KR20190026834A - 신규 보툴리눔 신경독소 및 그의 유도체 - Google Patents

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Abstract

신규 혈청형 (BoNT/X)의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드 및 BoNT 폴리펩티드를 예를 들어 치료 용도로 제조 및 사용하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

신규 보툴리눔 신경독소 및 그의 유도체
관련 출원
본 출원은 2016년 7월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/360,239를 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여된 R01NS080833 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridial Botulinum) 신경독소 (BoNT)는 가장 위험한 잠재적 생물테러 작용제 중 하나이고, 또한 증가하는 목록의 의학적 상태를 치료하는 데 임상적으로 사용된다. 지금까지 7종의 BoNT 혈청형 (BoNT/A-G)이 공지되어 있다. 최근 수년간, BoNT는 증가하는 목록의 의학적 상태를 치료하는 데 폭넓게 사용되어 왔다: 미량의 독소의 국부 주사는 표적화된 영역에서 뉴런 활성 약화시킬 수 있으며, 이는 많은 의학적 상태에서 뿐만 아니라 미용 목적을 위해 유익할 수 있다. BoNT의 적용이 증가함에 따라, 한계 및 유해 효과가 보고되었다. 주요 한계는 환자에서의 중화 항체의 생성이며, 이는 향후 치료를 비효과적으로 만든다. BoNT 사용의 종료에 의해 종종 환자는 그의 장애를 치료/완화시키는 다른 효과적인 방식이 없게 된다. BoNT 사용과 연관된 유해 효과는 일시적인 비-심각한 사건, 예컨대 안검하수증 및 복시에서부터 생명-위협 사건, 심지어 사망에 이른다. BoNT의 한계 및 유해 효과는 용량과 크게 상관관계가 있다. 치료 독소로서 신규 BoNT 유형을 개발하는 데 상당한 관심이 존재한다. 지난 45년 동안 새로운 BoNT 유형은 인식되지 않았다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 게놈 데이터베이스를 검색하는 것으로부터 신규 BoNT 혈청형 BoNT/X를 확인하는 것에 기초한다. BoNT/X는 다른 BoNT와 가장 낮은 서열 동일성을 가지며, 공지된 BoNT 유형에 대해 생성된 항혈청에 의해 인식되지 않는다. BoNT/X는 다른 BoNT와 같이, SNARE 단백질을 절단한다. 그러나, BoNT/X는 또한 다른 BoNT가 절단할 수 없는 여러 SNARE 단백질, 예를 들어 VAMP4, VAMP5 및 Ykt6을 절단한다. BoNT/X를 사용하여 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. BoNT/X를 제조하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 1에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 2에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 3에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 1의 C461, C467 및 C1240에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 치환 돌연변이(들)는 서열식별번호: 1에서의 C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S 또는 C467A/C1240A에 상응한다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 것에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 2의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 단일 치환 돌연변이를 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 치환 돌연변이는 서열식별번호: 2에서의 C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S 또는 C467A/C1240A에 상응한다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 것에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 측면은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에서의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 단일 치환 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 세포에 진입한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 세포 내 SNARE 단백질을 절단한다. 일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6, 및 신탁신 1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP1이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 39의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP2이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 40의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP3이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 41의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP4이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 42의 K87 및 S88에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP5이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 43의 R40 및 S41에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 Ykt6이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 44의 K173 및 S174에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 그의 상응하는 야생형 BoNT 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 분비 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 뉴런 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 뉴런 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 이완성 마비를 유발한다. 일부 실시양태에서, 세포는 배양된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 래트이다.
일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, 또는 G에 대한 항체와 교차 반응하지 않는다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드를 발현한다.
본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 배양물로부터 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 (a) 프로테아제 도메인; (b) 변형된 링커 영역; 및 (c) 전위 도메인을 포함하며; 여기서 (a), (b), 및 (c)는 BoNT 혈청형 X로부터의 것이고, 변형된 링커 영역은 서열식별번호: 1의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 (d) 수용체 결합 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 링커 영역은 서열식별번호: 1에서의 C461S 또는 C461A에 상응하는 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 링커 영역은 서열식별번호: 1에서의 C467S 또는 C467A에 상응하는 치환 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인은 BoNT/X로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인은 변형된다. 일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인은 서열식별번호: 1에서의 C1240S 또는 C1240A에 상응하는 치환 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인은 A, B, C, D, E, F, 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형으로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 세포에 진입한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 세포 내 SNARE 단백질을 절단한다. 일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6, 및 신탁신 1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP1이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 39의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP2이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 40의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP3이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 41의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP4이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 42의 K87 및 S88에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 VAMP5이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 43의 R40 및 S41에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, SNARE 단백질은 Ykt6이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 서열식별번호: 44의 K173 및 S174에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단한다.
일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 그의 상응하는 야생형 BoNT 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 분비 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 뉴런 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 뉴런 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 이완성 마비를 유발한다. 일부 실시양태에서, 세포는 배양된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 래트이다.
일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, 또는 G에 대한 항체와 교차 반응하지 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 링커 영역은 인공 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인공 링커는 프로테아제의 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 트롬빈, TEV, 프리시전 (3C 프로테아제), 인자 Xa, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20, 그랜자임-B, 및 엔테로키나제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 50-60 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드를 발현한다.
본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 배양물로부터 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 서열식별번호: 1에서의 R360, Y363, H227, E228, 또는 H231에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 치환 돌연변이는 서열식별번호: 1에서의 R360A/Y363F, H227Y, E228Q 또는 H231Y에 상응한다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 것에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 다른 측면은 a) 불활성 프로테아제 도메인; b) 링커 영역; 및 c) 전위 도메인을 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X는 수용체 결합 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 불활성 프로테아제 도메인은 서열식별번호: 1의 R360, Y363, H227, E228 또는 H231에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 치환 돌연변이는 서열식별번호: 1의 R360A/Y363F, H227Y, E228Q, 또는 H231Y에 상응한다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 세포에 진입한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT 폴리펩티드는 SNARE 단백질을 절단하지 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 (b)의 링커 영역에서의 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 영역에서의 변형은 서열식별번호: 1의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 치환 돌연변이는 서열식별번호: 1에서의 C461A, C461S, C467A, 또는 C467S에 상응한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 (d)의 수용체 결합 도메인에서의 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인에서의 변형은 서열식별번호: 1의 C1240에 상응하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드를 발현한다.
본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 배양물로부터 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
치료제를 뉴런 내로 전달하기 위한 전달 비히클로서의 본원에 기재된 변형된 BoNT 폴리펩티드의 용도가 본원에 추가로 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면은 제2 부분에 연결된 제1 부분을 포함하며, 여기서 제1 부분은 본원에 기재된 변형된 BoNT 폴리펩티드인 키메라 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 부분 및 제2 부분은 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 부분 및 제2 부분은 비-공유 연결된다.
일부 실시양태에서, 제2 부분은 소분자, 핵산, 짧은 폴리펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 부분은 생물활성 분자이다. 일부 실시양태에서, 제2 부분은 비-폴리펩티드 약물이다. 일부 실시양태에서, 제2 부분은 치료 폴리펩티드이다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 키메라 BoNT 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 본원에 기재된 키메라 BoNT 폴리펩티드를 발현한다.
본 개시내용의 키메라 BoNT 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 키메라 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 키메라 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 배양물로부터 키메라 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
이러한 제약 조성물 및 제약 조성물의 치료적 투여에 대한 지침서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드, 키메라 분자 또는 제약 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하여 상태를 치료하는 단계를 포함하는, 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상태는 과활성 뉴런 또는 선과 연관된다. 일부 실시양태에서, 상태는 연축성 발성장애, 연축성 사경, 후두 이상긴장증, 구강하악 발성장애, 설측 이상긴장증, 경부 이상긴장증, 초점성 손 이상긴장증, 안검연축, 사시, 편측안면 연축, 안검 장애, 뇌성 마비, 초점성 경직 및 다른 음성 장애, 연축성 결장염, 신경원성 방광, 항문경, 사지 경직, 틱, 진전, 이갈이, 치열, 무이완증, 연하곤란 및 다른 근긴장도 장애 및 근육군의 불수의 운동을 특징으로 하는 다른 장애, 누루, 다한증, 과다 타액분비, 과다 위장액 분비, 분비 장애, 근육 연축으로부터의 통증, 두통, 피부과적 또는 미적/미용 상태, 및 비만/감소된 식욕으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상태는 원치않는 뉴런 활성과 연관되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상태는 건선, 알레르기, 혈구포식성 림프조직구증식증, 및 알콜성 췌장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 투여는 원치않는 뉴런 활성이 존재하는 곳에의 주사를 통해 이루어진다.
본 개시내용의 또 다른 측면은
(i) 경쇄 (LC) 및 중쇄의 N-말단 도메인 (HN)을 포함하는 제1 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 단편을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 BoNT 단편은 C-말단 LPXTGG (서열식별번호: 60) 모티프를 포함하는 것인 단계;
(ii) 중쇄의 C-말단 도메인 (HC)을 포함하는 제2 BoNT 단편을 수득하는 단계이며, 여기서 제2 BoNT 단편은 그의 N-말단에서 특이적 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것인 단계;
(iii) 특이적 프로테아제로 제2 BoNT 단편을 절단하는 단계이며, 여기서 절단은 N-말단에서 유리 글리신 잔기를 생성하는 것인 단계; 및
(iv) 트랜스펩티다제의 존재 하에 제1 BoNT 단편 및 제2 BoNT 단편을 접촉시킴으로써, 제1 BoNT 단편 및 제2 BoNT 단편을 라이게이션하여 라이게이션된 BoNT를 형성하는 단계
를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 BoNT 단편은 친화성 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 N-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 C-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, 칼모듈린, 소프태그 1, 소프태그 3, TC, V5, VSV, 엑스프레스, 할로, 및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 친화성 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 N-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 C-말단에서 제2 BoNT 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, 칼모듈린, 소프태그 1, 소프태그 3, TC, V5, VSV, 엑스프레스, 할로, 및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 프로테아제는 트롬빈, TEV, 프리시전, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20, 그랜자임-B, 엔테로키나제, 및 SUMO 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 동족 프로테아제는 트롬빈이다.
일부 실시양태에서, 제1 BoNT 단편은 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 X로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 BoNT 단편은 BoNT/X로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 X로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 BoNT/A로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 BoNT/B로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 BoNT/C로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 BoNT/X로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 트랜스펩티다제는 소르타제이다. 일부 실시양태에서, 소르타제는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 것이다 (SrtA).
본 개시내용의 이들 및 다른 측면, 뿐만 아니라 다양한 이점 및 유용성은 발명의 상세한 설명과 관련하여 분명할 것이다. 본 개시내용의 각각의 측면은 이해될 바와 같이 다양한 실시양태를 포괄할 수 있다.
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도 1A-1E는 새로운 BoNT로서의 BoNT/X의 확인을 보여준다. 도 1A는 클러스탈W 방법에 의해 분석된, BoNT/A-G, BoNT/F5, TeNT 및 BoNT/X에 대한 단백질 서열 정렬의 계통수를 보여준다. 각각의 독소와 BoNT/X 사이의 서열 동일성의 백분율은 각각의 독소 뒤에 나타나 있다. BoNT/E와 BoNT/F 사이, 및 BoNT/B와 BoNT/G 사이의 서열 동일성의 백분율을 또한 나타내었다. 도 1B, 상부 패널은 BoNT/X의 3개의 도메인의 개략적 도면을 보여주며, 여기서 LC에서 보존된 프로테아제 모티프 및 HC에서 강글리오시드 결합 모티프가 나타나 있다. 도 1B, 하부 패널은 BoNT/X가 모든 다른 7종의 BoNT 및 TeNT에 대해 낮은 유사성이 그의 서열에 따라 고르게 분포되어 있다는 것을 입증하는 슬라이딩 서열 비교를 보여준다. 도 1C는 BoNT/X 유전자를 호스팅하는 orf 유전자 클러스터 (상부 패널)의 개략적 도면이며, 이는 orfX 클러스터의 2종의 공지된 변이체 (중간 및 하부 패널)와 비교하여 다음 2개의 고유한 특색을 갖는다: (1) BoNT/X 유전자 옆에 위치한 추가의 orfX2 단백질 (orfX2b로 지정됨)이 존재함; (2) orfX 유전자의 리딩 프레임이 BoNT/X 유전자와 동일한 방향을 가짐. 도 1D는 BoNT/X에서 발견된 고유한 유전자 방향성 및 추가의 OrfX2 유전자를 예시하는 개략도이다. 도 1E는 BoNT/X 경쇄의 예비 구조를 보여준다. 흑색 도트는 활성 부위 아연을 나타낸다. 구조는 1.9Å 해상도로 제시된다.
도 2A-2J는 BoNT/X의 LC (X-LC)가 VAMP를 고유한 부위에서 절단한다는 것을 보여준다. 도 2A는 EDTA로 사전-처리되거나 또는 사전-처리되지 않고 래트 뇌 세제 추출물 (BDE)과 함께 인큐베이션된 X-LC를 보여준다. 이뮤노블롯 분석을 수행하여 신탁신 1, SNAP-25 및 VAMP2를 검출하였다. 시냅토피신 (Syp)을 또한 로딩 대조군으로서 검출하였다. BoNT/A의 LC (A-LC) 및 BoNT/B의 LC (B-LC)를 병행하여 분석하였다. B-LC에 의한 VAMP2의 절단은 이뮤노블롯 신호의 상실을 유발하고, 반면에 A-LC에 의한 SNAP-25의 절단은 SNAP-25의 보다 작은 단편을 생성하며, 이는 이뮤노블롯에서 여전히 검출될 수 있다 (별표에 의해 표시됨). X-LC와의 인큐베이션은 VAMP2 이뮤노블롯 신호의 상실을 유발하였으며, 이는 X-LC가 VAMP2를 절단하였다는 것을 시사한다. EDTA는 X-, A-, 및 B-LC의 활성을 차단하였다. 도 2B는 His6-태그부착된 재조합 단백질로서 정제되고 X-LC와 함께 인큐베이션된 VAMP2 (잔기 1-96)를 보여준다. 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. X-LC는 VAMP2 (1-96)를 2개의 보다 작은 단편으로 전환시켰으며, 이는 X-LC가 VAMP2를 절단하였다는 것을 나타낸다. 도 2C-2E는 X-LC와 함께 인큐베이션된 VAMP2 (1-96)를 보여준다. 이어서 전체 단백질 샘플을 질량 분광측정법 (LC-MS/MS)에 의해 분석하여 절단된 단편의 정확한 분자량을 결정하였다. 도 2C에서 HPLC 칼럼으로부터의 용리된 펩티드 피크를 실행 시간 (RT, X-축)에 걸쳐 플롯팅하였다. 2개의 절단 생성물에 대한 질량 분광측정법 데이터는 각각의 신호에 대해 나타낸 질량-대-전하 비 (m/z)와 함께, 각각 도 2D 및 2E에 제시되어 있다. 분자량은 m에 z를 곱한 후 z를 뺌으로써 추정된다. 2개의 절단 생성물에 대한 단백질 서열은 상단에서 하단으로 서열식별번호: 61 및 62에 상응하고, 도 2C에 제시되어 있다. 도 2F는 VAMP 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, Sec22b 및 Ykt6 사이의 서열 정렬을 보여주며, 여기서 BoNT/B, D, F, G, 및 X에 대한 절단 부위는 밑줄표시되어 있고, 2개의 SNARE 모티프는 박스표시되어 있다. 서열은 상단에서 하단으로 서열식별번호: 63-71에 상응한다. 도 2G는 일시적 형질감염을 통해 HEK293 세포에서 발현된 HA-태그부착된 VAMP1, 3, 7 및 8, 및 myc-태그부착된 Sec22b 및 Ykt6을 보여준다. 세포 용해물을 X-LC와 함께 인큐베이션하고, 이뮤노블롯 분석에 적용하여 HA 또는 Myc 태그를 검출하였다. 액틴은 로딩 대조군으로서의 역할을 하였다. X-LC는 VAMP1, 3 및 Ykt6을 절단하였지만, VAMP7, 8 및 Sec22는 절단하지 않았다. 도 2H는 나타낸 시간 동안 X-LC (100 nM)와 함께 인큐베이션된 GST-태그부착된 Ykt6을 보여준다. 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. X-LC는 Ykt6을 절단하였다. 도 2I는 나타낸 시간 동안 X-LC와 함께 인큐베이션된 VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115), 및 VAMP5 (1-70)의 GST-태그부착된 세포질 도메인을 보여준다. 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. X-LC는 VAMP4 및 VAMP5 둘 다를 절단하였다. 대다수의 VAMP5를 절단하는 데 보다 긴 인큐베이션 시간 (360분)이 요구된다. VAMP5 단백질은 분해 생성물 또는 박테리아 단백질 오염물인 추가의 밴드를 함유하며, 이는 SDS-PAGE 상에서 절단 생성물에 가깝게 (그러나 동일하지는 않음) 전개된다는 것을 주목한다. 도 2J는 VAMP4 및 Sec22b가 검출되었다는 것을 제외하고, 도 2A에 기재된 바와 같이 수행된 실험을 보여준다. 시냅토태그민 I (Syt I)을 로딩 대조군으로서 검출하였다. X-LC는 BDE에서 천연 VAMP4를 절단하였다.
도 3A-3E는 LC와 HN 사이의 링커 영역의 단백질분해적 절단에 의한 BoNT/X의 활성화를 보여준다. 도 3A는 7종의 BoNT 및 BoNT/X의 LC와 HN 사이의 링커 영역의 서열 정렬을 보여준다. 서열은 상단에서 하단으로 서열식별번호: 72-79에 상응한다. BoNT/X는 모든 BoNT 중에서 가장 긴 링커 영역을 가지며, 이는 LC 및 HN에 2개의 보존된 시스테인 이외에 추가의 시스테인을 함유한다. 제한된 단백질분해 하의 Lys-C 절단 부위를 질량 분광측정법 접근법에 의해 확인하였다. 도 3B는 12시간 동안 배지에서 나타낸 농도의 X-LC-HN에 노출된 배양된 래트 피질 뉴런을 보여준다. 세포 용해물을 수거하고, 이뮤노블롯 분석을 수행하여 뉴런 내 신탁신 1, SNAP-25 및 VAMP2를 검사하였다. 액틴은 로딩 대조군으로서의 역할을 하였다. BoNT/A의 트립신-활성화된 LC-HN (A-LC-HN) 및 BoNT/B의 트립신-활성화된 LC-HN (B-LC-HN)을 대조군으로서 병행하여 분석하였다. VAMP2 이뮤노블롯 신호의 상실에 의해 입증된 바와 같이, X-LC-HN은 뉴런에 진입하여 VAMP2를 절단하였다. Lys-C에 의해 활성화된 X-LC-HN은 비-활성화된 X-LC-HN보다 대폭 증가된 효력을 나타내었다. X-LC-HN은 트립신-활성화된 B-LC-HN 및 A-LC-HN보다 더 강력하며, 이는 동일한 검정 농도 하에서 뉴런 내 그의 SNARE 기질의 임의의 검출가능한 절단을 나타내지 않았다. 도 3C는 제한된 단백질분해에 의해 활성화되고 DTT의 존재 또는 부재 하에 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석된, 나타낸 시스테인이 돌연변이된 X-LC-HN 돌연변이체, 뿐만 아니라 WT X-LC-HN을 보여준다. C423S 돌연변이는 DTT의 존재 또는 부재 하에 2개의 50 kDa 단편을 생성하였다. C461S 또는 C467S를 보유하는 돌연변이체는 DTT의 부재 하에 100 kDa에서 단일 밴드를 나타내었고 DTT의 존재 하에 2개의 ~50 kDa 밴드로 분리되었으며, 이는 HN 상의 C461 및 C467 둘 다가 LC 상의 C423과 쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있다는 것을 입증한다. WT X-LC-HN의 한 부분은 SDS-PAGE 겔의 상부에서 응집체를 형성하였다. 이들 응집체는 분자간 디술피드 결합의 형성으로 인한 것이며, 이들이 DTT의 존재 하에 사라졌기 때문이다. 3개의 시스테인 중 어느 1개를 돌연변이시키는 것은 응집체를 제거하였으며, 이는 분자간 디술피드 결합의 형성이 링커 영역 내 추가의 시스테인의 존재로 인한 것임을 나타낸다. 활성화된 WT X-LC-HN의 대부분은 또한 DTT의 부재 하에 SDS-PAGE 겔 상에서 2개의 ~50 kDa 밴드로 분리되었다. 이것은 도 3D에 기재된 디술피드 결합 셔플링으로 인한 것이다. 도 3D는 제한된 단백질분해에 의해 활성화되고, 이어서 디술피드 결합 셔플링을 차단하기 위해 나타낸 농도의 NEM과 사전-인큐베이션된 WT X-LC-HN를 보여준다. 이어서, 샘플을 DTT의 존재 또는 부재 하에 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. WT X-LC-HN의 대부분은 NEM 처리 후 DTT의 부재 하에 100 kDa에서 단일 밴드로서 존재하며, 이는 WT X-LC-HN이 주로 쇄간 디술피드 결합을 함유한다는 것을 나타낸다. 도 3E는 뉴런이 WT 또는 나타낸 X-LC-HN 돌연변이체에 노출되었다는 것을 제외하고, 도 3B에 기재된 바와 같이 수행된 실험을 보여준다. LC 상의 시스테인 (C423)을 돌연변이시키는 것은 X-LC-HN의 활성을 무효화하였고, 반면에 HN 상의 2개의 시스테인 (C461 또는 C467) 중 1개를 돌연변이시키는 것은 뉴런에 대한 X-LC-HN의 활성에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 쇄간 디술피드 결합의 형성이 X-LC-HN의 활성에 필수적이라는 것을 확인시켜 주었다.
도 4A-4F는 전장 BoNT/X가 배양된 뉴런에 대해 및 마우스의 생체내에서 활성이라는 것을 보여준다. 서열은 하기와 같다: LVPR-GS (서열식별번호: 80), LPETGG-His6 (서열식별번호: 81), GG-His6 (서열식별번호: 82) 및 LPETGS (서열식별번호: 59). 도 4A는 소르타제 라이게이션 방법을 사용하는 전장 BoNT/X의 합성을 예시하는 개략적 도면을 보여준다. 도 4B는 소르타제 라이게이션 반응 혼합물 및 나타낸 대조군 성분을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다는 것을 보여준다. 별표는 분자간 디술피드 결합으로 인한 단백질의 응집체를 표시하며, 이들 응집체가 DTT의 존재 하에 사라졌기 때문이다. 분자량 마커는 레인 1에 있다 (좌측으로부터 시작). 전장 BoNT/X (X-FL)는 단지 소르타제 라이게이션 혼합물에서만 나타났다 (레인 7 및 레인 14). 도 4C는 뉴런이 배지에서 12시간 동안 동일한 양 (5 μl)의 소르타제 라이게이션 혼합물 또는 나타낸 대조군 성분에 노출되었다는 것을 보여준다. 세포 용해물을 이뮤노블롯에 의해 분석하였다. X-LC-HN 단독은 반응 혼합물 중 그의 고농도로 인해 일부 VAMP2를 절단하였다. X-LC-HN 및 X-HC 둘 다를 함유하지만 소르타제는 함유하지 않는 대조군 혼합물은 X-LC-HN 단독과 비교하여 VAMP2의 절단을 다소 증진시켰으며, 이는 아마도 X-HC가 비-공유 상호작용을 통해 X-LC-HN과 회합되기 때문이다. 소르타제에 의한 X-LC-HN 및 X-HC의 라이게이션은 소르타제 부재 하의 X-LC-HN 및 X-FL의 혼합물에 비해 VAMP2의 절단을 증진시켰으며, 이는 라이게이션된 X-HC가 뉴런에서 기능적이라는 것을 입증한다. 도 4D는 패널 b에 기재된 바와 같이 제조된 소르타제 반응 혼합물 (레인 7)이 마우스에서 DAS 검정을 사용하여 생체내 분석시 활성이라는 것을 보여준다. 주사된 사지는 이완성 마비를 발생시켰고, 발가락은 12시간 이내에 펴지지 못하였다. 좌측 사지에는 독소를 주사하지 않았으며, 이는 대조군으로서의 역할을 하였다. 도 4E는 모자이크 독소 BoNT/DC인 BoNT/A-G, 및 BoNT/X를 4종의 말 항혈청 (3가 항-BoNT/A, B 및 E, 항-BoNT/C, 항-BoNT/DC, 및 항-BoNT/F), 뿐만 아니라 2종의 염소 항혈청 (항-BoNT/G 및 항-BoNT/D)을 사용하는 도트 블롯 분석 (독소당 0.2 μg을 니트로셀룰로스 막 상에 스팟팅함)에 적용하였다는 것을 보여준다. BoNT/X는 1:1 비의 정제된 X-LC-HN 및 X-HC로 구성된다. 이들 항혈청은 그의 상응하는 표적 독소를 인식하였지만, 이들 중 어느 것도 BoNT/X를 인식하지 않았다. 도 4F는 전장 불활성 형태의 BoNT/X (BoNT/XRY)를 이. 콜라이(E. coli)에서 His6-태그부착된 재조합 단백질로서 정제하고, DTT의 존재 또는 부재 하에 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다는 것을 보여준다.
도 5는 클로스트리디움 신경독소의 분포 및 관계를 보여주는 계통수이다. 계통수는 Jackhmmer 서치로부터의 상이한 BoNT 및 TeNT 서열의 관계를 나타낸다. BoNT/X는 원형표시되어 있다.
도 6은 무손상 VAMP2 (1-96)의 질량 분광측정법 분석을 보여준다. His6-태그부착된 VAMP2 (1-96)를 LC-MS/MS 질량 분광측정법에 의해 분석하였다. HPLC 프로파일은 단백질 서열과 함께, 좌측 패널에 열거되어 있다. 전장 VAMP2 (1-96)에 대한 질량 분광측정법 데이터를 각각의 신호에 대해 표시된 m/z 값과 함께, 우측 패널에 제시하였으며, 이는 서열식별번호: 83에 상응한다.
