ES2939001T3 - Una neurotoxina botulínica novedosa y sus derivados - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT) de un nuevo serotipo (BoNT/X) y métodos para producir y usar los polipéptidos BoNT, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Una neurotoxina botulínica novedosa y sus derivados
APOYO GUBERNAMENTAL
Esta invención se ha hecho con apoyo gubernamental bajo R01NS080833 concedido por los Institutos Nacionales de la Salud (National Institutes of Health). El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
ANTECEDENTES
Las neurotoxinas botulínicas clostridiales (BoNT) están entre los agentes de bioterrorismo potenciales más peligrosos y se usan también clínicamente para tratar una lista creciente de estados médicos. Hay siete serotipos de BoNT (BoNT/A-G) conocidos hasta la fecha. En los últimos años, las BoNT se han usado ampliamente para tratar una lista creciente de estados médicos: inyecciones locales de cantidad mínima de toxinas pueden atenuar la actividad neuronal en regiones seleccionadas como diana, lo que puede ser beneficioso en muchos estados médicos así como para fines cosméticos. A medida que crece la aplicación de las BoNT se han notificado limitaciones y efectos adversos. La principal limitación es la generación de anticuerpos neutralizantes en pacientes, lo que convierte un tratamiento futuro en inefectivo. La terminación de la utilización de BoNT deja a menudo a los pacientes sin otro modo efectivo de tratar/aliviar sus trastornos. Los efectos adversos asociados con el uso de BoNT van desde acontecimientos no graves transitorios tales como ptosis y diplopía hasta acontecimientos potencialmente mortales incluso la muerte. Las limitaciones y los efectos adversos de las BoNT están correlacionados en gran medida con la dosis. Hay intereses considerables por desarrollar tipos de BoNT novedosos como toxinas terapéuticas. No se han reconocido nuevos tipos de BoNT durante los últimos 45 años.
SUMARIO
La presente invención se define mediante el conjunto de reivindicaciones adjunto. Las presentes invenciones proporciona un polipéptido de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT) aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con s Eq ID NO: 3, comprendiendo opcionalmente el polipéptido de BoNT aislado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, no reaccionando de manera cruzada el polipéptido de BoNT con un anticuerpo frente al serotipo A, B, C, D, E, F o G de BoNT.
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en la identificación de un serotipo de BoNT novedoso, BoNT/X, a partir de la búsqueda en la base de datos genómica de cepas de Clostridium botulinum. BoNT/X la menor identidad de secuencia con otras BoNT y no se reconoce por antisueros creados frente a los tipos de BoNT conocidos. BoNT/X escinde proteínas SNARE, como otras BoNT. Sin embargo, BoNT/X también escinde varias proteínas SNARE que otras BoNT no pueden escindir, por ejemplo, VAMP4, VAMP5 y Ykt6. Se proporcionan composiciones y métodos para tratar enfermedades usando BoNT/X. También se proporcionan en el presente documento métodos de elaboración de BoNT/X.
Por consiguiente, algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT) aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT aislados una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La presente invención proporciona polipéptidos de BoNT aislados una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT modificados que comprenden una o más mutaciones de sustitución en una posición que corresponde a C461, C467 y C1240 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la(s) mutación/mutaciones de sustitución corresponde(n) a C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S o C467A/C1240A en SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 4-17. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con cualquiera de las SEQ ID NO: 4-17, no teniendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-17.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT modificados que comprenden una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la mutación de sustitución corresponde a C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S o C467A/C1240A en SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21, no teniendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT quiméricos que comprenden la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24, no teniendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende además una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de en SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT entra en una célula. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde una proteína SNARE en la célula. En algunas realizaciones, la proteína SNARE se selecciona del grupo que consiste en: SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6 y sintaxina 1.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP1. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP2. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP3. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 41.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP4. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a K87 y S88 de SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP5. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R40 y S41 de SEQ ID NO: 43.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es Ykt6. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a K173 y S174 de SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT tiene una estabilidad aumentada en comparación con su polipéptido de BoNT de tipo silvestre correspondiente.
En algunas realizaciones, la célula es una célula secretora. En algunas realizaciones, la célula es una célula neuronal. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT suprime la actividad neuronal. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT induce parálisis flácida. En algunas realizaciones, la célula es una célula cultivada. En algunas realizaciones, la célula está in vivo. En algunas realizaciones, la célula es de un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones, el mamífero es un roedor. En algunas realizaciones, el roedor es un ratones. En algunas realizaciones, el roedor es una rata.
En la presente invención, el polipéptido de BoNT no reacciona de manera cruzada con un anticuerpo frente al serotipo A, B, C, D, E, F o G de BoNT.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%, o el 100% con el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento. Se proporcionan vectores de ácido nucleico que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Se proporcionan células que comprenden las moléculas de ácido nucleico o los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, tales células expresan el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento.
Se proporcionan métodos de producción del polipéptido de BoNT de la presente divulgación. Tales métodos comprenden las etapas de cultivar la célula que expresa los polipéptidos de BoNT en condiciones en las que se produce dicho polipéptido de BoNT. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además recuperar el polipéptido de BoNT del cultivo.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT modificados que comprenden: (a) un dominio de proteasa; (b) una región ligadora modificada; y (c) un dominio de translocación; siendo (a), (b) y (c) del serotipo X de BoNT, y comprendiendo la región ligadora modificada una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende además: (d) un dominio de unión a receptor. En algunas realizaciones, la región ligadora modificada comprende una mutación de sustitución que corresponde a C461S o C461A en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la región ligadora modificada comprende una mutación de sustitución que corresponde a C467S o C467A en SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a receptor es de BoNT/X. En algunas realizaciones, el dominio de unión a receptor está modificados. En algunas realizaciones, el dominio de unión a receptor comprende una mutación de sustitución que corresponde a C1240S o C1240A en SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a receptor es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F y G.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado entra en una célula. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado escinde proteínas SNARE en la célula. En algunas realizaciones, la proteína SNARE se selecciona del grupo que consiste en: SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6 y sintaxina 1. En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP1. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP2. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP3. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 41.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP4. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a K87 y S88 de SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es VAMP5. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a R40 y S41 de SEQ ID NO: 43.
En algunas realizaciones, la proteína SNARE es Ykt6. En algunas realizaciones, la BoNT escinde entre los residuos de aminoácido que corresponden a K173 y S174 de SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT tiene una estabilidad aumentada en comparación con su polipéptido de BoNT de tipo silvestre correspondiente.
En algunas realizaciones, la célula es una célula secretora. En algunas realizaciones, la célula es una célula neuronal. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT suprime la actividad neuronal. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT induce parálisis flácida. En algunas realizaciones, la célula es una célula cultivada. En algunas realizaciones, la célula está in vivo. En algunas realizaciones, la célula es de un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones, el mamífero es un roedor. En algunas realizaciones, el roedor es un ratones. En algunas realizaciones, el roedor es una rata.
En la presente invención, el polipéptido de BoNT no reacciona de manera cruzada con un anticuerpo frente al serotipo A, B, C, D, E, F o G de BoNT.
En algunas realizaciones, la región ligadora modificada comprende un ligador artificial. En algunas realizaciones, el ligador artificial contiene un sitio de escisión de una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en trombina, TEV, PreScission (proteasa 3C), factor Xa, MMP-12, m Mp -13, MMP-17, MMP-20, granzima-B y enteroquinasa. En algunas realizaciones, el ligador comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-60).
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%, o el 100% con el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento. Se proporcionan vectores de ácido nucleico que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Se proporcionan células que comprenden las moléculas de ácido nucleico o los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, tales células expresan el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento.
Se proporcionan métodos de producción del polipéptido de BoNT de la presente divulgación. Tales métodos comprenden las etapas de cultivar la célula que expresa los polipéptidos de BoNT en condiciones en las que se produce dicho polipéptido de BoNT. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además recuperar el polipéptido de BoNT del cultivo.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT modificados que comprenden una o más mutaciones de sustitución en posiciones que corresponden a R360, Y363, H227, E228 o H231 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones de sustitución corresponden a R360A/Y363F, H227Y, E228Q o H231Y en SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 31-38. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con cualquiera de las SEQ ID NO: 31-38, no teniendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 31 -38.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan un polipéptido de BoNT/X modificado que comprende: a) un dominio de proteasa inactivo; b) una región ligadora; y c) un dominio de translocación. En algunas realizaciones, el BoNT/X modificado comprende además un dominio de unión a receptor.
En algunas realizaciones, el dominio de proteasa inactivo comprende una o más mutaciones de sustitución en posiciones que corresponden a R360, Y363, H227, E228 o H231 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones de sustitución corresponden a R360A/Y363F, H227Y, E228Q o H231Y de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado entra en una célula. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado no escinde una proteína SNARE.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado comprende además una modificación en la región ligadora de (b). En algunas realizaciones, la modificación en la región ligadora comprende una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la única mutación de sustitución corresponde a C461A, C461S, C467A o C467S en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado comprende además una modificación en el dominio de unión a receptor de (d).
En algunas realizaciones, la modificación en el dominio de unión a receptor comprende una mutación de sustitución en una posición que corresponde a C1240 de SEQ ID NO: 1.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%, o el 100% con el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento. Se proporcionan vectores de ácido nucleico que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Se proporcionan células que comprenden las moléculas de ácido nucleico o los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, tales células expresan el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento.
Se proporcionan métodos de producción del polipéptido de BoNT de la presente divulgación. Tales métodos comprenden las etapas de cultivar la célula que expresa los polipéptidos de BoNT en condiciones en las que se produce dicho polipéptido de BoNT. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además recuperar el polipéptido de BoNT del cultivo.
En el presente documento se proporciona además el uso del polipéptido de BoNT modificado descrito en el presente documento como vehículo de suministro para suministrar agentes terapéuticos a las neuronas.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan moléculas quiméricas que comprenden una primera porción ligada a una segunda porción, siendo la primera porción un polipéptido de BoNT modificado descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, la primera porción y la segunda porción están ligadas covalentemente. En algunas realizaciones, la primera porción y la segunda porción están ligadas de manera no covalente.
En algunas realizaciones, la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína. En algunas realizaciones, la segunda porción es una molécula bioactiva. En algunas realizaciones, la segunda porción es un fármaco no polipeptídico. En algunas realizaciones, la segunda porción es un polipéptido terapéutico.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%, o el 100% con el polipéptido de BoNT quimérico descrito en el presente documento. Se proporcionan vectores de ácido nucleico que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Se proporcionan células que comprenden las moléculas de ácido nucleico o los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, tales células expresan el polipéptido de BoNT quimérico descrito en el presente documento.
Se proporcionan métodos de producción del polipéptido de BoNT quimérico de la presente divulgación. Tales métodos comprenden las etapas de cultivar la célula que expresa los polipéptidos de BoNT quiméricos en condiciones en las que se produce dicho polipéptido de BoNT quimérico. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además recuperar el polipéptido de BoNT quimérico del cultivo.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de BoNT descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se proporcionan también un kit que comprende tales composiciones farmacéuticas e instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de BoNT, la molécula quimérica o la composición farmacéutica descrita en el presente documento para su uso en métodos de tratamiento de un estado, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de BoNT, la molécula quimérica o la composición farmacéutica descrita en el presente documento a un sujeto para tratar el estado.
En algunas realizaciones, el estado está asociado con neuronas o glándulas hiperactivas. En algunas realizaciones, el estado se selecciona del grupo que consiste en disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurógena, anismo, espasticidad de extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, estados dermatológicos y obesidad/apetito reducido.
En algunos aspectos, se proporciona un método no terapéutico de tratamiento de un estado cosmético o estético usando el polipéptido de BoNT descrito en el presente documento, siendo opcionalmente el estado surcos en el entrecejo o arrugas de la piel.
En algunas realizaciones, el estado no está asociado con una actividad neuronal no deseada. En algunas realizaciones, el estado se selecciona del grupo que consiste en: psoriasis, alergia, linfohistiocitosis hemofagocítica y enfermedades pancreáticas alcohólicas.
En algunas realizaciones, la administración es por medio de inyección a donde está presente la actividad neuronal no deseada.
Aún otros aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos de producción de un polipéptido de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT), comprendiendo el método:
(i) obtener un primer fragmento de BoNT que comprende una cadena ligera (LC) y un dominio N-terminal de una cadena pesada (Hn), comprendiendo el primer fragmento de BoNT un motivo LPXTGG C-terminal (SEQ ID NO: 60);
(ii) obtener un segundo fragmento de BoNT que comprende un dominio C-terminal de la cadena pesada (Hc); comprendiendo el segundo fragmento de BoNT un sitio de escisión de proteasa específico en su extremo N-terminal;
(iii) escindir el segundo fragmento de BoNT con una proteasa específica, dando como resultado la escisión un residuo glicina libre en el extremo N-terminal; y
(iv) poner en contacto el primer fragmento de BoNT y el segundo fragmento de BoNT en presencia de una transpeptidasa, ligando de ese modo el primer fragmento de BoNT y el segundo fragmento de BoNT para formar una BoNT ligada.
En algunas realizaciones, el primer fragmento de BoNT comprende además una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al primer fragmento de BoNT en el extremo N-terminal. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al primer fragmento de BoNT en el extremo C-terminal. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona del grupo que consiste en: His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, calmodulina, Softag 1, Softag 3, Tc , V5, VSV, Xpress, Halo y Fc.
En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT comprende además una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al primer fragmento de BoNT en el extremo N-terminal. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al segundo fragmento de BoNT en el extremo C-terminal. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona del grupo que consiste en: His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, calmodulina, Softag 1, Softag 3, TC, V5, VSV, Xpress, Halo y Fc.
En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en: trombina, TEV, PreScission, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20, granzima-B, enteroquinasa y proteasa SUMO. En algunas realizaciones, la proteasa afín es trombina.
En algunas realizaciones, el primer fragmento de BoNT es del serotipo de BoNT A, B, C, D, E, F, G o X. En algunas realizaciones, el primer fragmento de BoNT es de BoNT/X. En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT es del serotipo de BoNT A, B, C, D, E, F, G o X. En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT es de BoNT/A. En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT es de BoNT/B. En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT es de BoNT/C. En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT es de BoNT/X.
En algunas realizaciones, la transpeptidasa es una sortasa. En algunas realizaciones, la sortasa es de Staphylococcus aureus (SrtA).
Estos y otros aspectos de la divulgación, así como diversas ventajas y utilidades resultarán evidentes con referencia a la descripción detallada de la invención. Cada aspecto de la divulgación puede abarcar diversas realizaciones tal como se entenderá.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación, que pueden entenderse mejor mediante la referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentada en el presente documento. El archivo de patente o de solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Copias de esta publicación de patente o de solicitud de patente con dibujo(s) en color se proporcionarán por la Oficina tras la petición y el pago de la tasa necesaria.
Las FIGs. 1A-1E muestran la identificación de BoNT/X como nueva BoNT. La FIG. 1A muestra un árbol filogenético de la alineación de secuencias de proteína para BoNT/A-G, BoNT/F5, TeNT y BoNT/X, analizado mediante el método de ClustalW. Los porcentajes de identidad de secuencia entre cada toxina y BoNT/X se indican tras cada toxina. Los porcentajes de identidad de secuencia entre BoNT/E y BoNT/F, y entre BoNT/B y BoNT/G también se anotaron. La FIG. 1B, panel superior, muestra un dibujo esquemático de los tres dominios de BoNT/X, con motivo de proteasa conservado en la LC y el motivo de unión de gangliósido en la Hc anotada. La FIG. 1B, panel inferior, muestra una ventana de comparación de secuencia deslizante que demuestra que BoNT/X tiene una baja similitud distribuida uniformemente a lo largo de su secuencia con todas las otras siete BoNT y TeNT. La FIG. 1C es un dibujo esquemático de la agrupación de genes orf que alberga el gen BoNT/X (panel superior), que tiene dos características únicas en comparación con dos variantes conocidas de la agrupación orfX (paneles central e inferior): (1) hay una proteína orfX2 adicional (designada como orfX2b) ubicada cerca del gen BoNT/X; (2) el marco de lectura de los genes orfX tiene el mismo sentido que el gen BoNT/X. La FIG. 1D es un esquema que ilustra la direccionalidad génica única y el gen OrfX2 adicional encontrado en BoNT/X. La FIG. 1E muestra una estructura preliminar de la cadena ligera de BoNT/X. El punto oscuro representa el cinc de sitio activo. La estructura se muestra a una resolución de 1,9 Á.
Las FIGs. 2A-2J muestran que la LC de BoNT/X (X-LC) escinde VAMP en un sitio único. La FIG. 2A muestra X-LC, con o sin pretratamiento con EDTA, incubada con extractos de detergente de cerebro (BDE) de rata. Se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia para detectar sintaxina 1, SNAP-25 y VAMP2. También se detectó sinaptofisina (Syp) como control de carga. La LC de BoNT/A (A-LC) y BoNT/B (B-LC) se analizaron en paralelo. La escisión de VAMP2 mediante B-LC da como resultado pérdida de señales de inmunotransferencia, mientras que la escisión de SNAP-25 mediante A-LC genera un fragmento más pequeño de SNAP-25 que todavía puede detectarse en inmunotransferencia (marcado mediante un asterisco). La incubación con X-LC dio como resultado pérdida de señales de inmunotransferencia de VAMP2, lo que sugiere que X-LC escindió VAMP2. EDTA bloqueó la actividad de las X-, A- y B-LC. La FIG. 2B muestra VAMP2 (residuos 1-96) purificada como proteína recombinante etiquetada con His6 e incubada con X-LC. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. X-LC convirtió VAMP2 (1 -96) en dos fragmentos más pequeños, lo que indica que X-LC escindió VAMP2. Las FIGs. 2C-2E muestran VAMP2 (1-96) incubada con X-LC. Entonces se analizaron muestras de proteína completa mediante espectrometría de masas (LC-MS/MS) para determinar el peso molecular preciso de los fragmentos escindidos. Los picos de péptido eluido de la columna de HPLC se representaron en la FIG. 2C con respecto al tiempo de ejecución (RT, eje X). Los datos de espectrometría de masas para los dos productos de escisión se muestran en las FIGs. 2d y 2E, respectivamente, con la relación masa/carga (m/z) anotada para cada señal. El peso molecular se deduce multiplicando m por z, seguido de restar z. Las secuencias de proteína para los dos productos de escisión corresponden a SEQ ID NO: 61 y 62 de arriba abajo y se muestran en la FIG. 2C. La FIG. 2F muestra una alineación de secuencias entre VAMP 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, Sec22b y Ykt6, con sitios de escisión para BoNT/B, D, F, G y X subrayados, y dos motivos SNARE encuadrados. Las secuencias corresponden a las SEQ ID NO: 63-71 de arriba abajo. La FIG. 2G muestra VAMP1,3, 7 y 8 etiquetadas con HA, y Sec22b y Ykt6 etiquetadas con myc expresadas en células HEK293 por medio de transfección transitoria. Se incubaron lisados celulares con X-LC y se sometieron a análisis de inmunotransferencia que detecta la etiqueta HA o Myc. Actina sirvió como control de carga. X-LC escindió VAMP1,3 y Ykt6, pero no VAMP7, 8 y Sec22. La FiG. 2H muestra Ykt6 etiquetada con GST incubada con X-LC (100 nM) durante los tiempos indicados. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.
X-LC escindió Ykt6. La FIG. 2I muestra dominios citoplasmáticos etiquetados con GST de VAMP2 (33-86), VAMP4 (1 -115) y VAMP5 (1 -70) incubadas con X-LC durante los tiempos indicados. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. X-LC escindió tanto VAMP4 como VAMP5. Se requiere un tiempo de incubación mayor (360 min) para escindir la mayoría de VAMP5. Obsérvese que la proteína VAMP5 contiene una banda adicional que es o bien un producto de degradación o bien un contaminante proteico bacteriano, que discurre de manera próxima (pero no idéntica) al producto de escisión en SDS-PAGE. La FIG. 2J muestra experimentos llevados a cabo tal como se describe en la FIG. 2A, excepto porque se detectaron VAMP4 y Sec22b. Se detectó sinaptotagmina I (Syt I) como control de carga. X-LC escindió VAMP4 nativa en BDE.
Las FIGs. 3A-3E muestran la activación de BoNT/X mediante escisión proteolítica de la región ligadora entre LC y Hn. La FIG. 3A muestra una alineación de secuencias de las regiones ligadoras entre LC y Hn de las siete BoNT y BoNT/X. Las secuencias corresponden a las SEQ ID NO: 72-79 de arriba abajo. BoNT/X tiene la región ligadora más larga entre todas las BoNT, que contiene una cisteína extra además de las dos cisteínas conservadas en la LC y en la Hn. El sitio de corte de Lys-C bajo proteólisis limitada se identificó mediante un enfoque de espectrometría de masas. La FIG. 3B muestra neuronas corticales de rata cultivadas expuestas a las concentraciones indicadas de X-LC-Hn en medios durante 12 horas. Se recogieron lisados celulares y se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia para examinar sintaxina 1, SNAP-25 y VAMP2 en neuronas. Actina sirvió como control de carga. LC-Hn activados con tripsina de BoNT/A (A-LC-Hn) y BoNT/B (B-LC-Hn) se analizaron en paralelo como controles. X-LC-Hn entró en las neuronas y escindió VAMP2, tal como se evidencia mediante la pérdida de señales de inmunotransferencia de VAMP2. X-LC-Hn activado mediante Lys-C mostró una potencia aumentada drásticamente en comparación con las X-LC-Hn no activado. X-LC-Hn es más potente que B-LC-Hn y A-LC-Hn activados con tripsina, que no mostraron ninguna escisión detectable de sus sustratos SNARE en neuronas en las mismas condiciones de ensayo. La FIG. 3C muestra mutantes de X-LC-Hn con la cisteína indicada mutada, así como WT X-LC-Hn, activado mediante proteólisis limitada y analizado mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, con o sin DTT. La mutación de C423S dio como resultado dos fragmentos de 50 kDa, con o sin DTT. Los mutantes que albergan C461S o C467S mostraron una única banda en 100 kDa en ausencia de DTT, y se separó en dos bandas de ~50 kDa en presencia de DTT, lo que demuestra que tanto C461 como C467 en la Hn pueden formar el enlace disulfuro intercatenario con C423 en la LC. Una porción de WT X-LC-Hn formó agregados encima del gel de SDS-PAGE. Estos agregados se deben a la formación del enlace disulfuro intermolecular, ya que desaparecieron en presencia de DTT. La mutación de una cualquiera de las tres cisteínas suprimió los agregados, lo que indica que la formación del enlace disulfuro intermolecular se debe a la existencia de una cisteína extra en la región ligadora. La mayoría de la WT X-LC-Hn activado se separó también en dos bandas de ~50 kDa en gel de SDS-PAGE sin DTT. Esto se debe a la redistribución del enlace disulfuro descrita en la FIG. 3D. La FIG. 3D muestra WT X-LC-Hn activado mediante proteólisis limitada, seguida de incubación previa con las concentraciones indicadas de NEM para bloquear la redistribución del enlace disulfuro. Entonces se analizaron las muestras mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, con o sin la presencia de DTT. La mayoría del WT X-LC-Hn existe como una única banda en 100 kDa sin DTT tras el tratamiento con NEM, lo que indica que WT X-LC-Hn contiene principalmente enlace disulfuro intercatenario. La FIG. 3E muestra experimentos llevados a cabo tal como se describe en la FIG. 3B, excepto porque se expusieron neuronas a o bien WT o bien mutantes de X-LC-Hn indicados. La mutación de la cisteína en la LC (C423) suprimió la actividad de X-LC-Hn, mientras que la mutación de una de las dos cisteínas en la Hn (C461 o C467) no afectó a la actividad de X-LC-Hn sobre las neuronas. Estos resultados confirmaron que la formación del enlace disulfuro intercatenario es esencial para la actividad de X-LC-Hn.
