样品选自化妆品和人或动物的尿液或血液。
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