도 7A-7F는 X-LC에 의한 GST-VAMP2 (33-86) 상의 절단 부위의 확인을 보여준다. 도 7A는 X-LC와 함께 또는 그 없이 인큐베이션된 GST-태그부착된 VAMP2 (33-86)를 보여준다. 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. 도 7B-7C는 LC-MS/MS 질량 분광측정법에 의해 분석된 무손상 GST-태그부착된 VAMP2 (33-86)를 보여준다. HPLC 프로파일을 도 7B에 제시하였다. 질량 분광측정법 데이터를 도 7C에 제시하였으며, 단백질 서열 (서열식별번호: 84)도 도 7C에 나타나 있다. VAMP2 (33-66) 및 VAMP2 (67-86)가 표시되어 있다. 도 7D-7E는 X-LC와 함께 인큐베이션된 GST-태그부착된 VAMP2 (33-86)를 보여준다. 이어서 샘플을 LC-MS/MS 질량 분광측정법에 의해 분석하였다. HPLC 프로파일은 도 7D에 제시되어 있다. X-LC에 의해 생성된 C-말단 단편 (서열식별번호: 85)에 대한 질량 분광측정법 데이터는 도 7E에 제시되어 있다. N-말단 단편 (서열식별번호: 86)에 대한 질량 분광측정법 데이터를 도 7F에 제시하였다. C- 및 N- 말단 단편의 단백질 서열을 도 7E-7F에 나타내었으며, 이는 각각 서열식별번호: 85 및 86에 상응한다.
도 8A-8B는 XA 키메라 독소가 뉴런에 대해 활성이라는 것을 보여준다. 도 8A는 도 4A에 기재된 바와 같이 X-FL을 생성하는 것과 유사하게, X-LC-HN을 A-HC와 소르타제에 의해 라이게이션함으로써 생성된 XA 키메라 독소를 보여준다. 소르타제 라이게이션 혼합물 및 나타낸 대조군 성분을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. 대다수의 X-LC-HN이 XA 키메라 독소에 라이게이션된 바와 같이 라이게이션이 효율적이다. 도 8B는 배지에서 12시간 동안 나타낸 대조군 성분 또는 소르타제 라이게이션된 XA 혼합물 (5 μl)에 노출된 래트 피질 뉴런을 보여준다. 세포 용해물을 이뮤노블롯에 의해 분석하였다. X-LC-HN 단독은 반응 혼합물 중 그의 고농도로 인해 일부 VAMP2를 절단하였다. 라이게이션된 XA는 뉴런 내 VAMP2를 절단하였다.
도 9는 HN 내 추가의 시스테인 및 HC 내 시스테인을 돌연변이시키는 것이 BoNT/X의 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. X-HC (C1240S)를 소르타제 라이게이션에 의해 WT X-LC-HN, X-LC-HN (C461S), 또는 X-LC-HN (C467S)과 라이게이션하였다. 뉴런을 배지에서 12시간 동안 소르타제 라이게이션 혼합물 또는 대조군 성분 (5 μl)에 노출시켰다. 세포 용해물을 이뮤노블롯에 의해 분석하였다. C1240 및 HN 상의 시스테인 (C461 또는 C467) 중 1개를 돌연변이시키는 것은, 라이게이션된 돌연변이체 독소가 뉴런에 진입하여 VAMP2를 절단할 수 있기 때문에, BoNT/X의 활성에 영향을 미치지 않았다.
도 10은 뉴런 상의 그의 표적 BoNT를 중화시키는, BoNT의 7종의 혈청형에 대해 생성된 항혈청을 보여준다. 배양된 래트 피질 뉴런을 나타낸 항혈청과 함께 사전-인큐베이션되거나 또는 사전-인큐베이션되지 않은 나타낸 BoNT에 노출시켰다. 세포 용해물을 12시간 후에 수거하고, 이뮤노블롯 분석에 적용하였다. 모든 항혈청은 BoNT의 상이한 혈청형의 활성에 영향을 미치지 않으면서 그의 표적 BoNT를 특이적으로 중화시켰으며, 따라서 이는 이들 항혈청의 특이성 및 효력을 검증한다. BoNT에 대한 농도는 다음과 같았다: BoNT/A (50 pM), BoNT/B (2 nM), BoNT/C (1.5 nM), BoNT/D (100 pM), BoNT/E (0.5 nM), BoNT/F (0.5 nM), BoNT/G (5 nM). BoNT/A/B/E에 대한 항혈청을 웰당 20 μl로 사용하였다. 모든 다른 항혈청을 웰당 10 μl로 사용하였다. BoNT를 37℃에서 30분 동안 나타낸 항혈청과 함께 사전-인큐베이션한 후 배양 배지 내로 첨가하였다.
도 11A-11C는 BoNT/XRY가 뉴런에 대해 활성이 아니라는 것을 보여준다. 도 11A는 나타낸 농도의 BoNT/XRY에 노출된 배양된 래트 피질 뉴런을 보여준다. 세포 용해물을 이뮤노블롯에 의해 분석하였다. VAMP2는 절단되지 않았으며, 이는 BoNT/XRY가 뉴런에 대해 활성이 아니라는 것을 나타낸다. 도 11B는 BoNT/XRY의 세포 용해물 및 상청액 (S/N) 발현의 SDS-PAGE 분석 (4-12% 비스트리스, MOPS 완충제)을 보여준다. BoNT/X에 상응하는 150kDa에서의 밴드는 용해물 및 가용성 분획 둘 다에서 명확히 가시적이다. 도 11C는 고도로 정제된 BoNT/XRY의 최종 샘플의 SDS-PAGE 분석 (4-12% 비스트리스, MOPS 완충제)을 보여준다. BoNT/X에 상응하는 150 kDa에서의 단일 밴드는 명확히 가시적이고 ~90% 순도를 나타낸다.
도 12A-12F는 BoNT/X가 모든 4종의 뇌 강글리오시드에 결합한다는 것을 보여준다. 도 12A-12D는 각각 GD1a (도 12A), GT1b (도 12B), GD1b (도 12C) 및 GM1 (도 12D)에 결합하는 BoNT/X (사각형) 및 A-Hc (원형)를 보여준다. 곡선은 삼중 ELISA 검정의 평균에 상응하며, 이를 프리즘(Prism)7 (그래프패드(GraphPad) 소프트웨어)에 피팅하였다. 도 12E는 모든 4종의 강글리오시드에 결합하는 BoNT/X의 요약을 도 12F에서의 BoNT/A의 전체 결합과 비교하여 보여준다.
도 13A-13D는 질량 분광측정법 분석에 의한 Ykt6 상의 X-LC의 절단 부위의 확인을 보여준다. 도 13A-13D는 X-LC와 함께 사전-인큐베이션되거나 또는 사전-인큐베이션되지 않은, 10 μg GST-태그부착된 Ykt6 (1-192)이 SDS-PAGE 상에서 분리되었다는 것을 보여준다 (도 13A). 단백질 밴드를 나타낸 바와 같이 절제하고 키모트립신에 의해 소화시켰다. 소화된 펩티드를 탈염시키고, ESI-MS와 커플링된 C18 칼럼을 통한 역상 HPLC에 의해 분석하였다. X-LC와 함께 사전-인큐베이션되지 않은 GST-Ykt6의 HPLC 프로파일을 도 13B에 제시하였고, X-LC로 사전처리된 샘플을 도 13C에 제시하였다. 1개의 펩티드는 X-LC에 노출되지 않았던 샘플에서보다 X-LC로 사전처리된 샘플에서 ~100배 더 높은 강도인 것으로 확인되었다 (별표로 표시됨). 이 펩티드는 RT에서 37분에 m/z = 611로 용리되어 (도 13D), 단지 Ykt6 내 펩티드 서열 ESLLERGEKLDDLVSK (서열식별번호: 87)만이 적합할 수 있으며, 이는 이것이 X-LC에 대한 절단 부위의 N-말단 측에 위치하는 펩티드라는 것을 나타낸다. 따라서 절단 부위는 Ykt6 내 K173-S174이다.
도 14A-14E는 질량 분광측정법 분석에 의한 VAMP4 및 VAMP5 상의 X-LC의 절단 부위의 확인을 보여준다. 도 14A-14E는 VAMP4 (도 14B, 14C) 및 VAMP5 (도 14D, 14E)를 분석한 것을 제외하고, 도 13에 기재된 바와 같이 수행된 실험을 보여준다. 도 14B는 VAMP4 내 절단 부위의 N-말단 부위를 표시하는 펩티드이다. 펩티드 DELQDK의 서열은 서열식별번호: 88에 상응한다. 도 14C는 VAMP4 내 절단 부위의 C-말단 부위를 표시하는 펩티드이다. 펩티드 SESLSDNATAF의 서열은 서열식별번호: 89에 상응한다. 도 14D는 VAMP5 내 절단 부위의 N-말단 부위를 표시하는 펩티드이다. 펩티드 AELQQR의 서열은 서열식별번호: 90에 상응한다. 도 14E는 VAMP5 내 절단 부위의 C-말단 부위를 표시하는 펩티드이다. 펩티드 SDQLLDMSSTF의 서열은 서열식별번호: 91에 상응한다. 따라서, 절단 부위는 VAMP4 내의 K87-S88 및 VAMP5 내의 R40-S41인 것으로 결정되었다.
클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT)는 클로스트리디움 박테리아에 의해 생산되는 박테리아 독소 패밀리로, 7종의 널리-확립된 혈청형 (BoNT/A-G)이 존재한다 1- 3. 이들은 가장 위험한 잠재적 생물-테러 작용제 중 하나로, 미국 질병 통제 예방 센터 (CDC)에 의해 "카테고리 A" 선택제로 분류된다 4. 이들 독소는 단일 폴리펩티드로서 생산되고, 박테리아 또는 숙주 프로테아제에 의해 경쇄 (LC, ~ 50 kDa) 및 중쇄 (HC, ~ 100 kDa)로 분리될 수 있다. 2개의 쇄는 쇄간 디술피드 결합을 통해 연결되어 유지된다. HC는 2개의 서브도메인: 엔도솜 막을 가로질러 LC의 전위를 매개하는 N-말단 HN 도메인, 및 뉴런 상의 수용체에 대한 결합을 매개하는 C-말단 HC 도메인을 포함한다. 쇄간 디술피드 결합은 LC가 시토졸 내로 전위되면 환원된다 5, 6. 방출된 LC는 프로테아제로서 작용하여 뉴런 단백질 세트를 특이적으로 절단하며: BoNT/A, C, 및 E는 SNAP-25로서 공지된 단백질 상의 별개의 부위에서 절단하고; BoNT/B, D, F, 및 G는 소포 단백질 VAMP 상의 상이한 부위에서 절단하고; BoNT/C는 또한 막횡단 단백질 신탁신 1을 절단한다 1- 3. 이들 3종의 단백질은 신경전달물질의 방출에 필수적인, SNARE 복합체로 공지된 복합체를 형성한다 7, 8. 이들 3종의 SNARE 단백질 중 어느 하나의 절단은 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 차단하여, 근육을 마비시킨다.
BoNT는 공지된 가장 강력한 독소이고, 보툴리눔독소증으로 공지된 인간 및 동물 질환을 유발한다 3. 보툴리눔독소증의 주요 형태는 BoNT에 의해 오염된 식품을 섭취하는 것에 의해 유발된다 (식품 보툴리눔독소증). 영아 보툴리눔독소증과 같은 다른 형태가 또한 존재하며, 이는 영아에서 독소-생산 박테리아에 의한 장의 콜로니화로 인한 것이다. BoNT는 항상 NTNHA (비-독성 비-헤마글루티닌 단백질)로 공지된 또 다른 150 kDa 단백질과 함께 생산되며, 이는 BoNT와 pH-의존성 복합체를 형성하고, BoNT를 위장관에서 프로테아제로부터 보호한다 9. BoNT 및 NTNHA를 코딩하는 유전자는 2가지 유형의 유전자 클러스터: (1) BoNT/NTNHA와 복합체를 형성하고 장 상피 장벽을 가로질러 독소의 흡수를 용이하게 하는, 3개의 보존된 단백질 HA17, HA33 및 HA70에 대한 유전자를 함유하는 HA 클러스터 10-12, (2) 미지의 기능을 갖는 보존된 OrfX1, OrfX2, OrfX3 및 P47 단백질을 코딩하는 OrfX 클러스터로 발견된다 13.
미량의 독소의 국부 주사는 표적화된 영역에서 뉴런 활성을 감쇠시킬 수 있기 때문에, BoNT는 근육 연축, 만성 통증, 과민성 방광 문제를 포함한 증가하는 목록의 의학적 상태를 치료하는 데 뿐만 아니라 미용 용도로 사용되어 왔다 14- 16. BoNT 시장은 2011년에 이미 $15억을 초과하였고, 2018년까지 29억에 이를 것으로 예상된다.
BoNT는 전통적으로 마우스에서, 공지된 BoNT에 대한 항혈청의 존재 또는 부재 하에 클로스트리디움 박테리아의 배양물 상청액을 마우스에 주사하는 것에 의하는 중화 검정에 의해 유형화되었다. 첫번째로 구별된 혈청형, BoNT/A 및 BoNT/B는 1919년 게오르기나 부르케(Georgina Burke)에 의해 확립되었다 18. 7종의 유형 중 마지막인 BoNT/G는 1969년 아르헨티나에서 토양 샘플로부터 인식되었다 19. 1970년 이후로 어떠한 새로운 BoNT 혈청형도 인식된 바 없다. 이러한 분류는 1990년에 각각의 BoNT에 대한 단백질 서열이 결정된 후 사실로 유지되었다. 7종의 BoNT 중에서 임의의 2종의 쌍 사이의 서열 동일성은 32% 내지 65.3% 범위이다. 모든 7종의 BoNT는 그의 의학적 사용 시기 전에 확인되고 특징화되었다. 따라서, 이들 독소 중 어떠한 것에 대해서도 특허가 존재하지 않는다. 임의의 회사가 이들 7종의 BoNT 중 어느 하나를 생산하고 시판하는 데 자유롭다. 7종의 유형 중에서, BoNT/A 및 BoNT/B는 인간에서의 사용에 대해 현재 FDA-승인받은 2종의 독소이다 14- 16. BoNT/A는 의학적 및 미용 용도 둘 다를 위해 사용되는 우세한 유형이고, 앨러간 인크.(Allergan Inc.)로부터 보톡스(Botox), 입센 인크.(IPSEN Inc.)로부터 디스포르트(Dysport), 및 메르츠 인크.(Merz Inc.)로부터 제오민(Xeomin)으로 시판된다. BoNT/B는 유에스월드 메드(USWorld Med)에 의해 미오블록(Myobloc)으로 시판된다. 하기 2가지의 주요 이유로, 다른 BoNT 유형을 치료 독소로서 개발하는 데 상당한 관심이 존재한다:
(1) 치료에 있어서의 주요 한계는 환자에서의 BoNT/A 또는 BoNT/B에 대한 중화 항체의 생성으로, 이는 동일한 독소에 의한 추가 치료를 비효과적으로 만든다 20. 이러한 경우에, 환자는 상이한 유형의 BoNT에 의한 치료를 필요로 할 것이다. 이것이 치료 동안 BoNT/A에 대한 중화 항체를 생성하는 환자를 치료하는 데 BoNT/B가 종종 사용되는 이유이지만, BoNT/A 및 BoNT/B 둘 다에 대한 항체를 생성하는 환자를 위해 대안적 독소가 필요하다.
(2) 모든 BoNT가 동일한 구조 및 기능을 공유하더라도, 그들 사이에는 또한 상당한 차이가 존재한다. 예를 들어, BoNT/A는 SNAP-25를 절단하고 그의 수용체로서 단백질 SV2를 사용하는 반면에, BoNT/B는 VAMP를 절단하고 그의 수용체로서 단백질 시냅토태그민 (Syt)을 사용한다 21- 27. 이들 기능적 변이는 별개의 유형의 뉴런을 표적화하는 치료 효능에서의 잠재적 차이로 해석될 수 있다. 또한, 안정성 및 치료 지속시간이 7종의 유형의 독소 사이에서 상이할 수 있다. 따라서, 상이한 독소 유형이 BoNT/A 및 BoNT/B를 뛰어넘는 그의 장점을 가질 수 있다.
최근 수년간 게놈 서열분석에서의 빠른 진전은 BoNT의 현저한 다양성을 밝혀내었다 28, 29. 먼저, 다수의 하위유형이 존재하며, 이는 동일한 항혈청에 의해 인식될 수 있지만, 단백질 서열에서 유의한 수준의 변이를 함유한다 (2.6%~31.6% 차이) 28,30. 예를 들어, BoNT/A는 BoNT/A1-A8로 지정된 8종의 공지된 하위유형을 함유한다 13. 또한, 독소 유전자의 재조합으로부터 유래된 것일 수 있는, 다수의 모자이크 독소가 존재한다. 예를 들어, "유형 H"가 2013년에 보고되었지만, 이는 그의 LC가 BoNT/F 하위유형인 BoNT/F5의 LC와 ~ 80% 동일성을 공유하고, 그의 HC가 BoNT/A1의 HC와 ~ 84% 동일성을 공유하기 때문에 키메라 독소로서 이후에 인식되었다 31- 34. 일관되게, 이 독소는 BoNT/A에 대한 이용가능한 항혈청에 의해 인식될 수 있고 중화될 수 있다 33.
BoNT를 코딩하는 유전자 클러스터는 플라스미드, 박테리아 파지, 또는 염색체 상에 존재할 수 있고, 이는 독소 유전자가 이동가능하고 수평적 유전자 전달에 적용된다는 것을 나타낸다 13. 클로스트리디움 박테리아 균주가 2종 또는 심지어 3종의 상이한 독소 유전자를 함유하는 경우가 또한 존재한다 32,35, 36. 이들 경우에, 하나의 독소는 통상적으로 다른 독소 (소문자로 지정됨)보다 더 높은 수준으로 발현된다 (대문자로 지정됨). 예를 들어, 높은 수준의 BoNT/B 및 낮은 수준의 BoNT/F를 발현하는 균주는 BoNT/Bf 균주로 공지된다. 또한 하나의 독소는 발현되지만 다른 독소는 발현되지 않는 경우가 존재하며, 이는 침묵 독소 (통상적으로 ()로 표시됨)로 공지된다. 예를 들어, 캘리포니아에서의 영아 보툴리눔독소증 경우에 대한 조사는 8% 균주가 BoNT/A(B)임을 나타내었고, 이는 이들 균주가 BoNT/A 및 BoNT/B 둘 다에 대한 유전자를 함유하지만, 단지 BoNT/A의 검출가능한 수준만을 발현한다는 것을 의미한다 37-39.
본 개시내용의 도면 및 예에서 예시된 바와 같이, 공개된 클로스트리디움 박테리아 게놈 서열 데이터베이스를 검색하였고, 클로스트리디움 보툴리눔 균주 111의 염색체에 코딩된 신규 BoNT 유전자 (이하에서 "BoNT/X"로 지정됨)를 확인하였다. 균주 111은 1996년 일본에서 영아 보툴리눔독소증 환자로부터 최초로 단리되었다 40. 마우스에서 균주 111으로부터의 독성은 BoNT/B 항혈청에 의해 중화될 수 있는 것으로 제시되었다 40. 이후에 이러한 균주는 플라스미드에 코딩된 BoNT/B의 하위유형인 BoNT/B2를 발현하는 것으로 확인되었다 41, 42. BoNT/X의 서열은 2015년 2월, 균주 111의 게놈 서열의 일부로서 펍메드(PubMed) 데이터베이스에 기탁되었다. BoNT/X는 이전에 특징화된 적이 없었다. 그것이 균주 111에서 발현되는지 여부 및 그것이 기능적 독소인지 여부는 미지로 남아있다.
BoNT/X의 기능적 수준에서의 특징화가 본원에 또한 제공된다. 그의 LC는 모든 다른 BoNT의 공지된 표적 부위와 별개의 부위에서 VAMP를 절단하는 것으로 발견되었다. 소르타제를 통한 비-독성 단편의 공유 연결에 의해 생산된 전장 독소는 배양된 뉴런에 진입하여 뉴런 내 VAMP를 절단함으로써, 마우스에서 이완성 마비를 유발하는 것으로 발견되었다. 마지막으로, 상기 독소는 모든 7종의 공지된 BoNT에 대해 생성된 항혈청에 의해 인식되지 않는 것으로 발견되어, BoNT/X는 신규 BoNT 혈청형으로서 확립되었다. 그의 확인은 효과적인 대응책을 개발하는 것에 대한 긴급한 과제를 제기한다. 또한 이는 신규 치료 독소로 개발될 잠재력을 갖고, 잠재적으로 별개의 약리학적 특성을 갖는 키메라 독소를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드"는 본원에 기재된 보툴리눔 신경독소로부터의 임의의 폴리펩티드 또는 단편을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 용어 BoNT는 전장 BoNT를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 BoNT는 BoNT가 뉴런에 진입하여 신경전달물질 방출을 억제하는 전반적인 세포 메카니즘을 실행할 수 있는 BoNT의 단편을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 BoNT는 단순히 BoNT의 단편을 지칭하며, 이는 단편이 임의의 특정 기능 또는 활성을 가질 것을 요구하지 않는다. 예를 들어, BoNT 폴리펩티드는 BoNT, 예를 들어, BoNT/X의 경쇄 (LC)를 지칭할 수 있다. "클로스트리디알 보툴리눔 신경독소"에 대해 본 개시내용 전반에 걸쳐 사용될 수 있는 다른 용어는 BoNT, 보툴리눔 독소, 또는 씨. 보툴리눔(C. Botulium) 독소일 수 있다. 이들 용어는 상호교환가능하게 사용되는 것으로 이해되어야 한다. "BoNT/X"는 본 개시내용에 기재되고 특징화된 신규 BoNT 혈청형을 지칭한다. BoNT/X 단백질 서열 (진뱅크(GenBank) 번호 BAQ12790.1; 4개의 시스테인이 밑줄표시되고 볼드체표시됨)이 또한 제공된다:
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"변형된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT)"는 아미노산 서열에서의 임의의 변형, 예를 들어, 말단절단, 부가, 아미노산 치환, 및 그의 임의의 조합을 포함하는 BoNT를 포괄한다. 예를 들어, C461 또는 C467에서 아미노산 치환 돌연변이를 포함하는 BoNT/X는 변형된 BoNT이다. 또 다른 예에서, 전장 BoNT의 단편 또는 도메인 (예를 들어, 프로테아제 도메인, 또는 LC)이 변형된 BoNT로 간주된다. 일부 실시양태에서, BoNT의 도메인은 또한 아미노산 치환 돌연변이, 예를 들어, BoNT/X의 위치 C461 또는 C467에서 치환 돌연변이를 포함하는 프로테아제 도메인을 포함할 수 있다.
용어 "세포에 진입하다"는, 본 개시내용의 BoNT의 작용을 기재하는 데 사용되는 경우에, 낮은 또는 높은 친화도 수용체 복합체에의 BoNT의 결합, 강글리오시드에의 BoNT의 결합, 독소의 내재화, 세포질 내로의 독소 경쇄의 전위, 및 BoNT 기질의 효소적 변형을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 프로테아제 도메인"은 "경쇄 (LC)"와 동의어이다. BoNT 프로테아제 도메인은 BoNT의 경쇄에 위치하고, 따라서 또한 LC로 지칭된다. 용어는 중독 과정의 효소적 표적 변형 단계를 실행할 수 있는 BoNT 도메인을 의미한다. 특정 BoNT 혈청형으로부터의 LC가 언급될 경우, 용어 "혈청형-LC"가 사용된다. 예를 들어, "X-LC"는 BoNT/X로부터의 LC 폴리펩티드를 의미한다. BoNT 프로테아제 도메인은 씨. 보툴리눔 독소 기질을 특이적으로 표적화하고, 씨. 보툴리눔 독소 기질, 예컨대, 예를 들어, SNARE 단백질 예컨대 SNAP-25 기질, VAMP 기질 및 신탁신 기질의 단백질분해적 절단을 포괄한다. BoNT (예를 들어, BoNT/X, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C 등)에서, 프로테아제 도메인 또는 LC는 BoNT/X의 약 아미노산 1-439에 상응하는 것으로 간주된다. 도메인 경계는 약 25개 아미노산만큼 다를 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 도메인은 BoNT/X의 아미노산 1-414 또는 1-464에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 도메인은 BoNT/X의 아미노산 1-438, 1-437, 1-436, 1-435, 1-434, 1-433, 1-432, 1-431, 1-430, 1-429, 1-439, 1-440, 1-441, 1-442, 1-443, 1-444, 1-445, 1-446, 1-447, 1-448, 또는 1-449에 상응할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 전위 도메인"은 "HN 도메인"과 동의어이고, BoNT 경쇄 전위를 매개하는 중독 과정의 전위 단계를 실행할 수 있는 BoNT 도메인을 의미한다. 따라서, HN은 BoNT 경쇄가 막을 가로질러 세포의 세포질 내로 이동하는 것을 용이하게 한다. HN의 비제한적 예는 BoNT/A HN, BoNT/B HN, BoNT/Cl HN, BoNT/D HN, BoNT/E HN, BoNT/F HN, BoNT/G HN, 및 BoNT/X HN을 포함한다. 전위 도메인은 중쇄 (HC)의 N-말단에 위치하고, 따라서 또한 HN으로도 지칭된다. 이들 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "링커 영역"은 BoNT 프로테아제 도메인과 전위 도메인 사이의 아미노산 서열을 지칭한다. 링커는 위치 461 및 467에서 2개의 시스테인을 포함하고, 그 중 1개는 프로테아제 도메인의 시스테인, C423과 분자간 디술피드 결합을 형성한다 (C461-C423 디술피드 결합, 또는 C467-C423 디술피드 결합). 이러한 디술피드 결합의 형성은 BoNT/X의 활성을 위해 필수적이다.