Las FIGs. 4A-4F muestran que el BoNT/X de longitud completa es active sobre neuronas cultivadas e in vivo en ratones. Las secuencias son tal como sigue: LVPR-GS (SEQ ID NO: 80), LPETGG-His6 (SEQ ID NO: 81), GG-His6 (SEQ ID NO: 82) y LPETGS (SEQ ID NO: 59). La FIG. 4a muestra un dibujo esquemático que ilustra la síntesis del BoNT/X de longitud completa usando el método de ligación de sortasa. La FIG. 4B muestra que la mezcla de reacción de ligación de sortasa y los componentes de control indicados se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. El asterisco marca agregados de proteínas debidos al enlace disulfuro intermolecular, ya que estos agregados desaparecieron en presencia de DTT. El marcador de peso molecular está en el carril 1 (empezando desde el lado izquierdo). El BoNT/X de longitud completa (X-FL) solo apareció en la mezcla de ligación de sortasa (carril 7 y carril 14). La FIG. 4C muestra esas neuronas expuestas a la misma cantidad (5 pl) de mezcla de ligación de sortasa o los componentes de control indicados durante 12 horas en medios. Se analizaron lisados celulares mediante inmunotransferencia. X-LC-HN solo escindió algo de VAMP2 debido a su alta concentración en la mezcla de reacción. La mezcla de control que contiene tanto X-LC-HN como X-HC, pero no sortasa, potenció ligeramente la escisión de VAMP2 en comparación con X-LC-HN solo, probablemente debido a que X-HC se asocia con X-LC-HN por medio de interacciones no covalentes. La ligación de X-LC-HN y X-HC mediante sortasa potenció la escisión de VAMP2 con respecto a la mezcla de X-LC-HN y X-HC sin sortasa, lo que demuestra que el X-FL ligado es funcional en neuronas. La FIG. 4D muestra que la mezcla de reacción de sortasa preparada tal como se describe en el panel b (carril 7) es activa in vivo analizada usando el ensayo DAS en ratones. La extremidad inyectada desarrolló parálisis flácida y los dedos no se extendieron en el plazo de 12 horas. La extremidad izquierda no se inyectó con toxinas, sirviendo como control. La FIG. 4E muestra que BoNT/A-G, una toxina en mosaico BoNT/DC y BoNT/X se sometieron a análisis de transferencia puntual (0,2 pg por toxina, localizadas sobre membranas de nitrocelulosa), usando cuatro antisueros de caballo (anti-BoNT/A, B y E trivalentes, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC y anti-BoNT/F), así como dos antisueros de cabra (anti-BoNT/G y anti-BoNT/D). BoNT/X se compone de X-LC-HN y X-HC purificados a una relación de 1:1. Estos antisueros reconocieron sus toxinas diana correspondientes, pero ninguno de ellos reconoció BoNT/X. La FIG. 4F muestra que la forma inactiva de longitud completa de BoNT/X (BoNT/XRY) se purificó como proteína recombinante etiquetada con His6 en E. co liy se analizó mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, con o sin DTT.
La FIG. 5 es un árbol filogenético que muestra la distribución y la relación de neurotoxinas clostridiales. El árbol representa las relaciones de diferentes BoNT y secuencias de TeNT de la búsqueda de Jackhmmer. BoNT/X está rodeado con un círculo.
La FIG. 6 muestra un análisis de espectrometría de masas de VAMP2 intacta (1-96). Se analizó VAMP2 etiquetada con His6 (1-96) mediante espectrometría de masas LC-MS/MS. El perfil de HPLC se lista en el panel izquierdo, junto con la secuencia de proteína. Los datos de espectrometría de masas para VAMP2 de longitud completa (1-96) se mostraron en el panel derecho y corresponde a SEQ ID NO: 83, con el valor m/z marcado for cada señal.
Las FIGs. 7A-7F muestran la identificación del sitio de escisión en GST-VAMP2 (33-86) mediante X-LC. La FIG. 7A muestra una VAMP2 etiquetada con GST (33-86) incubada con o sin X-LC. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. Las FIGs. 7B-7C muestran VAMP2 etiquetada con GST intacta (33-86) analizada mediante espectrometría de masas LC-MS/MS. El perfil de HPLC se mostró en la FIG. 7B. Los datos de espectrometría de masas se mostraron en la FIG. 7C, con la secuencia de proteína (SEQ ID NO: 84) anotada en la FiG. 7C. VAMP2 (33-66) y VAMP2 (67-86) están marcadas. Las FIGs. 7D-7E muestran VAMP2 etiquetada con GST (33-86) incubada con X-LC. Entonces se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas LC-MS/MS. El perfil de HPLC se muestra en la FIG. 7D. Los datos de espectrometría de masas para el fragmento C-terminal (SEQ ID NO: 85) generado mediante X-LC se mostraron en la FIG. 7E. Los datos de espectrometría de masas para el fragmento N-terminal (SEQ ID NO: 86) se mostraron en la FIG. 7F. Las secuencias de proteína de los fragmentos C-y N-terminales se indicaron en las FIGs. 7E-7F, y corresponden a las SEQ ID NO: 85 y 86 respectivamente.
Las FIGs. 8A-8B muestran que la toxina quimérica XA es activa sobre neuronas. La FIG. 8A muestra un toxina quimérica XA generada ligando X-LC-Hn con A-Hc mediante sortasa, similar a la generación de X-FL descrita en la FIG. 4A. La mezcla de ligación de sortasa y los componentes de control indicados se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. La ligación es eficiente ya que la mayoría de X-LC-Hn se ligó en la toxina quimérica XA. La FIG. 8B muestra neuronas corticales de rata expuestas a los componentes de control indicados o mezcla XA ligada mediante sortasa (5 gl) durante 12 horas en medios. Se analizaron lisados celulares mediante inmunotransferencia. X-LC-Hn solo escindió algo de VAMP2 debido a su alta concentración en la mezcla de reacción. La XA ligada escindió VAMP2 en neuronas.
La FIG. 9 muestra que la mutación de la cisteína extra en la Hn y la cisteína en la He no afecta a la actividad de BoNT/X. X-He (C1240S) se ligó con WT X-LC-Hn, X-LC-Hn (C461S) o X-LC-Hn (C467S) mediante ligación mediante sortasa. Las neuronas se expusieron a mezcla de ligación de sortasa o componentes de control (5 gl) durante 12 horas en medios. Se analizaron lisados celulares mediante inmunotransferencia. La mutación de C1240 y una de la cisteína en Hn (C461 o C467) no afectó a la actividad de BoNT/X, ya que las toxinas mutantes ligadas son capaces de entrar en las neuronas y escindieron VAMP2.
La FIG. 10 muestra antisueros creados frente a los siete serotipos de las BoNT que neutralizan sus BoNT diana en las neuronas. Neuronas corticales de rata cultivadas se expusieron a las BoNT indicadas, con o sin incubación previa con los antisueros indicados. Se recogieron lisados celulares 12 horas después y se sometieron a análisis de inmunotransferencia. Todos los antisueros neutralizaron específicamente sus BoNT diana, sin afectar a la actividad de un serotipo diferente de las BoNT, validando por tanto la especificidad y potencia de estos antisueros. Las concentraciones para las BoNT eran: BoNT/A (50 pM), BoNT/B (2 nM), BoNT/C (1,5 nM), BoNT/D (100 pM), BoNT/E (0,5 nM), BoNT/F (0,5 nM), BoNT/G (5 nM). El antisuero frente a BoNT/A/B/E se usó a 20 gl por pocillo. Todos los demás antisueros se usaron a 10 gl por pocillo. Las BoNT se incubaron previamente con los antisueros indicados durante 30 min a 37°C antes de añadirlas a los medios de cultivo.
Las FIGs. 11A-11C muestran que BoNT/Xry no es activo sobre las neuronas. La FIG. 11A muestra neuronas corticales de rata cultivadas expuestas a BoNT/Xry a las concentraciones indicadas. Se analizaron lisados celulares mediante inmunotransferencia. VAMP2 no se escinde, lo que indica que BoNT/Xry no es activo sobre las neuronas. La FIG. 11B muestra el análisis de SDS-PAGE de la expresión de lisado celular y sobrenadante (S/N) de BoNT/Xry (4-12% de BisTris, tampón MOPS). Una banda en 150 kDa que corresponde a BoNT/X es claramente visible tanto en el lisado como en la fracción soluble. La FIG. 11C muestra el análisis de SDS-PAGE de una muestra final de BoNT/Xry altamente purificado (4-12% de BisTris, tampón MOPS). Una única banda en 150 kDa que corresponde a BoNT/X es claramente visible y muestra una pureza ~90%.
Las FIGs. 12A-12F muestran que BoNT/X se une a los cuatro gangliósidos de cerebro. Las FIGs. 12A-12D muestran la unión de BoNT/X (cuadrados) y A-Hc (círculos) a GD1a (FIG. 12A), GT1 b (FIG. 12B), GD1b (FIG. 12C) y GM1 (FIG.
12D), respectivamente. Las curvas corresponden a un promedio de análisis ELISA por triplicado y se ajustaron con Prism7 (software GraphPad). La FIG. 12E muestra un resumen de la unión de BoNT/X a los cuatro gangliósidos en comparación con la unión global de BoNT/A en la FIG. 12F.
Las FIGs. 13A-13D muestran la identificación de los sitios de escisión de X-LC en Ykt6 mediante análisis de espectrometría de masas. Las FIGs. 13A-13D muestran que 10 pg de Ykt6 etiquetada con GST (1-192), con o sin incubación previa con X-LC, se separaron en SDS-PAGE (FIG. 13A). Las bandas de proteína se escindieron tal como se indica y se digirieron mediante quimotripsina. Los péptidos digeridos se desalaron y se analizaron mediante HPLC de fase inversa por medio de una columna C18 acoplada con ESI-MS. Los perfiles de HPLC de GST-Ykt6 sin pretratamiento con X-LC se mostraron en la FIG. 13B, y la muestra pretratada con X-LC se mostró en la FIG. 13C. Un péptido se identificó como que tenía una intensidad ~ 100 veces mayor en las muestras pretratadas con X-LC que en las muestras que no se expusieron a X-LC (indicado con un asterisco). Este péptido se eluyó en 37 min de RT, con m/z = 611 (FIG. 13D), que solo puede ajustar la secuencia peptídica ESLLERGEKLDDLVSK (SEQ ID NO: 87) en Ykt6, lo que indica que este es el péptido ubicado el lado N-terminal del sitio de escisión para X-LC. Por tanto el sitio de escisión es K173-S174 en Ykt6.
Las FIGs. 14A-14E muestran la identificación de los sitios de escisión de X-LC en VAMP4 y VAMP5 mediante análisis de espectrometría de masas. Las FIGs. 14A-14E muestran experimentos llevados a cabo tal como se describe en la FIG. 13, excepto porque se analizaron VAMP4 (FIGs. 14B, 14C) y VAMP5 (FIGs. 14D, 14E). La FIG. 14B es el péptido que marca el sitio N-terminal del sitio de escisión en VAMP4. La secuencia del péptido DELQDK corresponde a SEQ ID NO: 88. La FIG. 14C es el péptido que marca el sitio C-terminal del sitio de escisión en VAMP4. La secuencia del péptido SESLSDNATAF corresponde a SEQ ID NO: 89. La FIG. 14D es el péptido que marca el sitio N-terminal del sitio de escisión en VAMP5. La secuencia del péptido AELQQR corresponde a SEQ ID NO: 90. La FIG. 14E es el péptido que marca el sitio C-terminal del sitio de escisión en VAMP5. La secuencia del péptido SDQLLDMSSTF corresponde a SEQ ID NO: 91. Por tanto, se determinó que los sitios de escisión eran K87-S88 en VAMP4 y R40-S41 en VAMP5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE ALGUNAS REALIZACIONES
Las neurotoxinas de Clostridium botulinum (BoNT) son una familia de toxinas bacterianas producidas por bacterias Clostridium, con siete serotipos ampliamente establecidos (BoNT/A-G)1-3. Son uno de los agentes de bioterrorismo potenciales más peligrosos, clasificados como agente selecto de “categoría A” por el Centro de Control de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos4. Estas toxinas se producen como un único polipéptido y pueden separarse mediante proteasas bacterianas o huésped en una cadena ligera (LC, ~ 50 kDa) y una cadena pesada (Hc, ~ 100 kDa). Las dos cadenas permanecen conectadas por medio de un enlace disulfuro intercatenario. La Hc contiene dos subdominios: el dominio Hn N-terminal que media en la translocación de la LC a través de las membranas endosomales, y el dominio Hc C-terminal que media en la unión a receptores en neuronas. El enlace disulfuro intercatenario se reduce una vez que la LC se transloca al citosol5,6. La LC liberada actúa como proteasa para escindir específicamente un conjunto de proteínas neuronales: BoNT/A, C y E escinden en sitios distintos en una proteína conocida como SNAP-25; BoNT/B, D, F y G escinden en sitios diferentes en una proteína vesicular VAMP; y BoNT/C también escinde una proteína transmembrana sintaxina 11-3. Estas tres proteínas forman un complejo, conocido como complejo SNARE, que es esencial para la liberación de neurotransmisores78. La escisión de una cualquiera de estas tres proteínas SNARE bloquea la liberación de neurotransmisores desde las neuronas, paralizando así los músculos.
Las BoNT son las toxinas más potentes conocidas y provocan la enfermedad humana y animal conocida como botulismo3. La principal forma de botulismo está provocada por la ingesta de alimento contaminado con BoNT (botulismo alimentario). También existen otras formas tal como botulismo infantil, que se debe a la colonización del intestino por bacterias que producen toxinas en lactantes. Las BoNT se producen siempre junto con otra proteína de 150 kDa conocida como NTNHA (proteína no hemaglutinina no tóxica), que forma un complejo dependiendo del pH con las BoNT y protege las BoNT frente a proteasas en el tracto gastrointestinal9. Los genes que codifican BoNT y NTNHA se encuentran en dos tipos de agrupaciones de genes: (1) la agrupación HA, que contiene genes para tres proteínas conservadas HA17, HA33 y HA70, que forman un complejo con BoNT/NTNHA y facilitan la absorción de toxinas a través de la barrera intestinal-epitelial10-12; (2) la agrupación OrfX, que codifica las proteínas conservadas OrfX1, OrfX2, OrfX3 y P47 con funciones desconocidas13.
Dado que las inyecciones locales de cantidades mínimas de toxinas pueden atenuar la actividad neuronal en regiones seleccionadas como diana, las BoNT se han usado para tratar una lista creciente de estados médicos14-16, incluyendo espasmos musculares, dolor crónico, problemas de vejiga hiperactiva, así como para aplicaciones cosméticas. El mercado para las BoNT ya ha superado los 1,5 mil millones de $ en 2011 y se estima que alcanzará los 2,9 mil millones en 2018.
Las BoNT se han determinado tradicionalmente mediante ensayos de neutralización en ratones, inyectando sobrenadante de cultivo de bacterias Clostridium en ratones, con o sin antisueros frente a BoNT conocidas. Los primeros serotipos distinguidos, BoNT/A y BoNT/B, se establecieron en 1919 por Georgina Burke18. El último de los siete tipos, BoNT/G, se reconoció en 1969 a partir de muestras de suelo en Argentina19. No se ha reconocido ningún serotipo nuevo de las BoNT desde 1970. Esta clasificación siguió siendo válida tras determinarse las secuencias de proteína para cada BoNT en la década de 1990. La identidad de secuencia entre dos pares cualquiera entre las siete BoNT oscila entre el 32% y el 65,3%. Las siete BoNT se han identificado y caracterizado antes de la era de su uso médico. Por tanto, no hay ninguna patente sobre ninguna de estas toxinas. Cualquier empresa es libre de producir y comercializar una cualquiera de estas siete BoNT. Entre los siete tipos, BoNT/A y BoNT/B son las dos toxinas que están actualmente aprobadas por la FDA para su uso en humanos14'16. BoNT/A es el tipo dominante usado para aplicaciones tanto médicas como cosméticas, comercializado como Botox de Allergan Inc., Dysport de IPSEN Inc. y Xeomin de Merz Inc. BoNT/B se comercializa como Myobloc por USWorld Med. Hay intereses considerables en desarrollar otros tipos de BoNT como toxinas terapéuticas, por dos motivos principales:
(1) Una limitación principal en el tratamiento es la generación de anticuerpo neutralizante frente a BoNT/A o BoNT/B en pacientes, lo que convierte el tratamiento futuro con la misma toxina en inefectivo20. En este caso, será necesario tratar a los pacientes con un tipo diferente de las BoNT. Este es el motivo por el cual a menudo se utiliza BoNT/B para tratar a pacientes que han generado anticuerpos neutralizantes frente a BoNT/A durante el tratamiento, pero hay una necesidad alternativas de toxinas para pacientes que han generado anticuerpos tanto frente a BoNt /A como frente a BoNT/B.
(2) Aunque todas las BoNT comparten la misma estructura y función, hay también diferencias considerables entre las mismas. Por ejemplo, BoNT/A escinde SNAP-25 y usa una proteína SV2 como su receptor, mientras que BoNT/B escinde VAMP y usa una proteína sinaptotagmina (Syt) como su receptor21-27. Estas variaciones funcionales pueden traducirse en diferencias potenciales en la eficacia terapéutica seleccionando como diana distintos tipos de neuronas. Además, la estabilidad y duración terapéutica también puede ser diferente entre los siete tipos de toxinas. Por tanto, un tipo de toxina diferente puede tener su ventaja con respecto a BoNT/A y BoNT/B.
El rápido progreso en secuenciación genómica en los últimos años ha revelado una diversidad notable de las BoNT2829. En primer lugar, hay múltiples subtipos, que pueden reconocerse mediante el mismo antisuero, pero contienen niveles significativos de variaciones en las secuencias de proteína (2,6%~31,6% de diferencias)2830. Por ejemplo, BoNT/A contiene 8 subtipos conocidos, designados como BoNT/A1 -A813. Además, existen múltiples toxinas mosaico, derivadas probablemente de la recombinación de genes de toxina. Por ejemplo, se notificó un “tipo H” en 2013, pero se reconoció posteriormente como toxina quimérica porque su LC comparte una ~ 80% de identidad con la LC de un subtipo BoNT/F, BoNT/F5, y su He comparte un ~ 84% de identidad con la He de BoNT/A131-34. De manera consistente, esta toxina puede reconocerse y neutralizarse mediante antisueros disponibles frente a BoNT/A33.
La agrupación de genes que codifica las BoNT puede estar en plásmidos, fago bacteriano o cromosomas, lo que indica que los genes de toxina son móviles y están sujetos a transferencia génica horizontal13. Hay también casos en los que una cepa bacteriana de Clostridium contiene dos o incluso tres genes de toxina diferentes32-35-36. En estos casos, una toxina se expresa habitualmente a niveles mayores (designada con una letra mayúscula) que la otra toxina (designada con una letra minúscula). Por ejemplo, las cepas que expresan niveles altos de BoNT/B y niveles bajos de BoNT/F se conocen como cepas BoNT/Bf. Hay también casos en los que una toxina se expresa, pero la otra toxina no se expresa, lo que se conoce como toxina silenciosa (marcada habitualmente con ()). Por ejemplo, un estudio para casos de botulismo infantil en California mostró que el 8% de las cepas eran BoNT/A(B), lo que significa que estas cepas contienen genes tanto para BoNT/A como para BoNT/B, pero solo expresan niveles detectables de BoNT/A37-39.
Como se ilustra en los dibujos y ejemplos de la presente divulgación, se buscó en bases de datos de secuencias genómicas de bacterias Clostridium publicadas y se identificó un gen de BoNT novedoso (designado en lo sucesivo como “BoNT/X”) codificado en el cromosoma de la cepa 111 de Clostridium botulinum. La cepa 111 se aisló por primera vez de un paciente con botulismo infantil en Japón en 199640. Se ha mostrado que la toxicidad de la cepa 111 en ratones puede neutralizarse mediante antisueros de BoNT/B40. Posteriormente se confirmó que esta cepa expresa un subtipo de BoNT/B, BoNT/B2, codificado en un plásmido4142. La secuencia de BoNT/X se depositó en la base de datos PubMed en febrero de 2015, como parte de la secuencia genómica de la cepa 111. BoNT/X no se ha caracterizado antes. Sigue sin conocerse si se expresa en la cepa 111 y si es una toxina funcional.
