CN110938150B - E型肉毒毒素重组l-hn抗原的制备方法及其应用 - Google Patents

E型肉毒毒素重组l-hn抗原的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了E型肉毒毒素重组L‑HN抗原的制备方法及其应用。本发明提供了E型肉毒毒素重组L‑HN抗原(E型肉毒毒素的轻链和重链氨基酸融合区)在如下任一中的应用：制备E型肉毒毒素亚单位疫苗中的应用；作为免疫原在制备E型肉毒抗毒素中的应用。本发明证实了L‑HN抗原作为免疫原的效力，优于包括Hc抗原在内的其他功能结构域抗原作为免疫原的效力。这一特性正好弥补了E型肉毒毒素重组Hc抗原在免疫保护力上效力不够强的问题。此外，人体临床试验时可能够需要免疫效力更强的免疫原以便能够产生强的免疫活性。因此本发明的E型肉毒毒素重组L‑HN抗原非常有希望作为候选亚单位疫苗应用于预防E型肉毒毒素。

Description

E型肉毒毒素重组L-HN抗原的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及E型肉毒毒素重组L-HN抗原的制备方法及其应用。
背景技术
肉毒中毒是由肉毒杆菌分泌的神经毒素(BoNTs)引起。肉毒毒素是人类已知的生物和化学毒物中毒力最强的物质，对人的LD50仅为0.1-1ng/kg，根据不同的血清学性质，肉毒毒素被分为A～G共7个型，其中A、B和E型引起的人类中毒较多，F型较少。肉毒毒素曾被多个国家制备成生物战剂，同时也引起了恐怖组织的浓厚兴趣。因此肉毒毒素被美国CDC等机构列为六个最主要的生物战剂之一，属于危害性最高的A类生物剂。肉毒毒素中毒在人群中发病机率小，但其毒性大，致死率高，对公共卫生安全危害极大，必须引起人们的高度重视。由于产生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界广泛存在，并且其芽孢对外界环境具有较强的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一个十分严重的公共卫生问题。近年，我国许多地区均发生数例肉毒中毒的疫情，甚至有群体肉毒毒素中毒事件发生。因此，进行肉毒毒素的防治研究无论是对国家生物安全，公共卫生安全，还是对人们的生命健康安全都具有重要的实际意义。
肉毒毒素相对分子质量为150kDa，由重链(H链，相对分子质量为100kDa)和轻链(L链，相对分子质量为50kDa)组成，二者由1个二硫键连接。轻链是毒性结构域，具有锌离子肽链内切酶活性；重链N端，HN结构域，此转运区域主要α螺旋组成，在毒素的跨膜转运中起重要作用；重链C端，Hc结构域，为神经细胞特异性结合结构域，由两个亚结构域(Hc-N和Hc-C)组成，与受体相互作用。肉毒毒素作为目前已知毒性最强的蛋白质，其疫苗和中和性抗体的研制一直备受关注，但目前研究或有限使用的类毒素疫苗存在许多缺点，无法推广应用。近年来国内外加强了对肉毒毒素疫苗的研究，试图找到安全、有效的疫苗，其中最具研究前景的是新型重组亚单位疫苗。先前的大部分研究表明肉毒毒素受体结合域Hc是保护性抗原基本决定簇，具有完全的保护作用，是肉毒毒素疫苗研究的一个主要靶抗原。
发明内容
申请人所在团队在A、B、E和F型肉毒毒素重组亚单位疫苗研究中发现，A、B和F型肉毒毒素重组Hc抗原以1或10μg免疫小鼠2次后，均能够产生强的免疫保护作用，能够分别对各自105或104LD50毒素攻击的完全保护，但E型肉毒毒素重组Hc抗原以1或10μg免疫小鼠2次后，仅仅高剂量10μg免疫组能够针对104LD50毒素攻击产生强的完全免疫保护作用；更重要的是，A、B和F型肉毒毒素重组Hc抗原单剂量免疫小鼠1次后，就能够产生强的免疫保护作用，能够对各自103LD50毒素攻击的保护作用，但E型肉毒毒素重组Hc抗原单剂量免疫小鼠1次后，不能够对102LD50毒素攻击的产生免疫保护作用。以上结果表明，与其他型相比，E型肉毒毒素重组Hc抗原产生了较弱的免疫保护作用，需要多次免疫高剂量才能够产生有效的免疫保护。以上E型肉毒毒素重组Hc抗原免疫结果，提示它作为亚单位疫苗应用于人体临床试验时可能够需要免疫更大剂量抗原和多次免疫。因此，针对此问题，需要进一步筛选更有效的重组抗原作为E型肉毒毒素重组亚单位疫苗，以提高其免疫保护作用，满足今后人体临床试验要求。
本发明的目的是提供E型肉毒毒素重组L-HN抗原的制备方法及其应用。
第一方面，本发明要求保护E型肉毒毒素重组L-HN抗原在如下任一中的应用：
(A)制备E型肉毒毒素亚单位疫苗中的应用；所述E型肉毒毒素亚单位疫苗用于预防肉毒毒素所引起的中毒病症。
(B)作为免疫原在制备E型肉毒抗毒素中的应用；所述E型肉毒抗毒素用于治疗肉毒毒素所引起的中毒病症。
所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为E型肉毒毒素的轻链和重链氨基酸融合区(L链和HN融合区)。
第二方面，本发明要求保护E型肉毒毒素亚单位疫苗。
本发明所要求保护的E型肉毒毒素亚单位疫苗，其活性成分为E型肉毒毒素重组L-HN抗原；所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为E型肉毒毒素的轻链和重链氨基酸融合区(L链和HN融合区)。
第三方面，本发明要求保护E型肉毒抗毒素。
本发明所要求保护的E型肉毒抗毒素是以E型肉毒毒素重组L-HN抗原作为免疫原免疫动物后所得。
在上述三方面中，所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原具体可为如下任一：
(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)将(A1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在上述三方面中，所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原可按照包括如下步骤的方法制备得到：将编码所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的核酸分子导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
其中，所述核酸分子可以重组载体的形式导入到所述大肠杆菌受体细胞中。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述核酸分子(SEQ IDNo.2)替换克隆到pTIG-Trx载体的酶切位点EcoRI和XhoI之间的小片段后得到的重组质粒。
其中，所述核酸分子具体可为如下任一：