본원에 사용된 용어 "LC-HN"은 프로테아제 도메인, 링커 영역, 및 전위 도메인을 포괄하는 BoNT 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 BoNT 혈청형으로부터의 LC-HN이 언급되는 경우에, 용어 "혈청형-LC-HN"이 사용된다. 예를 들어, "X-LC-HN"은 BoNT/X로부터의 LC-HN 폴리펩티드를 의미한다. LC-HN 폴리펩티드는 BoNT/X의 약 아미노산 1-892에 상응하는 것으로 간주된다. 도메인 경계는 약 25개 아미노산만큼 다를 수 있다. 예를 들어, LC-HN 폴리펩티드는 BoNT/X의 약 아미노산 1-917 또는 1-867에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, LC-HN 폴리펩티드는 BoNT/X의 아미노산 1-893, 1-894, 1-895, 1-896, 1-897, 1-898, 1-899, 1-900, 1-901, 1-902, 1-892, 1-891, 1-890, 1-889, 1-888, 1-887, 1-886, 1-885, 1-884, 또는 1-883에 상응할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 수용체-결합 도메인"은 "HC 도메인"과 동의어이고, 예를 들어 표적 세포의 형질 막 표면에 위치한 BoNT-특이적 수용체 시스템에의 BoNT의 결합을 포함한, 중독 과정의 세포 결합 단계를 실행할 수 있는 임의의 자연 발생 BoNT 수용체 결합 도메인을 의미한다. 본 개시내용의 일부 측면은 혈청형 X (BoNT/X)로부터의 변형된 BoNT 수용체 결합 도메인에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, "변형된 BoNT/X 수용체 결합 도메인"은 BoNT/X (서열식별번호: 1)의 C1240에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 수용체 결합 도메인, 또는 HC는 BoNT/X의 약 아미노산 893-1306에 상응하는 것으로 간주된다. 도메인 경계는 약 25개 아미노산만큼 다를 수 있다. 예를 들어, 수용체 결합 도메인 또는 HC는 아미노산 868-1306 또는 918-1306에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인 또는 HC는 BoNT/X의 아미노산 893-1306, 894-1306, 895-1306, 896-1306, 897-1306, 898-1306, 899-1306, 900-1306, 901-1306, 902-1306, 892-1306, 891-1306, 890-1306, 889-1306, 888-1306, 887-1306, 886-1306, 885-1306, 884-1306, 또는 883-1306에 상응할 수 있다.
"단리된"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 정상적으로 동반되는 성분이 다양한 정도로 부재하는 물질을 의미한다. "단리"는 원래의 공급원 또는 주변으로부터, 예를 들어 세포로부터 또는 플랭킹 DNA로부터 또는 DNA의 천연 공급원으로부터의 분리의 정도를 나타낸다. 용어 "정제된"은 제조물의 다른 성분 (예를 들어, 다른 폴리펩티드)과 관련하여, "실질적으로 순수한" 물질, 예컨대 폴리펩티드를 지칭하는 데 사용된다. 이는 다른 성분과 관련하여 적어도 약 50%, 60%>, 70%>, 또는 75%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 순수한 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 폴리펩티드와 관련하여 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된"은 1종 이상의 다른 성분 (예를 들어, 다른 폴리펩티드 또는 세포 성분)을 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만, 또는 1% 미만으로 함유하는 제조물을 지칭한다.
구체적인 아미노산에 대한 언급 없이 용어 "치환 돌연변이"는 그 위치에서 정상적으로 발견되는 야생형 잔기가 아닌 다른 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 비-극성 (소수성) 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 및 프롤린으로의 대체일 수 있다. 치환은 극성 (친수성) 아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민으로의 대체일 수 있다. 치환은 전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어, 음전기적으로 하전된 아미노산, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산 및 양전기적으로 하전된 아미노산, 예컨대 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로의 대체일 수 있다.
본원에 기재된 치환 돌연변이는 전형적으로 상이한 자연 발생 아미노산 잔기로의 대체일 것이지만, 일부 경우에, 비-자연 발생 아미노산 잔기가 또한 치환될 수 있다. 본원에 사용된 용어 비-자연 아미노산은 자연 발생되거나 화학적으로 합성된 비-단백질생성 (즉, 비-단백질 코딩) 아미노산이다. 예는 β-아미노산 (β3 및 β2), 호모-아미노산, 프롤린 및 피루브산 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 글리신 유도체, 고리-치환된 페닐알라닌 및 티로신 유도체, 선형 코어 아미노산, 디아미노산, D-아미노산, 및 N-메틸 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환된 아미노산 또는 치환기는 할로겐화된 방향족 또는 지방족 아미노산, 소수성 측쇄 상의 할로겐화된 지방족 또는 방향족 변형, 또는 지방족 또는 방향족 변형일 수 있다.
2개의 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된다. 관심 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램에 의해, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행될 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우에, 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같은 갭드(Gapped) BLAST가 사용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 사용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 단리된 BoNT 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 전장 BoNT/X 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 X-LC-HN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 X-LC 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 이루어진다.
X-LC 폴리펩티드는 연구 또는 치료 목적으로, 관련 기술분야의 외인성 단백질의 발현을 위한 임의의 공지된 기술에 의해, 예를 들어, LC 코딩 서열의 직접 세포 내로의 형질감염에 의해, 렌티바이러스 벡터를 통해, AAV 벡터를 통해, 또는 X-LC와 세포 관통 펩티드의 융합에 의해, BoNT 기질 (예를 들어, SNARE 단백질)의 절단을 목적으로 하는 세포 내로 단독으로 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드는 프로테아제 도메인 (LC), 링커 영역, 전위 도메인 (HN), 및 수용체 결합 도메인 (HC)을 포함하는 전장 BoNT/X이며, 여기서 링커 영역은 프로테아제 도메인과 전위 도메인 사이에 위치한다. 다른 BoNT와 마찬가지로, BoNT/X는 초기에 단일 폴리펩티드로서 생산되고, 박테리아 또는 숙주 프로테아제에 의한 LC 및 HN 사이의 링커 영역의 절단을 통해 활성화된다. 이러한 과정은 "활성화"로 공지되어 있고, 이는 BoNT/X의 활성을 위해 필수적이다. 절단 후, LC 및 HN은 LC가 세포의 시토졸 내로 전위되기 전에 쇄간 디술피드 결합을 통해 연결된 채로 유지되고, 세포의 시토졸에서 디술피드 결합은 환원되어 LC를 시토졸 내로 방출한다. BoNT/X는 다른 BoNT와 비교하여 보존된 2개의 시스테인, C423 및 C467을 함유한다. 흥미롭게도, BoNT/X는 또한, BoNT/X에 고유한 추가의 시스테인 (C461)을 함유한다. 쇄간 디술피드 결합 (C423-C461, 또는 C423-C467)의 형성은 BoNT/X 활성을 위해 요구된다.
링커 영역의 시스테인에 더하여, BoNT의 수용체 결합 도메인은 또 다른 시스테인, C1240을 함유하고, 이는 또한 BoNT/X의 다른 시스테인과 분자간 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이들 분자간 디술피드 결합은 BoNT/X가 응집되게 하고 단백질을 탈안정화되게 한다 (도 4B). BoNT/X 활성을 위해 요구되지 않는 시스테인을 대체하는 것은 증가된 안정성을 갖는 BoNT/X 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 야생형 BoNT/X보다 더 안정하고 대등한 활성을 갖는, C461, C467 또는 C1240에서 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드를 제공한다. 시스테인은 디술피드 결합의 형성을 무효화하는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 세린 (S) 또는 알라닌 (A)으로 치환된다. 본 개시내용의 변형된 BoNT에 존재할 수 있는 치환 돌연변이의 가능한 조합은, 비제한적으로: C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C461A/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240A, C467S/C1240S, C467A/C1240S, C467S/C1240A, 및 C467A/C1240A이다. "/"는 이중 돌연변이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열은 갖지 않는다. 예를 들어, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열은 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열은 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 BoNT 폴리펩티드는 본원에 기재된 치환 돌연변이를 포함하는 변형된 BoNT/X-LC-HN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X-LC-HN은 서열식별번호: 2에서 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X-LC-HN은 서열식별번호: 2에서 C461A, C461S, C467A 또는 C467S에 상응하는 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X-LC-HN 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열은 갖지 않는다. 예를 들어, 변형된 BoNT/X-LC-HN 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열은 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X-LC-HN 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열은 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 BoNT/X-LC-HN 폴리펩티드는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
본원에 기재된 (예를 들어, C461, C467 또는 C1240에서) 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드는 단백질의 응집을 유발하는 분자간 디술피드 결합을 형성하지 않고, 따라서 그의 상응하는 야생형 단백질보다 더 안정하다. BoNT 폴리펩티드의 활성은 시스테인의 치환 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 변형된 BoNT/X는 그의 증가된 안정성으로 인해 야생형 BoNT/X보다 더 치료 용도에 적합할 수 있다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 BoNT/X-LC-HN 및 상이한 BoNT로부터의 수용체 결합 도메인 (HC)을 포함하는 키메라 BoNT를 제공한다. 예를 들어, 수용체 결합 도메인은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/E, BoNT/F, 및 BoNT/G 중 어느 하나로부터의 것일 수 있다. 따라서, 본원에 고려되는 키메라 BoNT는 BoNT/X-LC-HN-A-HC, BoNT/X-LC-HN-B-HC, BoNT/X-LC-HN-C-HC, BoNT/X-LC-HN-D-HC, BoNT/X-LC-HN-E-HC, BoNT/X-LC-HN-F-HC, 및 BoNT/X-LC-HN-G-HC를 포함한다. 7종의 공지된 혈청형 (예를 들어, A, B, C, D, E, F, 또는 G) 중 임의의 하위유형의 HC 도메인은 키메라 독소에 적합한 것으로 이해되어야 한다. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, 또는 BoNT/G가 언급되는 경우, 이는 모든 하위유형을 포괄한다. 예를 들어, BoNT/A는 8종의 하위유형, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, BoNT/A5, BoNT/A6, BoNT/A7, 또는 BoNT/A8을 갖고, 이들 BoNT/A 하위유형 중 어느 하나의 HC는 본 개시내용의 키메라 BoNT에 사용하는 데 적합하다. 유사하게, BoNT/B의 8종의 하위유형, 즉, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6, BoNT/B7, 또는 BoNT/B8 중 어느 하나의 HC는 본 개시내용의 키메라 BoNT에 사용하는 데 적합하다.
일부 실시양태에서, BoNT/X-LC-HN-A1-HC (서열식별번호: 22), BoNT/X-LC-HN-B1-HC (서열식별번호: 23), 및 BoNT/X-LC-HN-C1-HC (서열식별번호: 24)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 BoNT는 링커 영역에서, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서 치환 돌연변이를 포함하는 변형된 BoNT/X-LC-HN을 포함한다. 예를 들어, 키메라 BoNT에서 BoNT/X-LC-HN은 서열식별번호: 2의 C461A, C467A, C461S, 또는 C467S에 상응하는 치환 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
키메라 독소, 예를 들어 BoNT/X-LC-HN-A1-HC 독소를 생성하기 위해, 약 1-892의 아미노산을 포함하는 X-LC-HN 단편 (서열식별번호: 2)은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/E, BoNT/F, 및 BoNT/G 중 어느 하나의 수용체 결합 도메인에 융합된다. 상이한 BoNT의 수용체 결합 도메인은 BoNT/B1의 약 860-1291의 아미노산에 상응한다. X-LC-HN 단편 및/또는 수용체 결합 도메인의 경계는 1-25개 아미노산만큼 다를 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 키메라 독소에 사용될 수 있는 X-LC-HN 단편은 BoNT/X의 아미노산 1- 917 또는 1-867을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 독소에 사용될 수 있는 X-LC-HN 단편은 BoNT/X의 아미노산 1-893, 1-894, 1-895, 1-896, 1-897, 1-898, 1-899, 1-900, 1-901, 1-902, 1-892, 1-891, 1-890, 1-889, 1-888, 1-887, 1-886, 1-885, 1-884, 또는 1-883을 포함할 수 있다. 유사하게, 키메라 독소에 사용될 수 있는 수용체 결합은 BoNT/X의 885-1291 또는 835-1291에 상응하는 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 독소에 사용될 수 있는 수용체 결합은 BoNT/B의 860-1291, 861-1291, 862-1291, 863-1291, 864-1291, 865-1291, 866-1291, 867-1291, 868-1291, 869-1291, 870-1291, 860-1291, 859-1291, 858-1291, 857-1291, 856-1291, 855-1291, 854-1291, 853-1291, 852-1291, 또는 851-1291에 상응하는 아미노산을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 서열 정렬 소프트웨어의 보조에 의해 또는 보조 없이, 단백질 상동성에 대한 그의 지식에 기초하여, 본 개시내용의 키메라 독소에 사용될 수 있는 도메인을 확인할 수 있다. 단편을 융합시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 표준 재조합 기술이다.
추가로, 특이적 프로테아제 절단 부위를 포함하는 변형된 링커 영역을 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드가 본원에 고려된다. 본원에 사용된 "특이적 프로테아제 절단 부위"는, 1종 초과의 비-특이적 프로테아제에 의해 인식 및 절단되는 서열과 대조적으로, 규격 프로테아제에 대한 인식 및 절단 부위를 지칭한다. 이러한 특이적 프로테아제는, 비제한적으로: 트롬빈, TEV, 프리시전, 인자 Xa, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20, 그랜자임-B, 및 엔테로키나제를 포함한다. 특이적 프로테아제의 절단 부위는 링커 영역에서의 삽입 또는 기존 아미노산의 대체 (예를 들어, BoNT/X 폴리펩티드의 아미노산 424-460의 대체)를 통해 BoNT/X 폴리펩티드의 링커 영역에 부가될 수 있다. 특이적 프로테아제 절단 부위 서열의 서열이 또한 제공된다: LVPR|GS (트롬빈, 서열식별번호: 50), ENLYFQ|G (TEV, 서열식별번호: 51), LEVLFQ|GP (프리시전, 서열식별번호: 52), IEGR| 또는 IDGR| (인자 Xa, 서열식별번호: 53 또는 54), DDDDK| (엔테로키나제, 서열식별번호: 55) 및 AHREQIGG| (SUMO 프로테아제, 서열식별번호: 56). "|"는 절단이 일어나는 부분을 나타낸다.
본 개시내용의 다른 측면은 BoNT/X 폴리펩티드의 기능적 특징화를 제공한다. 본 개시내용의 BoNT/X 폴리펩티드, 변형된 BoNT/X 폴리펩티드, 및 키메라 BoNT 폴리펩티드는 표적 세포, 예를 들어, 뉴런에 결합하고 진입하여, 그의 기질 단백질, 예를 들어 SNARE 단백질을 절단할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "SNARE 단백질"은 효모 및 포유동물 세포에서 60개 초과의 구성원으로 이루어진 대형 단백질 슈퍼패밀리인 SNAP (가용성 NSF 부착 단백질) 수용체를 지칭한다. SNARE 단백질의 1차 역할은 소포 융합 즉, 소포의 그의 표적 막 결합 구획 (예컨대 리소솜)과의 융합을 매개하는 것이다. 가장 잘 연구된 SNARE 단백질은 뉴런에서 시냅스 소포와 시냅스전 막의 도킹을 매개하는 것, 예를 들어, SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, VAMP7, VAMP8, 신탁신1, 및 Ykt6이다. 몇몇 이들 SNARE 단백질은 BoNT의 기질이다. 예를 들어, VAMP1, VAMP2, VAMP3, SNAP-25, 및 신탁신 1은 공지된 BoNT, 예를 들어, BoNT/A 및 BoNT/B에 의해 절단되는 것으로 제시되었다.
BoNT/X가 BoNT의 공지된 기질인 SNARE 단백질을 절단한다는 것을 보여주는 데이터가 본원에 제공된다. 본 개시내용의 하나의 놀라운 발견은 BoNT/X가 다른 BoNT는 절단할 수 없는 여러 SNARE 단백질, 예를 들어, VAMP4, VAMP5, 및 Ykt6을 절단할 수 있다는 것이다. VAMP4는 광범위하게 발현되고, 트랜스-골지 네트워크 (TGN)와 엔도솜 사이의 소포 융합, 뿐만 아니라 엔도솜의 동형 융합을 매개하는 것으로 공지되어 있다. BoNT는 전통적으로 형질 막 상에의 소포 세포외유출을 매개하는 표적 SNARE로 제한되는 것으로 공지되어 있다. BoNT/X는 형질 막과의 융합 사건이 아닌 세포 내 다른 유형의 융합 사건을 매개하는 SNARE를 절단할 수 있는 데스틴으로서 최초의 BoNT이다. VAMP4는 또한 뉴런에서 비동기 시냅스 소포 세포외유출, 인라지오솜 세포외유출, 및 활성-의존성 벌크 세포내이입 (ADBE)에 기여할 수 있다. 또한, VAMP4는 면역 세포에서 과립 방출에 연루되어 왔다. 따라서, BoNT/X는 모든 BoNT 중에서 면역 세포에서 염증성 분비를 조정하는 고유한 잠재력을 가질 수 있고, 이는 치료상 이용될 수 있다. VAMP5는 근육에서 주로 발현되고, 그의 기능은 확립되어야 할 것으로 남아있다. BoNT/X는 VAMP4 및 VAMP5의 기능을 조사하기 위한 고유한 도구일 것이다. Ykt6은 내형질 세망의 골지로의 수송에서 기능한다. 이는 또한 초기/재순환 엔도솜의 TGN으로의 수송에서 기능한다. 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드의 기질로서 Ykt6의 확인은 이것이 BoNT에 의해 광범위한 세포에서 분비를 차단하는 것에 대한 새로운 치료 용도를 열었다는 점에서 유의하다.
본 개시내용의 또 다른 놀라운 발견은 BoNT/X가 이전에 기재되지 않은 신규 부위에서 SNARE 단백질을 절단한다는 것이다. 본 개시내용의 실시예 및 도면에 예시된 바와 같이, BoNT/X는 VAMP1, VAMP2, 및 VAMP3에서 아미노산 R66-S67 사이를 절단한다. R66-A67은 모든 다른 BoNT에 대해 확립된 표적 부위와 별개의 신규 절단 부위이다 (도 2F). 또한, 이는 이전에 SNARE 모티프로 공지된 영역 내에 위치하는 유일한 BoNT 절단 부위이다 (도 2F).
따라서, 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드는 확장된 표적 세포 및 기질 프로파일을 갖는다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 세포 내 SNARE 단백질을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6, 및 신탁신 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 SNARE 단백질을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 VAMP1 (서열식별번호: 39)을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 39의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 VAMP1을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 VAMP2 (서열식별번호: 40)를 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 40의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 VAMP2를 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 VAMP3 (서열식별번호: 31)을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 41의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 VAMP3을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 VAMP4 (서열식별번호: 42)를 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 42의 K87 및 S88에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 VAMP4를 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 VAMP5 (서열식별번호: 43)를 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 43의 R40 및 S41에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 VAMP5를 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 Ykt6 (서열식별번호: 44)을 절단한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 서열식별번호: 44의 K173 및 S174에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 Ykt6을 절단한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드는 표적 세포 내 SNARE 단백질을 절단한다. 본원에 사용된, "표적 세포"는 BoNT가 진입하거나 중독시킬 수 있는 자연 발생 세포인 세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 분비 세포, 예를 들어, 뉴런 또는 분비 면역 세포이다. BoNT 표적 세포일 수 있는 뉴런의 예는, 비제한적으로, 운동 뉴런; 감각 뉴런; 자율 뉴런; 예컨대, 예를 들어, 교감 뉴런 및 부교감 뉴런; 비-펩티드성 뉴런, 예컨대, 예를 들어, 콜린성 뉴런, 아드레날린성 뉴런, 노르아드레날린성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, GABA성 뉴런; 및 펩티드성 뉴런, 예컨대, 예를 들어, 물질 P 뉴런, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 뉴런, 혈관활성 장 펩티드 뉴런, 뉴로펩티드 Y 뉴런, 콜레시스토키닌 뉴런을 포함한다.
본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드, 예를 들어, BoNT/X 또는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 VAMP4 또는 Ykt6을 절단할 수 있는 그의 능력으로 인해, 뉴런 이외의 다른 유형의 분비 세포를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드에 의해 표적화되는 분비 세포는 분비 면역 세포이다. 본원에 사용된 "분비 면역 세포"는 시토카인, 케모카인 또는 항체를 분비하는 면역 세포를 지칭한다. 이러한 분비 면역 세포는, 비제한적으로, 자연 킬러 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 대식세포, 호중구, 및 수지상 세포를 포함한 선천성 면역 세포일 수 있다. 항체를 분비하는 분비 면역 세포 (예를 들어, 백혈구)가 또한 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드에 의해 표적화될 수 있다. 항체 분비 세포의 비제한적 예는, 비제한적으로, 형질 B 세포, 형질세포, 플라스마 세포 및 이펙터 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 배양된 뉴런 또는 배양된 분비 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 생체내의 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 실시양태에서, 포유동물은 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트이다.
일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 뉴런 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 면역 반응을 조정한다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 이완성 마비를 유발한다. "이완성 마비"는 다른 명백한 원인 (예를 들어, 외상)의 부재 하의 쇠약 또는 마비 및 감소된 근긴장도를 특징으로 하는 임상 징후를 지칭한다.
본 개시내용의 다른 측면은 불활성 프로테아제 도메인을 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 BoNT/X 폴리펩티드 (또한 본원에서 "불활성 BoNT/X"로도 지칭됨)는 표적 세포에 진입할 수 있지만, 프로테아제 도메인의 불활성화로 인해 기질 단백질 (예를 들어, SNARE 단백질)은 절단할 수 없다. 일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X는 a) 불활성 프로테아제 도메인; b) 링커 영역; 및 c) 전위 도메인을 포함하는 X-LC-HN 단편이다. 일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X는 a) 불활성 프로테아제 도메인; b) 링커 영역; c) 전위 도메인; 및 d) 수용체 결합 도메인을 포함하는 전장 BoNT/X 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 불활성 프로테아제 도메인은 서열식별번호: 1의 R360, Y363, H227, E228 또는 H231에 상응하는 위치에서 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 치환 돌연변이(들)는 서열식별번호: 1에서 R360A/Y363F, H227Y, E228Q 또는 H231Y에 상응한다. 불활성 BoNT/X 폴리펩티드는 프로테아제 도메인을 불활성화시키는 임의의 돌연변이(들)를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 불활성 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X 폴리펩티드는 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X (예를 들어, 불활성 X-LC-HN 또는 불활성 전장 BoNT/X)는 링커 영역에서의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 영역에서의 변형은 서열식별번호: 1의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 치환 돌연변이는 서열식별번호: 1에서의 C461A, C461S, C467A 또는 C467S에 상응한다. 일부 실시양태에서, 불활성 BoNT/X (예를 들어, 불활성 전장 BoNT/X)는 수용체 결합 도메인에서의 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체 결합 도메인에서의 변형은 서열식별번호: 1의 C1240에 상응하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함한다.
또한, 본원에 기재된 불활성 프로테아제 도메인을 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드는 인간에서 표적 세포 (예를 들어, 뉴런)에 대한 전달 도구로서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 변형된 BoNT/X는 다른 치료제에 공유 또는 비공유 연결될 수 있고, 인간에서 표적 세포에 치료제를 전달하기 위한 표적화 비히클로서 작용한다.
이에 따라 개시내용의 또 다른 측면은 제2 부분에 연결된, 프로테아제 도메인을 불활성화시키는 1개 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 불활성 BoNT/X인 제1 부분을 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 분자의 제2 부분은 생물활성 분자 예컨대 치료제 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 비-폴리펩티드 약물)일 수 있다. 분자의 제1 및 제2 부분의 연결은 공유 (예를 들어, 융합 단백질의 형태) 또는 비-공유일 수 있다. 이러한 연결 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 숙련된 진료의에 의해 용이하게 적용될 수 있다. 키메라 분자의 제2 부분이 폴리펩티드이고 키메라 분자가 단백질 형태인 경우에, 이러한 키메라 분자를 코딩하는 핵산 및 핵산 벡터가 제공된다.
또한, 핵산 또는 핵산 벡터를 포함하는 세포, 및 이러한 키메라 분자를 발현하는 세포가 제공된다. 융합 단백질 형태의 키메라 분자는 본원에 개시된 방법을 사용하여 발현되고 단리될 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 비제한적으로, 서열식별번호: 1-38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)인 제2 부분을 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드, 키메라 BoNT 폴리펩티드 또는 키메라 분자는 일반적으로 적절한 세포 (예를 들어, 이. 콜라이, 또는 곤충 세포)에서 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 생산되고, 단리될 것이다. 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득되고, 핵산의 뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다.
추가로 본원에 개시된 BoNT 폴리펩티드 중 어느 것을 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 단리된 폴리펩티드 단편을 코딩하는 핵산은 이중-가닥 또는 단일 가닥인 DNA 또는 RNA일 수 있다. 특정 측면에서, 단리된 폴리펩티드 단편을 코딩하는 대상 핵산은 본원에 기재된 변형된 BoNT 폴리펩티드 중 어느 하나의 변이체인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 것으로 추가로 이해된다.
변이체 뉴클레오티드 서열은 1개 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실만큼 상이한 서열, 예컨대 대립유전자 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 1-38 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 1-38 중 어느 하나와 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 벡터, 예컨대 발현 벡터 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
시토메갈로바이러스 (CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR 예컨대 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 이. 콜라이 lac UV5 프로모터, 및 단순 포진 tk 바이러스 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 프로모터가 본원에 기재된 폴리펩티드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 조절성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조절성 프로모터는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하는 전사 조정인자로서 이. 콜라이로부터의 lac 리프레서를 사용하는 것 [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], 테트라시클린 리프레서 (tetR)를 사용하는 것 [Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]을 포함한다.
다른 시스템은 아스트라디올, RU486, 디페놀 무리슬레론, 또는 라파마이신을 사용하는 FK506 이량체, VP16 또는 p65를 포함한다. 유도성 시스템은 인비트로젠(Invitrogen), 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)로부터 입수가능하다. 오페론을 갖는 리프레서를 포함하는 조절성 프로모터가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 lac 리프레서는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하는 전사 조정인자로서 기능할 수 있고 [M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen and Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], 테트라시클린 리프레서 (tetR)는 전사 활성화제 (VP 16)와 조합되어 tetR-포유동물 세포 전사 활성화제 융합 단백질, tTa (tetR-VP 16)를 생성하고, 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV) 주요 극초기 프로모터로부터 유래된 tetO-보유 최소 프로모터와 조합되어 tetR-tet 오퍼레이터 시스템을 생성하여 포유동물 세포에서 유전자 발현을 제어한다. 한 실시양태에서, 테트라시클린 유도성 스위치가 사용된다 (Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)).