También se proporciona en el presente documento la caracterización de BoNT/X a niveles funcionales. Se encontró que su LC escinde VAMP en un sitio distinto a los sitios diana conocidos de todas las demás BoNT. Se encontró que la toxina de longitud completa, producida ligando covalentemente fragmentos no tóxicos por medio de sortasa, entra en neuronas cultivadas y escinde VAMP en neuronas, induciendo parálisis flácida en ratones. Finalmente, se encontró que la toxina no se reconoce por antisueros creados frente a las siete BoNT conocidas, estableciendo BoNT/X como un serotipo de BoNT novedoso. Su identificación presenta un reto urgente para desarrollar contramedidas efectivas. También tiene el potencial de desarrollarse para dar una nueva toxina terapéutica y puede usarse para generar toxinas quiméricas con propiedades farmacológicas potencialmente distintas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT)” abarca cualquier polipéptido o fragmento de una neurotoxina botulínica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el término BoNT se refiere a una BoNT de longitud completa. En algunas realizaciones, el término BoNT se refiere a un fragmento de la BoNT que puede ejecutar el mecanismo celular global mediante el cual una BoNT entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores. En algunas realizaciones, el término BoNT se refiere simplemente a un fragmento de la BoNT, sin requerir que el fragmento tenga ninguna función o actividad específica. Por ejemplo, un polipéptido de BoNT puede hacer referencia a la cadena ligera (LC) de una BoNT, por ejemplo, BoNT/X. Otros términos que pueden usarse a lo largo de la presente divulgación para “neurotoxinas botulínicas clostridiales” pueden ser BoNT, toxinas botulínicas o toxinas de C. botulinum. Debe entenderse que estos términos se usan de manera intercambiable. “BoNT/X” se refiere al serotipo de BoNT novedoso descrito y caracterizado en la presente divulgación. También se proporciona la secuencia de proteína BoNT/X (GenBank n.° BAQ12790.1; cuatro cisteínas están subrayadas y en negrita):
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNTNDLNIPSEPIME
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KTNWYFIPKDEGWDED (SEQ ID NO: 1)
Una “neurotoxina botulínica clostridial (BoNT) modificada” abarca una BoNT que comprende cualquier modificación en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, truncamiento, adición, sustitución de aminoácido y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, un BoNT/X que comprende mutaciones de sustitución de aminoácido en C461 o C467 es una BoNT modificada. En otro ejemplo, un fragmento o un dominio de la BoNT de longitud completa (por ejemplo, el dominio de proteasa, o LC) se considera una BoNT modificada. En algunas realizaciones, un dominio de la BoNT también puede comprender mutaciones de sustitución de aminoácido, por ejemplo, un dominio de proteasa que comprende mutaciones de sustitución en las posiciones C461 o C467 de BoNT/X.
El término “entra en una célula” cuando se usa para describir la acción de una BoNT de la presente divulgación, abarca la unión de una BoNT a un complejo receptor de baja o alta afinidad, la unión de una BoNT a gangliósido, la internalización de la toxina, la translocación de la cadena ligera de la toxina al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de BoNT.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio de proteasa de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT)” es sinónimo a “cadena ligera (LC)”. El dominio de proteasa de BoNT está ubicado en la cadena ligera de la BoNT y, por tanto, también se denomina LC. El término significa un dominio de BoNT que puede ejecutar la etapa de modificación de diana enzimática del proceso de intoxicación. Si se hace referencia a la LC de un serotipo de BoNT específico, se usa el término “serotipo-LC”. Por ejemplo, “X-LC” significa el polipéptido de LC de BoNT/X. Un dominio de proteasa de BoNT selecciona específicamente como diana un sustrato de toxina C. botulinum y abarca la escisión proteolítica de un sustrato de toxina C. botulinum, tal como, por ejemplo, proteínas SNARE tal como un sustrato de SNAP-25, un sustrato de VAMP y un sustrato de sintaxina. En BoNT (por ejemplo, BoNT/X, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, etc.). Se considera que el dominio de proteasa o la LC corresponde a aproximadamente el aminoácido 1-439 de BoNT/X. El límite del dominio puede variar en aproximadamente 25 aminoácidos. Por ejemplo, el dominio de proteasa puede corresponder a los aminoácidos 1-414 o 1-464 de BoNT/X. En algunas realizaciones, el dominio de proteasa puede corresponder a los aminoácidos 1-438, 1-437, 1-436, 1-435, 1-434, 1-433, 1-432, 1-431, 1-430, 1-429, 1-439, 1 -440, 1 -441, 1 -442, 1 -443, 1 -444, 1 -445, 1 -446, 1 -447, 1 -448 o 1 -449 de BoNT/X.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio de translocación de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT)” es sinónimo a “dominio Hn” y significa un dominio de BoNT que puede ejecutar la etapa de translocación del proceso de intoxicación que media en la translocación de cadena ligera de BoNT. Por tanto, una Hn facilita el movimiento de una cadena ligera de BoNT a través de una membrana al interior del citoplasma de una célula. Los ejemplos no limitativos de una Hn incluyen Hn de BoNT/A, una Hn de BoNT/B, una Hn de BoNT/Cl, una Hn de BoNT/D, una Hn de BoNT/E, una Hn de BoNT/F, una Hn de BoNT/G y una Hn de BoNT/X. El dominio de translocación está ubicado en el extremo N-terminal de la cadena pesada (Hc), y por tanto se denomina también Hn. Debe entenderse que estos términos se usan de manera intercambiable en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “región ligadora” se refiere a la secuencia de aminoácidos entre el dominio de proteasa de BoNT y el dominio de translocación. El ligador comprende dos cisteínas en la posición 461 y 467, una de las cuales forma un enlace disulfuro intermolecular con una cisteína en el dominio de proteasa, C423 (enlace disulfuro C461-C423 o enlace disulfuro C467-C423). La formación de este enlace disulfuro es esencial para la actividad de BoNT/X.
Tal como se usa en el presente documento, el término “LC-Hn” se refiere a un polipéptido de BoNT que abarca el dominio de proteasa, la región ligadora y el dominio de translocación. Si se hace referencia al LC-Hn de un serotipo de BoNT especifico, se usa el término “serotipo-LC-HN”. Por ejemplo, “X-LC-Hn” significa el polipéptido LC-Hn de BoNT/X. Se considera que el polipéptido LC-Hn corresponde a aproximadamente el aminoácido 1-892 de BoNT/X. El límite de dominio puede variar en aproximadamente 25 aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido LC-Hn puede corresponder a aproximadamente el aminoácido 1-917 o 1-867 de BoNT/X. En algunas realizaciones, el polipéptido LC-Hn puede corresponder a los aminoácidos 1-893, 1-894, 1-895, 1-896, 1-897, 1-898, 1-899, 1-900, 1-901, 1-902, 1-892, 1-891, 1-890, 1-889, 1-888, 1-887, 1-886, 1-885, 1-884 o 1-883 de BoNT/X.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio de unión a receptor de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT)” es sinónimo a “dominio Hc” y significa cualquier dominio de unión a receptor de BoNT que se produce de manera natural que puede ejecutar la etapa de unión a célula del proceso de intoxicación, incluyendo, por ejemplo, la unión de la BoNT a un sistema de receptor específico de BoNT ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a dominios de unión a receptor de BoNT modificados del serotipo X (BoNT/X). En algunas realizaciones, un “dominio de unión a receptor de BoNT/X modificado” comprende sustituciones de aminoácido en una posición que corresponde a C1240 en BoNT/X (SEQ ID NO: 1). Se considera que el dominio de unión a receptor, o la Hc, corresponde a aproximadamente el aminoácido 893­ 1306 de BoNT/X. El límite de dominio puede variar en aproximadamente 25 aminoácidos. Por ejemplo, el dominio de unión a receptor o Hc puede corresponder a los aminoácidos 868-1306 o 918-1306. En algunas realizaciones, el dominio de unión a receptor o Hc puede corresponder a los aminoácidos 893-1306, 894-1306, 895-1306, 896-1306, 897-1306, 898-1306, 899-1306, 900-1306, 901-1306, 902-1306, 892-1306, 891-1306, 890-1306, 889-1306, 888-1306, 887-1306, 886-1306, 885-1306, 884-1306 o 883-1306 de BoNT/X.
Con “aislado” quiere decirse un material que está libre de grados variables de componentes que lo acompañan normalmente tal como se encuentra en su estado nativo. “Aislado” indica un grado de separación de la fuente original o de los entornos, por ejemplo, de una célula o de ADN flanqueante o de la fuente natural del ADN. El término “purificado” se usa para hacer referencia a una sustancia, tal como un polipéptido, que es “sustancialmente pura”, con respecto a otros componentes de una preparación (por ejemplo, otros polipéptidos). Puede hacer referencia a un polipéptido que es puro en al menos aproximadamente el 50%, el 60%>, el 70%> o el 75%, preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, con respecto a otros componentes. Los términos “sustancialmente puro” o “esencialmente purificado”, con respecto a un polipéptido, se refieren a una preparación que contiene menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 15%, el 10%, el 8%, el 7%, lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1% o menos del 1%, de uno o más de otros componentes (por ejemplo, otros polipéptidos o componentes celulares).
El término “mutación de sustitución” sin la referencia a un aminoácido específico, puede incluir cualquier aminoácido distinto del residuo de tipo silvestre encontrado normalmente en esa posición. Tales sustituciones pueden ser reemplazo con aminoácidos no polares (hidrófobos), tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y prolina. Las sustituciones pueden ser reemplazo con aminoácidos polares (hidrófilos) tales como serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Las sustituciones pueden ser reemplazo con aminoácidos cargados eléctricamente, por ejemplo, aminoácidos cargados eléctricamente de manera negativa tales como ácido aspártico y ácido glutámico, y aminoácidos cargados eléctricamente de manera positiva tales como lisina, arginina e histidina.
Las mutaciones de sustitución descritas en el presente documento serán normalmente reemplazo con un residuo de aminoácido que se produce de manera natural diferente, pero en algunos casos también pueden sustituirse residuos de aminoácido que no se producen de manera natural. Aminoácidos no naturales, tal como se usa el término en el presente documento, son aminoácidos no proteinogénicos (es decir, que con codifican proteínas) que o bien se producen de manera natural o bien se sintetizan químicamente. Los ejemplos incluyen p-aminoácidos (p3 y p2), homoaminoácidos, derivados de prolina y ácido pirúvico, derivados de alanina 3-sustituidos, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina sustituidos en anillo, aminoácidos de núcleo lineales, diaminoácidos, D-aminoácidos y N-metilaminoácidos. En algunas realizaciones, el aminoácido puede estar sustituido o no sustituido. El aminoácido sustituido o sustituyente puede ser un aminoácido aromático o alifático halogenado, una modificación alifático o aromática halogenada en la cadena lateral hidrófoba, o una modificación alifática o aromática.
El “porcentaje de identidad” de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteicas de interés. Cuando existen huecos entre dos secuencias, puede utilizarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
La presente invención proporciona polipéptidos de BoNT aislados, comprendiendo el polipéptido de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT) aislado una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 3, comprendiendo opcionalmente el polipéptido de BoNT aislado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y no reaccionando de manera cruzada el polipéptido de BoNT con un anticuerpo frente al serotipo A, B, C, D, E, F o G de BoNT.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado es un polipéptido de BoNT/X de longitud completa. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado es un polipéptido X-LC-HN. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNt aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado es un polipéptido X-LC. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En la presente invención, el polipéptido de BoNT aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 3. En la presente invención, el polipéptido de BoNT aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
El polipéptido X-LC puede introducirse solo en células en las que se desea la escisión de un sustrato de BoNT (por ejemplo, una proteína SNARE) con un propósito de investigación o terapéutico, mediante cualquier técnica conocida de expresión de una proteína exógena en la técnica, por ejemplo, transfección de secuencia codificante de LC directamente en células, por medio de vectores lentivirales, por medio de vectores AAV o fusionando X-LC con péptidos que penetran en la célula).
En algunas realizaciones, los polipéptidos de BoNT de la presente divulgación es un BoNT/X de longitud completa que comprende un dominio de proteasa (LC), una región ligadora, un dominio de translocación (Hn) y un dominio de unión a receptor (Hc), estando ubicada la región ligadora entre el dominio de proteasa y el dominio de translocación. Como otras BoNT, BoNT/X se produce inicialmente como un único polipéptido y se activa por medio de la escisión de la región ligadora entre LC y HN de proteasas o bien bacterianas o bien huésped. Este proceso se conoce como “activación” y es esencial para la actividad de BoNT/X. Tras la escisión, la LC y la Hn permanecen conectadas por medio de un enlace disulfuro intercatenario antes de la translocación de LC al citosol de células, donde se reduce el enlace disulfuro con el fin de liberar la LC al citosol. BoNT/X contiene dos cisteínas que están conservadas en comparación con otras BoNT, C423 y C467. De manera interesante, BoNT/X contiene también una cisteína adicional (C461), que es única para BoNT/X. Se requiere la formación del enlace disulfuro intercatenario (C423-C461 o C423-C467) para la actividad de BoNT/X.
Además de las cisteínas en la región ligadora, el dominio de unión a receptor de BoNT contiene otra cisteína, C1240, que también puede formar enlaces disulfuro intermoleculares con otras cisteínas en BoNT/X. Estos enlaces disulfuro intermoleculares provocan que BoNT/X se agregue y desestabilice la proteína (FIG. 4B). Reemplazar las cisteínas que no se requieren para la actividad de BoNT/X puede producir polipéptidos BoNT/X con estabilidad aumentada.
Por consiguiente, algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan un polipéptido de BoNT/X modificado que comprende una o más mutaciones de sustitución en C461, C467 o C1240, que son más estables que el BoNT/X de tipo silvestre y tiene actividades comparables. Las cisteínas pueden estar sustituidas con cualquier aminoácido que suprima la formación de enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, las cisteínas están sustituidas con serina (S) o alanina (A). Posibles combinaciones de mutaciones de sustitución que pueden estar presentes en las BoNT modificadas de la presente divulgación son, sin limitación: C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C461A/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240A, C467S/C1240S, C467A/C1240S, C467S/C1240A y C467A/C1240A. “/” indica mutaciones dobles. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-17. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos el 85% con una cualquiera de SEQ ID NO: 4-17, y no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT/X modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-17, y no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-17, y no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-17.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modificado de la presente divulgación es un polipéptido BoNT/X-LC-HN modificado que comprende las mutaciones de sustitución descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el BoNT/X-LC-Hn modificado comprende una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el BoNT/X-LC-Hn modificado comprende una única mutación de sustitución que corresponde a C461A, C461S, C467A o C467S en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT/X modificado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21. En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X-LC-Hn modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos el 85% con una cualquiera de SEQ ID NO: 18-21, y no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, el polipéptido BoNT/X-LC-HN modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21, y no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X-LC-Hn modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21, y no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X-LC-Hn modificado consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21.
El polipéptido de BoNT modificado que comprende una o más mutaciones de sustitución (por ejemplo, en C461, C467 o C1240) descritas en el presente documento no forma enlaces disulfuro intermoleculares que provoquen la agregación de la proteína y por tanto son más estables que sus proteínas de tipo silvestre correspondientes. La actividad de los polipéptidos de BoNT no se ve afectada por las mutaciones de sustitución en las cisteínas. Por tanto, el BoNT/X modificado puede ser más adecuado para uso terapéutico que el BoNT/X de tipo silvestre debido a su estabilidad aumentada.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan BoNT quiméricas que comprenden el BoNT/X-LC-Hn descrito en el presente documento y el dominio de unión a receptor (Hc) de una BoNT diferente. Por ejemplo, el dominio de unión a receptor puede ser de una cualquiera de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G. Por tanto, las BoNT quiméricas contempladas en el presente documento incluyen BoNT/X-LC-Hn-A-Hc, BoNT/X-LC-Hn-B-Hc, BoNT/X-LC-Hn-C-Hc, BoNT/X-LC-Hn-D-Hc, BoNT/X-LC-Hn-E-Hc, BoNT/X-LC-Hn-F-Hc y BoNT/X-LC-Hn-G-Hc . Debe entenderse que el dominio Hc de cualquier subtipo de los siete serotipos conocidos (por ejemplo, A, B, C, D, E, F o G) es adecuado para la toxina quimérica. Cuando se hace referencia a BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G, abarca todos los subtipos. Por ejemplo, BoNT/A tiene 8 subtipos, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, BoNT/A5, BoNT/A6, BoNT/A7 o BoNT/A8, y la Hc de una cualquiera de estos subtipos de BoNT/A es adecuada para su uso en la BoNT quimérica de la presente divulgación. De manera similar, la Hc de uno cualquiera de los 8 subtipos de BoNT/B, es decir, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6, BoNT/B7 o BoNT/B8, es adecuada para su uso en la BoNT quimérica de la presente divulgación.
En algunas realizaciones, se proporcionan BoNT/X-LC-Hn-A1-Hc (SEQ ID NO: 22), BoNT/X-LC-Hn-B1-Hc (SEQ ID NO: 23) y BoNT/X-LC-Hn-C1-Hc (SEQ ID NO: 24). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos el 85% con una cualquiera de SEQ ID NO: 22-24. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT quimérico puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24.
En algunas realizaciones, la BoNT quimérica de la presente divulgación comprende un BoNT/X-LC-Hn modificado que comprende una mutación de sustitución en la región ligadora, por ejemplo, en una posición que corresponde a C461 0 C467 de SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, el BoNT/X-LC-Hn en la BoNT quimérica puede comprender una mutación de sustitución que corresponde a c 461A, C467A, C461S o C467S de SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT quimérico de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos el 85% con una cualquiera de SEQ ID NO: 25-30. Por ejemplo, el polipéptido de BoNT quimérico puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-30.
Para generar las toxinas quiméricas, por ejemplo, la toxina BoNT/X-LC-Hn-A1-Hc, el fragmento de X-LC-Hn que comprende el aminoácido de aproximadamente 1-892 (SEQ ID NO: 2) se fusiona al dominio de unión a receptor de uno cualquiera de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G. El dominio de unión a receptores de diferentes BoNT corresponde a los aminoácidos de aproximadamente 860-1291 de BoNT/B1. Debe entenderse que el límite del fragmento de X-LC-Hn y/o los dominios de unión a receptor puede variar en 1-25 aminoácidos. Por ejemplo, el fragmento de X-LC-HN que puede usarse para la toxina quimérica puede comprender los aminoácidos 1-917 o 1 -867 de BoNT/X. En algunas realizaciones, el fragmento de X-LC-Hn que puede usarse para la toxina quimérica puede comprender los aminoácidos 1-893, 1-894, 1-895, 1-896, 1-897, 1-898, 1-899, 1-900, 1-901, 1 -902, 1 -892, 1 -891, 1 -890, 1 -889, 1 -888, 1 -887, 1 -886, 1 -885, 1 -884 o 1 -883 de BoNT/X. De manera similar, la unión a receptor que puede usarse para la toxina quimérica puede comprender el aminoácido que corresponde a 885-1291 o 835-1291 de BoNT/X. En algunas realizaciones, la unión a receptor que puede usarse para la toxina quimérica puede comprender el aminoácido que corresponde a 860-1291, 861 -1291, 862-1291, 863-1291, 864-1291, 865-1291, 866-1291,867-1291,868-1291,869-1291,870-1291,860-1291,859-1291,858-1291,857-1291,856-1291,855-1291,854-1291, 853-1291, 852-1291 o 851 -1291 de BoNT/B. El experto en la técnica es capaz de identificar los dominios que pueden usarse para la toxina quimérica de la presente divulgación, basándose en su conocimiento en la homología de proteínas, con o sin la asistencia de un software de alineación de secuencias. Los métodos de fusión de los fragmentos son técnicas recombinantes estándar que son ampliamente conocidas para un experto en la técnica.
En el presente documento se contemplan además polipéptidos de BoNT/X modificados que comprenden una región ligadora modificada, comprendiendo la región ligadora un sitio de escisión de proteasa específico. Un “sitio de escisión de proteasa específico” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sitio de reconocimiento y de escisión para una proteasa específica, en oposición a una secuencia que se reconoce y se escinde por más de una proteasa no específica. Tales proteasas específicas incluyen, sin limitación: trombina, TEV, PreScission, factor Xa, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20, granzima-B y enteroquinasa. El sitio de escisión de las proteasas específicas puede añadirse a la región ligadora del polipéptido de BoNT/X por medio de inserción o reemplazo de los aminoácidos existentes en la región ligadora (por ejemplo, reemplazar los aminoácidos 424-460 del polipéptido de BoNT/X). También se proporcionan las secuencias de las secuencias de los sitios de escisión de proteasa específicos: LVPR|GS (trombina, SEQ ID NO: 50), ENLYFQ|G (TEV, SEQ ID NO: 51), LEVLFQ|GP (PreScission, SEQ ID NO: 52), IEGR| o IDGR| (factor Xa, SEQ ID NO: 53 o 54), DDDDK| (enteroquinasa, SEQ ID n O: 55) y AHREQIGG| (proteasa SUMO, SEQ ID NO: 56). “|” indica donde se produce la escisión.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan la caracterización funcional de los polipéptidos de BoNT/X. Los polipéptidos de BoNT/X, polipéptidos de BoNT/X modificados y los polipéptidos de BoNT quiméricos de la presente divulgación pueden unirse a y entrar en las células diana, por ejemplo, neuronas, y escindir sus proteínas de sustrato, por ejemplo proteínas SNARE. El término “proteínas SNARE,” tal como se usa en el presente documento, se refiere a receptores SNAP (proteína de unión a NSF soluble), que es una superfamilia de proteínas grande que consiste en más de 60 miembros en células de levadura y de mamífero. El papel primario de las proteínas SNARE es median en la fusión vesicular, es decir, la fusión de vesículas con sus compartimentos unidos a membrana diana (tal como un lisosoma). Las proteínas SNARE mejor estudiadas son aquellas que median en el acoplamiento de vesículas sinápticas con la membrana presináptica en neuronas, por ejemplo, SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, VAMP7, VAMP8, sintaxina 1 y Ykt6. Varias de estas proteínas SNARE son sustratos de las BoNT. Por ejemplo, se ha mostrado que VAMP1, VAMP2, VAMP3, SNAP-25 y sintaxina 1 se escinden mediante BoNT conocidas, por ejemplo, BoNT/A y BoNT/B.