(B1)SEQ ID No.9所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
进一步地，在对所述重组大肠杆菌进行培养的过程中，待培养至对数生长期时加入IPTG至终浓度为0.2-0.8mmol/L(如0.4mmol/L)，然后于30℃条件下220r/min振荡培养4～5h；培养结束后收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 8.0)，超声破碎，离心收集上清液，从所述上清液中即可获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原；
进一步地，由于在所述重组载体中，所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原与His标签融合表达，所以在离心收集所述上清液后还包括用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化的步骤。
第四方面，本发明要求保护制备E型肉毒毒素重组L-HN抗原的方法。
本发明所要求保护的制备E型肉毒毒素重组L-HN抗原的方法，可包括前文所述的制备所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的步骤。
第五方面，本发明要求保护如下任一物质：
(C1)蛋白质，为前文所述的E型肉毒毒素重组L-HN抗原；
(C2)核酸分子，为前文所述的核酸分子；
(C3)含有(C2)所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
(C4)用于预防和/或治疗肉毒毒素所引起的中毒病症的产品，含有(C1)所述的蛋白质或(C2)所述的核酸分子或(C3)所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
第五方面，本发明要求保护前文(C1)所述的蛋白质或(C2)所述的核酸分子或(C3)所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备用于预防和/或治疗肉毒毒素所引起的中毒病症的产品中的应用。
本发明利用基因工程技术制备了E型肉毒毒素各功能结构域的抗原片段蛋白，并对各重组抗原亚单位疫苗的免疫保护效力进行了探究，结果表明E型肉毒毒素各功能结构域抗原中，L-HN抗原具有最强的免疫保护作用，优于常用的Hc抗原，特别是它具有低剂量少免疫次数就能够产生强的完全保护作用，因此它是一个非常有潜力的E型肉毒毒素候选亚单位疫苗。另外，L-HN抗原免疫后产生非常高水平的中和抗体，这提示它作为免疫原时具有替代类毒素去免疫马制备抗毒素的潜力。
本发明证实了L-HN抗原作为免疫原的效力，优于包括Hc抗原在内的其他功能结构域抗原作为免疫原的效力。这一特性正好弥补了E型肉毒毒素重组Hc抗原在免疫保护力上效力不够强的问题。此外，人体临床试验时可能够需要免疫效力更强的免疫原以便能够产生强的免疫活性。因此本发明的E型肉毒毒素重组L-HN抗原非常有希望作为候选亚单位疫苗应用于预防E型肉毒毒素。
附图说明
图1为纯化获得的Hc、Hc-C、Hc-N、L-HN、HN和L抗原蛋白SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定图。泳道1～6分别为Hc、Hc-N、Hc-C、L-HN、HN和L抗原样品；M为蛋白Marker(从上往下依次为:180、130、95、72、55、43、34、26和17kDa)。A为E型肉毒毒素各抗原的SDS-PAGE鉴定；B为E型肉毒毒素各抗原的Western blot鉴定(马源E型肉毒抗毒素标准品为一抗的检定结果)；C为E型肉毒毒素受体结合区抗原的Western blot鉴定(马源抗E型肉毒毒素受体结合区的多克隆血清抗体为一抗的检定结果)。
图2为E型肉毒毒素重链羧基端结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的抗体水平结果。A为重组抗原Hc免疫组抗各重组抗原(Hc、Hc-C、Hc-N、L-HN、HN和L，PBS-BSA为阴性对照)的抗体反应；B为重组抗原Hc-N免疫组抗各重组抗原的抗体反应；C为重组抗原Hc-C免疫组的抗各重组抗原的抗体反应；D为重组抗原Hc-N+Hc-C免疫组的抗各重组抗原的抗体反应。
图3为E型肉毒毒素重链氨基端-轻链结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的抗体水平结果。A为重组抗原HN免疫组的抗各重组抗原(Hc、Hc-C、Hc-N、L-HN、HN和L，PBS-BSA为阴性对照)的抗体反应；B为重组抗原L免疫组的抗各重组抗原的抗体反应；C为重组抗原L-HN免疫组的抗各重组抗原的抗体反应；D为重组抗原HN+L免疫组的抗各重组抗原的抗体反应。
图4为E型肉毒毒素重链结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的抗体水平结果。A为重组抗原Hc免疫组的抗各重组抗原(Hc、Hc-C、Hc-N、L-HN、HN和L，PBS-BSA为阴性对照)的抗体反应；B为重组抗原HN免疫组的抗各重组抗原的抗体反应；C为重组抗原Hc+HN免疫组的抗各重组抗原的抗体反应。
图5为E型肉毒毒素全长毒素结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的抗体水平结果。A为重组抗原Hc免疫组的抗各重组抗原(Hc、Hc-C、Hc-N、L-HN、HN和L，PBS-BSA为阴性对照)的抗体反应；B为重组抗原L-HN免疫组的抗各重组抗原的抗体反应；C为重组抗原Hc+L-HN免疫组的抗各重组抗原的抗体反应。
图6为E型肉毒毒素重组Hc和L-HN抗原不同剂量免疫2次小鼠后的抗体水平结果。A为重组抗原Hc免疫组(抗原剂量依次为4000、1000、250、62.5、15.6和3.9ng/只)的抗Hc的抗体反应；B为重组抗原L-HN免疫组(抗原剂量依次为4000、1000、250、62.5、15.6和3.9ng/只)的抗Hc的抗体反应；C为重组抗原Hc+L-HN免疫组(抗原剂量依次为4000、1000、250、62.5、15.6和3.9ng/只)的抗Hc或L-HN的抗体反应。PBS组为阴性对照。
注：本实验所有数据GraphPad Prism 5.0进行分析，实验结果均用平均值±标准误差(mean±SD)，对于配对实验之间的差异均采用t检验方法或卡方检验方法分析其统计学意义。P＜0.05(*)则认为差异有统计学显著意义，P＜0.01(**)和P＜0.001(***)则认为差异有统计学极显著意义。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)和《中华人民共和国药典》(国家药典委员会编，2015年三部，化学工业出版社)。