추가적으로, 벡터는 예를 들어 하기 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다: 선택 마커 유전자, 예컨대 포유동물 세포에서의 안정한 또는 일시적 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 극초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 프로세싱 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 다기능 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 트랜스진을 함유하는 벡터를 생산하는 데 적합한 벡터 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 입수가능하다.
핵산을 포함하는 발현 벡터는 통상적인 기술 (예를 들어, 전기천공, 리포솜 형질감염, 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있고, 형질감염된 세포는 이어서 본원에 기재된 폴리펩티드를 생산하는 통상적인 기술에 의해 배양된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 조절된다.
본원에 기재된 단리된 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용되는 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이, 또는, 바람직하게는, 진핵생물 세포일 수 있다. 특히, 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)는 벡터 예컨대 인간 시토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 함께 이뮤노글로불린을 위한 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors," Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification," Biotechnology 8:662-667). 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드의 코딩 서열이 생산되고 이어서 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염되는 경우, 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드를 계내 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로미세스 피키아(Saccharomyces pichia)); 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바클로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV))로 감염된, 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)의 게놈으로부터 또는 포유동물 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프 세포 (미국 특허 번호 5,807,715 참조), Per C.6 세포 (크루셀(Crucell)에 의해 개발된 인간 망막 세포))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 시스템에서, 발현되는 폴리펩티드에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드의 제약 조성물의 생성을 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는, 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (Ruether et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794) (여기서 코딩 서열은 융합 단백질이 생산되도록 벡터 내에 개별적으로 lac Z 코딩 영역과 인 프레임으로 라이게이션될 수 있음); pIN 벡터 (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온의 존재 하의 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다.
pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다. 곤충 시스템에서, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3부 리더 서열에 라이게이션될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이어서 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하고 이뮤노글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659] 참조). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 또한 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역이 보장되도록 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 같은 상 내에 존재하여야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원의 것일 수 있다.
발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등을 포함시키는 것에 의해 증진시킬 수 있다 (문헌 [Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조). 또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 유전자 생성물을 목적하는 특정 방식으로 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 단백질 생성물의 변형 (예를 들어 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 단일 유전자 생성물로서 (예를 들어, 단일 폴리펩티드 쇄로서, 즉, 폴리단백질 전구체로서) 발현될 수 있고, 이는 본원에 기재된 개별 폴리펩티드를 형성하기 위해 천연 또는 재조합 세포 메카니즘에 의한 단백질분해적 절단을 필요로 한다.
따라서, 개시내용은 폴리단백질 전구체의 번역후 절단을 지시할 수 있는 코딩 서열을 포함하는, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 폴리단백질 전구체 분자를 코딩하도록 핵산 서열을 조작하는 것을 포괄한다. 폴리단백질 전구체의 번역후 절단은 본원에 기재된 폴리펩티드를 생성한다. 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 전구체 분자의 번역후 절단은 생체내에서 (즉, 천연 또는 재조합 세포 시스템/메카니즘, 예를 들어 적절한 부위에서의 푸린 절단에 의해 숙주 세포 내에서) 일어날 수 있거나, 또는 시험관내에서 (예를 들어 공지된 활성의 프로테아제 또는 펩티다제를 포함하는 조성물에서의 및/또는 목적하는 단백질분해 작용을 촉진하는 것으로 공지된 조건 또는 시약을 포함하는 조성물에서의 상기 폴리펩티드 쇄의 인큐베이션) 일어날 수 있다.
재조합 단백질의 정제 및 변형은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으므로 폴리단백질 전구체의 설계는 숙련된 작업자에 의해 용이하게 인식되는 다수의 실시양태를 포함할 수 있다. 전구체 분자의 기재된 변형을 위해 임의의 공지된 프로테아제 또는 관련 기술분야에 공지된 펩티다제, 예를 들어, 트롬빈 또는 인자 Xa (문헌 [Nagai et al. (1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255], 및 문헌 [Jenny et al. (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa," Protein Expr. Purif. 31:1-11]에서 검토되며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 엔테로키나제 (문헌 [Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA," BiotecHNology 13:982-987], 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 푸린, 및 AcTEV (문헌 [Parks et al. (1994) "Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase," Anal. Biochem. 216:413-417], 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 및 구제역 바이러스 프로테아제 C3이 사용될 수 있다.
상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 단백질을 장기간 고 수율로 생산하기 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 세포주는 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다, 오히려 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소 (예를 들어 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후에, 조작된 세포가 풍부화 배지에서 1-2일 동안 성장되게 할 수 있고, 이어서 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 내의 선택 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 그의 염색체 내로 플라스미드가 안정하게 통합되게 하고 성장하여 초점을 형성하게 하며, 이는 차례로 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 본원에 기재된 폴리펩티드와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 폴리펩티드의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 수많은 선택 시스템이 사용될 수 있고: 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11: 223-232), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection TecHNique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma TecHNiques And Gene Therapy," Bioessays 14: 495-500), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene," Cell 22: 817-823) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용될 수 있다. 또한, 항대사물 저항성이 하기 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo (Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932; 및 Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156). 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있는, 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 방법이 문헌 [Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, JoHN Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, JoHN Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해서는, 문헌 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987] 참조). 본원에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 벡터 시스템에서의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 본원에 기재된 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 폴리펩티드와 회합되어 있기 때문에, 폴리펩티드의 생산도 또한 증가할 것이다 (Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
본원에 기재된 폴리펩티드가 재조합적으로 발현되면, 이는 폴리펩티드, 폴리단백질 또는 항체의 정제를 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 항원 선택성에 기초한 항체 정제 스킴과 유사함)에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 특이적 항원에 대한 친화성 (임의로 폴리펩티드가 Fc 도메인 (또는 그의 부분)을 포함하는 단백질 A 선택 후), 및 크기결정 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도에 의해, 또는 폴리펩티드 또는 항체의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 예시적인 세포 유형은 본원에 기재된다. 본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 변형된 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포에 관한 것이다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 예시적인 세포 유형은 본원에 기재된다. 세포는 핵산의 증식을 위한 것 또는 핵산의 발현을 위한 것, 또는 둘 다일 수 있다. 비제한적으로, 이러한 세포는, 비제한적으로, 호기성, 약호기성, 호이산화탄소성, 조건혐기성, 혐기성, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 세포의 균주, 예컨대 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 페르프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피실레(Clostridia difficile), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 네이세리아 메닌기룰르스(Neisseria meningirulls), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유래된 것을 포함하는 원핵 세포; 및 비제한적으로, 효모 균주, 예컨대, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 안구스타(Pichia angusta), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유래된 것; 곤충 세포 및 곤충으로부터 유래된 세포주, 예컨대, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 만투카 섹타(Manduca sexta)로부터 유래된 것; 및 포유동물 세포 및 포유동물 세포로부터 유래된 세포주, 예컨대, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간으로부터 유래된 것을 포함하는 진핵 세포를 포함한다. 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection), 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(European Collection of Cell Cultures) 및/또는 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 및 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)로부터 입수할 수 있다. 적절한 세포주를 선택하고, 제조하고, 사용하기 위한 특정 프로토콜의 비제한적 예는 예를 들어, 문헌 [INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al. eds., JoHN Wiley and Sons, 1998); R. Ian FresHNey, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (JoHN R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 상기 문헌, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (JoHN M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 상기 문헌, (2004)]에 기재되어 있다.
이들 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내의 및 본원의 교시로부터의 상용 절차이다. 본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 세포를 수득하고, 상기 세포에서 본원에 기재된 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 폴리펩티드를 단리하고 정제하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 발효기에서 확립하고, 성장시킨 후, 발효된 혼합물을 공지된 절차에 따라 수확하고, 정제함으로써 수득될 수 있다. 모든 보툴리눔 독소 혈청형은 초기에 불활성 단일 쇄 단백질로서 합성되며, 이는 신경활성이 되기 위해서는 프로테아제에 의해 절단되거나 니킹되어야 한다.
보툴리눔 독소 혈청형 A 및 G를 만드는 박테리아 균주는 내인성 프로테아제를 보유하며, 따라서, 혈청형 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 우세하게 그의 활성 형태로 회수될 수 있다. 대조적으로, 보툴리눔 독소 혈청형 C, D 및 E는 비-단백질분해성 균주에 의해 합성되며, 따라서, 배양물로부터 회수되는 경우 전형적으로 불활성이다. 혈청형 B 및 F는 단백질분해성 및 비-단백질분해성 균주 둘 다에 의해 생산되며, 따라서, 활성 또는 불활성 형태로 회수될 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 유형 B 혈청형을 생산하는 단백질분해성 균주는 단지 생산된 독소의 일부만을 절단할 수 있다. 이들 균주를 사용한 BoNT/X 폴리펩티드의 생산이 본원에 고려된다.
니킹된 분자 대 비-니킹된 분자의 정확한 비율은 인큐베이션 길이 및 배양 온도에 의존한다. 따라서, 예를 들어, 보툴리눔 독소 유형 B 독소의 제조물의 특정 백분율은 불활성일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 신경독소는 활성 상태이다. 한 실시양태에서, 신경독소는 불활성 상태이다. 한 실시양태에서, 활성 및 불활성 신경독소의 조합이 고려된다.
본 개시내용의 한 측면은 BoNT의 2개의 비-독성 단편을 라이게이션하는 시험관내 트랜스펩티다제 반응을 통해 BoNT를 생산하는 신규 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (i) 경쇄 (LC) 및 중쇄의 N-말단 도메인 (HN)을 포함하는 제1 BoNT 단편을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 BoNT 단편은 C-말단 LPXTGG (서열식별번호: 60) 모티프를 포함하는 것인 단계; (ii) 중쇄의 C-말단 도메인 (HC)을 포함하는 제2 BoNT 단편을 수득하는 단계이며; 여기서 제2 BoNT 단편은 그의 N-말단에서 특이적 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것인 단계; (iii) 특이적 프로테아제로 제2 BoNT 단편을 절단하는 단계이며, 여기서 절단은 N-말단에서 유리 글리신 잔기를 생성하는 것인 단계; 및 (iv) 트랜스펩티다제의 존재 하에 제1 BoNT 단편 및 제2 BoNT 단편을 접촉시킴으로써, 제1 BoNT 단편 및 제2 BoNT 단편을 라이게이션하여 라이게이션된 BoNT를 형성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 BoNT 단편은 C-말단 LPXTGG (서열식별번호: 60) 모티프에 융합된 본원에 기재된 X-LC-HN 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 45), 또는 그의 임의의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 본원에 기재된 HC 폴리펩티드, 또는 그의 임의의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 46)를 포함한다. 임의의 BoNT 단편 또는 도메인은 본원에 기재된 방법을 사용하여 라이게이션될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 기재된 방법은 또한 키메라 BoNT를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 BoNT 단편은 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 X로부터의 것일 수 있다. 유사하게, 제2 BoNT 단편은 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 X로부터의 것일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제조될 수 있는 조합을 식별할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 BoNT 폴리펩티드 (예를 들어, BoNT/X-LC-HN-A1-HC, BoNT/X-LC-HN-B1-HC, 또는 BoNT/X-LC-HN-C1-HC)는 이러한 방법을 사용하여 제조된다.
일부 실시양태에서, 트랜스펩티다제는 소르타제이다. 일부 실시양태에서, 소르타제는 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 것이다 (SrtA).
2개의 비-독성 BoNT 단편을 라이게이션하는 데 관련 기술분야에서 입수가능한 다른 펩티드 라이게이션 시스템이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 인테인-매개 단백질 라이게이션 반응은 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 합성 펩티드 또는 단백질이 박테리아 발현된 단백질의 C-말단에 천연 결합을 통해 라이게이션되게 한다 (문헌 [Evans et al., (1998) Protein Sci.7, 2256-2264, Dawson et al.,(1994)Science266, 776-779; Tam et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 12485-12489, Muir et al.,(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA95,6705-6710; Severinov and Muir(1998)J. Biol. Chem.273, 16205-16209], 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 인턴-매개 단백질 라이게이션 반응을 위한 키트가 (예를 들어, 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터) 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 제1 BoNT 단편은 친화성 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 N-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 C-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된다. 친화성 태그가 제1 BoNT 단편의 C-말단에 융합된 경우에, 트랜스펩티다제는 LPXTGG (서열식별번호: 60) 모티프에서 T와 G 사이를 절단하고, 제1 BoNT 단편과 제2 BoNT 단편의 라이게이션 전에 친화성 태그를 제거한다.
일부 실시양태에서, 제2 BoNT 단편은 친화성 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 N-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 C-말단에서 제2 BoNT 단편에 융합된다. 친화성 태그가 제1 BoNT 단편의 N-말단에 융합된 경우에, 특이적 프로테아제가 특이적 프로테아제 절단 부위에서 절단하고, 트랜스펩티다제에 의한 제1 BoNT 단편과 제2 BoNT 단편의 라이게이션 전에 친화성 태그를 제거한다.
본원에 사용된 "친화성 태그"는 물질 또는 모이어티에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 서열을 지칭하며, 예를 들어 6개의 히스티딘을 포함하는 태그는 Ni2+에 특이적으로 결합한다. 친화성 태그는 단백질에 부가되어 그의 단리를 용이하게 할 수 있다. 친화성 태그는 전형적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 통해 단백질에 융합된다. 단백질 단리를 용이하게 하기 위한 친화성 태그의 사용은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 적합한 친화성 태그는, 비제한적으로, His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, 칼모듈린, 소프태그 1, 소프태그 3, TC, V5, VSV, 엑스프레스, 할로, 및 Fc를 포함한다.
제2 BoNT 단편은 N-말단에서 특이적 프로테아제 절단을 갖는다. 특이적 프로테아제에 의한 부위의 절단은 제2 BoNT 단편의 N-말단에 유리 글리신 잔기를 발생시킨다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 적합한 특이적 프로테아제는, 비제한적으로: 트롬빈, TEV, 프리시전, 엔테로키나제 및 SUMO 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특이적 프로테아제는 트롬빈이고, 절단 부위는 LVPR|GS (서열식별번호: 50)이다.
본원에 기재된 BoNT/X 폴리펩티드는 치료 용도에 대한 잠재력을 부여한다. 예를 들어, BoNT/X는 다른 BoNT 혈청형과 비교하여 더 강력할 수 있다. BoNT/X는 보다 다기능적이고, 다른 BoNT 혈청형보다 더 많은 기질을 절단할 수 있는 그의 능력으로 인해 광범위한 세포에서 더 효과적일 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 BoNT/X 폴리펩티드 또는 키메라 분자를 포함하는 제약 조성물을 고려한다. 또한 본 개시내용에서 나중에 보다 명백해질 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 제약 조성물은 이러한 조성물이 치료하도록 설계된 구체적인 질환에 적합한 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 신체의 한 부위 (예를 들어, 전달 부위)로부터 또 다른 부위 (예를 들어, 신체의 기관, 조직 또는 부분)로 폴리펩티드를 운반하거나 수송하는 데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 활석 마그네슘, 스테아르산칼슘 또는 스테아르산아연, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다.
제약상 허용되는 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 대상체의 조직에 유해하지 않다는 (예를 들어, 생리학상 상용성, 멸균, 생리적 pH 등) 의미에서 "허용된다". 제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원 무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질. 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. 용어 예컨대 "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드는 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 임플란트에 의해 투여되며, 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
전형적으로, 조성물을 투여하는 경우, 본 개시내용의 폴리펩티드가 흡수하지 않는 물질이 사용된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드는 제어 방출 시스템으로 전달된다. 투여를 위한 이러한 조성물 및 방법은 미국 특허 공개 번호 2007/0020295에 제공되어 있고, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조. 또한 문헌 [Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 다른 제어 방출 시스템이, 예를 들어, [Langer, 상기 문헌]에 논의되어 있다.
본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드는 치료 유효량의 결합제 및 1종 이상의 제약상 상용성인 성분을 포함하는 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 전형적 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체, 예를 들어, 인간에의 정맥내 또는 피하 투여에 적합화된 제약 조성물로서 상용 절차에 따라 제제화된다.
전형적으로, 주사에 의한 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중 용액이다. 필요한 경우, 제약은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 국부 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 함께 혼합되어 단위 투여 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 기밀 용기 예컨대 앰플 또는 사쉐 내의 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 제약이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 멸균 제약 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 제약이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다. 전신 투여를 위한 제약 조성물은 액체, 예를 들어, 멸균 염수, 락테이트화된 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 제약 조성물은 고체 형태일 수 있고, 사용 전 즉시 재-용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 고려된다. 제약 조성물은 지질 입자 또는 소포, 예컨대 리포솜 또는 미세결정 내에 함유될 수 있으며, 이는 또한 비경구 투여에 적합하다. 입자는 조성물이 그 안에 함유되는 한, 임의의 적합한 구조, 예컨대 단층 또는 복수층일 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드는 융합생성 지질 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 낮은 수준 (5-10 몰%)의 양이온성 지질을 함유하는 '안정화된 플라스미드-지질 입자' (SPLP) 내에 포획될 수 있고, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다 (Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47). 양으로 하전된 지질, 예컨대 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸술페이트, 또는 "DOTAP"는 이러한 입자 및 소포에 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 및 4,921,757을 참조한다. 본 개시내용의 제약 조성물은 예를 들어 단위 용량으로서 투여되거나 패키징될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물에 관하여 사용되는 경우 용어 "단위 용량"은 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 요구되는 희석제; 즉, 담체, 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 BoNT/X 폴리펩티드는 치료 모이어티, 예를 들어, 항생제에 접합될 수 있다. 이러한 치료 모이어티를 예를 들어 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; 및 Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev., 62:119-158]을 참조한다. 추가로, 제약 조성물은 (a) 동결건조 형태의 본 개시내용의 폴리펩티드를 함유하는 용기 및 (b) 주사용 제약상 허용되는 희석제 (예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 제약 키트로서 제공될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제는 본 개시내용의 동결건조된 폴리펩티드의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 관할하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 이러한 용기(들)에 임의로 회합될 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다.
적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 본원에 기재된 질환을 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 조성물 중의 활성제는 개시내용의 단리된 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 용기 상의 또는 그와 회합된 라벨은 조성물이 선택된 질환을 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수, 링거액, 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 추가로 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드 (예를 들어, BoNT/X 폴리펩티드), 키메라 분자, 및 제약 조성물은 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 상태의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 치료 유효량의 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드, 키메라 분자, 또는 제약 조성물을 투여하여 그에 의해 상태를 치료하는 것을 포함하는, 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 상태를 치료하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드, 키메라 분자, 및 제약 조성물은 원치 않는 뉴런 활성을 나타내는 1개 이상의 뉴런(들)에 접촉한다.
신경독소로 전형적으로 치료되는 상태 (예를 들어, 골격근 상태, 평활근 상태, 선상 상태, 신경근육 장애, 자율신경성 장애, 통증, 또는 미적/미용 상태)는 숙련된 진료의에 의해 측정된 바와 같이 원치 않는 뉴런 활성과 연관된다. 투여는 유효량의 조성물을 원치 않는 활성을 나타내는 뉴런에 접촉시키는 경로에 의한다. 일부 실시양태에서, 상태는 과활성 뉴런 또는 선과 연관될 수 있다. 본원에 논의된 방법에 의한 치료에 대해 고려되는 구체적인 상태는, 비제한적으로, 연축성 발성장애, 연축성 사경, 후두 이상긴장증, 구강하악 발성장애, 설측 이상긴장증, 경부 이상긴장증, 초점성 손 이상긴장증, 안검연축, 사시, 편측안면 연축, 안검 장애, 뇌성 마비, 초점성 경직 및 다른 음성 장애, 연축성 결장염, 신경원성 방광, 항문경, 사지 경직, 틱, 진전, 이갈이, 치열, 무이완증, 연하곤란 및 다른 근긴장도 장애 및 근육군의 불수의 운동을 특징으로 하는 다른 장애, 누루, 다한증, 과다 타액분비, 과다 위장액 분비 뿐만 아니라 다른 분비 장애, 근육 연축으로부터의 통증, 두통을 포함한다. 또한, 본 개시내용은 피부과적 또는 미적/미용 상태를 치료하는 데, 예를 들어, 이마 골의 감소, 피부 주름의 감소에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 BoNT/X 폴리펩티드의 하나의 고유한 특성은 VAMP4, VAMP5 및 Ykt6을 절단하는 그의 능력이다. 따라서, 광범위한 세포에서 원치 않는 분비 활성과 연관된 상태에서의 BoNT/X 폴리펩티드의 치료 용도가 본원에서 추가로 고려된다. 일부 실시양태에서, 원치 않는 분비는 면역 분비이다. 원치 않는 면역 분비와 연관된 상태는, 비제한적으로: 염증, 건선, 알레르기, 혈구포식성 림프조직구증식증, 및 알콜성 췌장 질환을 포함한다.
본 개시내용은 또한 스포츠 손상의 치료에 사용될 수 있다. 보로딕(Borodic)의 미국 특허 번호 5,053,005는 보툴리눔 유형 A를 사용하여 소아 척추 만곡, 즉 척추측만증을 치료하는 방법을 개시한다. 보로딕의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 보로딕에 의해 개시된 것과 실질적으로 유사한 방법을 사용하여, BoNT 폴리펩티드는 척추 만곡을 치료하기 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 적합한 실시양태에서, 류신-기반 모티프와 융합된 보툴리눔 유형 E를 포함하는 BoNT 폴리펩티드가 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 그의 경쇄의 카르복실 말단에 융합된 류신-기반 모티프를 갖는 보툴리눔 유형 A-E를 포함하는 BoNT 폴리펩티드가 척추 만곡을 치료하기 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다.
또한, BoNT 폴리펩티드는 통상적으로 보툴리눔 유형 A로 수행되는 널리 공지된 기술을 사용하여 신경근육 장애를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 통증, 예를 들어, 두통, 근육 연축으로부터의 통증 및 다양한 형태의 염증성 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 아오키(Aoki)의 미국 특허 번호 5,721,215 및 아오키의 미국 특허 번호 6,113,915는 통증을 치료하기 위해 보툴리눔 독소 유형 A를 사용하는 방법을 개시한다. 이들 2개의 특허의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
자율 신경계 장애가 또한 변형된 신경독소에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 선상 기능부전은 자율 신경계 장애이다. 선상 기능부전은 과다 발한 및 과다 타액분비를 포함한다. 호흡기 기능부전은 자율 신경계 장애의 또 다른 예이다. 호흡기 기능부전은 만성 폐쇄성 폐 질환 및 천식을 포함한다. 샌더스(Sanders) 등은 자연적으로 존재하는 보툴리눔 독소를 사용하여 자율 신경계를 치료하는 방법; 예를 들어, 자율 신경계 장애, 예컨대 과다 발한, 과다 타액분비, 천식 등을 치료하는 방법을 개시한다. 샌더스 등의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 샌더스 등의 것과 실질적으로 유사하지만, BoNT 폴리펩티드를 사용하는 방법이 자율 신경계 장애, 예컨대 상기 논의된 것을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, BoNT 폴리펩티드는 비강에서의 점액 분비를 제어하는 자율 신경계의 콜린성 뉴런을 퇴행시키는 데 충분한 양으로 포유동물의 비강에 국부로 적용될 수 있다. 변형된 신경독소에 의해 치료될 수 있는 통증은 근육 긴장 또는 연축에 의해 유발되는 통증, 또는 근육 연축과 연관되지 않는 통증을 포함한다. 예를 들어, 바인더(Binder)는 미국 특허 번호 5,714,468에서 혈관 장애, 근육 긴장, 신경통 및 신경병증에 의해 유발되는 두통이 자연 발생 보툴리눔 독소, 예를 들어 보툴리눔 유형 A로 치료될 수 있다는 것을 개시한다. 바인더의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 바인더의 것과 실질적으로 유사하지만, 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드를 사용하는 방법이 두통, 특히 혈관 장애, 근육 긴장, 신경통 및 신경병증에 의해 유발된 것을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 근육 연축에 의해 유발되는 통증은 또한 본원에 기재된 BoNT 폴리펩티드의 투여에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 보툴리눔 유형 E 경쇄의 카르복실 말단에서 류신-기반 모티프와 융합된 보툴리눔 유형 E는 통증을 완화시키기 위해 통증/연축 위치에서 근육내로 투여될 수 있다. 또한, 변형된 신경독소는 근육 장애, 예컨대 연축과 연관되지 않는 통증을 치료하기 위해 포유동물에게 투여될 수 있다.
하나의 넓은 실시양태에서, 비-연축 관련 통증을 치료하기 위한 본 개시내용의 방법은 BoNT 폴리펩티드의 중추 투여 또는 말초 투여를 포함한다. 예를 들어, 포스터(Foster) 등은 미국 특허 번호 5,989,545에서 표적화 모이어티와 접합된 보툴리눔 독소가 통증을 경감시키기 위해 중추로 (척수강내로) 투여될 수 있다는 것을 개시한다. 포스터 등의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 포스터 등의 것과 실질적으로 유사하지만, 본원에 기재된 조성물을 사용하는 방법이 통증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 치료되는 통증은 급성 통증 또는 만성 통증일 수 있다. 근육 연축과 연관되지 않은 급성 또는 만성 통증은 또한 포유동물 상의 실제 또는 인지된 통증 위치에의 변형된 신경독소의 국부, 말초 투여에 의해 경감될 수 있다.
한 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 통증의 위치에 또는 부근에, 예를 들어 자상에 또는 부근에 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 신경독소는 통증의 위치에 또는 부근에, 예를 들어, 포유동물 상의 타박상 위치에 또는 부근에 근육내로 투여된다. 일부 실시양태에서, BoNT 폴리펩티드는 관절염성 상태에 의해 유발된 통증을 치료하거나 경감시키기 위해 포유동물의 관절 내로 직접 주사된다. 또한, 말초 통증 위치에의 변형된 신경독소의 빈번한 반복된 주사 또는 주입은 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 방법을 위한 투여 경로는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 숙련된 진료의에 의해 본원에 기재된 방법에 대해 용이하게 적합화된다 (예를 들어, 예를 들어, 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), edited by Anthony Fauci et al., 14.sup.th edition, published by McGraw Hill] 참조).