En el presente documento se proporcionan datos que muestran que BoNT/X escinde las proteínas SNARE que son sustratos conocidos de las BoNT. Un hallazgo sorprendente de la presente divulgación es que BoNT/X es capaz de escindir varias proteínas SNARE que otras BoNT no son capaces de escindir, por ejemplo, VAMP4, VAMP5 y Ykt6. VAMP4 se expresa ampliamente y se conoce que media en la fusión vesicular entre la red trans-Golgi (TGN) y endosomas, así como en la fusión homotípica de endosomas. Se conoce que las BoNT tradicionalmente están limitadas a SNARE diana que median en la exocitosis vesicular sobre membranas plasmáticas. BoNT/X es la primera BoNT que es capaz de escindir SNARE que median en eventos de fusión de otro tipo dentro de células que no están con membrana plasmática como destina. VAMP4 también puede contribuir a la exocitosis vesicular sináptica asíncrona, exocitosis de vesícula a gran escala y endocitosis masiva dependiente de la actividad (ADBE) en neuronas. Además, se ha implicado a VAMP4 en la liberación de gránulos en células inmunitarias. Por tanto, BoNT/X puede tener un potencial único entre todas las BoNT para modular la secreción inflamatoria en células inmunitarias, lo que puede aprovecharse terapéuticamente. VAMP5 se expresa principalmente en músculos y su función sigue estando por establecer. BoNT/X será una herramienta única para investigar la función de VAMP4 y VAMP5. Ykt6 funciona en el retículo endoplasmático para el transporte de Golgi. También funciona en el endosoma temprano/de reciclaje para el transporte TGN. La identificación de Ykt6 como sustrato de los polipéptidos de BoNT descritos en el presente documento es significativa porque abre una nueva aplicación terapéutica para bloquear la secreción en una amplia gama de células mediante BoNT.
Otro hallazgo sorprendente de la presente divulgación es que BoNT/X escinde las proteínas SNARE en un sitio novedoso que no se había descrito previamente. Como se ilustra en los ejemplos y las figuras de la presente divulgación, BoNT/X escinde entre los aminoácidos R66-S67 en VAMP1, VAMP2 y VAMP3. R66-A67 es un sitio de escisión novedoso distinto de los sitios diana establecidos para todas las demás BoNT/X (FIG. 2F). También es el único sitio de escisión de BoNT ubicado dentro de una región conocida previamente como motivo SNARE (FIG. 2F).
Por consiguiente, los polipéptidos de BoNT de la presente divulgación han expandido el perfil de los sustratos y células diana. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde una proteína SNARE en la célula. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde una proteína SNARE seleccionada del grupo que consiste en: SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6 y sintaxina 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP 1 (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP1 entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP2 (SEQ ID NO: 40). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP2 entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP3 (SEQ ID NO: 31). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP3 entre los residuos de aminoácido que corresponden a R66 y A67 de SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP4 (SEQ ID NO: 42). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP4 entre los residuos de aminoácido que corresponden a K87 y S88 de SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP5 (SEQ ID NO: 43). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde VAMP5 entre los residuos de aminoácido que corresponden a R40 y S41 de SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde Ykt6 (SEQ ID NO: 44). En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT escinde Ykt6 entre los residuos de aminoácido que corresponden a K173 y S174 de SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT de la presente divulgación escinde una proteína SNARE en una célula diana. Tal como se usa en el presente documento, una “célula diana” significa una célula que es una célula que se produce de manera natural en la que BoNT es capaz de entrar o que la puede intoxicar. En algunas realizaciones, una célula diana es una célula secretora, por ejemplo, una neurona o una célula inmunitaria secretora. Los ejemplos de neuronas que pueden ser células diana de BoNT incluyen, sin limitación, neuronas motoras; neuronas sensoriales; neuronas autónomas; tal como, por ejemplo, neuronas simpáticas y neuronas parasimpáticas; neuronas no peptidérgicas, tales como, por ejemplo, neuronas colinérgicas, neuronas adrenérgicas, neuronas noradrenérgicas, neuronas serotonérgicas, neuronas GABAérgicas; y neuronas peptidérgicas, tales como, por ejemplo, neuronas de sustancia P, neuronas de péptido relacionado con el gen de la calcitonina, neuronas de péptido intestinal vasoactivo, neuronas de neuropéptido Y, neuronas de colecistoquinina.
El polipéptido de BoNT de la presente divulgación, por ejemplo, el BoNT/X o el polipéptido BoNT/X modificado, es capaz de selecciona como diana otros tipos de células secretoras distintos de las neuronas, debido a su capacidad para escindir VAMP4 o Ykt6. En algunas realizaciones, la célula secretora seleccionada como diana por el polipéptido de BoNT es una célula inmunitaria secretora. Una “célula inmunitaria secretora,” tal como se usa en el presente documento, se refiere a células inmunitarias que secretan citocinas, quimiocinas o anticuerpos. Tales células inmunitarias secretoras pueden ser células inmunitarias innatas que incluyen, sin limitación, células asesinas naturales, mastocitos, eosinófilos, basófilos, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas. Las células inmunitarias secretoras que secretan anticuerpos (por ejemplo, glóbulos blancos) también pueden seleccionarse como diana por los polipéptidos de BoNT de la presente divulgación. Los ejemplos no limitativos de células que secretan anticuerpos incluyen, sin limitación, células B plasmáticas, plasmocitos, plasmacitos y células B efectoras. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula cultivada, por ejemplo, una neurona cultivada o una célula inmunitaria secretora cultivada. En algunas realizaciones, la célula diana está in vivo. En algunas realizaciones, la célula diana es de un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En realizaciones, el mamífero es un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata.
En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT suprime la actividad neuronal. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT modula la respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT induce parálisis flácida. “Parálisis flácida” se refiere a una manifestación clínica caracterizada por debilidad o parálisis y un tono muscular reducido sin otra causa obvia (por ejemplo, traumatismo).
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan polipéptidos de BoNT/X modificados que comprenden un dominio de proteasa inactivo. Tales polipéptidos de BoNT/X (también denominados en el presente documento “BoNT/X inactivo”) pueden entrar en las células diana, pero no pueden escindir las proteínas sustrato (por ejemplo, una proteína SNARE) debido a la inactivación del dominio de proteasa. En algunas realizaciones, el BoNT/X inactivo es un fragmento de X-LC-Hn que comprende: a) un dominio de proteasa inactivo; b) una región ligadora; y c) un dominio de translocación. En algunas realizaciones, el BoNT/X inactivo es un polipéptido de BoNT/X de longitud completa que comprende: a) un dominio de proteasa inactivo; b) una región ligadora; c) un dominio de translocación; y d) un dominio de unión a receptor. En algunas realizaciones, el dominio de proteasa inactivo comprende una o más mutaciones de sustitución en una posición que corresponde a R360, Y363, H227, E228 o H231 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones de sustitución corresponden a R360A/Y363F, H227Y, E228Q o H231Y en SEQ ID NO: 1. Debe entenderse que el polipéptido de BoNT/X inactivo puede comprender cualquier mutación que inactive el dominio de proteasa.
En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X inactivo comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 31-38. En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X inactivo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos el 85% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 31 -38. Por ejemplo, el polipéptido BoNT/X inactivo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 31-38. En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X inactivo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99%, del 99,5% o del 100% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 31-38. En algunas realizaciones, el polipéptido BoNT/X inactivo consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 31 -38.
En algunas realizaciones, el BoNT/X inactivo (por ejemplo, X-LC-Hn inactivo o BoNT/X de longitud completa inactivo) comprende además mutaciones en la región ligadora. En algunas realizaciones, la modificación en la región ligadora comprende una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la única mutación de sustitución corresponde a C461A, C461S, C467A o C467S en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el BoNT/X inactivo (por ejemplo, el BoNT/X de longitud completa inactivo) comprende además una modificación en el dominio de unión a receptor. En algunas realizaciones, la modificación en el dominio de unión a receptor comprende una mutación de sustitución en una posición que corresponde a C1240 de SEQ ID NO: 1.
También se prevé que el polipéptido de BoNT/X modificado que comprende un dominio de proteasa inactivo descrito en el presente documento puede utilizarse como herramienta de suministro para células diana (por ejemplo, neuronas) en humanos. Por ejemplo, el BoNT/X modificado puede ligarse a otros agentes terapéuticos, covalente o no covalentemente, y actúa como vehículo de selección como diana para suministrar los agentes terapéuticos a células diana en humanos.
Como tal, otro aspecto de la divulgación se refiere a una molécula polipeptídica quimérica que comprende una primera porción que es un BoNT/X inactivo, que comprende una o más mutaciones de sustitución que inactivan el dominio de proteasa, ligada a una segunda porción. La segunda porción de la molécula puede ser una molécula bioactiva tal como un agente terapéutico (por ejemplo, un fármaco polipeptídico o no polipeptídico). La ligación de las porciones primera y segunda de la molécula puede ser covalente (por ejemplo, en forma de una proteína de fusión) o no covalente. Métodos de tal ligación se conocen en la técnica y pueden aplicarse fácilmente por el profesional experto. Cuando la segunda porción de la molécula quimérica es un polipéptido y la molécula quimérica está en forma de una proteína, se proporcionan ácidos nucleicos y vectores de ácido nucleico que codifican tales moléculas quiméricas.
También se proporcionan células que comprenden los ácidos nucleicos o vectores de ácido nucleico, y células que expresan tales moléculas quiméricas. Las moléculas quiméricas en forma de proteína de fusión pueden expresarse y aislarse usando los métodos dados a conocer en el presente documento.
Los polipéptidos de BoNT/X modificados, los polipéptidos de BoNT quiméricos o las moléculas quiméricas que comprenden una segunda porción que es un polipéptido de la presente divulgación (por ejemplo, sin limitación, polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-38), se producirán generalmente mediante la expresión de ácidos nucleicos recombinantes en células apropiadas (por ejemplo, E. co lio células de insecto) y se aislarán. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos descritos en el presente documento pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos determinarse, mediante cualquier método conocidos en la técnica.
En el presente documento se proporcionan además ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos de BoNT dados a conocer en el presente documento. Los ácidos nucleicos que codifican los fragmentos de polipéptido aislados de la presente divulgación pueden ser ADN o ARN, bicatenarios o monocatenarios. En ciertos aspectos, se entiende además que los ácidos nucleicos objeto que codifican los fragmentos de polipéptido aislados incluyen ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son variantes de un cualquiera de los polipéptidos de BoNT modificados descritos en el presente documento.
Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótido, tales como variantes alélicas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente divulgación que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-38. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente divulgación que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, del 86%, del 87%, del 88%, del 89%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98%, del 99% o del 100% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-38.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico está comprendido dentro de un vector, tal como un vector de expresión. En algunas realizaciones, el vector comprende un promotor ligado operativamente al ácido nucleico.
Pueden usarse una variedad de promotores para la expresión de los polipéptidos descritos en el presente documento, incluyendo promotor temprano intermedio de citomegalovirus (CMV), una LTR viral tal como la LTR del virus de sarcoma de Rous, HIV-LTr , HTLV-1 LTR, el promotor temprano del virus del simio 40 (SV40), promotor lac UV5 de E. coli y el promotor del virus del herpes simple tk. También pueden usarse promotores regulables. Tales promotores regulables incluyen aquellos que usan el represor lac de E. coli como modulador de la transcripción para regular la transcripción de promotores de células de mamífero que portan el operador lac [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], aquellos que usan el represor de tetraciclina (tetR) [Gossen, M., y Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et a l, Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et a l, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)].
Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 que usan astradiol, RU486, difenol murislerona o rapamicina. Sistemas inducibles están disponibles de Invitrogen, Clontech y Ariad. Pueden usarse promotores regulables que incluyen un represor con el operón. En una realización, el represor lac de Escherichia coli puede funcionar como modulador transcripcional para regular la transcripción de promotores de células de mamífero que portan el operador lac [M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen y Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)] combinando el represor de tetraciclina (tetR) con el activador de la transcripción (VP 16) para crear una proteína de fusión de tetR-activador de la transcripción de células de mamífero, tTa (tetR-VP 16), con el promotor mínimo que porta tetO derivado del promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (HCMV) para crear un sistema operador tetR-tet para controlar la expresión génica en células de mamífero. En una realización se usa un conmutador inducible de tetraciclina (Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et a l, Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et a l, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)).
Adicionalmente, el vector puede contener, por ejemplo, alguno o todos de los siguientes: un gen marcador seleccionable, tal como el gen de neomicina para la selección de transfectantes estables o transitorios en células de mamífero; secuencias de potenciador/promotor del gen temprano inmediato de CMV humano para altos niveles de transcripción; terminación de la transcripción y señales de procesamiento de ARN de SV40 para la estabilidad del ARNm; orígenes de replicación de polioma-SV40 y ColE1 para una replicación episomal apropiada; sitios de unión a ribosoma internos (IRES), sitios de clonación múltiple versátiles; y promotores de ARN de T7 y SP6 para la transcripción in vitro de ARN sentido y antisentido. Los vectores y métodos adecuados para producir vectores que contienen transgenes se conocen ampliamente y están disponibles en la técnica.
Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico puede transferirse a una célula huésped mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal y precipitación de fosfato de calcio) y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir los polipéptidos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la expresión de los polipéptidos descritos en el presente documento se regula mediante un promotor constitutivo, uno inducible o un específico de tejido.
Las células huésped usadas para expresar los polipéptidos aislados descritos en el presente documento pueden ser o bien células bacterianas tales como Escherichia coli, o bien preferiblemente células eucariotas. En particular, células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor de gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para inmunoglobulinas (Foecking et al. (1986) “Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors”, Gene 45:101 -106; Cockett et al. (1990) “High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification”, Biotechnology 8:662-667). Pueden utilizarse una variedad de sistemas de expresión de huésped-vector para expresar los polipéptidos aislados descritos en el presente documento. Tales sistemas de expresión de huésped representan vehículos mediante los que las secuencias codificantes de los polipéptidos aislados descritos en el presente documento pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar los polipéptidos aislados descritos en el presente documento in situ. Estos incluyen microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o vectores de expresión de ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes para los polipéptidos aislados descritos en el presente documento; levadura (por ejemplo, Saccharomyces pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican los polipéptidos aislados descritos en el presente documento; sistemas de célula de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baclovirus) que contienen las secuencias que codifican los polipéptidos aislados descritos en el presente documento; sistemas de célula vegetal infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican los polipéptidos aislados descritos en el presente documento; o sistemas de célula de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfocíticas (véase la patente estadounidense n.° 5.807.715), células Per C.6 (células retinianas humanas desarrolladas por Crucell) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus vaccinia 7.5K).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente un número de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para los polipéptidos que están expresándose. Por ejemplo, cuando debe producirse una gran cantidad de una proteína de este tipo, para la generación de composiciones farmacéuticas de polipéptidos descritos en el presente documento, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen el vector de expresión de E. co lipUR278 (Rüther et al. (1983) “Easy Identification Of cDNA Clones”, EMBO J. 2:1791 -1794), en el que la secuencia codificante puede ligarse individualmente al el vector en marco con la región codificante de lac Z de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye et al. (1985) “Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia col!’, Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) “Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia col!’, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de perlas de glutatiónagarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre.
Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de trombina o factor Xa de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto GST. En un sistema de insecto, se usa virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).
En células huésped de mamífero pueden utilizarse un número de sistemas de expresión de base viral. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/translación de adenovirus, por ejemplo, la secuencia de promotor tardío y líder tripartito. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan et al. (1984) “Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación tiene que estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control traduccional exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos.
La eficiencia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase Bitter et al. (1987) “Expression And Secrection Vectors For Yeast”, Methods in Enzymol. 153:516-544). Además, puede elegirse una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y el procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los polipéptidos descritos en el presente documento pueden expresarse como un único producto génico (por ejemplo, como una única cadena polipeptídica, es decir, como precursor de poliproteína), requiriendo escisión proteolítica mediante mecanismos celulares nativos o recombinantes para formar polipéptidos separados descritos en el presente documento.
Por tanto, la divulgación abarca la modificación mediante ingeniería de una secuencia de ácido nucleico para codificar una moléculas precursora de poliproteína que comprende los polipéptidos descritos en el presente documento, que incluye secuencias codificantes capaces de dirigir la escisión postraduccional de dicho precursor de poliproteína. La escisión postraduccional del precursor de poliproteína da como resultado los polipéptidos descritos en el presente documento. La escisión postraduccional de la molécula precursora que comprende los polipéptidos descritos en el presente documento puede producirse in vivo (es decir, dentro de la célula huésped mediante sistemas/mecanismos celulares nativos o recombinantes, por ejemplo, escisión de furina en un sitio apropiado) o puede producirse in vitro (por ejemplo, incubación de dicha cadena polipeptídica en una composición que comprende proteasas o peptidasas de actividad conocida y/o en una composición que comprende condiciones o reactivos conocidos para fomentar la acción proteolítica deseada).
La purificación y modificación de proteínas recombinantes se conoce ampliamente en la técnica, de modo que el diseño del precursor de poliproteína podría incluir un número de realizaciones apreciadas fácilmente por un trabajador experto. Cualquier proteasa o peptidasa conocida en la técnica puede usarse para la modificación descrita de la molécula precursora, por ejemplo, trombina o factor Xa (Nagai et al. (1985) “Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia col!’, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255, y revisado en Jenny et al. (2003) “A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa”, Protein Expr. Purif. 31:1-11)), enteroquinasa (Collins-Racie et al. (1995) “Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA”, BiotecHNology 13:982-987)), furina y AcTEV (Parks et al. (1994) “Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase”, Anal. Biochem. 216:413-417)) y la proteasa C3 del virus de la enfermedad de pies y manos.
Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas de huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada. Para este fin pueden usarse células huésped eucariotas que presentan la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para la producción a largo plazo, de alto rendimiento, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse mediante ingeniería líneas celulares que expresan de manera estable los polipéptidos descritos en el presente documento. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado mediante elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. T ras la introducción del ADN foráneo, puede dejarse que las células modificadas mediante ingeniería crezcan durante 1 -2 días en un medio enriquecido, y entonces se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para modificar mediante ingeniería líneas celulares que expresan los polipéptidos descritos en el presente documento. Tales líneas celulares modificadas mediante ingeniería pueden ser particularmente útiles en el muestreo y la evaluación de polipéptidos que interaccionan directa o indirectamente con los polipéptidos descritos en el presente documento.
Pueden usarse un número de sistemas de selección, incluyendo el empleo de los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al. (1977) “Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells”, Cell 11: 223-232), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al. (1992) “Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection TecHNique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma TecHNiques And Gene Therapy”, Bioessays 14: 495-500) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al. (1980) “Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene,” Cell 22: 817-823) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse resistencia de antimetabolito como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al. (1980) “Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O’Hare et al. (1981) “Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan et al. (1981) “Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); neo, que confiere resistencia al aminoglicóside G-418 (Tolstoshev (1993) “Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions”, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) “The Basic Science Of Gene Therapy”, Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) “Human Gene Therapy”, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al. (1984) “Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells”, Gene 30:147-156). Métodos conocidos comúnmente en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, JoHN Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, JoHN Wiley & Sons, n Y.; Colberre-Garapin et al. (1981) “A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells”, J. Mol. Biol. 150:1-14.
Los niveles de expresión de los polipéptidos descritos en el presente documento pueden aumentarse mediante la amplificación de vectores (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un polipéptido descrito en el presente documento es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos de un polipéptido descrito en el presente documento o un polipéptido descrito en el presente documento, la producción del polipéptido también aumentará (Crouse et al. (1983) “Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes”, Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
Una vez que un polipéptido descrito en el presente documento se ha expresado de manera recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de polipéptidos, poliproteínas o anticuerpos (por ejemplo, análogo a esquemas de purificación de anticuerpos basados en selectividad de antígeno), por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad para el antígeno específico (opcionalmente tras la selección de proteína A en la que el polipéptido comprende un dominio Fc (o una porción del mismo)) y cromatografía en columna de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier técnica estándar para la purificación de polipéptidos o anticuerpos. Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a una célula que comprende un ácido nucleico descrito en el presente documento o un vector descrito en el presente documento.
La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En algunas realizaciones, la célula en una célula de mamífero. En el presente documento se describen tipos de célula a modo de ejemplo. Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a una célula que expresa los polipéptidos de BoNT modificados descritos en el presente documento. La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En algunas realizaciones, la célula en una célula de mamífero. En el presente documento se describen tipos de célula a modo de ejemplo. La célula puede ser para la propagación del ácido nucleico o para la expresión del ácido nucleico, o ambas. Tales células incluyen, sin limitación, células procariotas que incluyen, sin limitación, cepas de células bacterianas aerobias, microaerófilas, capnofílicas, facultativas, anaerobias, gram-negativas y gram-positivas tales como aquellas derivadas de, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucariotas que incluyen, sin limitación, cepas de levadura, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células de insecto y líneas celulares derivadas de insectos, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogastery Manduca sexta; y células de mamífero y líneas celulares derivadas de células de mamífero, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de ratón, rata, hámster, cerdo, vaca, caballo, primate y humano. Las líneas celulares pueden obtenerse de la Colección americana de cultivos tipo, Colección europea de cultivos celulares y la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares. Ejemplos no limitativos de protocolos específicos para seleccionar, hacer y usar una línea celular apropiada se describen en, por ejemplo, INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison y Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., JoHN Wiley and Sons, 1998); R. Ian FresHNey, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (JoHN R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, citado anteriormente, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (JoHN M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, citado anteriormente, (2004).
Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y de la enseñanza en el presente documento. Aún otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método de producción de un polipéptido descrito en el presente documento, comprendiendo el método obtener una célula descrita en el presente documento y expresar el ácido nucleico descrito en el presente documento en dicha célula. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar y purificar un polipéptido descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, puede obtenerse neurotoxina botulínica estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y entonces recogiendo y purificando la mezcla fermentada según procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas monocatenarias inactivas que tienen que escindirse o mellarse mediante proteasas para volverse neuroactivos.
Las cepas bacterianas que constituyen los serotipos A y G de toxina botulínica presentan proteasas endógenas y por tanto los serotipos A y G pueden recuperarse de cultivos bacterianos en predominantemente su forma activa. Por el contrario, los serotipos C, D y E de toxina botulínica se sintetizan mediante cepas no proteolíticas y por tanto son normalmente inactivos cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen mediante cepas tanto proteolíticas como no proteolíticas y por tanto pueden recuperarse en forma o bien activa o bien inactiva. Las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de tipo B de toxina botulínica solo pueden escindir una porción de la toxina producida. La producción de polipéptidos de BoNT/X usando estas cepas se contempla en el presente documento.