下述实施例设计和制备了E型肉毒毒素各个结构功能表位重组抗原，并系统性对各个结构功能表位抗原的免疫原性进行了研究与评价，比较E型肉毒毒素各功能结构域抗原片段的免疫保护效力，目的是筛选并确定能够引起显著保护作用的功能表位重组抗原作为E型肉毒毒素亚单位候选疫苗。
实施例1、E型肉毒毒素各功能表位重组抗原在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定
一、E型肉毒毒素各功能表位抗原基因设计与合成
根据密码子简并性人工优化合成了编码E型肉毒毒素各功能表位抗原基因，并先直接克隆于pMD18-T载体(TaKaRa)中命名为pMD18-L、pMD18-HN、pMD18-L-HN、pMD18-Hc、pMD18-Hc-C和pMD18-Hc-N，分别编码L、HN、L-HN、Hc、Hc-C和Hc-N(详细抗原以及序列信息见表1)。克隆这些人工合成的基因时，为了方便下面的操作，在各功能表位抗原基因的5’端引入EcoR I和3’端引入了Xho I酶切识别位点。
以上基因设计采用大肠杆菌常用的密码子，同时兼顾真核细胞常用的密码子，并保证所编码的氨基酸残基序列不变。根据E型肉毒毒素全长基因序列和氨基酸残基序列(BoNT/E，菌株NCTC 11219，全长1252个氨基酸)优化全部各功能表位抗原基因，使整个分子基因序列中A和T含量由约76％降低至约53％，减少了大量的AT重复，增加了GC含量，更有利于基因的表达。
表1 E型肉毒毒素各功能结构域表位抗原的基本信息表
Figure GDA0003032462100000051
二、各重组原核表达载体的构建
用EcoR I和Xho I分别双酶切上述获得的质粒pMD18-L、pMD18-HN、pMD18-L-HN、pMD18-Hc、pMD18-Hc-C和pMD18-Hc-N，用DNA回收试剂盒分别回收相应的目的基因片段，与经相同酶双酶切的原核表达载体pTIG-Trx(见专利：ZL 200710089588.2)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，获得序列及插入位置均正确的重组原核表达载体，分别命名为pTIG-Trx-pMD18-L、pTIG-Trx-HN、pTIG-Trx-L-HN、pTIG-Trx-Hc、pTIG-Trx-Hc-C和pTIG-Trx-Hc-N。
三、各重组抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化与鉴定
1、各重组抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测
将步骤二构建的6个重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照，然后按1:100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的500mL的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(OD600约为0.6～1.0)时加入化学诱导剂IPTG至终浓度为0.4mmol/L，30℃条件下220r/min振荡培养4～5小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 8.0)，超声打碎细胞，离心收集上清进行12％SDS-PAGE检测，结果表明，经诱导表达的重组蛋白都获得了表达并能够以可溶性方式存在，而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白可能就是目的蛋白即各重组抗原。
2、表达产物的纯化及鉴定
步骤1所表达的各重组抗原的C端含有六个组氨酸标签，因此用Ni-NTA亲和层析柱(法玛西亚公司)并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化，得到洗脱纯化蛋白，然后对经纯化的蛋白进行12％SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了纯化的目的蛋白。获得的目的蛋白保存于-20℃或-80℃备用。图1中A所示是6种目的蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。
3、表达产物的Western blot鉴定
以马源E型肉毒抗毒素标准品(规格117.9mg/950IU，购自中国食品药品检定研究院)和马源抗E型肉毒毒素受体结合区多克隆抗体[Shi DY,Liu FJ,Mao YY,Cui RT,Lu JS,Yu YZ,Dong XJ,Yang ZX,Sun ZW,Pang XB.Development and evaluation of candidatesubunit vaccine and novel antitoxin against botulinum neurotoxin serotypeE.Hum Vaccin Immunother.2019Jul26:1-9.doi:10.1080/21645515.2019.1633878.]为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗马IgG(Sigma公司)为二抗，对纯化的各重组抗原蛋白进行Western blot分析，结果显示表达目的蛋白与E型肉毒抗毒素标准品中的抗体特异性结合，阳性条带大小位置与电泳位置一致，与各重组抗原的理论大小相当，表明经纯化的重组蛋白即为目的蛋白(图1中B)。但，Western blot鉴定时马源E型肉毒抗毒素抗体与L-HN、HN和L抗原反应结合显色较深，与Hc和Hc-C抗原反应结合显色较浅，与Hc-N无反应。而马源抗E型肉毒毒素受体结合区的多克隆血清抗体则与Hc、Hc-C和Hc-N抗原反应结合较好(图1中C)。
总之，利用基因工程技术克隆了E型肉毒毒素各功能结构域的基因序列，并连接在原核表达载体pTIG-Trx上，获得了重组表达质粒，通过诱导表达条件的优化，实现了重组质粒在大肠杆菌中的高效可溶性表达，通过HisTrapTM HP蛋白纯化柱纯化到了纯度较高、稳定性良好的重组抗原，为下面比较不同抗原片段的免疫保护效力提供了基础。
实施例2、E型肉毒毒素重链羧基端结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后抗体水平检测及对E型肉毒毒素的保护作用