비제한적 예로서, 신경근육 장애의 치료는 유효량의 분자를 근육 또는 근육의 군에 국부로 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 자율신경성 장애의 치료는 유효량의 분자를 선 또는 선들에 국부로 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 통증의 치료는 유효량의 분자를 통증의 부위에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 통증의 치료는 유효량의 변형된 신경독소를 척수에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "치료 유효량"은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 치료제와 조합하여 대상체에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 본 개시내용의 각각의 치료제의 양을 지칭한다. 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 치료될 특정한 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 대상체 파라미터, 치료의 지속기간, 공동 요법 (존재하는 경우)의 속성, 구체적인 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 전문지식 내의 기타 인자에 따라 달라진다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 불과 상용 실험으로 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 대상체는 의학적 이유, 심리적 이유로, 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 허용 용량을 고집할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 실험적 고려사항, 예컨대 반감기가 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 치료제, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체로부터의 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 반감기를 연장시키고 폴리펩티드가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
투여 빈도는 요법 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 반드시 그렇지는 않지만 일반적으로, 질환의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로, 폴리펩티드의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 매일, 격일, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 또는 6일마다이다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 1회; 또는 1개월마다, 2개월마다 또는 3개월마다, 또는 그 초과마다 1회이다. 통상적인 기술 및 검정에 의해 이러한 요법의 진행이 용이하게 모니터링된다.
투여 요법 (사용되는 폴리펩티드를 포함함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 대상체에 대해, 약 0.01 내지 1000 mg/kg의 범위의 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 1 내지 200 mg이다. 특정한 투여 요법, 즉, 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 대상체 및 그러한 대상체의 의료 병력, 뿐만 아니라 폴리펩티드의 특성 (예컨대 폴리펩티드의 반감기, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 고려사항)에 의존할 것이다.
본 개시내용의 목적상, 본원에 기재된 바와 같은 치료제의 적절한 투여량은 사용되는 구체적인 작용제 (또는 그의 조성물), 제제 및 투여 경로, 질환의 유형 및 중증도, 폴리펩티드가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 길항제에 대한 대상체의 임상 병력 및 반응, 담당 의사의 판단에 의존할 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적하는 결과를 달성하는 투여량이 도달될 때까지 폴리펩티드를 투여할 것이다.
1종 이상의 폴리펩티드의 투여는 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 또는 예방적인지 여부, 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 폴리펩티드의 투여는 본질적으로 미리 선택된 시간의 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 또는 예를 들어, 질환의 발생 전에, 동안, 또는 후에 일련의 이격된 용량으로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료하는"은 이를 필요로 하는 대상체에의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
"이를 필요로 하는 대상체"는 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치유하거나, 낫게 하거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 변경시키거나, 해결하거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 또는 영향을 미치기 위한 목적을 갖는, 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 갖는 개체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CDI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 질환을 경감시키는 것은 질환의 발생 또는 진행을 지연시키거나, 질환 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 질환을 경감시키는 것은 치유적 결과를 반드시 필요로 하지 않는다.
본원에 사용된, 질환의 발생을 "지연시키는 것"은 질환의 진행을 연기, 방해, 감속, 지연, 안정화, 및/또는 늦추는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료되는 질환 및/또는 개체의 이력에 따라 시간 길이가 다양할 수 있다. 질환 발생을 "지연" 또는 경감시키거나, 또는 질환의 개시를 지연시키는 방법은 이러한 방법을 사용하지 않은 경우와 비교하여 주어진 시간 프레임에서 질환의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는, 통계적으로 유의한 결과를 제공하는 데 충분한 다수의 대상체를 사용하여, 전형적으로 임상 연구에 기초한다.
질환의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 그 후의 진행을 의미한다. 질환의 발생은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능할 수 있고 평가될 수 있다. 그러나, 발생은 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적상, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"은 발병, 재발, 및 개시를 포함한다.
본원에 사용된, 질환의 "개시" 또는 "발병"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다. 의약 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여, 치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 단리된 폴리펩티드 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 다른 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있고, 예를 들어, 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 또는 이식 저장소를 통해 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 주사가능한 데포 투여 경로를 통해, 예컨대 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하여 이를 대상체에게 투여할 수 있다.
본원에 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물을 지칭한다. 통상적으로 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥 동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크, 예를 들어 레서스를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척, 페릿, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어 집고양이, 개 종, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭, 에뮤, 타조 및 어류, 예를 들어 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 환자 또는 대상체는 상기한 것의 임의의 하위세트, 예를 들어 상기 모두이나 1종 이상의 군 또는 종, 예컨대 인간, 영장류 또는 설치류를 제외한 것을 포함한다. 본원에 기재된 측면의 특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 완전히 발달된 대상체 (예를 들어, 성인) 또는 발달 과정을 겪고 있는 대상체 (예를 들어, 소아, 영아 또는 태아)일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나, 이들 예에 제한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물은 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 장애의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물을 치료하는 데 사용될 수 있다.
하기 실시예는 특정 실시양태의 예시인 것으로 의도되며, 비제한적이다. 본 출원 전반에서 인용된 모든 참고문헌 (문헌 참고문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류 특허 출원 포함)의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
표 1 BoNT 폴리펩티드 서열
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* 돌연변이는 밑줄에 의해 표시된다
신규 보툴리눔 신경독소 및 그의 유도체
보툴리눔 신경독소 (BoNT)는 가장 위험한 잠재적 생물테러 작용제 중에 속하고, 또한 증가하는 목록의 의학적 상태를 치료하기 위해 임상적으로 사용된다. 지금까지 공지된 BoNT의 7종의 혈청형 (BoNT/A-G)이 존재하고, 지난 45년 동안 새로운 유형이 승인된 적은 없었다. 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 게놈 데이터베이스 검색은 BoNT/X로 명명되는 신규 BoNT 유형을 밝혀냈다. 이 독소는 다른 BoNT와의 가장 낮은 서열 동일성을 나타내었고, 그것은 공지된 BoNT 유형에 대해 생성된 항혈청에 의해 인식되지 않는다. 그것은 BoNT/B/D/F/G의 표적이기도 한 뉴런 내 소포 연관된 막 단백질 (VAMP)을 절단하지만, BoNT/X는 이 독소에 있어 고유한 부위 (VAMP2 상의 Arg66-Ala67 사이)를 절단한다. BoNT/X의 활성을 입증하기 위해, 제한된 양의 전장 BoNT/X를 트랜스펩티다제 (소르타제)를 사용하여 BoNT/X의 2개의 비-독성 단편을 공유 연결에 의해 조립하였다. 조립된 BoNT/X는 배양된 뉴런에 진입하였고, VAMP2를 절단하였으며, 마우스에서 발가락 외전(Digit Abduction) 점수 검정에 의해 측정되는 이완성 마비를 유발하였다. 종합하여, 이들 데이터는 BoNT/X를 신규 BoNT 유형으로서 확립하였다. 그의 발견은 효과적인 대응책을 개발하는 것에 대한 긴급한 과제를 제기하고, 또한 잠재적 치료 용도를 위한 신규 도구를 제시한다.
게놈 데이터베이스 검색이 신규 BoNT 유전자를 밝혀냈다
BoNT의 진화적 전망을 조사하기 위한 시도로, 7종의 BoNT의 서열을 프로브로서 이용하여 펍메드 서열 데이터베이스의 반복적 은닉 마르코프 모델(Hidden Markov model) 검색을 수행하였다. 검색은 주요 BoNT 혈청형, 하위유형 및 모자이크 독소, 뿐만 아니라 관련된 파상풍 신경독소 (TeNT)를 성공적으로 확인하였다 (도 5). 예상외로, 그것은 또한 최근에 보고된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 111의 게놈 서열로부터, 신규 BoNT 유전자 (진뱅크 번호 BAQ12790.1)도 밝혀냈다. 이 독소 유전자는 본원에서 BoNT/X로 지정된다.
계통발생학적 분석은 BoNT/X가 다른 모든 BoNT 및 TeNT와 명백하게 구별된다는 것을 밝혀냈다 (도 1A). 그것은 BoNT/TeNT 패밀리 내에서의 쌍별 비교 중에 임의의 다른 BoNT와의 가장 작은 단백질 서열 동일성 (<31%)을 갖는다 (도 1A). 예를 들어, BoNT/A와 BoNT/B는 39% 서열 동일성을 공유하고, BoNT/B와 BoNT/G는 58% 서열 동일성을 갖는다. 게다가, 슬라이딩 서열 비교 윈도우는 다른 7종의 BoNT 및 TeNT와 비교 시 BoNT/X 서열을 따라 낮은 유사성이 고르게 분포되어 있음을 입증하였으며 (도 1B), 이는 그것이 모자이크 독소가 아니라는 것을 나타낸다.
낮은 서열 동일성에도 불구하고, 다음을 포함하는 BoNT의 전체 도메인 배열 및 소수의 주요 특색은 BoNT/X에 보존된 것으로 보인다 (도 1B): (1) 보존된 아연-의존성 프로테아제 모티프 HExxH (잔기 227-231, HELVH (서열식별번호: 92))는 추정 LC에 위치함; (2) 추정 LC와 HC 사이의 경계에 위치하는 2개의 보존된 시스테인이 존재하며, 그들은 필수 쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있음; (3) 보존된 수용체 결합 모티프 SxWY가 추정 HC (잔기 1274-1277, SAWY (서열식별번호: 93))에 존재하며, 그것은 지질 보조-수용체 강글리오시드를 인식함 43,44.
예상한 대로, BoNT/X 유전자는 추정 NTNHA 유전자로 시작된다 (도 1C). 그들은 OrfX 유전자 클러스터에 위치한다. 그러나, BoNT/X의 OrfX 유전자 클러스터는 다른 2종의 공지된 OrfX 클러스터와 비교하여 2가지 고유한 특색을 갖는다 (도 1C): (1) 임의의 다른 OrfX 클러스터에 대해 보고된 적 없는, BoNT/X 유전자의 옆에 위치한 추가의 OrfX2 단백질 (OrfX2b로서 지정됨)이 존재함; (2) OrfX 유전자의 리딩 프레임은 BoNT/X 유전자와 동일한 방향을 가지고 있음, 그러나 OrfX 유전자는 다른 OrfX 클러스터에서 BoNT 유전자의 방향과 통상적으로 반대임 (도 1C). 종합하여, 이들 특색은 BoNT/X가 BoNT 패밀리의 고유한 진화적 가지를 구성할 수 있음을 시사한다.
BoNT/X의 LC는 신규 부위에서 VAMP2를 절단한다
BoNT/X가 기능적 독소인지 여부를 다음에 검사하였다. 먼저, BoNT/X의 LC (X-LC)를 조사하였다. LC의 경계 (잔기 1-439)를 다른 BoNT와의 서열 정렬에 의해 결정하였다. LC를 코딩하는 cDNA를 합성하였고, LC를 이. 콜라이에서 His6-태그부착된 재조합 단백질로서 생산하였다. X-LC를 래트 뇌 세제 추출물 (BDE)과 인큐베이션하였고, 이뮤노블롯 분석을 사용하여 뇌 내 3종의 우세한 SNARE 단백질, SNAP-25, VAMP2, 및 신탁신 1이 절단되었는지를 검사하였다. BoNT/A의 LC (A-LC) 및 BoNT/B의 LC (B-LC)를 대조군으로서 병행하여 검정하였다. BoNT/A에 의한 SNAP-25의 절단은 이뮤노블롯에서 여전히 인식될 수 있는 보다 작은 단편을 생성하는 반면, BoNT/B에 의한 VAMP2의 절단은 VAMP2의 이뮤노블롯 신호를 무효화한다 (도 2A). 또한, 시냅스 소포 단백질인 시냅토피신 (Syp)을 내부 로딩 대조군으로서 검출하였다. X-LC의 래트 뇌 DTE와의 인큐베이션은 신탁신 1 또는 SNAP-25에 영향을 미치지 않았지만, VAMP2 신호를 무효화하였다 (도 2A). BoNT의 LC는 아연-의존성 프로테아제이다 25. 예상한 대로, EDTA는 X-, A-, 및 B-LC에 의한 SNARE 단백질의 절단을 방지하였다 (도 2A). X-LC가 VAMP2를 절단한다는 것을 추가로 확인하기 위해, His6-태그부착된 단백질로서 VAMP2의 시토졸 도메인 (잔기 1-96)을 정제하였다. VAMP2 (1-96)의 X-LC와의 인큐베이션은 SDS-PAGE 겔 상에서 VAMP2 밴드를 2개의 보다 저분자량 밴드로 전환시켰으며 (도 2B), 이는 X-LC가 VAMP2를 절단한다는 것을 확인해준다.
VAMP2 상의 절단 부위를 확인하기 위해, VAMP2 (1-96) 단백질을 X-LC와의 사전-인큐베이션과 함께 또는 사전-인큐베이션 없이, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS, 도 2C-2E, 상세한 사항은 하기 참조)에 의해 분석하였다. 단일 우세 펩티드 피크는 X-LC와의 인큐베이션 후에 나타났다 (도 2C, 2E, 및 6). 그의 분자량은 오직 VAMP2의 잔기 A67-L96의 펩티드 서열에만 적합한 3081.7인 것으로 결정되었다 (그림 2C, 2E). 일관되게, His6-태그의 시작부에서 VAMP2의 잔기 R66까지의 다른 단편이 또한 검출되었다 (도 2D). 이 결과를 추가로 확인하기 위해, 검정을 상이한 VAMP2 단편: GST-태그부착된 재조합 VAMP2 (33-86)로 반복하였다 (도 7). X-LC와의 인큐베이션은 오직 VAMP2의 잔기 A67-R86의 펩티드 서열에만 적합한 2063.1의 분자량을 갖는, 단일 우세 피크를 생성하였다 (도 7D-7E). 예상한 대로, GST 태그의 시작부에서 VAMP2의 잔기 R66까지의 다른 단편이 또한 검출되었다 (도 7F). 종합하여, 이들 결과는 X-LC가 R66과 A67 사이의 VAMP2 상에 단일 절단 부위를 갖는다는 것을 입증하였다.
R66-A67은 다른 모든 BoNT에 대한 확립된 표적 부위와는 구별되는 신규 절단 부위이다 (도 2F). 또한 그것은 이전에 SNARE 모티프 (도 2F, 음영처리된 영역)로서 공지된 영역 내에 위치한 유일한 BoNT 절단 부위이다 45. VAMP 패밀리 단백질은 VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 뿐만 아니라 관련된 Sec22b 및 Ykt6을 포함한다. R66-A67은 VAMP2에 대해 고도로 상동인 VAMP1 및 VAMP3 내에 보존되어 있지만, VAMP7 및 VAMP8과 같은 다른 VAMP 상동체 내에는 그러하지 않다. X-LC의 특이성을 검증하기 위해, HA-태그부착된 전장 VAMP1, 3, 7, 8 및 myc-태그부착된 Sec22b 및 Ykt6을 일시적 형질감염을 통해 HEK293 세포에서 발현시켰다. 세포 용해물을 X-LC와 함께 인큐베이션하였다 (도 2G). 이뮤노블롯 신호가 보다 저분자량으로 이동한 것에 의해 입증된 것처럼, VAMP1 및 3 둘 다는 X-LC에 의해 절단되었고, 반면에 VAMP7, VAMP8, 및 Sec22B는 X-LC에 대해 내성이 있었다 (도 2G).
예상외로, Ykt6은 X-LC에 의해 절단되었다 (도 2G). 이러한 발견은 X-LC와의 인큐베이션 후에 보다 저분자량 밴드로 이동한 정제된 GST-태그부착된 Ykt6 단편을 사용하여 확인되었다 (도 2H). 절단 부위는 무손상 Ykt6 대 X-LC에 의해 절단된 Ykt6의 질량 분광측정법 분석에 의해 K173-S174인 것으로 결정되었다 (도 13A). 이것은 VAMP2에서의 절단 부위에 대해 상동인 부위이며 (도 2F), 이는 절단 부위의 위치가 상이한 VAMP에 걸쳐서 보존된다는 것을 나타낸다. VAMP 구성원 중에, VAMP4는 이 부위에 Ykt6과 동일한 잔기 쌍 (K87-S88)을 함유한다. VAMP4의 GST-태그부착된 세포질 도메인은 X-LC에 의해 효율적으로 절단된 것으로 밝혀졌다 (도 2I). 일관되게, X-LC는 BDE에서 천연 VAMP4를 절단하였다 (도 4J). 대조군으로서, Sec22b는 BDE에서 X-LC에 의해 절단되지 않았다. 게다가, VAMP2 및 VAMP4보다 더 느린 속도였지만, VAMP5의 GST-태그부착된 세포질 도메인도 또한 절단되었다 (도 2I). 절단 부위는 질량 분광측정법 분석에 의해 VAMP4 내의 K87-S88 및 VAMP5 내의 R40-S41인 것으로 확인하였다 (도 14). 둘 다는 VAMP2에서의 절단 부위에 대해 상동인 부위이다 (도 2F). VAMP4, VAMP5, 및 Ykt6을 절단하는 X-LC의 능력은, 그들의 서열이 실질적으로 VAMP1/2/3과 상이하기 때문에, 대단히 비통상적이다. BoNT/X는 정규 표적 VAMP1/2/3을 넘어서 VAMP를 절단할 수 있는 최초의 BoNT이다 66. 또한, X-LC는 BDE에서 VAMP4를 절단하였고, 절단은 EDTA에 의해 차단되었다 (도 2J).
BoNT/X의 주목할 만한 특색은 VAMP4 및 Ykt6을 절단하는 그의 고유한 능력이다. VAMP4는 광범위하게 발현되고, 트랜스-골지망 (TGN)과 엔도솜 사이의 소포 융합, 뿐만 아니라 엔도솜의 동형 융합을 매개하는 것으로 공지되어 있다 59, 60. Ykt6은 막횡단 도메인이 없는 비정형 SNARE이다 67- 70. 그것은 그의 막 회합의 동적 조절을 허용하는 지질화를 통해 막에 고정되어 있다. Ykt6은 ER-골지, 골지내, 엔도솜-골지-공포, 및 자가포식소체 형성을 포함하는 다중 막 융합 사건에 연루되는, 효모 내 필수 단백질이다. 포유동물 세포에서의 그의 기능은 아직 확립되지 않았다. BoNT는 형질 막 상으로 소포 세포외유출을 매개하는 SNARE를 표적화하는 것에 제한되는 것으로 전통적으로 공지되어 있다. BoNT/X는 다양한 세포내 막 트래픽킹 사건을 매개하는 SNARE를 절단할 수 있는 최초의 BoNT이다.
흥미롭게도, VAMP4 및 Ykt6 둘 다는 뉴런에서 풍부하다. 최근 연구는 VAMP4가 또한 뉴런에서 비동기 시냅스 소포 세포외유출, 인라지오솜 세포외유출, 및 활성-의존성 벌크 세포내이입 (ADBE)에 또한 기여할 수 있음을 시사하였다 61- 63. 뉴런에서의 Ykt6의 역할은 아직 확립되지 않았지만, 그것은 파킨슨병 모델에서 α-시뉴클레인의 독성을 억제하는 것으로 밝혀졌다 71- 72. BoNT/X의 다른 기질인 VAMP5는 주로 근육 세포에서 발현되고, 그의 기능은 아직 확립되지 않았다 64. BoNT/X는 VAMP4, Ykt6, 및 VAMP5 기능 및 관련된 막 트래픽킹 사건을 조사하기 위한 강력한 도구일 것이다. 게다가, VAMP4는 면역 세포에서 과립 방출에 연루되어 있고 65, 따라서 BoNT/X는 모든 BoNT 중에서 면역 세포에서의 염증성 분비를 조정하는 고유한 잠재력을 가질 수도 있다.
BoNT/X의 단백질분해적 활성화
BoNT는 처음에 단일 폴리펩티드로서 생산된다. LC와 HN 사이의 링커 영역은 BoNT의 활성에 필수적인, "활성화"로서 공지된 과정에서 박테리아 또는 숙주 프로테아제에 의해 절단될 필요가 있다. BoNT의 LC 및 HN은 세포의 시토졸 내로의 LC의 전위 전에 쇄간 디술피드 결합을 통해 연결된 채로 있으며, 여기서 디술피드 결합이 LC를 시토졸 내로 방출하기 위해 환원된다. 서열 정렬은 BoNT/X가 다른 모든 BoNT와 비교하여 2개의 보존 시스테인 사이에 가장 긴 링커 영역 (C423-C467, 도 3A)을 함유한다는 것을 밝혀냈다. 게다가, BoNT/X의 링커 영역은 BoNT/X에 있어 고유한, 추가의 시스테인 (C461)을 함유한다.
BoNT/X의 LC와 HN 사이의 링커 영역이 단백질분해적 절단에 대해 감수성인지 여부를 검사하기 위해, 재조합 X-LC-HN 단편 (잔기 1-891)을 이. 콜라이에서 생산하고, 리신 잔기의 C-말단 측면에서 절단하는, 엔도프로테이나제 Lys-C에 의한 제한된 단백질분해에 적용하였다. 제한된 단백질분해 조건 하에서의 감수성 절단 부위를 확인하기 위해, X-LC-HN을 탠덤 질량 태그 (TMT) 표지 및 탠덤 질량 분광측정법 접근법을 사용하여 분석하였다. TMT는 유리 N-말단 (및 리신)을 표지한다. Lys-C에 의한 제한된 단백질분해는, 무손상 X-LC-HN 샘플에서 존재하지 않을 추가의 유리 N-말단을 생산한다 (상세한 사항은 하기 참조). 간략하게, 무손상 X-LC-HN 샘플을 가벼운 TMT로 표지하였고, 동등량의 X-LC-HN 샘플을 Lys-C에 노출시킨 다음, 무거운 TMT로 표지하였다. 이어서, 샘플 둘 다를 키모트립신에 의해 소화시키고, 합하고, 정량적 질량 분광측정법 분석에 적용하였다. 확인된 펩티드의 목록을 하기 표 2에 나타내었다. 가벼운 TMT : 무거운 TMT 비는, 가벼운 TMT 표지에 대해서는 어떠한 신호도 보여주지 않았던 N439로 시작하는 5개의 펩티드를 제외하고는, 통상적으로 각각의 펩티드에 대해 서로의 2배 이내였으며, 이는 이것이 Lys-C 절단에 의해 생성된 새로운 N-말단이라는 것을 나타낸다 (도 3A, 표 2). 따라서, Lys-C는 제한된 단백질분해 조건 하에서 K438-N439를 우선적으로 절단하며, 이는 링커 영역이 프로테아제에 대해 감수성임을 입증한다 (도 3A).
이 단백질분해 활성화가 BoNT/X의 기능에 중요한지 여부를 다음에 검사하였다. 고농도의 BoNT의 LC-HN을 배양된 뉴런과 함께 인큐베이션하는 것이, 가능성있게는 뉴런 내로의 비-특이적 흡수를 통해 뉴런 내로 LC-HN이 진입하도록 한다는 것이 이전에 밝혀졌다 46, 47. 이러한 접근법을 사용하여, 배양된 래트 피질 뉴런에서 무손상 대 활성화된 X-LC-HN의 효력을 비교하였다. 뉴런을 12시간 동안 배지에서 X-LC-HN에 노출시켰다. 세포 용해물을 수확하였고, 이뮤노블롯 분석을 수행하여 SNARE 단백질의 절단을 검사하였다. 도 3B에 나타난 바와 같이, X-LC-HN은 농도-의존성 방식으로 뉴런에 진입하여 VAMP2를 절단하였다. Lys-C에 의해 활성화된 X-LC-HN은 무손상 X-LC-HN보다 대폭 상승된 효력을 보여주었다: 10 nM 활성화된 X-LC-HN은 150 nM 무손상 X-LC-HN과 유사한 수준의 VAMP2를 절단하였다 (도 3B). 무손상 X-LC-HN이 세포 표면 프로테아제에 의한 단백질분해적 절단에 감수성일 가능성이 있다는 점, 이 점이 그것이 고농도에서 뉴런에 대해 여전히 활성인 이유라는 것에 주목한다. 흥미롭게도, 활성화된 X-LC-HN은, 동일한 검정 조건 하에 뉴런 내 그의 SNARE 기질의 어떠한 검출가능한 절단도 나타내지 않은 활성화된 BoNT/A의 LC-HN (A-LC-HN) 및 BoNT/B의 LC-HN (B-LC-HN)보다 더 강력한 것으로 보인다 (도 3B).
표 2. TMT 표지 및 정량적 질량 분광측정법에 의해 분석된 제한된 단백질분해 하의 X-LC-HN의 펩티드 단편.
His6-태그부착된 재조합 X-LC-HN을 가벼운 TMT로 표지하였다. 동등량의 X-LC-HN 샘플을 Lys-C에 노출시킨 다음, 무거운 TMT로 표지하였다. 이어서, 샘플 둘 다를 키모트립신에 의해 소화시키고, 합하고, 정량적 질량 분광측정법 분석에 적용하였다. 확인된 펩티드의 목록을 나타내었다. 가벼운 TMT : 무거운 TMT 비는, N439로 시작하는 5개의 펩티드 (밑줄표시됨)를 제외하고는, 모든 펩티드에 대해 서로의 2배 이내이다. 이들 5개의 펩티드는 가벼운 TMT 표지에 대해서는 어떠한 신호도 보여주지 않았으며, 이는 N439가 Lys-C 절단에 의해 생성된 새로운 N-말단이라는 것을 나타낸다. 표 2의 펩티드 서열은 상단에서 하단까지 서열식별번호: 94-226에 상응한다.