La proporción exacta de moléculas melladas con respecto a no melladas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por tanto, un cierto porcentaje de una preparación de, por ejemplo, la toxina de tipo B de toxina botulínica puede ser inactivo. En una realización, la neurotoxina de la presente divulgación está en un estado activo. En una realización, la neurotoxina está en un estado inactivo. En una realización se prevé una combinación de neurotoxina activa e inactiva.
Un aspecto de la presente divulgación proporciona métodos novedosos de producción de BoNT por medio de una reacción transpeptidasa in vitro que liga dos fragmentos no tóxicos de las BoNT. Tales métodos comprenden las etapas de: (i) obtener un primer fragmento de BoNT que comprende una cadena ligera (LC) y un dominio N-terminal de una cadena pesada (Hn), comprendiendo el primer fragmento de BoNT un motivo LPXTGG C-terminal (SEQ ID NO: 60); (ii) obtener un segundo fragmento de BoNT que comprende un dominio C-terminal de la cadena pesada (HC); comprendiendo el segundo fragmento de BoNT un sitio de escisión de proteasa específico en su extremo N-terminal; (iii) escindir el segundo fragmento de BoNT con una proteasa específica, dando como resultado la escisión un residuo de glicina libre en el extremo N-terminal; y (iv) poner en contacto el primer fragmento de BoNT y el segundo fragmento de BoNT en presencia de una transpeptidasa, ligando de ese modo el primer fragmento de BoNT y el segundo fragmento de BoNT para formar una BoNT ligada.
En algunas realizaciones, el primer fragmento de BoNT comprende el polipéptido X-LC-Hn descrito en el presente documento fusionado a un motivo LPXTGG C-terminal (SEQ ID NO: 60) (por ejemplo, SEQ ID NO: 45), o cualquier variante del mismo. En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT comprende el polipéptido Hc descrito en el presente documento, o cualquier variante del mismo (por ejemplo, SEQ ID NO: 46). Debe entenderse que cualquier dominio o fragmento de BoNT puede ligarse usando los métodos descritos en el presente documento.
Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para generar BoNT quiméricas. Por ejemplo, el primer fragmento de BoNT puede ser del serotipo A, B, C, D, E, F, G o X de BoNT. De manera similar, el segundo fragmento de BoNT puede ser del serotipo A, B, C, D, E, F, G o X de BoNT. Un experto en la técnica será capaz de discernir las combinaciones que pueden hacerse. En algunas realizaciones, los polipéptidos de BoNT quiméricos descritos en el presente documento (por ejemplo, BoNT/X-LC-Hn-A1-Hc, BoNT/X-LC-Hn-B1-Hc o BoNT/X-Lc -Hn-C1-HC) se hacen usando este método.
En algunas realizaciones, la transpeptidasa es una sortasa. En algunas realizaciones, la sortasa es de Staphylococcus aureus (SrtA).
También pueden usarse otros sistemas de ligación de péptidos disponibles en la técnica para ligar dos fragmentos de BoNT no tóxicos. Por ejemplo, una reacción de ligación de proteína mediada por inteína permite la ligación de un péptido sintético o una proteína con un residuo cisteína N-terminal al extremo C-terminal de una proteína expresada de manera bacteriana a través de un enlace peptídico nativo (Evans et al., (1998) Protein Sci.7, 2256-2264, Dawson et al.,(1994) Science266, 776-779; Tam et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 12485-12489, Muir et a/.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95,6705-6710; Severinov y Muir (1998) J. Biol. Chem. 273, 16205-16209). Kits están disponibles comercialmente (por ejemplo, de New England Biolabs) para reacciones de ligación de proteína mediadas de manera interna.
En algunas realizaciones, el primer fragmento de BoNT comprende además una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al primer fragmento de BoNT en el extremo N-terminal. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al primer fragmento de BoNT en el extremo C-terminal. En el caso de que la etiqueta de afinidad esté fusionada al extremo C-terminal del primer fragmento de BoNT, la transpeptidasa escinde entre la T y la G en el motivo LPXTGG (SEQ ID NO: 60) y elimina la etiqueta de afinidad antes de ligar el primer fragmento de BoNT y el segundo fragmento de BoNT.
En algunas realizaciones, el segundo fragmento de BoNT comprende además una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al primer fragmento de BoNT en el extremo N-terminal. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad está fusionada al segundo fragmento de BoNT en el extremo C-terminal. En el caso de que la etiqueta de afinidad esté fusionada al extremo N-terminal del primer fragmento de BoNT, la proteasa específica escinde en el sitio de escisión de proteasa específico y elimina la etiqueta de afinidad antes de ligar el primer fragmento de BoNT y el segundo fragmento de BoNT mediante la transpeptidasa.
Una “etiqueta de afinidad,” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polipéptido que puede unirse específicamente a una sustancia o un resto, por ejemplo, una etiqueta que comprende seis histidinas se une específicamente a Ni2+. Las etiquetas de afinidad pueden agregarse a proteínas para facilitar su aislamiento. Las etiquetas de afinidad se fusionan normalmente a proteínas por medio de técnicas de ADN recombinantes conocidas por los expertos en la técnica. El uso de etiquetas de afinidad para facilitar el aislado de proteína se conoce también ampliamente en la técnica. Las etiquetas de afinidad adecuadas que pueden usarse según la presente divulgación incluyen, sin limitación, His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLa G, HA, Myc, SBP, E, calmodulina, Softag 1, Softag 3, TC, V5, VSV, Xpress, Halo y Fc.
El segundo fragmento de BoNT tiene una escisión de proteasa específica en el extremo N-terminal. La escisión del sitio mediante la proteasa específica da como resultado un residuo de glicina libre en el extremo N-terminal del segundo fragmento de BoNT. Las proteasas específicas adecuadas que pueden usarse según la presente divulgación incluyen, sin limitación: trombina, TEV, PreScission, enteroquinasa y proteasa SUMO. En algunas realizaciones, la proteasa específica es trombina, y el sitio de escisión es: LVPR|GS (SEQ ID NO: 50).
Los polipéptidos de BoNT/X descritos en el presente documento ofrecen potencial para uso terapéutico. Por ejemplo, BoNT/X puede ser más potente en comparación con otros serotipos de BoNT. BoNT/X es más versátil y puede ser más efectivo en una amplia gama de células debido a su capacidad para escindir más sustratos que otros serotipos de BoNT.
Por tanto, la presente divulgación contempla también composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de BoNT/X o las moléculas quiméricas de la presente divulgación. Como puede resultar también claro más adelante en la presente divulgación, la composición farmacéutica de la presente divulgación, puede comprender además otros agentes terapéuticos adecuados para la enfermedad específica para cuyo tratamiento está diseñada tal composición. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente divulgación comprende además portadores farmacéuticamente aceptables.
El término “portador farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, adyuvante de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o cinc, o ácido esteárico), o disolvente que encapsula el material, implicado en el porte o transporte del polipéptido de un sitio (por ejemplo, el sitio de suministro) del cuerpo a otro sitio (por ejemplo, órgano, tejido o porción del cuerpo).
Un portador farmacéuticamente aceptable es “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el tejido del sujeto (por ejemplo, fisiológicamente compatible, estéril, pH fisiológico, etc.). Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras par supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de haba de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol (PEG); (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de carga, tales como polipéptidos y aminoácidos; (23) componente de suero, tal como albúmina sérica, HDL y LDL; (22) C2-C12 alcoholes, tales como etanol; y (23) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. También pueden estar presentes agentes humectantes, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservante y antioxidantes en la formulación. Los términos tales como “excipiente”, “portador”, “portador farmacéuticamente aceptable” o similares se usan de manera intercambiable en el presente documento. En algunas realizaciones, un polipéptido de BoNT de la presente divulgación en una composición se administra mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo una membrana, tal como una membrana sialástica, o una fibra.
Normalmente, cuando se administra la composición, se usan materiales en los que el polipéptido de la divulgación no se absorbe. En otras realizaciones, los polipéptidos de BoNT de la presente divulgación para su uso se suministran en un sistema de liberación controlada. Tales composiciones y métodos para su administración se proporcionan en la publicación de patente estadounidense n ° 2007/0020295. En una realización puede usarse una bomba (véase, por ejemplo, Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización pueden usarse materiales poliméricos (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Ratón, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, Nueva York, 1984); Ranger y Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Otros sistemas de liberación controlada se discuten, por ejemplo, en Langer, citado anteriormente.
Los polipéptidos de BoNT para el uso de la presente divulgación pueden administrarse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión y uno o más componentes farmacéuticamente compatibles. En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se formula según procedimientos rutinarios como composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa o subcutánea a un sujeto, por ejemplo, un ser humano.
Normalmente, las composiciones para administración mediante inyección son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, el producto farmacéutico puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los componentes se suministran o bien por separado o bien mezclados entre sí en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando el producto farmacéutico deba administrarse mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando el producto farmacéutico se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los componentes puedan mezclarse antes de la administración. Una composición farmacéutica para administración sistémica puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina estéril, solución de Ringer o de Hank lactato. Además, la composición farmacéutica puede estar en formas sólidas y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes del uso. También se contemplan formas liofilizadas. La composición farmacéutica puede estar contenida dentro de una vesícula o partícula lipídica, tal como un liposoma o microcristal, que también es adecuada para la administración parenteral. Las partículas pueden ser de cualquier estructura adecuada, tal como unilaminar o plurilaminar, siempre que las composiciones estén contenidas en las mismas.
Los polipéptidos de la presente divulgación pueden estar atrapados en “partículas de plásmido-lípido estabilizadas” (SPLP) que contienen el lípido fusogénico dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), bajos niveles (5-10% en moles) de lípido catiónico y estabilizadas mediante un recubrimiento de polietilenglicol (PEG) (Zhang Y. P. et al., Gene Ther.
1999, 6:1438-47). Los lípidos cargados positivamente tales como metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio, o “DOTAP”, se prefieren particularmente para tales partículas y vesículas. La preparación de tales partículas lipídicas se conoce ampliamente. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.880.635; 4.906.477; 4.911.928; 4.917.951; 4.920.016; y 4.921.757. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse o empaquetarse como dosis unitaria, por ejemplo.
El término “dosis unitaria” cuando se usa en referencia a una composición farmacéutica de la presente divulgación se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unida una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido; es decir, portador o vehículo. En algunas realizaciones, los polipéptidos de BoNT/X descritos en el presente documento pueden conjugarse con un resto terapéutico, por ejemplo, un antibiótico. Las técnicas para conjugar tales restos terapéuticos a polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, dominios Fc, se conocen ampliamente; véanse, por ejemplo, Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, págs. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, págs.
623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, págs. 475-506); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, págs. 303-16, Academic Press; y Thorpe et al. (1982) “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-158. Además, la composición farmacéutica puede proporcionarse como kit farmacéutico que comprende (a) un recipiente que contiene un polipéptido de la divulgación en forma liofilizada y (b) un segundo recipiente que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua estéril) for inyección. El diluyente farmacéuticamente aceptable puede usarse para la reconstitución o dilución del polipéptido liofilizado de la divulgación. Opcionalmente asociado con tal(es) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agente gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, aviso que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración humana. En otro aspecto se incluye un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de las enfermedades descritas anteriormente. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta.
Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. En algunas realizaciones, el recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar una enfermedad descrita en el presente documento y puede tener un orificio de acceso estéril. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica. El agente activo en la composición es un polipéptido aislado de la divulgación. En algunas realizaciones, la etiqueta sobre o asociada con el recipiente indica que la composición se usa para tratar la enfermedad de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Los polipéptidos de BoNT (por ejemplo, polipéptidos de BoNT/X), las moléculas quiméricas y las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden usarse para el tratamiento de estados asociados con actividades neuronales no deseadas. Por tanto, en el presente documento se proporcionan además el polipéptido de BoNT, la molécula quimérica o la composición farmacéutica descritos en el presente documento para su uso en métodos de tratamiento de un estado asociado con actividad neuronal no deseada, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de BoNT, la molécula quimérica o la composición farmacéutica descritos en el presente documento para tratar de ese modo el estado. En algunas realizaciones, los polipéptidos de BoNT, las moléculas quiméricas y las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación entran en contacto con una o más neuronas que presentan actividad neuronal no deseada,
Los estados tratados normalmente con una neurotoxina (por ejemplo, estados de músculos esqueléticos, estados de músculos lisos, estados glandulares, un trastorno neuromuscular, un trastorno autónomo, dolor o un estado estético/cosmético) están asociados con actividad neuronal no deseada, tal como se determina por el profesional experto. La administración es mediante una vía que pone en contacto una cantidad efectiva de la composición con neuronas que presentan la actividad no deseada. En algunas realizaciones, el estado puede estar asociado con neuronas o glándulas hiperactivas. Los estados específicos previstos para el polipéptido de BoNT, la molécula quimérica o la composición farmacéutica descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento mediante los métodos discutidos en el presente documento incluyen, sin limitación, disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurógena, anismo, espasticidad de extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas así como otros trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza. Además, la presente divulgación puede usarse para tratar estados dermatológicos o estéticos/cosméticos, por ejemplo, reducción de surcos en el entrecejo, reducción de arrugas de la piel.
Una propiedad única de los polipéptidos de BoNT/X de la presente divulgación es su capacidad para escindir VAMP4, VAMP5 y Ykt6. Por tanto, en el presente documento también se contempla el uso terapéutico de los polipéptidos de BoNT/X en estados asociados con actividades de secreción no deseadas en una amplia gama de células. En algunas realizaciones, la secreción no deseada es secreción inmune. Los estados asociados con secreción inmune no deseada incluyen, sin limitación: inflamación, psoriasis, alergia, linfohistiocitosis hemofagocítica y enfermedad pancreática alcohólica.
La presente divulgación puede usarse también en el tratamiento de lesiones deportivas. Borodic, patente estadounidense n° 5.053.005 da a conocer métodos para tratar la curvatura espinal juvenil, es decir escoliosis, usando botulina tipo A. En una realización, un polipéptido de BoNT descrito en el presente documento es para su uso en métodos sustancialmente similares a los dados a conocer por Borodic, un polipéptido de BoNT puede administrarse a un mamífero, preferiblemente un humano, para tratar la curvatura espinal. En una realización adecuada se administra un polipéptido de BoNT que comprende botulina de tipo E fusionada con un motivo a base de leucina. Incluso más preferiblemente, un polipéptido de BoNT que comprende botulina de tipo A-E con un motivo a base de leucina fusionado al externo carboxilo-terminal de su cadena ligera se administra al mamífero, preferiblemente un humano, para tratar la curvatura espinal.
Además, los polipéptidos de BoNT pueden administrarse para tratar trastornos neuromusculares usando técnicas ampliamente conocidas que se realizan comúnmente con botulina tipo A. Por ejemplo, la presente divulgación puede usarse para tratar el dolor, por ejemplo, dolor de cabeza, dolor por espasmos musculares y diversas formas de dolor inflamatorio. Por ejemplo, Aoki, patente estadounidense n° 5.721.215 y Aoki, patente estadounidense n .o 6.113.915 dan a conocer métodos de uso de toxina botulínica tipo A para tratar el dolor.
Trastornos de sistema nervioso autónomo también pueden tratarse con una neurotoxina modificada. Por ejemplo, el mal funcionamiento glandular es un trastorno del sistema nervioso autónomo. El mal funcionamiento glandular incluye sudoración excesiva y salivación excesiva. El mal funcionamiento respiratorio es otro ejemplo de un trastorno del sistema nervioso autónomo. El mal funcionamiento respiratorio incluye enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma. Sanders et al. dan a conocer métodos para tratar el sistema nervioso autónomo; por ejemplo, tratar trastornos del sistema nervioso autónomo tales como sudoración excesiva, salivación excesiva, asma, etc., usando toxinas botulínicas que existen de manera natural.
En una realización, un polipéptido de BoNT descrito en el presente documento es para su uso en métodos sustancialmente similares al de Sanders et al., pero usando un polipéptido de BoNT, para tratar trastornos del sistema nervioso autónomo tales como los discutidos anteriormente. Por ejemplo, un polipéptido de BoNT puede aplicarse localmente a la cavidad nasal del mamífero en una cantidad suficiente para degenerar neurona colinérgicas del sistema nervioso autónomo que controlan la secreción mucosa en la cavidad nasal. El dolor que puede tratarse mediante una neurotoxina modificada incluye dolor provocado por tensión muscular, o espasmo, o dolor que no está asociado con espasmo muscular. Por ejemplo, Binder en la patente estadounidense n.° 5.714.468 da a conocer que el dolor de cabeza provocado por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía puede tratarse con una toxina botulínica que se produce de manera natural, por ejemplo botulina tipo A.
En una realización, un polipéptido de BoNT descrito en el presente documento es para su uso en métodos sustancialmente similares al de Binder, pero usando un polipéptido de BoNT descrito en el presente documento, para tratar el dolor de cabeza, especialmente los provocados por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía. El dolor provocado por espasmo muscular también puede tratarse mediante una administración de un polipéptido de BoNT descrito en el presente documento. Por ejemplo, una botulina tipo E fusionada con un motivo a base de leucina, preferiblemente en el extremo carboxilo-terminal de la cadena ligera de botulina tipo E, puede administrarse por vía intramuscular en la ubicación del dolor/espasmo para aliviar el dolor. Además, una neurotoxina modificada puede administrarse a un mamífero para tratar dolor que no está asociado con un muscular trastorno, tal como espasmo.
En una realización amplia, el polipéptido de BoNT, la molécula quimérica o la composición farmacéutica descritos en el presente documento para su uso en métodos de la presente divulgación para tratar dolor no relacionado con espasmo incluyen la administración central o administración periférica del polipéptido de BoNT. Por ejemplo, Foster et al. en la patente estadounidense n° 5.989.545 dan a conocer que una toxina botulínica conjugada con un resto de selección como diana puede administrarse de manera central (vía intratecal) para aliviar el dolor.
En una realización, las composiciones descritas en el presente documento son para su uso en métodos sustancialmente similares al de Foster et al., pero usando las composiciones descritas en el presente documento para tratar el dolor. El dolor que debe tratarse puede ser un dolor agudo o dolor crónico. Un dolor agudo o crónico que no está asociado con un espasmo muscular también puede aliviarse con una administración local, periférica, de la neurotoxina modificada a una ubicación de dolor real o una percibida en el mamífero.
En una realización, el polipéptido de BoNT para su uso se administra por vía subcutánea en o cerca de la ubicación del dolor, por ejemplo, en o cerca de un corte. En algunas realizaciones, la neurotoxina modificada para su uso se administra por vía intramuscular en o cerca de la ubicación del dolor, por ejemplo, en o cerca de una ubicación de magulladura en el mamífero. En algunas realizaciones, el polipéptido de BoNT para su uso se inyecta directamente en una articulación de un mamífero, para tratar o aliviar el dolor provocado por estados artríticos. Además, la inyección o infusión repetida frecuente de la neurotoxina modificada a una ubicación de dolor periférico está dentro del alcance de la presente divulgación. Vías de administración para tales métodos se conocen en la técnica y se adaptan fácilmente a los métodos descritos en el presente documento por el profesional experto (por ejemplo, véase, por ejemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14.sup.th edición, publicado por McGraw Hill).
A modo de ejemplo no limitativo, el tratamiento de un trastorno neuromuscular puede comprender una etapa de administrar localmente una cantidad efectiva de la molécula a un músculo o un grupo de músculos, el tratamiento de un trastorno autónomo puede comprender una etapa de administrar localmente una efectiva de la molécula a una glándula o glándulas, y el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administrar una cantidad efectiva de la molécula al sitio del dolor. Además, el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administrar una cantidad efectiva de una neurotoxina modificada a la médula espinal.
“Una cantidad terapéuticamente efectiva” tal como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de cada agente terapéutico de la presente divulgación requerida para conferir efecto terapéutico al sujeto, ya sea solo o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos. Las cantidades efectivas varían, tal como reconocen los expertos en la técnica, dependiendo del estado particular que esté tratándose, la gravedad del estado, los parámetros del sujeto individual incluyendo edad, estado físico, tamaño, género y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Estos factores se conocen ampliamente por los expertos habituales en la técnica y pueden abordarse sin más que experimentación rutinaria. Generalmente se prefiere que se usa una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta según el criterio médico sensato. Sin embargo, los expertos habituales en la técnica entenderán que un sujeto puede insistir en una dosis menor o dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o por prácticamente cualquier otro motivo. Las consideraciones empíricas, tales como la vida media, contribuirán generalmente a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, agentes terapéuticos que son compatibles con el sistema inmune humano, tal como polipéptidos que comprenden regiones de anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, pueden usarse para prolongar la vida media del polipéptido y para impedir que el polipéptido sea atacado por el sistema inmune del huésped.
La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse a lo largo del curso de la terapia, y generalmente, pero no necesariamente, se basa en tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retardo de una enfermedad. Alternativamente, formulaciones de liberación continua sostenida de un polipéptido pueden ser apropiadas. Diversas formulaciones y dispositivos para conseguir una liberación sostenida se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la dosificación es diaria, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días o cada seis días. En algunas realizaciones, la frecuencia de dosificación es una vez a la semana, cada 2 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas o cada 10 semanas; o una vez al mes, cada 2 meses o cada 3 meses, o más. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
El régimen de dosificación (incluyendo el polipéptido usado) puede variar a lo largo del tiempo. En algunas realizaciones, para un sujeto adulto de peso normal, pueden administrarse dosis que oscilan entre aproximadamente 0,01 y 1000 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis es de entre 1 y 200 mg. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el tiempo y la repetición, dependerá del sujeto particular y del historial médico del sujeto, así como de las propiedades del polipéptido (tal como la vida media del polipéptido, y otras consideraciones ampliamente conocidas en la técnica).
Para el propósito de la presente divulgación, la dosificación apropiada de un agente terapéutico tal como se describe en el presente documento dependerá del agente específico (o composiciones del mismo) empleado, la formulación y la vía de administración, el tipo y la gravedad de la enfermedad, si el polipéptido se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del sujeto y la respuesta al antagonista, y la discreción del médico que lo atienda. Normalmente, el médico administrará un polipéptido hasta que se alcance una dosificación que alcance el resultado deseado.
La administración de uno o más polipéptidos puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración de un polipéptido puede ser esencialmente continua a lo largo de un periodo de tiempo seleccionado previamente o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, o bien antes, durante o bien después de desarrollar una enfermedad. Tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” se refiere a la aplicación o administración de un polipéptido o composición que incluye el polipéptido a un sujeto que lo necesite.