将以上实施例1制备所得的各重组抗原分别免疫小鼠，检验其免疫原性和保护性。具体方法为：将Balb/c小鼠(6-8周，雌性，SPF级，购自军事医学研究院实验动物中心)随机分组，每组8只，免疫剂量分别为每只小鼠1μg或10μg抗原蛋白，联合组则每个抗原蛋白各半，而阴性对照组免疫不含重组蛋白的PBS，与终浓度为1mg/ml的铝佐剂(AlhydrogelTM2.0％，邦泰(Brenntag Biosector)公司产品)混合，间隔3周加强免疫(抗原蛋白和铝佐剂的用量同上)，两或三次免疫后对小鼠采血，然后用E型肉毒毒素(BoNT/E)攻毒评价抗原的保护作用(观察一周，统计结果)，并用ELISA法检测小鼠血清抗体水平和用经典的体内中和实验测定中和效价，方法如下。
用ELISA法(用酶联免疫板包被各个重组抗原，浓度为2μg/mL，用分离的免疫小鼠血清为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)为二抗)测定血清抗体水平。以空对照组小鼠血清为阴性对照(即N)，免疫组的OD492值(即P)达到0.3以上，并且P/N≥2.1为阳性。各组抗体水平以平均值±标准误差来表示。
用经典的体内中和实验测定了免疫小鼠血清抗体的体内中和活性及中和抗体效价。根据药典2015版3510肉毒抗毒素效价测定法，设计如下方案测定小鼠血清中和效价。血清抗体滴度以每毫升国际单位(IU/ml)报告，一个IU定义为中和103LD50 E型肉毒毒素的中和抗体。
(1)毒素与待测样品稀释。将毒素稀释到100LD50/ml。然后将小鼠血清按照预计的效价稀释到与对应毒素相当的倍数，如预计2IU/ml的血清，稀释200倍到0.1IU/ml。同时将抗毒素标准品稀释到相应浓度。
(2)毒素与待测样品体外结合。将稀释后的1ml毒素与不同体积的稀释后血清或者标准品混合，每组设置5个梯度。用稀释液补齐至所有终体积为2.5ml，将毒素和抗体混合均匀，置于37℃温箱孵育15min，使毒素和抗体充分反应。
(3)动物给药与观察。将15-18g的SPF级雌性KM小鼠随机分组，每组4只。将孵育后的毒素与抗毒素结合样品腹腔注射到小鼠体内，注射剂量500μl/只，每个样品的每个稀释度给药4只。每天观察动物发病及死亡情况，连续7天。以标准品动物组50％死亡终点比较实验组动物的50％保护终点，推算出血清的效价。
本实施例2中，Hc、Hc-C和Hc-N抗原均以10μg剂量免疫2和3次。表2和图2所示结果表明，Hc、Hc-C和Hc-N各重组抗原均产生了仅仅针对自己的抗体反应，无其他交叉抗体反应。但，针对毒素的保护作用和中和抗体水平则差异不同，Hc-N两次和三次免疫均无保护作用；Hc-C有部分保护作用，三次免疫才产生了中和抗体；而Hc两次和三次免疫均完全保护作用，并且产生了较高的中和抗体。然而，Hc-C和Hc-N联合组(相当于Hc)则无强的保护作用，相比各单独抗原无增强保护作用，没有产生相应的联合或协同效应，远远低于Hc组效力。另外，阴性对照组血清无相应特异性抗体反应，也无保护作用和中和抗体。
表2 E型肉毒毒素重链羧基端结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的保护水平结果
Figure GDA0003032462100000071
注：Hc-N+Hc-C组为两个抗原组联合免疫；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用不同剂量的E型肉毒毒素攻击进行保护性实验；血清中和抗体用经典的体内中和实验测定。保护水平上，Hc组与其他组相比有极显著的统计学差异。ND示未做这个剂量的保护性试验。
实施例3、E型肉毒毒素重链氨基端-轻链结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后抗体水平检测及对E型肉毒毒素的保护作用
E型肉毒毒素重链氨基端-轻链结构区表位抗原蛋白免疫方案同实施例2。表3和图3所示结果表明，HN、EL和L-HN抗原均以1和10μg剂量免疫2和3次，各重组抗原均产生了仅仅针对自己的抗体反应，无其他交叉抗体反应。各免疫组不同剂量和免疫次数均产生了保护反应，也呈现剂量正相关性。但，值得说明的是，L-HN抗原的保护作用高于HN和L组，特别是低剂量时差异更明显。同时，中和抗体水平差异更大，L-HN组2次免疫后1和10μg剂量组分别达到14.6和29.3IU/ml，3次免疫后1和10μg剂量组分别达到51.2和136.6IU/ml，而HN和L组最高组水平才3.2IU/ml。另外，HN+L联合组与单独抗原免疫组相比，有一定的增强效应，但还是弱于L-HN组，特别是在中和抗体水平上，远远低于L-HN组。以上结果表明，L-HN抗原具有良好的免疫保护作用，并且能够产生强的中和抗体。
表3 E型肉毒毒素重链氨基端-轻链结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的保护水平结果
Figure GDA0003032462100000072
Figure GDA0003032462100000081
注：HN+L组为两个抗原组联合免疫；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用不同剂量的E型肉毒毒素攻击进行保护性实验；血清中和抗体用经典的体内中和实验测定。保护水平上，L-HN组与其他组相比有极显著的统计学差异。
实施例4、E型肉毒毒素重链结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后抗体水平检测及对E型肉毒毒素的保护作用
E型肉毒毒素重链结构区表位抗原蛋白免疫方案同实施例2。表4和图4所示结果表明，HN、Hc和Hc+HN抗原均以1和10μg剂量免疫2和3次，各重组抗原均产生了仅仅针对自己的抗体反应，无其他交叉抗体反应。各免疫组不同剂量和免疫次数均产生了保护反应，也呈现剂量正相关性。但，Hc抗原的保护作用高于HN组，特别是低剂量时差异更明显，并且中和抗体水平差异更大。另外，Hc+HN联合组与强免疫原性的单独Hc抗原免疫组相比，无明显差异，两组免疫保护水平相当；但在中和抗体水平上，联合组还弱于Hc组，可能HN有一定的干扰影响。总之，Hc+HN联合组没有产生协同的增强效应。
表4 E型肉毒毒素重链结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的保护水平结果
Figure GDA0003032462100000082
Figure GDA0003032462100000091
注：Hc+HN组为两个抗原组联合免疫；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用不同剂量的E型肉毒毒素攻击进行保护性实验；血清中和抗体用经典的体内中和实验测定。保护水平上，Hc组与其他组相比有极显著的统计学差异。
实施例5、E型肉毒毒素全长毒素结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后抗体水平检测及对E型肉毒毒素的保护作用