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BoNT/X에서의 디술피드 결합의 고유한 특색
BoNT/X의 링커 영역은 BoNT/X에 있어 고유한, 추가의 시스테인 (C461)을 함유한다. 어느 시스테인이 LC와 HC를 연결시키는 디술피드 결합을 형성하는지를 결정하기 위해, 3종의 X-LC-HN 돌연변이체를, 3개의 시스테인 잔기 각각을 돌연변이시켜 (C423S, C461S, 및 C467S) 생성하였다. 이들 3종의 시스테인 돌연변이체, 뿐만 아니라 야생형 (WT) X-LC-HN을 제한된 단백질분해에 적용하였고, 이어서 환원제 DTT의 존재 또는 부재 하에 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 통해 분석하였다 (도 3C). LC 상의 시스테인을 돌연변이시키는 것 (C423S)은 DTT의 존재 또는 부재 하에 2개의 ~ 50 kDa 밴드로 분리된 단백질을 생성하였다는 것이 밝혀졌으며, 이는 C423S가 쇄간 디술피드 결합을 무효화하였다는 것을 나타낸다. 대조적으로, C461S 또는 C467S를 함유하는 돌연변이체는 DTT의 부재 하에 100 kDa에서의 단일 밴드를 보여주고, DTT의 존재 하에 2개의 ~50 kDa 밴드로 분리되었으며, 이는 HN 상의 C461 및 C467 둘 다가 LC 상의 C423과 쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있음을 시사한다. 또한, X-LC-HN (C423S) 돌연변이체는 단백질의 추가적 분해를 발생시키면서, C461S 및 C467S 돌연변이체 둘 다보다 Lys-C에 더 감수성인 것으로 보인다 (도 3C). 이 결과는 쇄간 디술피드 결합을 잃는 것이 LC 및 HN의 자유도를 증가시키고, 따라서 더 많은 표면적을 노출시킬 수 있음을 시사한다. 게다가, WT X-LC-HN의 한 부분은 SDS-PAGE 겔의 상부에서 응집체를 형성하였다 (도 3C). 이들 응집체는 분자간 디술피드 결합의 형성으로 인한 것이며, 이들이 DTT의 존재 하에 사라졌기 때문이다 (도 3C, +DTT). C423, C461 및 C467은 X-LC-HN에서 유일한 3개의 시스테인이다. 3개의 시스테인 중 어느 하나를 돌연변이시키는 것은 X-LC-HN 응집체를 무효화하였으며 (도 3C, -DTT), 이는 분자간 디술피드 결합의 형성이 링커 영역 내 추가의 시스테인의 존재로 인한 것임을 나타낸다.
활성화된 WT X-LC-HN의 대부분은 또한 DTT의 부재 하에 SDS-PAGE 겔 상에서 2개의 ~50 kDa 밴드로 분리되었다 (도 3C). 다른 한편으로는, WT X-LC-HN은 C461S 및 C467S 돌연변이체처럼 Lys-C에 대해 유사하게 내성이 있고, 그것은 C423S 돌연변이체가 그러하였던 것처럼 추가의 분해가 없는 것으로 나타났으며 (도 3C, +DTT), 이는 WT X-LC-HN이 C423S 돌연변이체와 상이하다는 것을 시사한다. 한 가지 가능한 설명은 디술피드 결합을 쇄간 C423-C467 또는 C423-C467에서 변성 조건 하에 쇄내 C461-C467로 재배열할 수 있는, HN (C461과 C467) 상에서의 서로 근접한 2개의 시스테인의 존재로 인한 디술피드 결합 셔플링이다 48, 49. 이 가설을 시험하기 위해, 유리 시스테인의 술프히드릴과 반응하여 영구적으로 임의의 유리 시스테인을 차단하는 알킬화 시약, N-에틸말레이미드 (NEM)를 사용하였다. 도 3D에 나타난 바와 같이, NEM으로 사전처리한 WT X-LC-HN은 DTT의 부재 하에 100 kDa에서 단일 밴드로서 주로 나타났고, DTT의 존재 하에 2개의 ~50 kDa 밴드로 분리되었다. 이들 결과는 천연 WT X-LC-HN이 주로, 링커 영역 내 제3 시스테인의 존재로 인한 디술피드 결합 셔플링에 감수성인 쇄간 디술피드 결합을 함유한다는 것을 확인하였다.
최종적으로, 배양된 뉴런 상의 3개의 X-LC-HN 시스테인 돌연변이체의 활성을 검사하였다. 도 3E에 나타난 바와 같이, 뉴런에서 VAMP2 절단이 결여된 것에 의해 입증된 바와 같이, LC의 시스테인 (C423S)을 돌연변이시키는 것은 X-LC-HN의 활성을 무효화하였다. HN 상에서의 2개의 시스테인 (C461 또는 C467) 중 하나를 돌연변이시키는 것은 야생형 (WT) X-LC-HN과 비교하여 X-LC-HN의 효력에 유의하게 영향을 미치지 않았다 (도 3E). 이들 결과는 쇄간 디술피드 결합이 BoNT/X의 활성에 필수적이라는 것을 확인하였고, 기능적 쇄간 디술피드 결합이 C423-C461 또는 C423-C467 중 하나를 통해 형성될 수 있다는 것을 입증하였다.
소르타제-매개 라이게이션을 통한 전장 BoNT/X의 생성
BoNT/X가 기능적 독소인지를 평가하기 위해, 전장 BoNT/X를 생성하고 시험하는 것이 필요하였다. 그러나, BoNT는 가장 위험한 잠재적 생물테러 작용제 중 하나이다. 따라서, 필요한 예방조치를 취하였고, 전장 활성 독소 유전자는 생성되지 않았다. 그 대신에, BoNT의 2개의 비-독성 단편을 효소적 라이게이션하는 것에 의해 제어 조건 하에 시험 튜브 내에 제한된 양의 전장 BoNT를 생성하는 접근법을 개발하였다. 이 방법은 특정한 펩티드 모티프를 인식하고 천연 펩티드 결합을 형성함으로써의 2개의 펩티드를 함께 공유 연결하는, 소르타제로서 공지된 트랜스펩티다제를 이용한다 (도 4A). 이러한 접근법은 키메라 독소 및 다른 융합 단백질을 생성하기 위해 이전에 이용된 적이 있다 50,51.
SrtA*로서 공지된 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 조작된 소르타제 A를 생성하였다 51. SrtA*는 펩티드 모티프 LPXTG (서열식별번호: 57)를 인식하고, T-G 사이를 절단하며, 하나 이상의 N-말단 글리신을 함유하는 다른 단백질/펩티드와 LPXTG (서열식별번호: 57)를 함유하는 단백질 사이에 새로운 펩티드 결합을 공동으로 형성한다 (도 4A). BoNT/X의 2개의 비-독성 단편: (1) LPETGG (서열식별번호: 58) 모티프 및 C-말단에 융합된 His6-태그를 갖는 LC-HN; (2) GST 태그 및 그의 N-말단에 트롬빈 절단 부위를 갖는 BoNT/X의 HC (X-HC)를 생산하였다. 트롬빈에 의한 절단은 N-말단에 유리 글리신을 갖는 X-HC를 방출시켰다. 이들 2개의 단편을 SrtA*와 인큐베이션하는 것은 LC-HN과 HC 사이에 짧은 링커 (LPETGS, 서열식별번호: 59)를 함유하는 제한된 양의 ~150 kD 전장 BoNT/X를 생성하였다 (도 4A-4B).
X-HC는 그것이 GST 태그로부터 절단될 시에, BoNT/X에 대해 라이게이션 효율이 낮은 이유일 수도 있는 알려지지 않은 이유로 용액 내 응집에 대한 강한 경향을 나타낸 것이 관찰되었다 (도 4B). 대조적으로, 동일한 접근법을 사용하여 X-LC-HN을 BoNT/A의 HC (A-HC)와 라이게이션하는 것은 대부분의 X-LC-HN이 전장 XA 키메라 독소 내로 라이게이션되도록 하면서 훨씬 더 높은 효율을 달성하였다 (도 8A).
BoNT/X는 배양된 뉴런 상에서 활성이다
전장 BoNT/X의 활성을 분석하기 위해, 모델 시스템으로서의 배양된 래트 피질 뉴런을 사용하였다. 뉴런을 배지에서 소르타제 라이게이션 혼합물 및 다양한 대조군 혼합물에 노출시켰다. 세포 용해물을 12시간 후에 수확하였고, 이뮤노블롯 분석을 수행하여 SNARE 단백질의 절단을 검사하였다. 도 4C에 나타난 바와 같이, X-LC-HN 단독은 반응 혼합물 중 그의 고농도로 인해 일부 VAMP2를 절단하였다. X-LC-HN 및 X-HC를 함유하지만 소르타제는 함유하지 않는 대조군 혼합물은 X-LC-HN 단독과 비교하여 VAMP2의 절단을 다소 증진시켰다. 이 결과는 X-HC가 비-공유 상호작용을 통해 X-LC-HN과 회합될 수도 있다는 것을 시사한다. 이 상호작용은, X-LC-HN 및 A-HC를 함유하는 대조군 혼합물이 X-LC-HN 단독에서와 동일한 VAMP2 절단 수준을 보여주었기 때문에 특이적인 것으로 보인다 (도 8B). 소르타제에 의한 X-LC-HN과 X-HC의 라이게이션은 소르타제 부재 하의 X-LC-HN 및 X-HC의 혼합물보다 VAMP2의 절단을 증진시켰으며 (도 4C), 이는 라이게이션된 전장 BoNT/X가 뉴런에 진입하여 VAMP2를 절단할 수 있다는 것을 입증한다. 유사하게, 라이게이션된 전장 XA 키메라 독소는 또한 뉴런에 진입하여 VAMP2를 절단하였다 (도 8B).
X-HC를 X-LC-HN과 혼합하는 것은 X-LC-HN 단독과 비교하여 SDS-PAGE 겔의 상부에서의 응집체의 양을 증가시켰다. 이들 응집체는 DTT의 존재 하에 사라졌으며, 이는 X-HC의 일부가 X-LC-HN과 함께 분자간 디술피드 결합을 형성하였다는 것을 시사한다. DTT의 존재는 또한 라이게이션된 전장 BoNT/X의 양을 증가시켰으며, 이는 BoNT/X의 일부가 분자간 디술피드 결합을 통해 응집하였다는 것을 시사한다 (도 4B). 이들 응집체의 형성은 용액에서의 효과적인 독소 단량체 농도를 현저하게 감소시킬 수 있었다. 이것이 BoNT/X 서열의 내인성 약점일 수 있었다. X-HC는 단일 시스테인 (C1240)을 함유하고, 이 시스테인을 돌연변이시키는 것은 라이게이션된 BoNT/X의 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 9). 게다가, C1240S 돌연변이체는 X-LC-HN에서의 C461S 또는 C467S 돌연변이와 조합하여 어떠한 유리 시스테인도 없는 변형된 BoNT/X를 생성할 수 있다 (도 9). 이들 돌연변이체 독소는 WT BoNT/X와 동일한 수준의 활성을 유지하였지만, WT BoNT/X보다 단량체로서 용액에서 보다 안정하다.
BoNT/X는 마우스에서 생체내 이완성 마비를 유발하였다
BoNT/X가 생체내에서 활성인지 여부를 발가락 외전 점수 (DAS)로서 공지된 마우스에서의 널리-확립된 비-치사성 검정을 사용하여 검사하였다. 이 검정은 마우스 뒷다리 근육 내로 BoNT를 주사한 후에 국부 근육 마비를 측정한다 52, 53. BoNT는 놀람 반응 동안 발가락을 펴지 못하는 것에 의해 검출될 수 있는 사지 근육의 이완성 마비를 유발한다. 활성화된 소르타제 반응 혼합물 (도 4B, 레인 7)을 마우스에서 우측 뒷다리의 비복근 내에 주사하였다. 12시간 내에, 우측 사지는 전형적 이완성 마비를 발생시켰고, 발가락은 펴지지 못하였다 (도 4D). 이들 결과는 BoNT/X가 다른 BoNT처럼 생체내에서 이완성 마비를 유발할 수 있다는 것을 확인하였다.
BoNT/X는 모든 공지된 BoNT에 대하여 생성된 항혈청에 의해 인식되지 않았다
BoNT/X가 혈청학적으로 고유한 BoNT라는 것을 추가로 확인하기 위해, 도트 블롯 검정을 모든 7종의 혈청형뿐만 아니라 하나의 모자이크 독소 (BoNT/DC)를 포함하는 공지된 BoNT에 대하여 생성된 항혈청을 사용하여 수행하였다. 4종의 말 항혈청 (3가 항-BoNT/A, B, 및 E, 항-BoNT/C, 항-BoNT/DC 및 항-BoNT/F), 뿐만 아니라 2종의 염소 항혈청 (항-BoNT/G 및 항-BoNT/D)을 이용하였다. 이들 항혈청은 모두 그의 상응하는 표적 BoNT를 중화시킬 수 있었고, 뉴런에서의 SNARE 단백질의 절단을 방지하고 (도 10), 그에 따라 그의 특이성 및 효력을 검증하였다. 도 4E에 나타난 바와 같이, 이들 항혈청은 그의 상응하는 표적 독소를 인식하였지만, 이들 중 어느 것도 BoNT/X를 인식하지 않았다. BoNT/DC 및 BoNT/C에 대하여 생성된 항혈청은, 그들이 그의 HC에서 높은 정도의 유사성을 공유하기 때문에, 서로 교차반응한다는 것에 유의한다. 이들 결과는 BoNT/X를 BoNT의 새로운 혈청학 유형으로서 확립하였다.
전장 불활성 BoNT/X
최종적으로, 전장 BoNT/X를 가용성 단백질로서 생산할 수 있는지 여부를 검사하였다. 생물안전성 요건을 보장하기 위해, BoNT/X의 LC에 그의 독성을 불활성화시키는 돌연변이를 도입하였다. BoNT/A의 2개의 잔기 R362A/Y365F에서의 돌연변이는 시험관내에서 LC의 프로테아제 활성을 불활성화시키는 것으로 밝혀졌고 마우스 생체내에서 전장 BoNT/A의 독성을 무효화한다 54- 56. 이들 2개의 잔기는 BoNT/X를 포함하는 모든 BoNT 내에 보존된다. 따라서, 상응하는 돌연변이를 이들 2개의 부위 (BoNT/X의 R360A/Y363F)에 도입하였다. 도 4F에 나타난 바와 같이, BoNT/X의 이러한 전장 불활성화된 형태 (BoNT/XRY)를 이. 콜라이에 재조합적으로 생산하고 His6-태그부착된 단백질로서 정제하였다. 그것은, VAMP2가 뉴런에서 절단되지 않았기 때문에, 뉴런 상에서의 어떠한 활성도 갖지 않는다 (도 11).
BoNT/XRY의 상당 부분은 SDS-PAGE 겔의 상부에 응집체를 형성하였다 (도 4F). 이것은 DTT를 첨가하는 것이 응집체를 단량체 BoNT/XRY로 전환시키기 때문에, 링커 영역의 추가의 시스테인 및 HC의 시스테인으로부터 분자간 디술피드 결합을 형성하는 것에 기인할 가능성이 있다 (도 4F). 이들 시스테인을 돌연변이시키는 것은 BoNT/X의 활성에 영향을 미치지 않고 (도 9), 분자간 디술피드 결합의 형성 및 BoNT/X의 응집을 방지하는 이익을 갖는다.
BoNT/X의 불활성 형태는 뉴런 내로 치료제를 전달하기 위한 비히클로서 이용될 수도 있다. 불활성화는 하기 잔기 중 어느 하나 또는 그의 조합에서의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다: R360, Y363, H227, E228, 또는 H231 (뒤의 3개의 잔기는 보존 프로테아제 모티프를 형성함).
산업-규모에서의 전장 불활성 BoNT/X의 정제
전장 BoNT/X가 치료 독소로서의 BoNT/X (또는 그의 유도체)의 산업적 생산에 중요할 고도의 순도 및 우수한 수율로 정제될 수 있는지 여부를 조사하였다. 세포 성장 및 발현의 여러 파라미터, 예컨대 온도, 유도 시간 및 IPTG 농도를 시험하였다. 단백질 발현을 위해 선택된 최적 파라미터는 그들이 지수 성장에 도달할 때까지 37℃에서 세포를 배양하는 것이었으며, 이 단계에서 온도를 18℃로 감소시켰고 배지에 1 mM IPTG를 첨가함으로써 발현을 유도하였다. 이어서, 세포를 수확 전에 16 내지 18시간 동안 배양하였다. BoNT/X의 존재를 SDS-PAGE에 의해 검증하였고, 가용성 분획에서 높은 수준의 과다-발현을 보여주었다 (도 11B).
여러 소규모 정제 시험을 수행하여 생산 과정을 최적화하였다. 에멀시플렉스-C3(Emulsiflex-C3) (아베스틴(Avestin), 독일 만하임)을 사용하는 기계적 세포 용해는 세포내 단백질 추출을 위한 바람직한 방법이었고, 초음파처리보다 더 효율적으로 보였다. 또한, 다양한 완충제 조건을 BoNT/X의 최적 회수를 위해 평가해야 하였다. 환원제를 정제 과정 전체에 걸쳐 포함시켰고, 이는 원치 않는 응집에 대한 성향을 대단히 감소시켰다. 추가적으로, 글리세롤을 정제 과정의 초기 단계 동안 첨가제로서 사용하였고, 이는 단백질 안정성을 개선시켰다.
BoNT/X 구축물을 제1 정제 단계로서 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있었던 HIS6-태그와 발현시켰다. 소규모 시험을 위해, 5 ml HIsTrapFF 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 스웨덴 단데뤼드)을 사용하였다. 초기 크로마토그래피로부터 가장 높은 순도를 달성하기 위해, 다양한 농도의 이미다졸을 시험하였다. BoNT/X를 100 mM 농도 이미다졸로부터 용리시켰으나; 주요 오염물이 즉시 독소와 함께 공동-정제되었다. 이 오염물은 BoNT/X와 비-특이적으로 상호작용하는 것처럼 보였고, 이를 이. 콜라이 숙주 단백질 (이관능성 폴리믹신 내성 단백질 ArnA)로서 질량 분광측정법에 의해 확인하였다. 이러한 오염물의 존재는 높은 염 농도 (500 mM NaCl)의 도입에 의해 및 정제 동안 100 mM 이미다졸에서 추가의 세척 단계를 수행함으로써 상당히 감소하였다. 이것은 250 mM 이미다졸에서 보다 순수한 BoNT/X 분획을 용리하도록 하였다. 이어서, 이러한 후자의 분획을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 폴리싱할 수 있었다.
일단 배치 시에, 이 프로토콜을 상기 기재된 조건으로 배지를 12 L까지 발현시킴으로써 규모를 확대시켰다. 추가적으로, 프로티노(Protino)® Ni-NTA 아가로스 (마슈레-나겔(Macherey-Nagel), 독일 뒤렌) 15 ml로 이루어진 보다 큰 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 제조하여 BoNT/X 회수의 수율을 증가시켰다. 최종 정제 단계를 슈퍼덱스(Superdex)200-16/60 칼럼 (지이 헬스케어, 스웨덴 단데뤼드)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 이 방법을 사용하여, 85 내지 90%의 순도를 수득하였다 (도 11C). 단백질을 농축시킬 수 있었고 (100kDa 컷오프를 갖는 비바스핀(Vivaspin) 농축기 사용; 지이 헬스케어, 스웨덴 단데뤼드), 이는 10 mg/ml까지 안정적으로 보였다. 단백질 생산 과정의 전체 세부사항을 하기 기재한다. 수득한 BoNT/X의 수율은 세포 배양물 리터당 대략 3 mg이었다. 종합하여 이들 결과는 BoNT/X가 산업적 규모에서 높은 순도로 정제될 수 있다는 것을 입증하였다.
정제가 LC와 HC 사이의 디술피드 결합을 감소시켰을 환원제의 존재 하에 행해졌으므로 정제된 독소가 활성이 아닐 것이라는 것에 유의한다. 그러나, 시스테인 부위에 돌연변이 (C1240을 돌연변이시키는 것과 조합된, C461 또는 C467에서의 하나의 돌연변이)를 함유하는 설계된 BoNT/X 유도체는 환원제 없이 정제될 수 있을 것이다. BoNT/X (및 그의 시스테인 돌연변이 유도체)의 불활성 형태가 뉴런 내로 치료제를 전달하기 위한 비히클로 이용될 수도 있다는 것에 유의한다. 불활성화는 하기 잔기 중 어느 하나 또는 그의 조합에서의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다: R360, Y363, H227, E228, 또는 H231 (뒤의 3개의 잔기는 보존 프로테아제 모티프를 형성함).
BoNT/X에 대한 수용체로서의 강글리오시드의 확인
강글리오시드는 모든 BoNT에 대해 널리 확립되어 있는 지질 보조-수용체이고, 강글리오시드-결합 모티프는 BoNT/X에서 널리 보존된다 (도 1C). 고도로 정제된 전장 불활성 BoNT/X를 사용하여 BoNT/X가 강글리오시드를 통해 뉴런 세포에 결합하는지 여부를 검사하였다. 시험관내 ELISA 검정을 4종의 주요 뇌 강글리오시드: GD1a, GD1b, GT1b, 및 GM1과의 상호작용을 시험하기 위해 개발하였다. A-LC를 비특이적 결합을 평가하기 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 또한, BoNT/A의 수용체 결합 도메인 (A-HC)과의 직접적 비교를 수행하였다. 단백질의 결합을 항-His6-태그 항체를 사용하여 검출하였다. BoNT/X는 모든 4종의 강글리오시드에 대해 A-LC의 비-특이적 결합 수준을 넘어 용량-의존성 결합을 보여준 것으로 밝혀졌으며 (도 12), 이는 BoNT/X가 보조-수용체로서 모든 4종의 뇌 강글리오시드를 이용할 수 있다는 것을 시사한다. 이전의 보고에 따르면, BoNT/A는 GD1a 및 GT1b (도 12F) 및 그의 말단 NAcGal-Gal-NAcNeu 모이어티에 대한 동일한 선호도를 나타내었다 (S자형 용량-반응 모델로 피팅 시에 각각 0.7 및 1.0μM의 겉보기 EC50 값을 가짐). 대조적으로, BoNT/X는 GD1a 및 GT1b보다 GD1b 및 GM1에 대한 더 높은 친화도를 보여주었다 (도 12E). 이것은 BoNT/X가 BoNT/B 및 TeNT에서도 보이는 선호되는 시알산 인식 패턴을 갖는다는 것을 시사할 것이다. BoNT/X는 다른 독소 중 하나에 대한 상동 위치에 보존된 SxWY 모티프를 보유한다. 낮은 친화도에 의해서라 할지라도 그것이 모든 4종의 강글리오시드를 인식할 수 있었다는 사실은 다중 탄수화물 결합 부위의 지표일 수 있다.
논의
BoNT의 제8 혈청형은 마지막 주요 BoNT 혈청형을 확인한 후에 45년이 넘어 확인되었다. BoNT/X는 이러한 독소 패밀리 중 임의의 다른 BoNT 및 TeNT에 대해 가장 낮은 단백질 서열 동일성을 가지고 있고, 이러한 낮은 수준의 동일성은 독소 서열을 따라 고르게 분포되어 있다. 예상한 대로, BoNT/X는 공지된 BoNT에 대하여 생성된 임의의 항혈청에 의해 인식되지 않았다. 그것은 분명히 독소 패밀리의 고유한 별개의 진화적 가지를 나타낸다.
BoNT/X는 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 게놈 서열을 검색하는 것에 의해 밝혀졌고, 그것은 게놈 서열분석 및 생물정보학 접근법에 의해 확인된 첫 번째 주요 독소 유형을 나타낸다. BoNT/X 유전자를 함유하는 균주 111은 1990년대에 영아 보툴리눔독소증 환자로부터 처음 확인되었다. 전형적 중화 검정을 사용하는 이전의 특징화는 이 균주의 주요 독소로서 BoNT/B2를 확립하였다. BoNT/X는 침묵 독소 유전자이거나 또는 실험실에서 배양 조건 하에 검출가능한 독성 수준으로 발현되지 않았을 가능성이 있다. 따라서, 그것은 오직 균주 111을 서열분석함으로써만 확인될 수 있다. 이는 미생물 병독성 인자를 이해하는 데 있어 게놈 서열분석 및 생물정보학 접근법의 중요성을 설명한다.
침묵 BoNT 유전자는 다양한 클로스트리디움 보툴리눔 균주에서 이전에 빈번하게 발견되었다. 왜 이들 박테리아가 침묵 독소 유전자를 유지하는지는 명확하지 않다. 그것은 진화론적으로 퇴화된 유전자일 수 있었다. 이것은 분명히 침묵 독소 유전자가 미성숙 정지 코드 돌연변이를 함유하는 경우이다. 그러나, 침묵 유전자가 전장 BoNT를 코딩하는 경우도 또한 있다. 이들 침묵 전장 BoNT가 특정 환경 조건 하에 발현되어서 독성을 나타낼 수 있을지 여부는 흥미로운 질문으로 남아 있다.
BoNT의 일반적 3-도메인 구조 및 기능은 BoNT/X 내에 잘 보존되지만, 그것은 또한 하기 소수의 고유한 특징을 갖는다: (1) 그것은 BoNT/B, D, F, 및 G와 뉴런에서 그의 표적으로서 VAMP를 공유하지만, 그것은 이 독소에 있어 고유한 신규 부위 (VAMP2의 R66-A67)에서 VAMP를 절단한다. 이것은 상이한 부위에서 VAMP를 제거하는 데 사용될 수 있는 독소의 레퍼토리를 추가로 확대한다. (2) LC와 HN을 연결하는 쇄간 디술피드 결합은 BoNT/X 내에 보존되지만, 그것은 또한 디술피드 결합 셔플링으로 이어질 수 있는 링커 영역 내 고유한 추가의 시스테인을 함유한다. HN 상의 추가의 시스테인은 LC-HN의 활성에 필수적이지 않고 (도 3D), 그것을 돌연변이시키는 것은 분자간 디술피드 결합의 형성을 방지하는 이익을 갖는다 (도 3D, 4B).
His6-태그부착된 X-LC-HN 단편은 재조합 단백질로서 완충제에서 안정적이다. 그것은 A-LC-HN 및 B-LC-HN 둘 다보다 뉴런 상에서 더 높은 수준의 활성을 보여주었으며 (도 3B), 이는 그의 막 전위 및/또는 프로테아제 활성이 BoNT/A 및 BoNT/B 내 상응하는 단편보다 더 효율적일 수도 있다는 것을 시사한다. X-LC-HN은 그의 진입이 뉴런으로 제한되지 않을 수도 있기 때문에 광범위한 세포 유형 및 조직에서 VAMP1/2/3을 표적화하기 위한 유용한 시약일 수 있었다. 예를 들어, 그것은 감각 뉴런과 염증성 신호를 분비하는 다른 세포 둘 다를 표적화함으로써 국부 영역에서 통증을 줄이는 데 잠재적으로 이용될 수 있다. 그것은 또한 키메라 독소, 예컨대 XA를 생성하는 데 사용될 수 있다 (도 8).