“Un sujeto que lo necesite” se refiere a un individuo que tiene una enfermedad, un síntoma de la enfermedad, o una predisposición hacia la enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad. En algunas realizaciones, el sujeto tiene CDI. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un primate no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es humano. Aliviar una enfermedad incluye retardar el desarrollo o progreso de la enfermedad, o reducir la gravedad de la enfermedad. Aliviar la enfermedad no requiere necesariamente resultados curativos.
Tal como se usa en el presente documento, “retardar” el desarrollo de una enfermedad significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o postponer la progresión de la enfermedad. Este retardo puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo del historial de la enfermedad y/o los individuos que estén tratándose. Un método que “retarda” o alivia el desarrollo de una enfermedad, o retarda la aparición de la enfermedad, es un método que reduce la probabilidad de desarrollar uno o más síntomas de la enfermedad en un marco de tiempo dado y/o reduce el grado de los síntomas en un marco de tiempo dado, en comparación con no usar el método. Tales comparaciones se basan normalmente en estudios clínicos, usando un número de sujetos suficiente para dar un resultado estadísticamente significativo.
“Desarrollo” o “progresión” de una enfermedad significa manifestaciones iniciales y/o una progresión consiguiente de la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad puede detectarse y evaluarse usando técnicas clínicas estándar tal como se conoce ampliamente en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a progresión que puede ser indetectable. Para el propósito de esta divulgación, desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. “Desarrollo” incluye ocurrencia, recurrencia y aparición.
Tal como se usa en el presente documento la “aparición” u “ocurrencia” de una enfermedad incluye la aparición inicial y/o recurrencia. Pueden usarse métodos convencionales, conocidos por los expertos habituales en la técnica de la medicina, para administrar el polipéptido aislado o la composición farmacéutica al sujeto, dependiendo del tipo de enfermedad que deba tratarse o el sitio de la enfermedad. Esta composición también puede administrarse por medio de otras vías convencional, por ejemplo, administrarse por vía oral, vía parenteral, mediante spray de inhalación, vía tópica, vía rectal, vía nasal, vía bucal, vía vaginal o por medio de un depósito implantado.
El término “parenteral” tal como se usa en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutáneas, intracutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarticulares, intraarteriales, intrasinoviales, intraesternales, intratecales, intralesionales e intracraneales. Además, puede administrarse al sujeto por medio de vías de administración de depósito inyectable tal como usando materiales y métodos biodegradables o inyectables de depósito de 1,3 o 6 meses.
Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” se refiere a un humano o animal. Habitualmente, el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cynomologus, monos araña y macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervo, visón, búfalo, especies felinas, por ejemplo, gato doméstico, especies caninas, por ejemplo, perro, zorro, lobo, especies aviares, por ejemplo, pollo, emú, avestruz, y pescado, por ejemplo, trucha, bagre y salmón. El paciente o sujeto incluye cualquier subconjunto de los anteriores, por ejemplo, todos los anteriores, pero excluyendo uno o más grupos o especies tales como humanos, primates o roedores. En determinadas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un humano.
Los términos “paciente” y “sujeto” se usan de manera intercambiable en el presente documento. Un sujeto puede ser macho o hembra. Un sujeto puede ser un sujeto completamente desarrollado (por ejemplo, un adulto) o a sujeto que experimenta el proceso de desarrollo (por ejemplo, un niño, lactante o feto). Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca. Mamíferos distintos de humanos pueden usarse ventajosamente como sujetos que representan modelos animales de trastornos asociados con actividad neuronal no deseada. Además, los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para tratar animales domesticados y/o mascotas.
Los siguientes ejemplos pretenden ser ilustrativos de determinadas realizaciones y son no limitativos.
EJEMPLOS
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Una neurotoxina botulínica novedosa y sus derivados
Las neurotoxinas botulínicas (BoNT) están entre los agentes de bioterrorismo potenciales más peligrosos y se usan también clínicamente para tratar una lista creciente de estados médicos. Hay siete serotipos de las BoNT (BoNT/A-G) conocidos hasta la fecha y no se han reconocido nuevos tipos durante los últimos 45 años. La búsqueda de la base de datos Ggenomic de cepas de Clostridium botulinum reveló un tipo de BoNT novedoso, denominado BoNT/X. Esta toxina mostró la menor identidad de secuencia con otras BoNT y no se reconoce por antisueros creados frente a tipos de BoNT conocidos. Escinde la proteína de membrana asociada a vesícula (VAMP) en neuronas, que es también la diana de BoNT/B/D/F/G, pero BoNT/X escinde en un sitio (entre Arg66-Ala67 en VAMP2) único para esta toxina. Para validar la actividad de BoNT/X, se ensambló una cantidad limitada del BoNT/X de longitud completa ligando covalentemente dos fragmentos no tóxicos de BoNT/X usando una transpeptidasa (sortasa). El BoNT/X ensamblado entró en neuronas cultivadas y escindió VAMP2, y provocó parálisis flácida en ratones medida mediante el ensayo de puntuación de abducción digital. Juntos, estos datos establecieron BoNT/X como un tipo de BoNT novedoso. Su descubrimiento plantea un reto urgente para desarrollar contramedidas efectivas y presenta también una herramienta novedosa para aplicaciones terapéuticas potenciales.
La búsqueda de bases de datos genómicas reveló un gen de BoNT novedoso
En un intento por estudiar el paisaje evolutivo de las BoNT, se realizaron búsquedas de modelo Hidden Markov iterativas de la base de datos de secuencias PubMed, utilizando secuencias de las siete BoNT como sondas. La búsqueda identificó satisfactoriamente serotipos de BoNT principales, subtipos y toxinas mosaico, así como la neurotoxina del tétano relacionada (TeNT) (FIG. 5). Inesperadamente, también reveló un gen de BoNT novedoso (GenBank n.° BAQ 12790.1), de la secuencia genómica notificada recientemente de la cepa 111 de Clostridium botulinum. Este gen de toxina se designa en el presente documento BoNT/X.
El análisis filogenético reveló que BoNT/X es claramente distinto de todas las demás BoNT y TeNT (FIG. 1A). Tiene la menor identidad de secuencia de proteína (<31%) con respecto a cualquier otra BoNT entre comparaciones por pares dentro de la familia de BoNT/TeNT (FIG. 1A). Por ejemplo, BoNT/A y BoNT/B comparten un 39% de identidad de secuencia, y BoNT/B y BoNT/G tienen un 58% de identidad de secuencia. Además, una ventana de comparación de secuencia deslizante demostró que la baja similitud está distribuida uniformemente a lo largo de la secuencia de BoNT/X en comparación con las otras siete BoNT y TeNT (FIG. 1B), indicando que no es una toxina mosaico.
A pesar de la baja identidad de secuencia, la disposición de dominio global y unas pocas características clave de las BoNT parecen estar conservadas en BoNT/X (FIG. 1B), incluyendo: (1) un motivo de proteasa dependiente de cinc conservado HExxH (residuos 227-231, HELVH (SEQ ID NO: 92)) está ubicado en la LC putativa; (2) hay dos cisteínas conservadas ubicadas en el límite entre las LC y HC putativas, que puede formar el enlace disulfuro intercatenario esencial; (3) un motivo de unión a receptor conservado SxWY existe en la He putativa (residuos 1274-1277, SAWY (SEQ ID NO: 93)), que reconoce gangliósidos de co-receptores lipídicos4344.
Como se esperaba, el gen BoNT/X va precedido de un gen NTNHA putativo (FIG. 1C). Están ubicados en una agrupación de genes OrfX. Sin embargo, la agrupación de genes OrfX de BoNT/X tiene dos características únicas en comparación con las otras dos agrupaciones OrfX conocidas (FIG. 1C): (1) hay una proteína OrfX2 adicional (designada como OrfX2b) ubicada cerca del gen BoNT/X, que no se ha notificado para ninguna otra agrupación OrfX; (2) el marco de lectura de los genes OrfX tiene el mismo sentido que el gen BoNT/X, mientras que habitualmente son opuestos al sentido del gen de BoNT en otras agrupaciones OrfX (FIG. 1C). Juntas, estas características sugieren que BoNT/X puede constituir una rama evolutiva única de la familia de BoNT.
La LC de BoNT/X escinde VAMP2 en un sitio novedoso
A continuación se examinó si BoNT/X es una toxina funcional. En primer lugar se investigó la LC de BoNT/X (X-LC). El límite de la LC (residuos 1-439) se determinó mediante alineación de secuencias con otras BoNT. Se sintetizó el ADNc que codifica la LC y se produjo la LC como proteína recombinante etiquetada con His6 en E. coli. Se incubó X-LC con extractos de detergente de cerebro (BDE) de rata y se usó análisis de inmunotransferencia para examinar si se escindían las tres proteínas SNARE dominantes en el cerebro, SNAP-25, VAMP2 y sintaxina 1. Las LC de BoNT/A (A-LC) y BoNT/B (B-LC) se sometieron a ensayo en paralelo como controles. La escisión de SNAP-25 mediante BoNT/A genera un fragmento más pequeño que todavía puede reconocerse en inmunotransferencia, mientras que la escisión de VAMP2 mediante BoNT/B suprime la señal de inmunotransferencia de VAMP2 (FIG. 2A). También se detectó sinaptofisina (Syp), una proteína vesicular sináptica, como control de carga interno. La incubación de X-LC con DTE de cerebro de rata no afectó a sintaxina 1 o SNAP-25, pero suprimió las señales de VAMP2 (FIG. 2A). Las LC de las BoNT son proteasas dependientes de cinc25. Como se esperaba, EDTA impidió la escisión de proteínas SNARE mediante las X-, A- y B-LC (FIG. 2A). Para confirmar adicionalmente que X-LC escinde VAMP2, se purificó el dominio citosólico de VAMP2 (residuos 1 -96) como proteína etiquetada con His6. La incubación de VAMP2 (1 -96) con X-LC convirtió la banda de VAMP2 en dos bandas de peso molecular menor en gel de SDS-PAGE (FIG. 2B), confirmando que X-LC escinde VAMP2.
Para identificar el sitio de escisión en VAMP2, se analizó la proteína VAMP2 (1 -96) con o sin incubación previa con X-LC, mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS, FIGs. 2C-2E, véase más adelante para el detalle). Un único pico de péptido dominante apareció tras la incubación con X-LC (FIGs. 2C, 2E y 6). Se determinó que su peso molecular era de 3081,7, lo que se ajusta solo a la secuencia peptídica de los residuos A67-L96 de VAMP2 (FIGs. 2C, 2E). De manera consistente, también se detectó el otro fragmento desde el comienzo de la etiqueta His6 hasta el residuo R66 de VAMP2 (FIG. 2D). Para confirmar adicionalmente este resultado, se repitió el ensayo con un fragmento de VAMP2 diferente: VAMP2 recombinante etiquetado con GST (33-86) (FIG. 7). La incubación con X-LC generó un único pico dominante, con un peso molecular de 2063,1, lo que se ajusta solo a la secuencia peptídica de los residuos A67-R86 de VAMP2 (FIGs. 7D-7E). Como se esperaba, también se detectó el otro fragmento desde el comienzo de la etiqueta GST hasta el residuo R66 de VAMP2 (FIG. 7F). Juntos, estos resultados demostraron que X-LC tiene un único sitio de escisión en VAMP2 entre R66 y A67.
R66-A67 es un sitio de escisión novedoso distinto de los sitios diana establecidos para todas las demás BoNT (FIG.
2F). Es también el único sitio de escisión de BoNT ubicado dentro de una región conocida previamente como motivo SNARE (FIG. 2F, regiones sombreadas)45. Las proteínas de la familia VAMP incluyen VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, así como las Sec22b y Ykt6 relacionadas. R66-A67 está conservado en VAMP1 y VAMP3, que son altamente homólogos a VAMP2, pero no en otros homólogos de VAMP tales como VAMP7 y VAMP8. Para validar la especificidad de X-LC, se expresaron VAMP1, 3, 7, 8 de longitud completa etiquetadas con HA y Sec22b y Ykt6 etiquetadas con myc en células HEK293 por medio de transfección transitoria. Se incubaron lisados celulares con X-LC (FIG. 2G). Tanto VAMP1 como 3 se escindieron mediante X-LC, tal como se evidencia mediante el desplazamiento de la señal de inmunotransferencia a peso molecular menor, mientras que VAMP7, VAMP8 y Sec22B eran resistentes a X-LC (FIG.
2G).
Inesperadamente, Ykt6 se escindió mediante X-LC (FIG. 2G). Este hallazgo se confirmó usando un fragmento de Ykt6 etiquetado con GST purificado, que se desplazó a una banda de peso molecular menor tras la incubación con X-LC (FIG. 2H). Se determinó que el sitio de escisión era K173-S174 mediante análisis de espectrometría de masas de la Ykt6 intacta frente a la Ykt6 escindida mediante X-LC (FIG. 13A). Este es el sitio homólogo al sitio de escisión en VAMP2 (FIG. 2F), lo que indica que la ubicación del sitio de escisión está conservada entre diferentes VAMP. Entre los miembros de VAMP, VAMP4 contiene el mismo par de residuos (K87-S88) en este sitio que Ykt6. Se encontró que el domino citoplasmático etiquetado con GST de VAMP4 se escindía eficientemente mediante X-LC (FIG. 2I). De manera consistente, X-LC escindió la VAMP4 nativa en BDE (FIG. 4J). Como control, Sec22b no se escindió mediante X-LC en BDE. Además, también se escindió el dominio citoplasmático etiquetado con GST de VAMP5, aunque a una tasa más lenta que VAMP2 y VAMP4 (FIG. 2I). Se confirmó que los sitios de escisión eran K87-S88 en VAMP4 y R40-S41 en VAMP5 mediante análisis de espectrometría de masas (FIG. 14). Ambos son los sitios homólogos al sitio de escisión en VAMP2 (FIG. 2F). La capacidad de X-LC para escindir VAMP4, VAMP5 y Ykt6 es altamente inusual, ya que sus secuencias son sustancialmente diferentes de VAMP 1/2/3. BoNT/X es la primera BoNT que puede escindir las VAMP más allá de las dianas canónicas VAMP1/2/366. X-LC también escindió VAMP4 en BDE, y la escisión se bloqueó mediante EDTA (FIG. 2J).
Una característica notable de BoNT/X es su capacidad única para escindir VAMP4 e Ykt6. VAMP4 se expresa ampliamente y se conoce que media en la fusión vesicular entre la red trans-Golgi (TGN) y endosomas, así como en la fusión homotípica de endosomas5160. Ykt6 es una SNARE atípica sin un dominio transmembrana67-70. Está anclada a las membranas por medio de lipidación, lo que permite la regulación dinámica de su asociación a la membrana. Ykt6 es una proteína esencial en levadura, implicada en múltiples eventos de fusión de membrana incluyendo ER-Golgi, intra-Golgi, endosoma-Golgi-vacuolar y formación autofagosoma. Su función en células de mamífero sigue sin establecerse. Se conoce que las BoNT tradicionalmente están limitadas a SNARE diana que median en la exocitosis vesicular sobre membranas plasmáticas. BoNT/X es la primera BoNT que es capaz de escindir SNARE que median en diversos eventos de tráfico de membrana intracelulares.
De manera interesante, tanto VAMP4 como Ykt6 están enriquecidas en las neuronas. Estudios recientes sugirieron que VAMP4 también puede contribuir a la exocitosis vesicular sináptica asíncrona, la exocitosis de vesícula a gran escala y la endocitosis masiva dependiente de la actividad (ADBE) en neuronas61-63. El papel de Ykt6 en las neuronas sigue estando por establecer, pero se ha mostrado que suprime la toxicidad de a-sinucleína en modelos de enfermedad de Parkinson71-72. El otro sustrato de BoNT/X, VAMP5, se expresa principalmente en células musculares y su función sigue estando por establecer64. BoNT/X será una herramienta potente para investigar las funciones de VAMP4, Ykt6 y VAMP5 y eventos de tráfico de membrana relacionados. Además, se ha implicado a VAMP4 en la liberación de gránulos en células inmunitarias65, por tanto BoNT/X puede tener un potencial único entre todas las BoNT para modular secreción inflamatoria en células inmunitarias.
Activación proteolítica de BoNT/X
Las BoNT se producen inicialmente como un único polipéptido. Es necesario escindir la región ligadora entre LC y Hn mediante proteasas o bien bacterianas o bien huésped en un proceso conocido como “activación”, que es esencial para la actividad de las BoNT. LC y Hn de las BoNT permanecen conectadas por medio de un enlace disulfuro intercatenario antes de la translocación de LC al citosol de las células, donde se reduce el enlace disulfuro con el fin de liberar la LC al citosol. La alineación de secuencias reveló que BoNT/X contiene la región ligadora más larga entre dos cisteínas conservadas en comparación con todas las demás BoNT (C423-C467, FIG. 3A). Además, la región ligadora de BoNT/X contiene una cisteína adicional (C461), que es única para BoNT/X.
Para examinar si la región ligadora entre la LC y la Hn de BoNT/X es susceptible a escisión proteolítica, se produjo un fragmento de X-LC-Hn recombinante (residuos 1-891) en E. coli y se sometió a proteólisis limitada mediante endoproteinasa Lys-C, que corta en el lado C-terminal de residuos lisina. Para identificar el sitio de escisión susceptible en condiciones de proteólisis limitada, se analizó X-LC-Hn usando un enfoque de marcado con Tandem Mass Tag (TMT) y espectrometría de masas en tándem. La TMT marca el extremo N-terminal libre (y lisinas). La proteólisis limitada mediante Lys-C produce extremos N-terminales libres adicionales, que no existirían en una muestra de X-LC-Hn intacta (véase más adelante para detalles). Brevemente, se marcaron muestras de X-LC-Hn intactas con la TMT ligera y se expuso una cantidad igual de muestras de X-LC-Hn a Lys-C y entonces se marcaron con la TMT pesada. Ambas muestras se digirieron entonces con quimotripsina, se combinaron entre sí y se sometieron a análisis de espectrometría de masas cuantitativa. Una lista de los péptidos identificados se mostró en la tabla 2, a continuación. Las relaciones de TMT ligera:TMT pesada están habitualmente dentro de un nivel de 2 veces entre sí para cada péptido, con la excepción de los 5 péptidos empezando con N439, que no mostraron ninguna señal para el marcado con la TMT ligera, lo que indica que este es un nuevo extremo N-terminal generado por el corte con Lys-C (FIG. 3A, tabla 2). Por tanto, Lys-C corta preferentemente K438-N439 en condiciones proteolíticas limitadas, lo que demuestra que la región ligadora es susceptible a las proteasas (FIG. 3A).
A continuación se examinó si esta activación proteolítica es importante para la función de BoNT/X. Se ha mostrado previamente que la incubación de altas concentraciones de LC-HN de las BoNT con neuronas cultivadas dio como resultado la entrada de LC-Hn en las neuronas, probablemente a través de captación no específica en las neuronas4647. Usando este enfoque, se comparó la potencia de X-LC-Hn intacto frente a activado en neuronas corticales de rata cultivadas. Las neuronas se expusieron a X-LC-Hn en medios durante 12 horas. Se recogieron lisados celulares y se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia para examinar la escisión de proteínas SNARE. Como se muestra en la FIG. 3B, X-LC-Hn entró en las neuronas y escindió VAMP2 de una manera dependiente de la concentración. X-LC-Hn activado mediante Lys-C mostró una potencia aumentada drásticamente en comparación con X-LC-Hn intacto: X-LC-Hn activado 10 nM escindió niveles similares de VAMP2 a los de X-LC-Hn intacto 150 nM (FIG.
3B). Obsérvese que probablemente el X-LC-Hn intacto es susceptible a escisión proteolítica mediante proteasas de la superficie celular, por lo cual está todavía activo en neuronas a altas concentraciones. De manera interesante, el X-LC-Hn activado parece ser más potente que el LC-Hn activado de BoNT/A (A-LC-Hn) y BoNT/B (B-LC-Hn), que no mostraron ninguna escisión detectable de sus sustratos SNARE en neuronas en las mismas condiciones de ensayo (FIG. 3B).
Tabla 2. Fragmentos de péptido de X-LC-Hn bajo proteólisis limitada analizados mediante etiquetado con TMT y espectrometría de masas cuantitativa
X-LC-Hn recombinante etiquetado con His6 se etiquetó con la TMT ligera. Una cantidad igual de muestras de X-LC-Hn se expuso a Lys-C y entonces se marcó con la TMT pesada. Ambas muestras se digirieron entonces con quimotripsina, se combinaron entre sí y se sometieron a análisis de espectrometría de masas cuantitativa. Se mostró una lista de péptidos identificados. Las relaciones de TMT ligera:TMT pesada están dentro de un nivel de 2 veces entre sí para todos los péptidos, excepto cinco péptidos (subrayados) empezando con N439. Estos cinco péptidos no mostraron ninguna señal para el marcado con TMT ligera, lo que indica que N439 es un nuevo extremo N-terminal generado por el corte con Lys-C. Las secuencias peptídicas en la tabla 2 corresponden, de arriba abajo, a las SEQ ID NO: 94-226.
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Característica única del enlace disulfuro en BoNT/X
La región ligadora de BoNT/X contiene una cisteína adicional (C461), que es única para BoNT/X. Para determinar qué cisteína forma el enlace disulfuro que conecta la LC y la HC, se generaron tres mutantes de X-LC-Hn, con cada uno de los tres residuos cisteína mutados (C423S, C461S y C467S). Estos tres mutantes de cisteína, así como el X-LC-Hn de tipo silvestre (WT) se sometieron a proteólisis limitada y entonces se analizaron por medio de SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, con o sin agente reductor DTT (FIG. 3C). Se encontró que la mutación de la cisteína en la LC (C423S) dio como resultado una proteína que se separaba en dos bandas de ~ 50 kDa, con o sin DTT, lo que indica que C423S suprimía el enlace disulfuro intercatenario. Por el contrario, los mutantes que contenía o bien C461S o bien C467S mostraron una única banda a 100 kDa en ausencia de DTT, que se separaba en dos bandas de ~50 kDa en presencia de DTT, lo que sugiere que tanto C461 como C467 en la Hn pueden formar un enlace disulfuro intercatenario con C423 en la LC. Además, el mutante de X-LC-Hn (C423S) parece ser más susceptible a Lys-C que los mutantes tanto C461S como C467S, dando como resultado la degradación adicional de la proteína (FIG. 3C). Este resultado sugiere que perder el enlace disulfuro intercatenario puede aumentar la libertad de LC y Hn, exponiendo así más áreas superficiales. Además, una porción de WT X-LC-Hn formó agregados encima del gel de SDS-PAGE (FIG.