E型肉毒毒素全长毒素结构区表位抗原蛋白免疫方案同实施例2。表5和图5所示结果表明，Hc、L-HN和Hc+L-HN抗原均以1和10μg剂量免疫2和3次，各重组抗原均产生了仅仅针对自己的抗体反应，无其他交叉抗体反应。各免疫组均产生了强的保护作用，仅仅Hc抗原1μg剂量免疫2次时，不能够保护104LD50高剂量毒素的攻击，而L-HN抗原则能够完全保护。在中和抗体水平上，L-HN组2次免疫后1和10μg剂量组分别达到14.6和29.3IU/ml，3次免疫后1和10μg剂量组分别达到51.2和136.6IU/ml，而Hc组2次免疫后1和10μg剂量组分别达到0.25和4IU/ml，3次免疫后1和10μg剂量组分别达到12和32IU/ml。这个结果则表明L-HN抗原在各个组别上均高于Hc组的效果。为了进一步评价它们的免疫保护能力，用105LD50更高剂量毒素去攻击，结果L-HN抗原各组则能够完全保护，而Hc组2次免疫10μg组和3次免疫1μg组却不能够保护。这个结果与各组的中和抗体水平是相一致的。总之，L-HN抗原在保护效力上是优于Hc抗原的，提示它作为亚单位疫苗可能具有更优的效果。
另外，Hc+L-HN联合组(相当于全长毒素)与单独免疫原性的强L-HN抗原免疫组相比，无明显差异，两组免疫保护水平相当；但在中和抗体水平上，联合组还弱于L-HN组，这可与免疫剂量有关，这也表明Hc+L-HN联合组没有产生协同的增强效应。
表5 E型肉毒毒素全长毒素结构区各功能表位抗原蛋白免疫小鼠后的保护水平结果
Figure GDA0003032462100000092
注：Hc+L-HN组为两个抗原组联合免疫；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用不同剂量的E型肉毒毒素攻击进行保护性实验；血清中和抗体用经典的体内中和实验测定。保护水平上，L-HN组与Hc组相比有极显著的统计学差异。
实施例6、E型肉毒毒素重组Hc和L-HN抗原剂量依赖性免疫保护性结果
E型肉毒毒素重组Hc和L-HN抗原剂量依赖性免疫保护性方案如下：重组Hc和L-HN抗原和Hc+L-HN联合组抗原剂量依次为4000、1000、250、62.5、15.6和3.9ng/只，免疫2次，其他同上面方案。各免疫组第二次免疫三周后用103LD50 BoNT/E进行攻击，观察一周，统计存活数结果。使用概率分析方法(SPSS17.0-Probit)计算各组的半数有效剂量ED50值，以这个值来表示疫苗的效力。
图6所示的结果表明，各重组抗原组均产生了仅仅针对自己(抗Hc或抗L-HN)的抗体反应，并且呈现抗原剂量依赖性。Hc抗原第二次免疫三周后对103LD50 BoNT/E保护的半数有效剂量ED50约为0.051μg；L-HN抗原第二次免疫三周后对103LD50 BoNT/E的半数有效剂量ED50约为0.0235μg；Hc+L-HN联合抗原第二次免疫三周后对103LD50 BoNT/E的半数有效剂量ED50约为0.033μg(表6)。以上结果表明，L-HN组的效力最高，在62.5ng低剂量时其具有完全的免疫保护效力，而Hc抗原仅仅在大于1000ng剂量时才具有完全的免疫保护效力。而联合组在依赖性免疫保护性试验中也没有协同增强免疫保护作用的效应，表明起决定性作用的仍然是L-HN抗原。
为了进一步评价L-HN和Hc在一次免疫后的保护效力，本发明对这两个抗原以不同剂量免疫一次后就进行保护性试验，结果表明Hc抗原1次免疫三周后各个剂量组没有产生针对102LD50 BoNT/E毒素攻击的保护作用，而L-HN抗原1次免疫三周后1和4μg剂量组均有保护作用，保护率达到80％，并且250ng组也有20％保护率，与Hc抗原相比有极显著统计学差异(表7)。以上结果进一步表明L-HN作为免疫抗原是远远优于Hc，特别是低剂量，少免疫次数条件下，其效果更明显。
鉴于人体临床试验时可能够需要免疫更大剂量抗原和多次免疫，并且免疫产生的反应弱于在动物上的效果，L-HN作为免疫抗原这个特性可能更利于它作为人用疫苗使用，能够在低剂量和少免疫次数的前提下就产生良好的抗体反应和保护作用。另外，基于它能够产生比Hc抗原更高的中和抗体，提示它不仅仅可作为亚单位疫苗抗原，也可作为免疫原替代类毒素去免疫马制备抗毒素。
表6 E型肉毒毒素重组Hc和L-HN抗原不同剂量免疫2次小鼠后的保护水平结果
Figure GDA0003032462100000101
注：Hc+L-HN组为两个抗原组联合免疫；各免疫组第二次免疫三周后用103LD50BoNT/E进行攻击，观察一周，统计存活数结果。
表7 E型肉毒毒素重组Hc和L-HN抗原不同剂量免疫1次小鼠后的保护水平结果
Figure GDA0003032462100000111
注：各免疫组1次免疫三周后用102LD50 BoNT/E进行攻击，观察一周，统计存活数结果。保护水平上，L-HN组与Hc组相比有极显著的统计学差异。
综上所述，本发明利用基因工程技术制备了E型肉毒毒素各功能结构域的抗原片段蛋白，并对各重组抗原亚单位疫苗的免疫保护效力进行了探究，结果表明E型肉毒毒素各功能结构域抗原中，Hc和L-HN抗原具有很好的免疫原性和免疫保护作用，Hc-C、HN、L抗原具有一般的免疫保护作用，Hc-N无保护作用。进一步研究分析结果表明，与Hc抗原相比，L-HN抗原在保护效力和中和抗体产生具有明显的优势和更好的效力。如E型肉毒毒素重组Hc抗原以1或10μg免疫小鼠2次后，仅仅高剂量10μg免疫组能够针对104LD50毒素攻击产生强的完全免疫保护作用，也不能够产生对105LD50毒素攻击的免疫保护作用；但E型肉毒毒素重组L-HN抗原以1或10μg免疫小鼠2次后，两个剂量免疫组均能够针对104和105LD50毒素攻击产生强的完全免疫保护作用。更重要的是，E型肉毒毒素重组Hc抗原1次免疫不能够产生对102LD50毒素攻击的免疫保护作用，但E型肉毒毒素重组L-HN抗原1或4μg单剂量免疫小鼠后，就能够产生对102LD50毒素攻击的强保护作用。另外，L-HN抗原以1或10μg免疫小鼠2次后分别产生了15和50IU/ml中和抗体；三次免疫分别产生30和140IU/ml中和抗体；而Hc抗原以1或10μg免疫小鼠2次后分别产生了0.25和4IU/ml中和抗体；三次免疫分别产生12和32IU/ml中和抗体。因此，本发明制备的重组L-HN抗原作为E型肉毒毒素亚单位疫苗的效力优于Hc抗原，具有更好免疫保护效力和应用前景。另外，基于它能够产生比Hc抗原更高的中和抗体，提示它不仅仅可作为亚单位疫苗抗原，也可作为免疫原替代类毒素去免疫马制备抗毒素。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> E型肉毒毒素重组HN-L抗原的制备方法及其应用
<130> GNCLN192668