X-HC는 그의 존재가 LC-HN 단독보다 뉴런에서 VAMP2의 절단을 증진시켰기 때문에 기능적이다 (도 4C). 그러나, X-HC는 추가로 평가될 것으로 남아있는 일부 불리한 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 충분한 수준의 가용성 X-HC는 그것이 His6 태그가 아니라 단백질 폴딩/용해성을 용이하게 하는 것으로 공지되어 있는 GST와 융합되었을 때만 생산되었다. 일단 GST 태그로부터 방출되면, X-HC는 응집하는 경향이 있다. 게다가, X-HC 내 시스테인은 또한 분자간 디술피드 결합을 형성할 수도 있다 (도 4B). 전장 불활성 BoNT/X는 정제되어 가용성 단백질로서 존재할 수 있으며, 이는 X-HC에 의한 용해성 문제가 적어도 부분적으로 X-LC-HN으로부터의 이 도메인의 분리에 기인할 수도 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, X-LC-HN은 X-HC와 상호작용할 수도 있고, 다중-도메인 단백질에 통상적이지 않은 전장 콘텍스트에 그의 잠재적 소수성 절편을 포함한다.
강글리오시드는 오랫동안 모든 BoNT 하위유형에 대한 뉴런 수용체로서 확립되어 있었다. BoNT/X가 모든 4종의 가장 풍부한 강글리오시드: GD1a, GD1b, GT1b, 및 GM1에 결합할 수 있다는 것이 입증된다. 추가적으로 그것은 BoNT/A와 비교 시 친화도 및 특이성에서 주목할 만한 차이로 그러하다. 다른 BoNT는 강글리오시드의 하위군을 향한 다양한 정도의 선호도를 갖는 것으로 보이기 때문에, 이것은 흥미로운 특성이다. 예를 들어, BoNT/A, E, F, 및 G는 GD1a 및 GT1b를 선호한다. BoNT/X는 다른 BoNT와 비교하여 더 광범위한 범위의 뉴런 유형을 잠재적으로 인식할 수도 있다.
BoNT/X는 생체내 낮은 독성을 갖는 것이 가능하며, 이 점이 왜 BoNT/X 활성이 균주 111 상에서의 최초 연구에서 검출되지 않았는지를 설명할 수도 있다. 이 경우라면, 감소된 독성은 그의 HC 도메인에 기인할 가능성이 있으며 X-LC-HN이 A-LC-HN 및 B-LC-HN 둘 다보다 더 활성인 것으로 보이기 때문이다. 분자간 디술피드 결합의 형성은 또한 유효 독소 농도를 감소시킬 수도 있다. 그의 생체내 효력을 결정하기 위해 전장 천연 BoNT/X를 생산하는 것이 필수적일 것이지만, 전장 독소를 생산하기 전에 BoNT/X의 비-독성 단편을 사용하여 중화 항혈청을 생성하는 것이 중요할 것이다.
전장 활성 독소 유전자를 임의의 발현 시스템/유기체로 도입하는 것은 늘 상당한 생물안전성 우려가 있으며, 생물학적 독소의 구조-기능 연구에 있어 엄청난 장애물이 되었다. 이것은 그들이 6개의 카테고리 A 잠재적 생물테러 작용제 중 하나이기 때문에 특히 BoNT에 대한 중요한 고려사항이다 4. 본원에서 2개의 상보적이고 비-독성인 단편으로부터 제한된 양의 전장 독소를 생화학적으로 조립하는 방법을 개발하였다. 각각의 단편을 발현시키고 개별적으로 정제한 다음, 시험 튜브에서 소르타제에 의해 함께 라이게이션하였다. 다른 단백질 라이게이션 방법, 예컨대 분할 인테인 시스템 (단백질 트랜스-스플라이싱을 통해 2개의 단백질 단편을 융합시킴)이 또한 이용될 수 있다 57. 반응에서 전구체 단편의 양을 제어함으로써, 라이게이션된 전장 독소의 양을 엄격하게 제어할 수 있다. 이 "반-합성" 접근법은 제어 조건 하에 다중-도메인 생물학적 독소 및 다른 독성 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다. 그것은 또한 융합 및 키메라 독소를 생성하기 위한, 예컨대 2개의 BoNT의 HC를 교환시키거나, BoNT의 HC를 다른 표적화 단백질로 대체하거나, 독소에 추가의 물질을 부착하기 위한 다기능 플랫폼을 제공한다. 지금까지 생성된 전장 독소 cDNA가 없고 박테리아 또는 임의의 다른 살아있는 유기체에서 독소의 발현이 없기 때문에, 이러한 접근법은 야생형 및 돌연변이체 독소를 생산하는 것과 연관된 생물안전성 우려를 현저하게 완화시키고, 생물학적 독소 및 독성 단백질의 구조-기능 연구를 매우 용이하게 할 것이다.
물질 및 방법
물질: 신탁신 1 (HPC-1), SNAP-25 (C171.2), 및 VAMP2 (C169.1)에 대한 마우스 모노클로날 항체는 이. 채프먼(E. Chapman) (위스콘신주 매디슨)에 의해 관대하게 제공되었고, 시냅틱 시스템즈(Synaptic Systems) (독일 고에팅겐)으로부터 입수가능하다. 액틴을 위한 마우스 모노클로날 항체는 시그마(Sigma) (AC-15)로부터 구입하였다. BoNT/A/B/E, BoNT/C, BoNT/DC, BoNT/F에 대한 말 폴리클로날 항혈청 및 BoNT/G에 대한 염소 폴리클로날 항혈청은 FDA로부터 입수하였다. BoNT/D에 대한 염소 폴리클로날 항체는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) (NB10062469)으로부터 구입하였다. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, 및 BoNT/G는 메타바이오로직스(Metabiologics) (위스콘신주 매디슨)로부터 구입하였다. BoNT/D는 이. 존슨(E. Johnson) (위스콘신 매디슨)에 의해 관대하게 제공되었다.
cDNA 및 구축물: X-LC (잔기 1-439) 및 X-HC (잔기 893-1306)를 코딩하는 cDNA를 합성하였다. X-HN을 코딩하는 cDNA는 깁슨(Gibson) 조립 방법을 사용하여 자체 생성하였다. A-LC (잔기 1-425, M30196) 및 B-LC (잔기 1-439, AB232927)를 코딩하는 cDNA는 젠스크립트(GenScript) (뉴저지주 뉴브런즈윅)에 의해 합성하였다. 이들 LC를 His6-태그부착된 단백질로서 발현시키기 위해 pET28 벡터 내로 클로닝하였다. X-HC를 GST-태그부착된 단백질로서 발현시키기 위해 pGEX4T 내로 클로닝하였다. X-LC-HN, A-LC-HN, 및 B-LC-HN을 그의 C-말단에 융합된 펩티드 서열 LPETGG (서열식별번호: 58)와 함께, pET28 벡터 내로 서브클로닝하였고, His6-태그부착된 단백질로서 정제하였다. BoNT/X의 전장 불활성 형태를 돌연변이된 X-LC (R360A/Y363F), X-HN 및 X-HC로부터 자체 조립하였다. 그것을 BoNT/X의 C-말단에 융합된 His6-태그와 함께 pET28 벡터 내로 클로닝하였다. 래트 VAMP2를 코딩하는 cDNA는 이. 채프먼 (위스콘신주 매디슨)에 의해 관대하게 제공되었다. VAMP2 (1-96)를 pET28 벡터로 클로닝하고 His6-태그부착된 단백질로서 발현시켰다. VAMP2 (33-86)를 pGEX4T 벡터 내로 클로닝하고, GST-태그부착된 단백질로서 발현시켰다. 마우스 VAMP1, VAMP3, 래트 VAMP7, 및 VAMP8을 코딩하는 cDNA는 씨. 후(C. Hu) (켄터키주 루이빌)에 의해 관대하게 제공되었다. 그들을 그의 C-말단에 융합된 HA 태그와 함께, 변형된 pcDNA3.1 벡터 내로 클로닝하였다. His6-태그부착된 소르타제 (SrtA*)를 코딩하는 구축물은 비. 펜텔루트(B. Pentelute) (매사추세츠주 보스톤)에 의해 관대하게 제공되었고, 이전에 기재된 적이 있다 51.
생물정보학: 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스를 수렴 시까지 BoNT 유형 A 서열 (유니프롯 수탁 번호 A5HZZ9)을 사용하여 HMMER 웹 서버에서 jackhmmer에 의해 검색하였다. 복귀된 서열을 클러스탈 오메가(Clustal Omega), 및 스플리츠트리4(SplitsTree4)에 의해 측정된 네이버넷(NeighborNet) 계통 네트워크로 정렬하였다.
단백질 정제: 이. 콜라이 BL21 (DE3)을 단백질 발현에 이용하였다. 발현의 유도를 밤새 22℃에서 0.1 mM IPTG에 의해 수행하였다. 박테리아 펠릿을 초음파처리에 의해 용해 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl)에서 파괴하였고, 상청액을 4℃에서 30분 동안 20000g로 원심분리한 후에 수집하였다. 단백질 정제를 AKTA 프라임(Prime) FPLC 시스템 (지이)을 사용하여 수행하였고, 정제된 단백질을 추가로 PD-10 칼럼 (지이, 17-0851-01)에 의해 탈염시켰다. 구체적으로, 전장 불활성 BoNT/X (BoNT/XRY)를 pET22b 벡터 내로 클로닝하였다. 상응하는 플라스미드를 이. 콜라이 BL21 (DE3) 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 생성된 콜로니를 사용하여 250 ml 진탕-플라스크 중에 100 μg/ml 카르베니실린 함유 TB 배지의 100 ml 밤샘 배양물을 접종시키고, 37℃에서 성장시켰다. 발현을 위한 배양물을 먼저 렉스(LEX) 생물반응기 (에피파이트3(Epiphyte3), 캐나다 온타리오주)를 사용하여 OD600이 0.8에 도달할 때까지 TB 배지 1.5 L 중에서 37℃에서 성장시켰다. 이어서, 온도를 1 mM IPTG에 의한 발현의 유도를 위해 18℃로 감소시키고, 16-17시간 동안 성장시켰다. 세포를 수확하고, 얼음 상에서 50 mM HEPES pH 7.2, 500 mM NaCl, 25 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 2 mM TCEP에 재현탁시켜, 20,000 psi에서 에멀시플렉스-C3 (아베스틴, 독일 만하임)에 의해 세포 용해되도록 하였다. 용해물을 4℃에서 45분 동안 200,000 g로 초-원심분리하였다. 상청액을 15 ml 프로티노® Ni-NTA 아가로스 (마슈레-나겐, 독일 뒤렌) 칼럼 상에 로딩시켰고, 이어서 칼럼을 50 mM HEPES pH 7.2, 500 mM NaCl, 100 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 1 mM TCEP로 세척하였다. 용리를 50 mM HEPES pH 7.2, 500 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 1 mM TCEP에 의해 수행하였다. 용리액을 4℃에서 50 mM HEPES pH 7.2, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.5 mM TCEP에서 밤새 투석하였다. 투석액을 비바스핀 농축기 (100kDa 컷오프, 지이 헬스케어, 스웨덴 단데뤼드)를 사용하여 농축시킨 후, 투석에 사용된 것과 동일한 완충제에서 사전-평형화된 슈퍼덱스200-16/60 칼럼 (지이 헬스케어, 스웨덴 단데뤼드) 상에 로딩시켰다. BoNT/X에 상응하는 용리 피크를 수집하고, 최종 샘플이 10 mg/ml의 농도가 되도록 농축시켰다. 샘플을 분취하고, -80℃에서 보관하기 위해 액체 질소에서 급속-동결시켰다.
강글리오시드 결합 검정: 정제된 강글리오시드 GD1a, GD1b, GT1b, 및 GM1 (카르보신트(Carbosynth), 영국 콤프턴)을 DMSO에 용해시키고 메탄올에 희석시켜 2.5 μg/ml의 최종 농도에 도달시켰고; 100 μL를 96-웰 PVC 검정 플레이트 (카탈로그 번호 2595, 코닝(Corning); 뉴욕주 코닝)의 각 웰에 적용하였다. 21℃에서의 용매 증발 후에, 웰을 200 μL PBS/0.1% (w/v) BSA로 세척하였다. 비특이적 결합 부위를 PBS/2% (w/v) BSA 200 μL 중에 4℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션함으로써 차단하였다. 샘플 (삼중)을 (연속 2배 희석물에서) 6 μM 내지 0.05 μM의 범위의 농도로 함유하는 웰당 100 μL PBS/0.1% (w/v) BSA에서, 결합 검정을 4℃에서 1시간 동안 수행하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 PBS/0.1% (w/v) BSA로 3회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 HRP-접합된 항-6xHis 모노클로날 항체 (1:2000, 써모피셔(ThermoFisher))와 인큐베이션하였다. PBS/0.1% (w/v) BSA에 의한 3회의 세척 단계 후에, 결합된 샘플을 울트라-티엠비(Ultra-TMB) (100 μL/웰, 써모피셔)를 기질로 사용하여 검출하였다. 반응을 100 μL 0.2M H2SO4의 첨가에 의해 15분 후에 정지시켰고, 450 nm에서의 흡광도를 인피니트(Infinite) M200PRO 플레이트 판독기 (테칸(Tecan), 스위스 메네도르프)를 사용하여 측정하였다. 데이터를 프리즘7 (그래프패드 소프트웨어)에 의해 분석하였다.
래트 뇌 세제 추출물 (BDE)에서의 SNARE 단백질의 절단: 래트 BDE를 이전에 기재된 바와 같이 신선한 절제된 성체 래트 뇌로부터 제조하였다 58. 간략하게, 래트 뇌를 15 ml의 320 mM 수크로스 완충제에서 균질화하고, 이어서 4℃에서 2분 동안 5000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 12분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하였다. 펠릿을 수집하고, 15 ml의 트리스-완충 염수 (TBS : 20 mM 트리스, 150 mM NaCl) 플러스 트리톤(Triton) X-100 2% 및 프로테아제 억제제의 칵테일 (로슈(Roche), 캘리포니아주)에서 30분 동안 가용화시켰다. 후속적으로, 샘플을 20분 동안 17,000 rpm으로 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 최종 BDE 농도는 ~ 2 mg/ml 단백질이다. BDE (60 μl)를 37℃에서 1시간 동안 각각 X-LC (0.5 μM), A-LC (1 μM), 또는 B-LC (1 μM)와 인큐베이션하였고, 이어서 증진된 화학발광 (ECL) 방법 (피어스(Pierce))을 사용하는 이뮤노블롯에 의해 분석하였다. 대조군으로서, LC를 실온 (RT)에 20분 동안 20 mM EDTA와 사전-인큐베이션하여 그의 활성을 탈-활성시킨 후, BDE 내로 첨가하였다.
X-LC에 의한 재조합 VAMP의 절단: VAMP2 (1-96)를 발현시켜 His6-태그부착된 단백질로서 정제하였고, VAMP2 (33-86)를 발현시켜 GST-태그부착된 단백질로서 정제하였다. 이들 단백질 (0.6 mg/ml)을 37℃에서 1시간 동안 TBS 완충제 중 0.1 μM X-LC와 인큐베이션하였다. 샘플을 SDS-PAGE 겔 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하거나, 질량 분광측정법 분석에 적용하였다.
세포 용해물에서의 VAMP의 절단: 전장 HA-태그부착된 VAMP1, 3, 7 및 8을 제조업체의 지침서에 따라 폴리젯(PolyJet) 형질감염 시약 (시그나젠(SignaGen), 메릴랜드주)을 사용하여 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 세포 용해물을 RIPA 완충제 (50 mM 트리스, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS, 10-cm 디쉬 당 400 μl) 플러스 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치)에서 48시간 후에 수확하였다. 세포 용해물 (250 μl)을 37℃에서 1시간 동안 X-LC (0.5 μM)와 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 이뮤노블롯에 의해 분석하였다.
LC-MS/MS에 의한 전체 단백질 분석: 샘플을 하버드 의과 대학(Harvard Medical School)의 타플린 생물학적 질량 분광측정법 핵심 기관(Taplin Biological Mass Spectrometry Core Facility)에서 분석하였다. 간략하게, 전체 단백질 샘플을 압력 셀을 사용하여 3cm 비드 오프라인으로 패킹된 100 μm 내부 직경 C18 역상 HPLC 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 액셀라(Accela) 600 펌프 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 매사추세츠주 월섬)에 재부착하였다. 증가하는 아세토니트릴의 빠른 구배를 사용하여 HPLC 칼럼으로부터 단백질/펩티드를 용리하였다. 펩티드가 용리되면, 이들을 전기분무 이온화에 적용한 다음, LTQ 오비트랩 벨로스 프로 (Orbitrap Velos Pro) 이온-트랩 질량 분광계 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)에 입력하여, 60000 해상도의 고해상도 FTMS 스캔, 이온 트랩에서의 저해상도의 제2 스캔, 및 데이터 의존성 MS/MS를 수행하기 위한 최종 스캔을 획득하였다. 충전 상태 엔벨로프를 수동으로 디콘볼루션하여 가능한 경우 모노-동위원소 질량을, 또는 단백질에 대한 평균 질량을 수득하였다. 펩티드 및 단백질 동일성을, 소프트웨어 프로그램 시퀘스트(Sequest) (써모 피셔 사이언티픽)에 의해 획득된 단편화 패턴에 단백질 데이터베이스를 매칭함으로써 결정하였다. 모든 데이터베이스는 모든 서열의 역상 버전을 포함하고, 데이터를 1 내지 2 퍼센트 펩티드 오류 발견율로 필터링하였다.
LC와 HN 사이의 프로테아제 절단 부위의 확인: His6-태그부착된 재조합 X-LC-HN 단편 (잔기 1-891)을 이. 콜라이에서 정제하고, 엔도프로테이나제 Lys-C (시그마 P2289, 100:1 (독소:Lys-C) 몰비, 실온에서 25분)에 의해 제한된 단백질분해에 적용하였다. 절단 부위를 탠덤 질량 태그 (TMT) 표지 및 탠덤 질량 분광측정법 접근법에 의해 결정하였다. 간략하게, 무손상 X-LC-HN 샘플을 가벼운 TMT로 표지하였고, 동등량의 X-LC-HN 샘플을 Lys-C에 노출시킨 다음, 무거운 TMT로 표지하였다. 이어서, 샘플 둘 다를 키모트립신에 의해 소화시키고, 합하고, 정량적 질량 분광측정법 분석에 적용시켰다.
NEM에 의한 시스테인 알킬화: Lys-C 활성화된 X-LC-HN 단편을 표시된 농도 (20, 10 및 5 mM)의 NEM의 존재 또는 부재 하에, 0.3 mg/ml의 최종 농도로 인산나트륨 완충제 (10 mM, pH 6.5) 내로 희석시켰고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. NEM을 인산나트륨 완충제에서 새롭게 제조하였다. 샘플을 3x 중성 로딩 염료 (200 mM 트리스 pH 6.8, 30% 글리세롤, 6% 리튬 도데실 술페이트, 10 mM NEM 및 0.06% BPB)와 혼합하였다. NEM 없는 샘플에 대해, NEM 없이 동일한 3x SDS 로딩 염료를 사용하였다. 샘플을 10분 동안 실온에서 로딩 염료와 추가로 인큐베이션하고, 55℃에서 10분 동안 가열한 다음, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다.
뉴런 배양물 및 이뮤노블롯 분석: 본 발명자들이 이전에 기재한 바와 같이, 일차 래트 피질 뉴런을 파파인 해리 키트 (워팅턴 바이오케미칼(Worthington Biochemical), 뉴저지주)를 사용하여 E18-19 배아로부터 제조하였다 58. 실험을 DIV 14-16 상에서 수행하였다. 뉴런을 12시간 동안 배지에서 BoNT/X 단편 또는 소르타제 라이게이션 혼합물에 노출시켰다. 이어서, 세포를 세척하고, RIPA 완충제 (50 mM 트리스, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS) 플러스 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치)로 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 마이크로원심분리를 사용하여 최대 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 SDS-PAG 및 이뮤노블롯 분석에 적용하였다.
도트 블롯: BoNT (1 μl 중 0.2 μg)를 니트로셀룰로스 막 상에 스팟팅하고, 건조시켰다 (실온에서 10분). 막을 30분 동안 TBST (TBS 플러스 0.05% 트윈20(Tween20)) 중 5% 우유에 의해 차단시켰고, 이어서 30분 동안 나타낸 항혈청 (1:500 희석물)과 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 TBST로 3회 세척하고, 30분 동안 HRP (양고추냉이 퍼옥시다제) 접합된 2차 항체와 인큐베이션하고, TBST로 3회 더 세척하고, ECL 방법 (피어스)으로 분석하였다. 본 발명자들은 BoNT/X 샘플이 정제된 X-LC-HN 및 X-HC가 1:1 비로 구성되었다는 것에 주목한다.
소르타제-매개 라이게이션: GST-X-HC를 트롬빈에 의해 4℃에서 밤새 절단한 후에 단백질의 혼합물에 첨가하였다. 라이게이션 반응을 X-LC-HN (8 μM), 트롬빈-절단된 GST-X-HC (25 μM), Ca2 + (10 mM), 및 소르타제 (10 μM)를 첨가하면서 50 μl TBS 완충제 중 실온에서 40분 동안으로 설정하였다. 도 4C에서, 뉴런을 12시간 동안 배지에서 혼합물 5 μl에 노출시켰다. 도 4D에 기재된 DAS 검정에서, 혼합물 25 μl를 마우스의 뒷다리에 주사하였다.
DAS 검정: 소르타제 라이게이션 혼합물을 먼저 트립신 (60:1 몰비 (단백질 : 트립신의 총량), 실온에서 30분)을 사용하여 제한된 단백질분해에 의해 활성화시켰다. 본 발명자들은, 그들이 트립신 억제제 (대두 트립신 억제제, 1:10 비 (트립신 : 트립신 억제제))를 첨가함으로써 단백질분해를 정지시킬 수 있기 때문에, 여기서 Lys-C 대신에 트립신을 선택하였다. 마우스 (CD-1 균주, 21-25g, n = 6)를 이소플루란 (3-4%)으로 마취시키고, 우측 뒷다리의 비복근 내로, 멸균 해밀턴(Hamilton) 시린지에 부착된 30-게이지 바늘을 사용하여 소르타제 라이게이션 혼합물을 주사하였다. BoNT는 놀람 반응에서 뒷발의 마비를 발생시킨다. 근육 마비는 이전에 기재된 바와 같이 주사 후 12시간 내에 관찰되었다 52,53.
참고문헌
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 일반적인 일련의 동등하거나 유사한 특색의 예이다.
상기 설명으로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 필수적 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 그의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고, 본 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 생성하여 이를 다양한 용법 및 조건에 적합화시킬 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 또한 청구범위 내에 포함된다.
등가물 및 범주
여러 본 발명의 실시양태가 본원에 기재되고 예시되어 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 따라 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 상용 실험을 사용하여, 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시된 것이고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서, 본 발명의 실시양태가 구체적으로 기재되고 청구된 바와 달리 실시될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않는 경우, 2종 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합이 본 개시내용의 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에서 정의되고 사용된 모든 정의는 사전적인 정의, 참조로 포함된 문헌의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 대상과 관련하여 참조로 포함되고, 일부 경우에 이는 그 문헌의 전체를 포괄할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 부정 관사는, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉 일부 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 복수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 결합된 요소의 "하나 이상의"로 이해되어야 한다. 다른 요소는 구체적으로 식별되는 요소와의 관련 또는 비관련을 불문하고 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별되는 요소 이외에 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 한 실시양태에서 A만 (임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서 B만 (임의로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서 A 및 B 둘 다 (임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 경우에, "또는" 또는 "및/또는"은 포함의 의미로, 즉 요소의 개수 또는 목록 중, 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 하나 초과, 및 임의로, 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. "중 오직 하나" 또는 "중 정확하게 하나" 또는 청구범위에서 사용될 때 "로 이루어진"과 같이 달리 명백하게 나타내어진 용어만이 다수의 요소의 개수 또는 목록 중 정확하게 한 요소를 포함하는 것으로 지칭될 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "중 하나", "중 오직 하나" 또는 "중 정확하게 하나"와 같은 배제적 용어가 이어질 때에만 배제적 대안 (즉, "둘 다가 아닌 하나 또는 다른 것")을 나타내는 것으로 해석될 것이다. "로 본질적으로 이루어진"이 청구범위에 사용된 경우에, 특허법 영역에서 사용되는 바와 같은 통상의 의미를 가질 것이다.
하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록의 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것이 아님을 이해해야 한다. 이러한 정의는 또한 어구 "적어도 하나"가 언급하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인되는 요소 이외의 요소가, 그러한 구체적으로 확인되는 요소와 관련되는지 비관련되는지에 관계없이 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
달리 명백하게 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 작용이 언급된 순서에 제한되지는 않는 것으로 또한 이해되어야 한다.