3C). Estos agregados se deben a la formación del enlace disulfuro intermolecular, ya que desaparecían en presencia de DTT (FIG. 3C, DTT). C423, C461 y C467 son las únicas tres cisteínas en X-LC-Hn. La mutación de una cualquiera de las tres cisteínas suprimió los agregados de X-LC-Hn (FIG. 3C, -DTT), lo que indica que la formación del enlace disulfuro intermolecular se debe a la existencia de una cisteína extra en la región ligadora.
La mayoría del WT X-LC-Hn activado también se separó en dos bandas de ~50 kDa en gel de SDS-PAGE gel DTT (FIG. 3C). Por otro lado, WT X-LC-Hn es resistente a Lys-C de manera similar a los mutantes C461S y C467S, y no mostró ninguna degradación adicional como sí lo hizo el mutante C423S (FIG. 3C, DTT), lo que sugiere que WT X-LC-Hn es diferente del mutante C423S. Una posible explicación es la redistribución del enlace disulfuro debido a la existencia de dos cisteínas próximas entre sí en la Hn (C461 y C467), lo que puede redisponer el enlace disulfuro de intercatenario C423-C467 o C423-C467 a intracatenario C461-C467 en condiciones desnaturalizadas4849. Para someter a prueba esta hipótesis, se usó un reactivo alquilante, W-etilmaleimida (NEM), que reacciona con los sulfhidrilos de la cisteína libre y bloquea de manera permanente cualquier cisteína libre. Como se muestra en la FIG.
3D, WT X-LC-Hn pretratado con NEM mostró en gran medida una única banda a 100 kDa en ausencia de DTT, y se separó en dos bandas de ~50 kDa en presencia de DTT. Estos resultados confirmaron que el WT X-LC-Hn nativo contiene principalmente enlace disulfuro intercatenario, que es susceptible a la redistribución de enlace disulfuro debido a la existencia de la tercera cisteína en la región ligadora.
Finalmente se examinó la actividad de los tres mutantes de cisteína de X-LC-Hn en neuronas cultivadas. Como se muestra en la FIG. 3E, mutar la cisteína en la LC (C423S) suprimió la actividad de X-LC-Hn, como se evidencia mediante la ausencia de escisión de VAMP2 en neuronas. Mutar una de las dos cisteínas en la Hn (C461 o C467) no afectó significativamente a la potencia de X-LC-Hn en comparación con el X-LC-Hn de tipo silvestre (WT) (FIG. 3E). Estos resultados confirmaron que el enlace disulfuro intercatenario es esencial para la actividad de BoNT/X y demostraron que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario funcional por medio de o bien C423-C461 o bien C423-C467.
Generación de BoNT/X de longitud completa por medio de ligación mediada por sortasa
Para evaluar si BoNT/X es una toxina funcional, fue necesario generar y someter a prueba BoNT/X de longitud completa. Sin embargo, las BoNT son uno de los agentes de bioterrorismo potenciales más peligrosos. Por tanto, se tomó la precaución necesaria y no se generó el gen de toxina activa de longitud completa. En su lugar, se desarrolló un enfoque para generar cantidades limitadas de BoNT de longitud completa en tubos de ensayo en condiciones controladas mediante la ligación enzimática de dos fragmentos no tóxicos de las BoNT. Este método utiliza una transpeptidasa conocida como sortasa, que reconoce motivos de péptido específicos y une covalentemente dos péptidos entre sí formando un enlace peptídico nativo (FIG.4A). Este enfoque se ha utilizado previamente para generar toxinas quiméricas y otras proteínas de fusión5051.
Se generó una sortasa A modificada mediante ingeniería, conocida como SrtA*, de Staphylococcus aureuS51. SrtA* reconoce el motivo de péptido LPXTG (SEQ ID NO: 57), escinde entre T-G y forma de manera concurrente un nuevo enlace peptídico entre la proteína que contiene LPXTG (SEQ ID NO: 57) y otras proteínas/péptidos que contienen una o más glicinas N-terminal (FIG. 4A). Se produjeron dos fragmentos no tóxicos de BoNT/X: (1) LC-Hn con motivo LPETGG (SEQ ID NO: 58) y una etiqueta His6 fusionada al extremo C-terminal; (2) la Hc de BoNt /X (X-Hc) con una etiqueta GST y sitio de escisión de trombina en su extremo N-terminal. El corte mediante trombina libera X-Hc con una glicina libre en el extremo N-terminal. La incubación de estos dos fragmentos con SrtA* generó una cantidad limitada de BoNT/X de longitud completa de ~ 150 kD que contenían un ligador corto (LPETGS, SEQ ID NO: 59) entre LC-Hn y Hc (FIGs. 4A-4B).
Se observó que X-Hc mostró una fuerte tendencia a la agregación en disolución por motivos desconocidos una vez que se corta de la etiqueta GST, lo que puede ser el motivo por el cual la eficiencia de ligación es baja para BoNT/X (FIG. 4B). Por el contrario, la ligación de X-LC-Hn con la Hc de BoNT/A (A-Hc) usando el mismo enfoque consiguió una eficiencia mucho mayor, con la mayoría del X-LC-Hn ligado a una toxina quimérica XA de longitud completa (FIG.
8A).
BoNT/X es activo en neuronas cultivadas
Para analizar la actividad de BoNT/X de longitud completa, se usaron neuronas corticales de rata cultivadas como sistema modelo. Las neuronas se expusieron a la mezcla de ligación de sortasa y diversas mezclas de control en medios. Se recogieron lisados celulares 12 horas después y se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia para examinar la escisión de proteínas SNARE. Como se muestra en la FIG. 4C, X-LC-Hn solo escindió algo de VAMP2 debido a su alta concentración en la mezcla de reacción. La mezcla de control que contiene X-LC-Hn y X-Hc pero no sortasa aumentó ligeramente la escisión de VAMP2 en comparación con X-LC-Hn solo. Este resultado sugiere que X-Hc puede estar asociado con X-LC-Hn por medio de interacciones no covalentes. Esta interacción parece ser específica, ya que la mezcla de control que contiene X-LC-Hn y A-Hc mostró el mismo nivel de escisión de VAMP2 que X-LC-Hn solo (FIG. 8B). Ligar X-LC-Hn y X-Hc mediante sortasa potenció la escisión de VAMP2 con respecto a la mezcla de X-LC-Hn y X-Hc sin sortasa (FIG. 4C), lo que demuestra que el BoNT/X de longitud completa ligado puede entrar en las neuronas y escindir VAMP2. De manera similar, la toxina quimérica XA de longitud completa ligada también entró en las neuronas y escindió VAMP2 (FIG. 8B).
Mezclar X-Hc con X-LC-Hn aumentó las cantidades de agregados en la parte superior del gel de SDS-PAGE en comparación con X-LC-Hn solo. Estos agregados desaparecieron en presencia de DTT, lo que sugiere que una porción del X-Hc formó un enlace disulfuro intermolecular con X-LC-Hn. La presencia de DTT también aumentó la cantidad de BoNT/X de longitud completa ligado, lo que sugiere que una porción de BoNT/X se agregó por medio de enlace disulfuro intermolecular (FIG. 4B). La formación de estos agregados pudo reducir significativamente las concentraciones de monómero de toxina efectivas en disolución. Esto podría ser una debilidad intrínseca de la secuencia de BoNT/X. X-Hc contiene una única cisteína (C1240) y mutar esta cisteína no afectó a la actividad de BoNT/X ligado (FIG. 9). Además, el mutante C1240S puede combinarse con mutaciones C461S o C467S en el X-LC-Hn para generar un BoNT/X modificado sin cisteínas libres (FIG. 9). Estas toxinas mutantes mantuvieron los mismos niveles de actividad que WT BoNT/X, pero son más estables en disolución como monómeros que WT BoNT/X.
BoNT/X indujo parálisis flácida in v iv o en ratones
Se examinó si BoNT/X es activo in vivo usando un ensayo no letal ampliamente establecido en ratones, conocido como puntuación de abducción digital (DAS, Digit Abduction Score). Este ensayo mide para parálisis muscular local tras la inyección de las BoNT en músculos de extremidades traseras de ratones5253. Las BoNT provocan parálisis flácida de los músculos de las extremidades, lo que puede detectarse mediante la falta de extensión de los dedos durante la respuesta ante la sorpresa. Se inyectó una mezcla de reacción de sortasa activada (FIG. 4B, carril 7) en los músculos del gastrocnemio de la extremidad trasera derecha en ratones. En el plazo de 12 horas, la extremidad derecha desarrolló parálisis flácida típica y los dedos no pudieron extenderse (FIG. 4D). Estos resultados confirmaron que BoNT/X es capaz de provocar parálisis flácida in vivo como otras BoNT.
BoNT/X no se reconoció por antisueros creados frente a todas las BoNT conocidas
Para confirmar adicionalmente que BoNT/X es una BoNT serológicamente única, se llevaron a cabo ensayos de transferencia puntual usando antisueros creados frente a BoNT conocidas, incluyendo los siete serotipos así como una toxina mosaico (BoNT/DC). Se utilizaron cuatro antisueros de caballo (anti-BoNT/A, B y E trivalente, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC y anti-BoNT/F), así como dos antisueros de cabra (anti-BoNT/G y anti-BoNT/D). Estos antisueros fueron todos capaces de neutralizar sus BoNT diana correspondientes e impidieron la escisión de proteínas SNARE en neuronas (FIG. 10), validando así su especificidad y potencia. Como se muestra en la FIG. 4E, estos antisueros reconocieron sus toxinas diana correspondientes, pero ninguno de ellos reconoció BoNT/X. Obsérvese que los antisueros creados frente a BoNT/DC y BoNT/C reaccionan de manera cruzada entre sí, ya que comparten un algo grado de similitud en su Hc . Estos resultado establecieron a BoNT/X como un nuevo tipo serológico de las BoNT.
BoNT/X inactivo de longitud completa
Finalmente, se examinó si BoNT/X de longitud completa puede producirse como proteína soluble. Para garantizar el requisito de bioseguridad, se introdujeron mutaciones en la LC de BoNT/X que inactivan su toxicidad. Se ha mostrado que mutaciones en dos residuos R362A/Y365F en BoNT/A inactivan la actividad proteasa de la LC in vitro y suprimen la toxicidad de BoNT/A de longitud completa en ratones in vivo54-56. Estos dos residuos están conservados en todas las BoNT, incluyendo BoNT/X. Por tanto, se introdujeron las mutaciones correspondientes en estos dos sitios (R360A/Y363F en BoNT/X). Como se muestra en la FIG. 4F, esta forma inactivada de longitud completa de BoNT/X (BoNT/Xry) se produjo y se purificó como proteína etiquetada con His6 en E. coli de manera recombinante. No tiene ninguna actividad sobre las neuronas, ya que VAMP2 no se escindió en las neuronas (FIG. 11).
Una porción sustancial de BoNT/Xry formó agregados en la parte superior del gel de SDS-PAGE (FIG. 4F). Esto se debe probablemente a la formación del enlace disulfuro intermolecular a partir de la cisteína extra en la región ligadora y la cisteína en la Hc, ya que la adición DTT convirtió los agregados en Bo NT/Xry monomérico (FIG. 4F). Mutar estas cisteínas no afecta a la actividad de BoNT/X (FIG. 9) y tiene el beneficio de impedir la formación del enlace disulfuro intermolecular y agregaciones de BoNT/X.
Una forma inactiva de BoNT/X puede utilizarse como vehículo para suministrar agentes terapéuticos a neuronas. La inactivación puede conseguirse mediante mutaciones en uno cualquiera de los siguientes residuos o sus combinaciones: R360, Y363, H227, E228 o H231, formando los últimos tres residuos el motivo de proteasa conservado.
Purificación de BoNT/X inactivo de longitud completa a escala industrial
Se investigó si BoNT/X de longitud completa puede purificarse hasta un alto grado de pureza y con un buen rendimiento, lo que será importante para la producción industrial de BoNT/X (o su derivado) como toxina terapéutica. Se sometieron a prueba varios parámetros de crecimiento y expresión celular, tal como temperatura, tiempo de inducción y concentraciones de IPTG. Los parámetros óptimos elegidos para la expresión de proteína fueron cultivo de las células a 37°C hasta que alcanzaron un crecimiento exponencial, fase en la cual se redujo la temperatura hasta 18°C y se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 1 mM a los medios. Entonces se cultivaron las células durante de 16 a 18 horas antes de la recogida. Se verificó la presencia de BoNT/X mediante SDS-PAGE y mostró un alto nivel de sobreexpresión en la fracción soluble (FIG. 11B).
Se llevaron a cabo varios ensayos de purificación a pequeña escala para optimizar el proceso de producción. La lisis celular mecánica usando un Emulsiflex-C3 (Avestin, Mannheim, Alemania) fue el método preferido para la extracción de proteína intracelular y pareció ser más eficiente que la sonicación. También tuvieron que evaluarse diversas condiciones de tampón para la recuperación óptima de BoNT/X. Se incluyó un agente reductor a lo largo de todo el proceso de purificación y disminuyó enormemente la propensión a una agregación no deseada. Adicionalmente, se usó glicerol como aditivo durante la fase temprana del proceso de purificación y mejoró la estabilidad de la proteína.
El constructo BoNT/X se expresó con una etiqueta HIS6 que podría usarse para cromatografía de afinidad como primera etapa de purificación. Para ensayos a pequeña escala, se usó una columna HIsTrapFF de 5 ml (GE Healthcare, Danderyd, Suecia). Con el fin de conseguir la mayor pureza desde la cromatografía inicial, se sometieron a prueba diversas concentraciones de imidazol. BoNT/X eluyó a partir de una concentración de 100 mM de imidazol; sin embargo, un contaminante importante se purificó de manera conjunta fácilmente con la toxina. Este contaminante parecía interaccionar de manera no específica con BoNT/X y se identificó mediante espectrometría de masas como proteína huésped de E. coli (proteína de resistencia a polimixina bifuncional ArnA). La presencia de este contaminante se redujo drásticamente con la introducción de una alta concentración de sal (NaCl 500 mM) y llevando a cabo una etapa de lavado adicional a 100 mM de imidazol durante la purificación. Esto permitió la elución de una fracción de BoNT/X más pura a 250 mM de imidazol. Esta última fracción pudo refinarse entonces mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Una vez a punto, este protocolo se aumentó a escala expresando hasta 12 l de medios con las condiciones descritas anteriormente. Adicionalmente, se preparó una matriz de cromatografía de afinidad más grande que consistía en 15 ml de agarosa Protino® Ni-NTA (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) para aumentar el rendimiento de recuperación de BoNT/X. La etapa de purificación final se realizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superdex200-16/60 (GE Healthcare, Danderyd, Suecia). Usando este método se obtuvo entre el 85 y el 90% de pureza (FIG. 11C). La proteína pudo concentrarse (usando un concentrador Vivaspin con un punto de corte a 100 kDa; GE Healthcare, Danderyd, Suecia) y pareció ser estable hasta 10 mg/ml. Los detalles completos del proceso de producción de proteína se describen más adelante. El rendimiento de BoNT/X obtenido fue de aproximadamente 3 mg por litro de cultivo celular. Conjuntamente estos resultados demostraron que BoNT/X puede purificarse a escala industrial hasta una alta pureza.
Obsérvese que la purificación se realizó en presencia de agente reductor, lo que pudo reducir el enlace disulfuro entre la LC y la HC, de modo que la toxina purificada no estuviera activa. Sin embargo, un derivado de BoNT/X diseñado que contiene mutaciones en los sitios de cisteína (una mutación en C461 o C467, combinada con mutar C1240) podría purificarse sin agentes reductores. Obsérvese que una forma inactiva de BoNT/X (y su derivado de mutación de cisteína) puede utilizarse como vehículo para suministrar agentes terapéuticos a las neuronas. La inactivación puede conseguirse mediante mutaciones en uno cualquiera de los siguientes residuos o sus combinaciones: R360, Y363, H227, E228 o H231 (los últimos tres residuos forman el motivo de proteasa conservado).
Identificación de gangliósidos como receptores para BoNT/X
Los gangliósidos son co-receptores lipídicos ampliamente establecidos para todas las BoNT y un motivo de unión a gangliósido está bien conservado en BoNT/X (FIG. 1C). Se usó BoNT/X inactivo de longitud completa altamente purificado para examinar si BoNT/X se une a células neuronales por medio de gangliósidos. Se desarrolló un ensayo ELISA in vitro para someter a prueba la interacción con cuatro gangliósidos de cerebro principales: GD1a, GD1b, GT1b y GM1. Se usó A-LC como control negativo para evaluar la unión no específica. También se realizó una comparación directa con el dominio de unión a receptor de BoNT/A (A-HC). Se detectó unión de proteínas usando un anticuerpo anti-etiqueta His6. Se encontró que BoNT/X mostraba una unión dependiente de la dosis a los cuatro gangliósidos con respecto al nivel de unión no específica de A-LC (FIG. 12), lo que sugiere que BoNT/X es capaz de utilizar los cuatro gangliósidos de cerebro como co-receptores. Según informes previos, BoNT/A presentaba una preferencia igual por GD1a y GT1b (FIG 12F) y su resto NAcGal-Gal-NAcNeu terminal (con valores EC50 aparentes de 0,7 y 1,0 gM, respectivamente, cuando se ajustó con un modelo de dosis-respuesta sigmoidal). Por el contrario, BoNT/X mostró una mayor afinidad por GD1b y GM1 con respecto a GD1a y GT1b (FIG 12E). Esto sugeriría que BoNT/X tiene un patrón de reconocimiento de ácido siálico preferido, visto también en BoNT/B y TeNT. BoNT/X presenta el motivo SxWY conservado en una ubicación homóloga a la de las otras toxinas. El hecho de que pudiera reconocer los cuatro gangliósidos, aunque con baja afinidad, puede ser una indicación de múltiples sitios de unión a carbohidrato.
Discusión
Se ha identificado el octavo serotipo de las BoNT más de 45 años tras la identificación del último serotipo de BoNT importante. BoNT/X tiene la menor identidad de secuencia de proteína con cualquier otra BoNT y TeNT entre esta familia de toxinas, y este bajo nivel de identidad está distribuido uniformemente a lo largo de la secuencia de la toxina. Como se esperaba, BoNT/X no se reconoció por ningún antisuero creado frente a las BoNT conocidas. Claramente representa una rama evolutiva única y distinta de la familia de las toxinas.
BoNT/X se reveló buscando en secuencias genómicas de cepas de Clostridium botulinum y representa el primer tipo de toxina importante identificado mediante un enfoque de secuenciación genómica y bioinformática. La cepa 111 que contiene el gen BoNT/X se identificó inicialmente a partir de un paciente con botulismo infantil en la década de 1990. Caracterizaciones previas usando un ensayo de neutralización clásica han establecido BoNT/B2 como la principal toxina de esta cepa. Es probable que BoNT/X sea un gen de toxina silencioso, o no se expresó a niveles de toxicidad detectables en las condiciones de cultivo en el laboratorio. Por tanto, solo puede identificarse secuenciando la cepa 111. Esto ilustra la importancia de los enfoques de secuenciación genómica y bioinformática para entender factores virulentos microbianos.
Genes BoNT silenciosos se han encontrado de manera frecuente previamente en diversas cepas de Clostridium botulinum. No está claro por qué estas bacterias mantienen un gen de toxina silencioso. Podría ser un gen degenerado de manera evolutiva. Este es claramente el caso cando los genes de toxina silenciosos contienen mutaciones de codón de parada prematuras. Sin embargo, hay también casos en los que el gen silencioso codifica una BoNT de longitud completa. Si estas BoNT de longitud completa silenciosas pueden expresarse y presentar toxicidad en ciertas condiciones ambientales sigue siendo una cuestión intrigante.
Las funciones y estructuras de tres dominios generales de las BoNT están bien conservadas en BoNT/X, pero también tiene unas pocas características únicas: (1) comparte VAMP como su diana en neuronas con BoNT/B, D, F y G, pero corta VAMP en un sitio novedoso (R66-A67 en VAMP2) que es único para esta toxina. Esto expande adicionalmente el repertorio de toxinas que pueden usarse para la ablación de VAMP en diferentes sitios. (2) El enlace disulfuro intercatenario que conecta LC y Hn está conservado en BoNT/X, pero también contiene una cisteína adicional única en la región ligadora, lo que puede conducir a redistribución del enlace disulfuro. La cisteína extra en Hn no es esencial para la actividad de lC-Hn (FIG. 3D) y mutarla tiene el beneficio de impedir la formación del enlace disulfuro intermolecular (FIGs. 3D, 4B).
El fragmento de X-LC-Hn etiquetado con His6 es estable en tampones como proteínas recombinantes. Mostró un mayor nivel de actividad en neuronas que tanto A-LC-Hn como B-LC-Hn (FIG. 3B), lo que sugiere que su translocación de membrana y/o actividad proteasa puede ser más eficiente que los fragmentos correspondientes en BoNT/A y BoNT/B. X-LC-Hn podría ser un reactivo útil para seleccionar como diana VAMP1/2/3 en una amplia gama de tipos celulares y tejidos ya que su entrada puede no estar restringida a neuronas. Por ejemplo, puede utilizarse potencialmente para reducir el dolor en una región local seleccionando como diana tanto neuronas sensoriales como otras células que secretan señales inflamatorias. También podría usarse para generar toxinas quiméricas, tales como XA (FIG. 8).
X-Hc es funcional ya que su presencia aumentó la escisión de VAMP2 en neuronas con respecto a LC-HN solo (FIG.