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
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Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp
65 70 75 80
Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu
85 90 95
Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
100 105 110
Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly
115 120 125
Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser
130 135 140
Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu
145 150 155 160
Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser
165 170 175
Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys
180 185 190
Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn
195 200 205
Ile Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser
210 215 220
Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu
225 230 235 240
Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn
245 250 255
Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg
260 265 270
Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys
275 280 285
Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys
290 295 300
Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His Leu Phe
305 310 315 320
Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr Ile Lys
325 330 335
Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val Met Asn Ser
340 345 350
Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly Asn Asn
355 360 365
Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val Val Ala Ser Thr Trp
370 375 380
Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp
385 390 395 400
Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp Gln Glu Lys
405 410
<210> 5
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg
1 5 10 15
Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile
20 25 30
Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe
35 40 45
Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp
50 55 60
Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp
65 70 75 80
Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu
85 90 95
Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
100 105 110
Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly
115 120 125
Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser
130 135 140
Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu
145 150 155 160
Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser
165 170 175
Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys
180 185 190
Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn
195 200 205
Ile Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr
210 215 220
<210> 6
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile
1 5 10 15
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr
20 25 30
Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp
35 40 45
Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn
50 55 60
Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn
85 90 95
Phe Val Ala Ser Lys Thr His Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg
115 120 125
Phe Asn Gln Val Val Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met
130 135 140
Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys
145 150 155 160
Ala Asp Thr Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp
165 170 175
His Thr Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His
180 185 190
Gly Trp Gln Glu Lys
195
<210> 7
<211> 1263
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ccgaaaatca actctttcaa ctacaacgac ccggttaacg accgtaccat cctgtacatc 60
aaaccgggtg gttgccagga attttacaaa tctttcaaca tcatgaaaaa catctggatc 120
atcccggaac gtaacgttat cggtaccacc ccgcaggact tccatccgcc gacctctctg 180
aaaaacggtg actcttctta ctacgacccg aactacctgc agtctgacga agaaaaagac 240
cgtttcctga aaatcgttac caaaatcttc aaccgtatca acaacaacct gtctggtggt 300
atcctgctgg aagaactgtc taaagctaac ccgtacctgg gtaacgacaa caccccggac 360
aaccagttcc atatcggtga cgcttctgct gttgaaatca aattctctaa cggttctcag 420
gacatcctgc tgccgaacgt tatcatcatg ggtgctgaac cggacctgtt cgaaaccaac 480
tcttctaaca tctctctgcg taacaactac atgccgtcta accatggttt cggttctatc 540
gctatcgtta ccttctctcc ggaatactct ttccgtttca acgacaactc tatgaacgaa 600
tttatccagg acccggctct gaccctgatg catgaactga tccattctct gcatggtctg 660
tacggtgcta aaggtatcac caccaaatac accatcaccc agaaacagaa cccgctgatc 720
accaacatcc gtggtaccaa catcgaagaa tttctgacct tcggtggtac cgacctgaac 780
atcatcacct ctgctcagtc taacgacatc tacaccaacc tgctggctga ctacaaaaaa 840
atcgcttcta aactgtctaa agttcaggtt tctaacccgc tgctgaaccc gtacaaagac 900
gttttcgaag ctaaatacgg tctggacaaa gacgcttctg gtatctactc tgttaacatc 960
aacaaattca acgacatctt caaaaaactg tactctttca ccgaatttga cctggctacc 1020
aaattccagg ttaaatgccg tcagacctac atcggtcagt acaaatactt caaactgtct 1080
aacctgctga acgactctat ctacaacatc tctgaaggtt acaacatcaa caacctgaaa 1140
gttaacttcc gtggtcagaa cgctaacctg aacccgcgta tcatcacccc gatcaccggt 1200
cgtggtctgg ttaaaaaaat catccgtttc tgcaaaaaca tcgtttctgt taaaggtatc 1260
cgt 1263
<210> 8
<211> 1254
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
aaatctatct gcatcgaaat caacaacggt gaactgttct tcgttgcttc tgaaaactct 60
tacaacgacg acaacatcaa caccccgaaa gaaatcgacg acaccgttac ctctaacaac 120
aactacgaaa acgacctgga ccaggttatc ctgaacttca actctgaatc tgctccgggt 180
ctgtctgacg aaaaactgaa cctgaccatc cagaacgacg cttacatccc gaaatacgac 240
tctaacggta cctctgacat cgaacagcat gacgttaacg aactgaacgt tttcttctac 300
ctggacgctc agaaagttcc ggaaggtgaa aacaacgtta acctgacctc ttctatcgac 360
accgctctgc tggaacagcc gaaaatctac accttcttct cttctgaatt tatcaacaac 420
gttaacaaac cggttcaggc tgctctgttc gtttcttgga ttcagcaggt tctggttgac 480
ttcaccaccg aagctaacca gaaatctacc gttgacaaaa tcgctgacat ctctatcgtt 540
gttccgtaca tcggtctggc tctgaacatc ggtaacgaag ctcagaaagg taacttcaaa 600
gacgctctgg aactgctggg tgctggtatc ctgctggaat ttgaaccgga actgctgatc 660
ccgaccatcc tggttttcac catcaaatct ttcctgggtt cttctgacaa caaaaacaaa 720