상기 명세서뿐만 아니라 청구범위에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "로 구성된" 등은 개방형, 즉 포함하지만 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다만 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 문헌 [United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03]에 기재된 바와 같이, 각각 폐쇄형 및 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Children's Medical Center Corporation <120> A NOVEL BOTULINUM NEUROTOXIN AND ITS DERIVATIVES <130> C1233.70106US00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/360,239 <151> 2016-07-08 <160> 226 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1306 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Met Lys Leu Glu Ile Asn Lys Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Gly 1 5 10 15 Ile Asn Val Ile Thr Met Arg Pro Pro Arg His Ser Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Lys Gly Lys Gly Pro Phe Lys Ala Phe Gln Val Ile Lys Asn Ile Trp 35 40 45 Ile Val Pro Glu Arg Tyr Asn Phe Thr Asn Asn Thr Asn Asp Leu Asn 50 55 60 Ile Pro Ser Glu Pro Ile Met Glu Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Pro Asn 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Thr Pro Ser Glu Lys Asp Glu Phe Leu Gln Gly Val Ile 85 90 95 Lys Val Leu Glu Arg Ile Lys Ser Lys Pro Glu Gly Glu Lys Leu Leu 100 105 110 Glu Leu Ile Ser Ser Ser Ile Pro Leu Pro Leu Val Ser Asn Gly Ala 115 120 125 Leu Thr Leu Ser Asp Asn Glu Thr Ile Ala Tyr Gln Glu Asn Asn Asn 130 135 140 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 146 Tyr Ser Thr Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Val Ser 1 5 10 15 Phe Ser <210> 147 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 147 Tyr Ser Thr Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Val Ser 1 5 10 15 Phe Ser <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 148 Tyr Ser Thr Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu 1 5 10 <210> 149 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 149 Tyr Ser Thr Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Val Ser 1 5 10 15 Phe Ser Pro Phe Tyr 20 <210> 150 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 150 Tyr Ser Thr Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Val Ser 1 5 10 15 Phe Ser Pro Phe Tyr 20 <210> 151 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 151 Tyr Ser Thr Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu 1 5 10 <210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 152 Leu Ser Glu Val Ser Phe Ser Pro Phe Tyr 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 153 Leu Ser Glu Val Ser Phe Ser Pro Phe Tyr 1 5 10 <210> 154 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 154 Phe Tyr Leu Lys Pro Phe Asp Glu Ser Tyr Gly Asn Tyr Arg 1 5 10 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 155 Phe Tyr Leu Lys Pro Phe Asp Glu Ser Tyr Gly 1 5 10 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 156 Phe Asp Glu Ser Tyr Gly Asn Tyr Arg 1 5 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 157 Tyr Gly Asn Tyr Arg Ser Leu Val Asn Ile Val Asn Lys Phe Val 1 5 10 15 <210> 158 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 158 His Asn Leu Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Asn Phe Tyr 1 5 10 <210> 159 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 159 Phe Tyr Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Lys Ile Glu Thr Ser Arg Gln Gln 1 5 10 15 Asn Ser <210> 160 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 160 Phe Tyr Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Lys Ile Glu Thr Ser Arg Gln Gln 1 5 10 15 Asn Ser <210> 161 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 161 Tyr Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Lys Ile Glu Thr Ser Arg Gln Gln Asn 1 5 10 15 Ser Leu Ile <210> 162 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 162 Leu Ile Ser Glu Arg Leu Asn Thr Val Thr Val Glu Asn Asp Leu Leu 1 5 10 15 Lys Tyr Ile <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 163 Leu Asn Thr Val Thr Val Glu Asn Asp Leu Leu Lys Tyr Ile 1 5 10 <210> 164 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 164 Phe Val Leu Asn Glu Ser Asn Leu Ala Gln Arg Phe Ser 1 5 10 <210> 165 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 165 His Tyr Leu Lys Glu Arg Pro Ile Asp Pro Ile Tyr Val Asn Ile Leu 1 5 10 15 Asp Asp Asn Ser Tyr Ser 20 <210> 166 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 166 Asp Pro Ile Tyr Val Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ser Tyr Ser 1 5 10 <210> 167 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 167 Asp Pro Ile Tyr Val Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ser Tyr Ser 1 5 10 <210> 168 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 168 Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ser Tyr Ser Thr Leu Glu 1 5 10 <210> 169 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 169 Tyr Ser Thr Leu Glu Gly Phe Asn 1 5 <210> 170 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 170 Tyr Ser Thr Leu Glu Gly Phe Asn 1 5 <210> 171 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 171 Tyr Ser Thr Leu Glu Gly Phe Asn 1 5 <210> 172 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 172 Tyr Ser Thr Leu Glu Gly Phe Asn 1 5 <210> 173 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 173 Phe Asn Ile Ser Ser Gln Gly Ser Asn Asp Phe Gln Gly Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu <210> 174 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 174 Phe Asn Ile Ser Ser Gln Gly Ser Asn Asp Phe Gln Gly Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ser Ser Tyr Phe Glu 20 <210> 175 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 175 Phe Asn Ile Ser Ser Gln Gly Ser Asn Asp Phe Gln Gly Gln Leu 1 5 10 15 <210> 176 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 176 Leu Leu Tyr Asn Ala Ile Tyr Arg 1 5 <210> 177 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 177 Leu Leu Tyr Asn Ala Ile Tyr Arg 1 5 <210> 178 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 178 Lys Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr 1 5 10 15 <210> 179 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 179 Lys Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr Ser 1 5 10 15 Lys Thr Asn Val 20 <210> 180 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 180 Lys Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr Ser 1 5 10 15 Lys Thr Asn Val 20 <210> 181 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 181 Lys Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr Ser 1 5 10 15 <210> 182 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 182 Lys Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr Ser 1 5 10 15 Lys Thr Asn <210> 183 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 183 Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr Ser 1 5 10 15 <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 184 Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp Lys Lys Thr Thr Ser 1 5 10 15 <210> 185 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 185 Gly Cys Ile Glu Val Glu Asn Lys Asp Leu Phe Leu 1 5 10 <210> 186 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 186 Phe Leu Ile Ser Asn Lys Asp Ser Leu Asn Asp Ile Asn Leu Ser Glu 1 5 10 15 Glu Lys Ile Lys Pro Glu Thr Thr Val Phe Phe 20 25 <210> 187 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 187 Phe Leu Ile Ser Asn Lys Asp Ser Leu Asn Asp Ile Asn Leu Ser Glu 1 5 10 15 Glu Lys Ile Lys Pro Glu Thr Thr Val Phe Phe 20 25 <210> 188 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 188 Lys Asp Ser Leu Asn Asp Ile Asn Leu Ser Glu Glu Lys Ile Lys Pro 1 5 10 15 Glu Thr Thr Val Phe Phe 20 <210> 189 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 189 Asp Ser Leu Asn Asp Ile Asn Leu Ser Glu Glu Lys Ile Lys Pro Glu 1 5 10 15 Thr Thr Val Phe Phe 20 <210> 190 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 190 Leu Ser Asn Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile 1 5 10 15 <210> 191 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 191 Leu Ser Asn Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser 1 5 10 15 Gln Gln Asn <210> 192 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 192 Leu Ser Asn Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser 1 5 10 <210> 193 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 193 Leu Ser Asn Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser 1 5 10 <210> 194 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 194 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 Ile Leu Glu <210> 195 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 195 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 Ile Leu Glu <210> 196 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 196 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 <210> 197 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 197 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 <210> 198 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 198 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 Ile Leu Glu Arg Asn Glu Glu Leu Tyr Glu Pro Ile Arg Asn Ser 20 25 30 <210> 199 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 199 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 Ile <210> 200 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 200 Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn 1 5 10 15 Ile <210> 201 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 201 Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Gln Asn Ile Leu Glu Arg Asn Glu 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Glu Pro Ile Arg Asn Ser Leu Phe Glu 20 25 <210> 202 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 202 Leu Thr Asp Ser Val Asp Glu Ala Leu Ser Asn Pro Asn Lys Val Tyr 1 5 10 15 Ser <210> 203 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 203 Leu Thr Asp Ser Val Asp Glu Ala Leu Ser Asn Pro Asn Lys Val Tyr 1 5 10 15 Ser <210> 204 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 204 Leu Thr Asp Ser Val Asp Glu Ala Leu Ser Asn Pro Asn Lys Val Tyr 1 5 10 15 Ser <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 205 Leu Ser Asn Pro Asn Lys Val Tyr Ser 1 5 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 206 Leu Ser Asn Pro Asn Lys Val Tyr Ser 1 5 <210> 207 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 207 Tyr Ser Pro Phe Lys Asn Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr 1 5 10 15 Gly Ile Thr Ser Thr Tyr Ile 20 <210> 208 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 208 Tyr Ser Pro Phe Lys Asn Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr 1 5 10 15 Gly Ile Thr Ser Thr Tyr Ile 20 <210> 209 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 209 Phe Lys Asn Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr 1 5 10 15 Ser Thr Tyr Ile 20 <210> 210 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 210 Phe Lys Asn Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr 1 5 10 15 Ser Thr Tyr Ile 20 <210> 211 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 211 Phe Lys Asn Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr 1 5 10 15 Ser Thr Tyr Ile 20 <210> 212 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 212 Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr Ser Thr Tyr 1 5 10 15 Ile <210> 213 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 213 Met Ser Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr Ser Thr Tyr 1 5 10 15 Ile <210> 214 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 214 Asn Thr Ile Asn Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr Ser Thr Tyr Ile 1 5 10 15 <210> 215 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 215 Phe Ser Asp Glu Thr Gly Lys Ile Asp Val Ile Asp Lys Ser Ser Asp 1 5 10 15 Thr Leu Ala <210> 216 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 216 Leu Ala Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Leu Leu 1 5 10 <210> 217 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 217 Val Pro Tyr Ile Gly Pro Leu Leu 1 5 <210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 218 Val Ile Gly Gly Glu Leu Ala Arg Glu Gln Val Glu Ala 1 5 10 <210> 219 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 219 Leu Ser Arg Gln Ala Asn Ala Ile Lys Met Asn 1 5 10 <210> 220 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 220 Leu Ser Arg Gln Ala Asn Ala Ile Lys Met Asn 1 5 10 <210> 221 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 221 Phe Ser Glu Phe Asp Asp Leu Ile Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 <210> 222 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 222 Phe Asp Asp Leu Ile Asn Gln Tyr Lys Asn Glu Gly Ser Ile Leu Pro 1 5 10 15 Glu Thr Gly Gly Leu Glu His His His 20 25 <210> 223 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 223 Tyr Lys Asn Glu Gly Ser Ile Leu Pro Glu Thr Gly Gly Leu Glu His 1 5 10 15 His His His His His 20 <210> 224 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 224 Tyr Lys Asn Glu Gly Ser Ile Leu Pro Glu Thr Gly Gly Leu Glu 1 5 10 15 <210> 225 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 225 Tyr Lys Asn Glu Gly Ser Ile Leu Pro Glu Thr Gly Gly Leu Glu His 1 5 10 15 His <210> 226 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 226 Tyr Lys Asn Glu Gly Ser Ile Leu Pro Glu Thr Gly Gly Leu Glu His 1 5 10 15 His His

Claims (175)

  1. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  2. 서열식별번호: 1에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드.
  3. 제A1항에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 BoNT 폴리펩티드.
  4. 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  5. 서열식별번호: 2에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드.
  6. 제4항에 있어서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 BoNT 폴리펩티드.
  7. 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  8. 서열식별번호: 3에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 BoNT 폴리펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 BoNT 폴리펩티드.
  10. 서열식별번호: 1의 C461, C467 또는 C1240에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 치환 돌연변이가 서열식별번호: 1에서의 C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S 또는 C467A/C1240A에 상응하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  12. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  13. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 4-17 중 어느 것에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖지 않는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  14. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 4-17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  15. 서열식별번호: 2의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 단일 치환 돌연변이를 포함하는 변형된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 치환 돌연변이가 서열식별번호: 2에서의 C461S, C461A, C467S, C467A, C1240S, C1240A, C461S/C1240S, C416S/C1240A, C461A/C1240S, C461A/C1240A, C467S/C1240S, C461S/C1240A, C467A/C1240S 또는 C467A/C1240A에 상응하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  18. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 18-21 중 어느 것에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖지 않는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  19. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  20. 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖지 않는 키메라 BoNT 폴리펩티드.
  22. 제20항에 있어서, 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 BoNT 폴리펩티드.
  23. 제20항에 있어서, 서열식별번호: 2의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 단일 치환 돌연변이를 추가로 포함하는 키메라 BoNT 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 BoNT 폴리펩티드.
  25. 제23항에 있어서, 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 BoNT 폴리펩티드.
  26. 제23항에 있어서, 서열식별번호: 25-30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 BoNT 폴리펩티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 진입하는 BoNT 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 세포 내 SNARE 단백질을 절단하는 BoNT 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, SNARE 단백질이 SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6, 및 신탁신 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP1인 BoNT 폴리펩티드.
  31. 제26항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 39의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  32. 제29항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP2인 BoNT 폴리펩티드.
  33. 제32항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 40의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  34. 제29항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP3인 BoNT 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 41의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  36. 제29항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP4인 BoNT 폴리펩티드.
  37. 제36항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 42의 K87 및 S88에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  38. 제29항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP5인 BoNT 폴리펩티드.
  39. 제30항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 43의 R40 및 S41에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  40. 제29항에 있어서, SNARE 단백질이 Ykt6인 BoNT 폴리펩티드.
  41. 제40항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 44의 K173 및 S174에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  42. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 야생형 BoNT 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖는 BoNT 폴리펩티드.
  43. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 분비 세포인 BoNT 폴리펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 세포가 뉴런 세포인 BoNT 폴리펩티드.
  45. 제43항에 있어서, 세포가 면역 세포인 BoNT 폴리펩티드.
  46. 제45항에 있어서, 뉴런 활성을 억제하는 BoNT 폴리펩티드.
  47. 제46항에 있어서, 이완성 마비를 유발하는 BoNT 폴리펩티드.
  48. 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배양된 세포인 BoNT 폴리펩티드.
  49. 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체내의 것인 BoNT 폴리펩티드.
  50. 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물로부터의 것인 BoNT 폴리펩티드.
  51. 제50항에 있어서, 포유동물이 인간인 BoNT 폴리펩티드.
  52. 제50항에 있어서, 포유동물이 설치류인 BoNT 폴리펩티드.
  53. 제52항에 있어서, 설치류가 마우스인 BoNT 폴리펩티드.
  54. 제52항에 있어서, 설치류가 래트인 BoNT 폴리펩티드.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G에 대한 항체와 교차 반응하지 않는 BoNT 폴리펩티드.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 BoNT 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자.
  57. 제56항의 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터.
  58. 제56항의 핵산 분자 또는 제A57항의 핵산 벡터를 포함하는 세포.
  59. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  60. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 BoNT 폴리펩티드를 생산하는 방법이며, 상기 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 제59항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 배양물로부터 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  62. (a) 프로테아제 도메인;
    (b) 변형된 링커 영역; 및
    (c) 전위 도메인
    을 포함하며,
    여기서 (a), (b), 및 (c)는 BoNT 혈청형 X로부터의 것이고, 변형된 링커 영역은 서열식별번호: 1의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함하는 것인
    변형된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  63. 제62항에 있어서, (d) 수용체 결합 도메인을 추가로 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 변형된 링커 영역이 서열식별번호: 1에서의 C461S 또는 C461A에 상응하는 치환 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, 변형된 링커 영역이 서열식별번호: 1에서의 C467S 또는 C467A에 상응하는 치환 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  66. 제63항에 있어서, 수용체 결합 도메인이 BoNT/X로부터의 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  67. 제66항에 있어서, 수용체 결합 도메인이 변형된 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  68. 제67항에 있어서, 수용체 결합 도메인이 서열식별번호: 1에서의 C1240S 또는 C1240A에 상응하는 치환 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 결합 도메인이 A, B, C, D, E, F, 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형으로부터의 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  70. 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 진입하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  71. 제70항에 있어서, 세포 내 SNARE 단백질을 절단하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  72. 제71항에 있어서, SNARE 단백질이 SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6, 및 신탁신 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  73. 제72항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP1인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  74. 제73항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 39의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  75. 제72항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP2인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  76. 제73항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 40의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  77. 제72항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP3인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  78. 제77항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 41의 R66 및 A67에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  79. 제72항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP4인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  80. 제79항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 42의 K87 및 S88에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  81. 제72항에 있어서, SNARE 단백질이 VAMP5인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  82. 제81항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 43의 R40 및 S41에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  83. 제72항에 있어서, SNARE 단백질이 Ykt6인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  84. 제83항에 있어서, BoNT가 서열식별번호: 44의 K173 및 S174에 상응하는 아미노산 잔기 사이를 절단하는 것인 BoNT 폴리펩티드.
  85. 제62항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 야생형 BoNT 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  86. 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 분비 세포인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  87. 제86항에 있어서, 세포가 뉴런 세포인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  88. 제86항에 있어서, 세포가 면역 세포인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  89. 제88항에 있어서, 뉴런 활성을 억제하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  90. 제89항에 있어서, 이완성 마비를 유발하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  91. 제70항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배양된 세포인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  92. 제70항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체내의 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 세포가 포유동물로부터의 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  94. 제93항에 있어서, 포유동물이 인간인 BoNT 폴리펩티드.
  95. 제93항에 있어서, 포유동물이 설치류인 BoNT 폴리펩티드.
  96. 제95항에 있어서, 설치류가 마우스인 BoNT 폴리펩티드.
  97. 제95항에 있어서, 설치류가 래트인 BoNT 폴리펩티드.
  98. 제62항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 링커 영역이 인공 링커를 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  99. 제98항에 있어서, 인공 링커가 프로테아제의 절단 부위를 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  100. 제99항에 있어서, 프로테아제가 트롬빈, TEV, 프리시전 (3C 프로테아제), 인자 Xa, 엔테로키나제, 및 SUMO 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  101. 제100항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 50-56 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  102. 제62항 내지 제101항 중 어느 한 항의 변형된 BoNT 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자.
  103. 제102항의 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터.
  104. 제102항의 핵산 분자 또는 제B42항의 핵산 벡터를 포함하는 세포.
  105. 제62항 내지 제101항 중 어느 한 항의 변형된 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  106. 변형된 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드를 생산하는 방법이며, 상기 변형된 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 제105항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 배양물로부터 변형된 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  108. 서열식별번호: 1에서의 R360, Y363, H227, E228 또는 H231에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드.
  109. 제108항에 있어서, 1개 이상의 치환 돌연변이(들)가 서열식별번호: 1에서의 R360A/Y363F, H227Y, E228Q 또는 H231Y에 상응하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  110. 제109항에 있어서, 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  111. 제108항에 있어서, 서열식별번호: 31-38 중 어느 것에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖지 않는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  112. 제110항에 있어서, 서열식별번호: 31-38 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  113. (a) 불활성 프로테아제 도메인;
    (b) 링커 영역; 및
    (c) 전위 도메인
    을 포함하는 변형된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소, 혈청형 X (BoNT/X) 폴리펩티드.
  114. 제113항에 있어서, 변형된 BoNT/X가 수용체 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 불활성 프로테아제 도메인이 서열식별번호: 1의 R360, Y363, H227, E228 또는 H231에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하는 것인 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  116. 제115항에 있어서, 1개 이상의 치환 돌연변이(들)가 서열식별번호: 1의 R360A/Y363F, H227Y, E228Q 또는 H231Y에 상응하는 것인 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  117. 제108항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 진입하는 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  118. 제117항에 있어서, 변형된 BoNT 폴리펩티드가 SNARE 단백질을 절단하지 않는 것인 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  119. 제108항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 링커 영역에서의 변형을 추가로 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  120. 제119항에 있어서, 링커 영역에서의 변형이 서열식별번호: 1의 C461 또는 C467에 상응하는 위치에서의 1개의 단일 치환 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  121. 제120항에 있어서, 단일 치환 돌연변이가 서열식별번호: 1에서의 C461A, C461S, C467A 또는 C467S에 상응하는 것인 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  122. 제114항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 수용체 결합 도메인에서의 변형을 추가로 포함하는 변형된 BoNT/X 폴리펩티드.
  123. 제122항에 있어서, 수용체 결합 도메인에서의 변형이 서열식별번호: 1의 C1240에 상응하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 BoNT/X.
  124. 제108항 내지 제123항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 BoNT 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자.
  125. 제124항의 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터.
  126. 제C17항의 핵산 분자 또는 제125항의 핵산 벡터를 포함하는 세포.
  127. 제108항 내지 제123항 중 어느 한 항의 변형된 BoNT 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  128. 변형된 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드를 생산하는 방법이며, 상기 변형된 BoNT 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 제127항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 배양물로부터 변형된 BoNT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  130. 제108항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제를 뉴런 내로 전달하기 위한 전달 비히클로서 사용하기 위한 변형된 BoNT 폴리펩티드.
  131. 제2 부분에 연결된 제1 부분을 포함하며, 여기서 제1 부분은 제108항 내지 제123항 중 어느 한 항의 변형된 BoNT 폴리펩티드인 키메라 분자.
  132. 제131항에 있어서, 제1 부분 및 제2 부분이 공유 연결된 것인 키메라 분자.
  133. 제131항에 있어서, 제1 부분 및 제2 부분이 비-공유 연결된 것인 키메라 분자.
  134. 제131항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 부분이 소분자, 핵산, 짧은 폴리펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키메라 분자.
  135. 제134항에 있어서, 제2 부분이 생물활성 분자인 키메라 분자.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 제2 부분이 비-폴리펩티드 약물인 키메라 분자.
  137. 제134항 또는 제135항에 있어서, 제2 부분이 치료 폴리펩티드인 키메라 분자.
  138. 제137항의 키메라 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  139. 제138항의 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터.
  140. 제138항의 핵산 분자 또는 제139항의 핵산 벡터를 포함하는 세포.
  141. 제140항의 키메라 분자를 발현하는 세포.
  142. 키메라 분자를 생산하는 방법이며, 상기 키메라 분자가 생산되는 조건 하에 제141항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  143. 제142항에 있어서, 배양물로부터 키메라 분자를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  144. 제1항 내지 제55항, 제62항 내지 제101항 및 제108항 내지 제123항 중 어느 한 항의 BoNT 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
  145. 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항의 키메라 분자를 포함하는 제약 조성물.
  146. 제144항 또는 제145항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  147. 제144항 내지 제146항 중 어느 한 항의 제약 조성물 및 제약 조성물의 치료적 투여에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  148. 제1항 내지 제55항, 제62항 내지 제101항 및 제108항 내지 제123항 중 어느 한 항의 변형된 BoNT 폴리펩티드, 또는 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 또는 제144항 내지 제146항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하여 상태를 치료하는 단계를 포함하는, 상태를 치료하는 방법.
  149. 제148항에 있어서, 상태가 과활성 뉴런 또는 선과 연관된 것인 방법.
  150. 제148항 또는 제149항에 있어서, 상태가 연축성 발성장애, 연축성 사경, 후두 이상긴장증, 구강하악 발성장애, 설측 이상긴장증, 경부 이상긴장증, 초점성 손 이상긴장증, 안검연축, 사시, 편측안면 연축, 안검 장애, 뇌성 마비, 초점성 경직 및 다른 음성 장애, 연축성 결장염, 신경원성 방광, 항문경, 사지 경직, 틱, 진전, 이갈이, 치열, 무이완증, 연하곤란 및 다른 근긴장도 장애 및 근육군의 불수의 운동을 특징으로 하는 다른 장애, 누루, 다한증, 과다 타액분비, 과다 위장액 분비, 분비 장애, 근육 연축으로부터의 통증, 두통, 피부과적 또는 미적/미용 상태, 비만/감소된 식욕으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  151. 제1501항에 있어서, 상태가 원치 않는 뉴런 활성과 연관되지 않는 것인 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상태가 건선, 알레르기, 혈구포식성 림프조직구증식증, 및 알콜성 췌장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  153. 제F1항 내지 제F5항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 원치 않는 뉴런 활성이 존재하는 곳에의 주사를 통한 것인 방법.
  154. 제1항 내지 제55항, 제62항 내지 제101항, 제108항 내지 제123항, 제131항 내지 제137항 및 제144항 내지 146항 중 어느 한 항에 있어서, 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 상태를 치료하는 데 사용하기 위한 변형된 BoNT 폴리펩티드, 키메라 분자, 또는 제약 조성물.
  155. 제1항 내지 제55항, 제62항 내지 제101항, 제108항 내지 제123항, 제131항 내지 제137항 및 제144항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 변형된 BoNT 폴리펩티드, 키메라 분자, 또는 제약 조성물.
  156. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 폴리펩티드를 생산하는 방법이며,
    (i) 경쇄 (LC) 및 중쇄의 N-말단 도메인 (HN)을 포함하는 제1 BoNT 단편을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 BoNT 단편은 C-말단 LPXTGG (서열식별번호: 60) 모티프를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 중쇄의 C-말단 도메인 (HC)을 포함하는 제2 BoNT 단편을 수득하는 단계이며; 여기서 제2 BoNT 단편은 그의 N-말단에서 특이적 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것인 단계;
    (iii) 특이적 프로테아제로 제2 BoNT 단편을 절단하는 단계이며, 여기서 절단은 N-말단에서 유리 글리신 잔기를 생성하는 것인 단계; 및
    (iv) 트랜스펩티다제의 존재 하에 제1 BoNT 단편 및 제2 BoNT 단편을 접촉시킴으로써, 제1 BoNT 단편 및 제2 BoNT 단편을 라이게이션하여 라이게이션된 BoNT를 형성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  157. 제156항에 있어서, 제1 BoNT 단편이 친화성 태그를 추가로 포함하는 것인 방법.
  158. 제157항에 있어서, 친화성 태그가 N-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된 것인 방법.
  159. 제157항에 있어서, 친화성 태그가 C-말단에서 제1 BoNT 단편에 융합된 것인 방법.
  160. 제156항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 태그가 His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, 칼모듈린, 소프태그 1, 소프태그 3, TC, V5, VSV, 엑스프레스, 할로, 및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  161. 제156항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 BoNT 단편이 친화성 태그를 추가로 포함하는 것인 방법.
  162. 제161항에 있어서, 친화성 태그가 N-말단에서 제2 BoNT 단편에 융합된 것인 방법.
  163. 제161항에 있어서, 친화성 태그가 C-말단에서 제2 BoNT 단편에 융합된 것인 방법.
  164. 제161항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 태그가 His6, GST, Avi, Strep, S, MBP, Sumo, FLAG, HA, Myc, SBP, E, 칼모듈린, 소프태그 1, 소프태그 3, TC, V5, VSV, 엑스프레스, 할로, 및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  165. 제161항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제가 트롬빈, TEV, 프리시전 (3C 프로테아제), 엔테로키나제, 및 SUMO 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  166. 제165항에 있어서, 동족 프로테아제가 트롬빈인 방법.
  167. 제156항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 BoNT 단편이 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 X로부터의 것인 방법.
  168. 제167항에 있어서, 제1 BoNT 단편이 BoNT/X로부터의 것인 방법.
  169. 제156항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 BoNT 단편이 BoNT 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 X로부터의 것인 방법.
  170. 제169항에 있어서, 제2 BoNT 단편이 BoNT/A로부터의 것인 방법.
  171. 제169항에 있어서, 제2 BoNT 단편이 BoNT/B로부터의 것인 방법.
  172. 제169항에 있어서, 제2 BoNT 단편이 BoNT/C로부터의 것인 방법.
  173. 제169항에 있어서, 제2 BoNT 단편이 BoNT/X로부터의 것인 방법.
  174. 제156항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스펩티다제가 소르타제인 방법.
  175. 제174항에 있어서, 소르타제가 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 것 (SrtA)인 방법.
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