4C). Sin embargo, X-Hc puede tener algunas características desfavorables que siguen sin haberse evaluado adicionalmente. Por ejemplo, solo se produjeron niveles suficientes de X-Hc soluble cuando se fusionó con GST, que se conoce que facilita el plegado/la solubilidad de proteínas, pero con la etiqueta His6. Una vez liberado de la etiqueta GST, X-Hc es propenso a la agregación. Además, la cisteína en X-Hc puede formar también un enlace disulfuro intermolecular (FIG. 4B). El BoNT/X inactivo de longitud completa puede purificarse y existir como proteína soluble, lo que sugiere que el problema de la solubilidad con X-Hc puede deberse al menos parcialmente a la separación de este dominio de X-LC-Hn. Por ejemplo, X-LC-Hn puede interaccionar con X-Hc y cubre sus segmentos hidrófobos potenciales en el contexto de longitud completa, lo que no es inusual para una proteína de múltiples dominios.
Los gangliósidos se han establecido desde hace tiempo como receptores neuronales para todos los subtipos de BoNT. Está demostrado que BoNT/X puede unirse a los cuatro de los gangliósidos más abundantes: GD1a, GD1b, GT1b y GM1. Adicionalmente, lo hace con una diferencia notable en la afinidad y especificidad en comparación con BoNT/A. Esta es una propiedad intrigante, ya que otras BoNT parecen tener diversos grados de preferencias hacia un subgrupo de gangliósidos. Por ejemplo, BoNT/A, E, F y G prefieren GD1a y GT1b. BoNT/X puede reconocer potencialmente una gama más amplia de tipos de neuronas en comparación con otras BoNT.
Es posible que BoNT/X tenga una baja toxicidad in vivo, lo que puede explicar por qué la actividad de BoNT/X no se detectó en el estudio original en la cepa 111. Si este es el caso, la toxicidad reducida se debe probablemente a su dominio Hc, ya que X-LC-Hn parece ser más activo que tanto A-LC-Hn como B-LC-Hn. La formación del enlace disulfuro intermolecular puede reducir también la concentración de toxina efectiva. Será necesario producir BoNT/X nativo de longitud completa con el fin de determinar su potencia in vivo, pero será importante generar antisueros neutralizantes usando fragmentos no tóxicos de BoNT/X antes de producir toxina de longitud completa.
La introducción de gen de toxina activa de longitud completa en cualquier sistema de expresión/organismo es siempre un problema de bioseguridad significativo y se ha convertido en un obstáculo formidable para estudios de estructurafunción de toxinas biológicas. Estas es particularmente una consideración importante para las BoNT ya que son uno de los seis agentes de bioterrorismo potenciales de categoría A4. En este caso se desarrolló un método para ensamblar una cantidad limitada de toxina de longitud completa bioquímicamente a partir de dos fragmentos complementario y no tóxicos. Cada fragmento se expresa y purifica individualmente, y entonces se ligan entre sí mediante sortasa en tubos de ensayo. También pueden utilizarse otros métodos de ligación de proteína tales como sistemas de inteína dividida, que fusionan dos fragmentos de proteína a través de proteína trans-corte y empalme57. Controlando la cantidad de fragmentos precursores en la reacción, puede controlarse estrictamente la cantidad de toxina de longitud completa ligada. Este enfoque “semisintético” puede usarse para producir toxinas biológicas de múltiples dominios y otras proteínas tóxicas en condiciones controladas. También proporciona una plataforma versátil para generar toxinas de fusión y quiméricas, tal como intercambiar la Hc de dos BoNT, reemplazar la Hc de las BoNT con otras proteínas de selección como diana o acoplar una carga adicional a las toxinas. Como no se ha generado nunca un ADNc de toxina de longitud completa y ninguna expresión de toxinas en bacterias ni ningún otro organismo vivo, este enfoque mitiga significativamente los problemas de bioseguridad asociados con la producción de toxinas de tipo silvestre y mutantes y facilitará enormemente los estudios de estructura-función de toxinas biológicas y proteínas tóxicas.
Materiales y métodos
Materiales: Anticuerpos monoclonales de ratón para sintaxina 1 (HPC-1), SNAP-25 (C171.2) y VAMP2 (C169.1) fueron proporcionados generosamente por E. Chapman (Madison, WI) y están disponibles de Synaptic Systems (Goettingen, Alemania). Anticuerpo monoclonal de ratón para actina se adquirió de Sigma (AC-15). Antisueros policlonales equinos frente a BoNT/A/B/E, BoNT/C, BoNT/DC, BoNT/F, y antisueros policlonales de cabra frente a BoNT/G se obtuvieron de la FDA. Anticuerpo policlonal de cabra frente a BoNT/D se adquirió de Fisher Scientific (NB10062469). BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G se adquirieron de Metabiologics (Madison, WI). BoNT/D fue proporcionado generosamente por E. Johnson (Madison, WI).
ADNc y constructos: Se sintetizaron los ADNc que codifican X-LC (residuos 1-439) y X-Hc (residuos 893-1306). El ADNc que codifica X-Hn se generó de manera interna usando el método de ensamblaje de Gibson. Los ADNc que codifican A-LC (residuos 1-425, M30196) y B-LC (residuos 1-439, AB232927) se sintetizaron por GenScript (New Brunswick, NJ). Estas LC se clonaron en vectores pET28 para la expresión como proteínas etiquetadas con His6. X-Hc se clonó en pGEX4T para expresarse como proteína etiquetada con GST. X-LC-Hn, A-LC-Hn y B-LC-Hn se subclonaron en el vector pET28, con una secuencia peptídica LPETGG (SEQ ID NO: 58) fusionada a sus extremos C-terminales, y se purificaron como proteínas etiquetadas con His6. La forma inactiva de longitud completa de BoNT/X se ensambló de manera interna a partir de X-LC mutado (R360A/Y363F), X-Hn y X-Hc . Se clonó en el vector pET28 con una etiqueta His6 fusionada al extremo C-terminal de BoNT/X. El ADNc que codifica VAMP2 de rata fue proporcionado generosamente por E. Chapman (Madison, WI). VAMP2 (1-96) se clonó en el vector pET28 y se expresó como proteína etiquetada con His6. VAMP2 (33-86) se clonó en un vector pGEX4T y se expresó como proteína etiquetada con Gs T. El ADNc que codifica VAMP1, VAMP3 de ratón, VAMP7 y VAMP8 de rata se proporcionó generosamente por C. Hu (Louisville, KY). Se clonaron en vectores pcDNA3.1 modificados, con una etiqueta HA fusionada a sus extremos C-terminales. El constructo que codifica sortasa etiquetada con His6 (SrtA*) se proporcionó generosamente por B. Pentelute (Boston, MA) y se ha descrito previamente51.
Bioinformática: Se buscó la base de datos Uniprot con jackhmmer en el servidor web de HMMER usando una secuencia de tipo A de BoNT (número de registro Uniprot A5HZZ9) hasta convergencia. Las secuencias devueltas se alinearon con Clustal Omega y una red filogenética NeighborNet estimada con SplitsTree4.
Purificación de proteínas: Se utilizó BL21 de E. coli (DE3) para la expresión de proteína. La inducción de la expresión se llevó a cabo con IPTG 0,1 mM a 22°C durante la noche. Se rompieron los sedimentos bacterianos en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) mediante sonicación y se recogieron los sobrenadantes tras la centrifugación a 20000 g durante 30 min a 4°C. La purificación de proteínas se llevó a cabo usando el sistema AKTA Prime FPLC (GE) y las proteínas purificadas se desalinizaron adicionalmente con una columna PD-10 (GE, 17-0851-01). Específicamente, se clonó BoNT/X inactivo de longitud completa (BoNT/Xry) en un vector pET22b. El plásmido correspondiente se transformó en células competentes BL21 de E. coli (DE3). Las colonias resultantes se usaron para inocular 100 ml de cultivos durante la noche de medio TB que contenía 100 pg/ml de carbenicilina en un matraz de agitación de 250 ml y se hicieron crecer a 37°C. Los cultivos para la expresión se hicieron crecer en primer lugar usando un biorreactor LEX (Epiphyte3, Ontario, Canadá) a 37°C en 1,5 l de medios TB hasta que la DO600 alcanzó 0,8. Entonces se redujo la temperatura hasta 18°C para la inducción de la expresión con IPTG 1 mM y se hicieron crecer durante 16-17 horas. Las células se recogieron y resuspendieron en hielo en HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, imidazol 25 mM, glicerol al 5%, TCEP 2 mM para permitir la lisis celular con un Emulsiflex-C3 (Avestin, Mannheim, German) a 20.000 psi. El lisado se ultracentrifugó a 200.000 g durante 45 minutos a 4°C. El sobrenadante se cargó en una columna de agarosa Protino® Ni-NTA de 15 ml (Macherey-Nagen, Düren, Alemania) que se lavó entonces con HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM, glicerol al 5%, TCEP 1 mM. La elución se llevó a cabo con HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM, glicerol al 5%, TCEP 1 mM. El eluido se dializó durante la noche en HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, TCEP 0,5 mM a 4°C. El dializado se concentró usando un concentrador Vivaspin (punto de corte 100 kDa, GE Healthcare, Danderyd, Suecia) antes de cargarse en una columna Superdex200-16/60 (GE Healthcare, Danderyd, Suecia) equilibrada previamente en el mismo tampón que se usó para la diálisis. Se recogió el pico de elución que corresponde a BoNT/X y se concentró de modo que la muestra final estaba a una concentración de 10 mg/ml. Se tomaron alícuotas de la muestra y se congelaron de manera ultrarrápida en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80°C.
Ensayo de unión a gangliósidos: Se disolvieron los gangliósidos purificados GD1a, GD1b, GT1b y GM1 (Carbosynth, Compton, R. U.) en DMSO y se diluyeron en metanol hasta alcanzar una concentración final de 2,5 pg/ml; se aplicaron 100 pl a cada pocillo de una placa de ensayo de PVC de 96 pocillos (n° de catálogo 2595, Corning; Corning, NY). Tras la evaporación del disolvente a 21°C, los pocillos se lavaron con 200 pl de PBS/BSA al 0,1% (p/v). Los sitios de unión no específica se bloquearon mediante incubación durante 2,5 h a 4°C en 200 pl de PBS/BSA al 2% (p/v). Se realizaron ensayos de unión en muestras que contenían 100 pl de PBS/BSA al 0,1% (p/v) por pocillo durante 1 h a 4°C (triplicado) a concentraciones que oscilan entre 6 pM y 0,05 pM (en una dilución de 2 veces en serie). Tras la incubación, los pocillos se lavaron tres veces con PBS/BSA al 0,1% (p/v) y se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-6xHis conjugado con HRP (1:2000, ThermoFisher) durante 1 h a 4°C. Tras tres etapas de lavado con PBS/BSA al 0,1% (p/v), se detectaron las muestras unidas usando Ultra-TMB (100 pl/pocillo, ThermoFisher) como sustrato. La reacción se detuvo tras 15 minutos mediante la adición de 100 pl de H2SO40,2 M y se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de placas Infinite M200PRO (Tecan, Mannedorf, Suiza). Los datos se analizaron con Prism7 (software de GraphPad).
Escisión de proteínas SNARE en extractos de detergente de cerebro (BDE) de rata: Se prepararon BDE de rata a partir de cerebros de rata adulta recién diseccionados tal como se describió previamente58. Brevemente, un cerebro de rata se homogeneizó en 15 ml de tampón sacarosa 320 mM, seguido de una centrifugación a 5000 rpm durante 2 min a 4°C. Los sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron a 11.000 rpm durante 12 min. El sedimento se recogió y se solubilizó durante 30 min en 15 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 20 mM, NaCl 150 mM) más un 2% de Triton X-100 y un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche, CA). Posteriormente se centrifugaron las muestras a 17.000 rpm durante 20 min para eliminar los materiales insolubles. La concentración de BDE final es de ~ 2 mg/ml de proteínas. Se incubaron los BDE (60 pl) con X-LC (0,5 pM), A-LC (1 pM) o B-LC (1 pM), respectivamente, durante 1 hora a 37°C, y entonces se analizaron mediante inmunotransferencia usando el método de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Pierce). Como controles, se incubaron previamente LC con EDTA 20 mM durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) para desactivar su actividad antes de la adición a BDE.
Escisión de VAMP recombinante mediante X-LC: VAMP2 (1 -96) se expresó y se purificó como proteína etiquetada con His6 y VAMP2 (33-86) se expresó y se purificó como proteína etiquetada con GST. Estas proteínas (0,6 mg/ml) se incubaron con X-LC 0,1 pM en tampón TBS durante 1 hora a 37°C. Las muestras o bien se analizaron mediante geles de SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, o bien se sometieron a análisis de espectrometría de masas.
Escisión de VAMP en lisados celulares: VAMP1,3, 7 y 8 etiquetadas con HA de longitud completa se transfectaron a células HEK293 usando reactivos de transfección PolyJet (SignaGen, MD) siguiendo la instrucción del fabricante. Se recogieron lisados celulares 48 horas después en tampón RIPA (Tris 50 mM, NP40 al 1%, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, 400 pl por placa de 10 cm) más un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich). Los lisados celulares (250 pl) se incubaron con X-LC (0,5 pM) durante 1 hora a 37°C. Entonces se analizaron las muestras mediante inmunotransferencia.
Análisis de proteínas completas mediante LC-MS/MS: Las muestras se analizaron en la Taplin Biological Mass Spectrometry Core Facility en la facultad de medicina de Harvard. Brevemente, se cargaron muestras de proteínas completas sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 con diámetro interno de 100 pm empaquetadas con 3 cm de perlas fuera de línea usando una celda de presión. La columna volvió a acoplarse a una bomba Accela 600 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se usó gradiente rápido de acetonitrilo creciente para eluir el proteína/péptido de la columna de HPLC. A medida que se eluyeron los péptidos, se sometieron a ionización por electrospray y entonces se introdujeron en un espectrómetro de masas con trampa iónica LTQ Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para obtener un barrido FTMS de alta resolución a una resolución de 60000, un segundo barrido a baja resolución en la trampa iónica y un barrido final para realizar MS/MS dependiente de los datos. Las envueltas de estado de carga se desenrollaron manualmente para obtener masas monoisotópicas cuando fuera posible o masas promedio para las proteínas. La identidad de péptido y de proteína se determinaron emparejando bases de datos de proteínas con el patrón de fragmentación adquirido mediante el programa de software, Sequest (Thermo Fisher Scientific). Todas las bases de datos incluyen una versión inversa de todas las secuencias y los datos se filtraron a entre un uno y un dos por ciento de tasa de descubrimiento falso de péptido.
Identificación del sitio de escisión de proteasa entre LC y Hn : Un fragmento de X-LC-Hn recombinante etiquetado con His6 (residuos 1-891) se purificó en E. coli y se sometió a proteólisis limitada mediante endoproteinasa Lys-C (Sigma P2289, relación molar de 100:1 (toxina:Lys-C), 25 minutos a temperatura ambiente). El sitio de escisión se determinó mediante el enfoque de marcado con Tandem Mass Tag (TMT) y espectrometría de masas en tándem. Brevemente, muestras de X-LC-Hn intactas se marcaron con la TMT ligera y una cantidad igual de muestras de X-LC-Hn se expusieron a Lys-C y entonces se marcaron con la TMT pesada. Ambas muestras se digirieron entonces con quimotripsina, se combinaron entre sí y se sometieron a análisis de espectrometría de masas cuantitativa.
Alquilación de cisteína mediante NEM: Un fragmento de X-LC-Hn activado con Lys-C se diluyó en tampón fosfato de sodio (10 mM, pH 6,5) a la concentración final de 0,3 mg/ml, con o sin NEM a las concentraciones indicadas (20, 10 y 5 mM) y se incubó durante 10 minutos a TA. Se preparó recientemente NEM en tampón fosfato de sodio. Las muestras se mezclaron con 3 x tintes de carga neutros (Tris 200 mM pH 6,8, glicerol al 30%, dodecilsulfato de litio al 6%, NEM 10 mM y BPB al 0,06%). Para las muestras sin NEM se usó el mismo 3 x colorante de carga de SDS sin NEM. Las muestras se incubaron adicionalmente con el colorante de carga a TA durante 10 minutos, se calentaron durante 10 min a 55°C y entonces se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.
Cultivo de neuronas y análisis de inmunotransferencia: Se prepararon neuronas corticales de rata primarias a partir de embriones E18-19 usando un kit de disociación de papaína (Worthington Biochemical, NJ), tal como describimos previamente58. Se llevaron a cabo experimentos en DIV 14-16. Las neuronas se expusieron a fragmentos de BoNT/X o mezcla de ligación de sortasa en medios durante 12 h. Entonces se lavaron las células y se lisaron con tampón RIPA (Tris 50 mM, NP40 al 1%, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%) más un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich). Los lisados se centrifugaron durante 10 min a velocidad máxima usando una microcentrífuga a 4°C. Los sobrenadantes se sometieron a SDS-PAG y análisis de inmunotransferencia.
Transferencia puntual: Se mancharon BoNT (0,2 pg en 1 pl) sobre membranas de nitrocelulosa y se secaron (10 minutos a temperatura ambiente). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche en TBST (TBS más Tween20 al 0,05%) durante 30 min y entonces se incubaron con los antisueros indicados (dilución 1:500) durante 30 min. Entonces se lavaron las membranas tres veces con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (peroxidasa del rábano) durante 30 min, se lavaron tres veces más con TBST y se analizaron con el método ECL (Pierce). Observamos que la muestra de BoNT/X se componía de X-LC-Hn y X-Hc purificados a una relación de 1:1.
Ligación mediada por sortasa: Se escindió GST-X-Hc durante la noche a 4°C mediante trombina antes de añadirlo a la mezcla de proteínas. La reacción de ligación se configuró en tampón TBS 50 pl con adición de X-LC-Hn (8 pM), GST-X-Hc escindido mediante trombina (25 pM), Ca2+ (10 mM) y sortasa (10 pM), durante 40 min a TA. En la FIG. 4C, las neuronas se expusieron a 5 pl de la mezcla en medios durante 12 h. En el ensayo DAS descrito en la FIG. 4D, se inyectaron 25 pl de la mezcla en la pata trasera de ratones.
Ensayo DAS: La mezcla de ligación de sortasa se activó en primer lugar con proteólisis limitada usando tripsina (relación molar 60:1 (la cantidad total de las proteínas:tripsina), 30 min a TA). Elegimos tripsina en lugar de Lys-C en este caso ya que podemos detener la proteólisis añadiendo inhibidor de tripsina (inhibidor de tripsina de haba de soja, relación 1:10 (tripsina:inhibidor de tripsina). Se anestesiaron los ratones (cepa CD-1,21 -25 g, n = 6) con isoflurano (3-4%) y se les inyectó mezcla de ligación de sortasa usando una aguja de calibre 30 acoplada a las jeringas Hamilton estériles, en los músculos del gastrocnemio de la extremidad trasera derecha. Las BoNT dan como resultado parálisis de la pata trasera en la respuesta ante la sorpresa. Se observó parálisis muscular en el plazo de 12 horas tras la inyección tal como se describió previamente5253.
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Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un polipéptido de neurotoxina botulínica clostridial (BoNT) aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 3, comprendiendo opcionalmente el polipéptido de BoNT aislado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, no reaccionando de manera cruzada el polipéptido de BoNT con un anticuerpo frente al serotipo A, B, C, D, E, F o G de BoNT.
  2. 2. - El polipéptido de BoNT aislado según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 2, comprendiendo opcionalmente el polipéptido de BoNT aislado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
  3. 3. - El polipéptido de BoNT aislado según la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con SEQ ID NO: 1, comprendiendo opcionalmente el polipéptido de BoNT aislado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
  4. 4. - El polipéptido de BoNT/X modificado según la reivindicación 3, que comprende una o más mutaciones de sustitución en una posición que corresponde a C461, C467 o C1240 de SEQ ID NO: 1, en el que opcionalmente
    (i) la mutación de sustitución corresponde a C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S o C467A/C1240A en SEQ ID NO: 1, o
    (ii) el polipéptido de BoNT/X modificado comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 4-17.
  5. 5. - El polipéptido de BoNT/X modificado según la reivindicación 2, que comprende una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de SEQ ID NO: 2, en el que opcionalmente
    (i) la mutación de sustitución corresponde a C461S, C461A, C467S o C467A en SEQ ID NO: 2, o
    (ii) el polipéptido de BoNT/X modificado comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 18-21.
  6. 6. - El polipéptido de BoNT/X modificado según la reivindicación 3, que comprende una o más mutaciones de sustitución en una posición que corresponde a R360, Y363, H227, E228 o H231 en SEQ ID NO: 1, en el que opcionalmente
    (i) la una o más mutaciones de sustitución corresponden a R360A/Y363F, H227Y, E228Q o H231Y en SEQ ID NO: 1, o
    (ii) el polipéptido de BoNT/X modificado comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 31-38.
  7. 7. - El polipéptido de BoNT/X modificado según la reivindicación 6, que comprende además una única mutación de sustitución en una posición que corresponde a C461 o C467 de SEQ ID NO: 1, correspondiendo opcionalmente la única mutación de sustitución a C461A, C461S, C467A o C467S en SEQ ID NO: 1.
  8. 8. - El BoNT/X modificado según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que comprende además una mutación de sustitución en una posición que corresponde a C1240 de SEQ ID NO: 1.
  9. 9. - Una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%, o el 100% con el polipéptido de BoNT según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8.
  10. 10. - Un vector de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9.
  11. 11. - Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o el vector de ácido nucleico según la reivindicación 10.
  12. 12. - Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de BoNT según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, comprendiendo además opcionalmente la composición farmacéutica un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  13. 13. - El polipéptido de BoNT modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en terapia.
  14. 14. - El polipéptido de BoNT modificado o la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 13, para tratar un estado asociado con actividad neuronal no deseada, estado asociado opcionalmente el estado con neuronas o glándulas hiperactivas, seleccionándose opcionalmente el estado del grupo que consiste en: disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurógena, anismo, espasticidad de extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, estados dermatológicos, obesidad/apetito reducido.
  15. 15. - El polipéptido de BoNT modificado o la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 13, no estando asociado el estado con actividad neuronal no deseada, seleccionándose opcionalmente el estado del grupo que consiste en: psoriasis, alergia, linfohistiocitosis hemofagocítica y enfermedad pancreática alcohólica.
  16. 16. - El polipéptido de BoNT según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8 ligado a un agente terapéutico, siendo el polipéptido de BoNT adecuado para suministrar el agente terapéutico a células diana, siendo opcionalmente las células diana neuronas.
  17. 17. - Un método no terapéutico de tratamiento de un estado cosmético o estético usando el polipéptido de BoNT según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, siendo opcionalmente el estado surcos en el entrecejo o arrugas de la piel.
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