gttatcaaag ctatcaacaa cgctctgaaa gaacgtgacg aaaaatggaa agaagtttac 780
tctttcatcg tttctaactg gatgaccaaa atcaacaccc agttcaacaa acgtaaagaa 840
cagatgtacc aggctctgca gaaccaggtt aacgctatca aaaccatcat cgaatctaaa 900
tacaactctt acaccctgga agaaaaaaac gaactgacca acaaatacga catcaaacag 960
atcgaaaacg aactgaacca gaaagtttct atcgctatga acaacatcga ccgtttcctg 1020
accgaatctt ctatctctta cctgatgaaa ctgatcaacg aagttaaaat caacaaactg 1080
cgtgaatacg acgaaaacgt taaaacctac ctgctgaact acatcatcca gcatggttct 1140
atcctgggtg aatctcagca ggaactgaac tctatggtta ccgacaccct gaacaactct 1200
atcccgttca aactgtcttc ttacaccgac gacaaaatcc tgatctctta cttc 1254
<210> 9
<211> 2517
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ccgaaaatca actctttcaa ctacaacgac ccggttaacg accgtaccat cctgtacatc 60
aaaccgggtg gttgccagga attttacaaa tctttcaaca tcatgaaaaa catctggatc 120
atcccggaac gtaacgttat cggtaccacc ccgcaggact tccatccgcc gacctctctg 180
aaaaacggtg actcttctta ctacgacccg aactacctgc agtctgacga agaaaaagac 240
cgtttcctga aaatcgttac caaaatcttc aaccgtatca acaacaacct gtctggtggt 300
atcctgctgg aagaactgtc taaagctaac ccgtacctgg gtaacgacaa caccccggac 360
aaccagttcc atatcggtga cgcttctgct gttgaaatca aattctctaa cggttctcag 420
gacatcctgc tgccgaacgt tatcatcatg ggtgctgaac cggacctgtt cgaaaccaac 480
tcttctaaca tctctctgcg taacaactac atgccgtcta accatggttt cggttctatc 540
gctatcgtta ccttctctcc ggaatactct ttccgtttca acgacaactc tatgaacgaa 600
tttatccagg acccggctct gaccctgatg catgaactga tccattctct gcatggtctg 660
tacggtgcta aaggtatcac caccaaatac accatcaccc agaaacagaa cccgctgatc 720
accaacatcc gtggtaccaa catcgaagaa tttctgacct tcggtggtac cgacctgaac 780
atcatcacct ctgctcagtc taacgacatc tacaccaacc tgctggctga ctacaaaaaa 840
atcgcttcta aactgtctaa agttcaggtt tctaacccgc tgctgaaccc gtacaaagac 900
gttttcgaag ctaaatacgg tctggacaaa gacgcttctg gtatctactc tgttaacatc 960
aacaaattca acgacatctt caaaaaactg tactctttca ccgaatttga cctggctacc 1020
aaattccagg ttaaatgccg tcagacctac atcggtcagt acaaatactt caaactgtct 1080
aacctgctga acgactctat ctacaacatc tctgaaggtt acaacatcaa caacctgaaa 1140
gttaacttcc gtggtcagaa cgctaacctg aacccgcgta tcatcacccc gatcaccggt 1200
cgtggtctgg ttaaaaaaat catccgtttc tgcaaaaaca tcgtttctgt taaaggtatc 1260
cgtaaatcta tctgcatcga aatcaacaac ggtgaactgt tcttcgttgc ttctgaaaac 1320
tcttacaacg acgacaacat caacaccccg aaagaaatcg acgacaccgt tacctctaac 1380
aacaactacg aaaacgacct ggaccaggtt atcctgaact tcaactctga atctgctccg 1440
ggtctgtctg acgaaaaact gaacctgacc atccagaacg acgcttacat cccgaaatac 1500
gactctaacg gtacctctga catcgaacag catgacgtta acgaactgaa cgttttcttc 1560
tacctggacg ctcagaaagt tccggaaggt gaaaacaacg ttaacctgac ctcttctatc 1620
gacaccgctc tgctggaaca gccgaaaatc tacaccttct tctcttctga atttatcaac 1680
aacgttaaca aaccggttca ggctgctctg ttcgtttctt ggattcagca ggttctggtt 1740
gacttcacca ccgaagctaa ccagaaatct accgttgaca aaatcgctga catctctatc 1800
gttgttccgt acatcggtct ggctctgaac atcggtaacg aagctcagaa aggtaacttc 1860
aaagacgctc tggaactgct gggtgctggt atcctgctgg aatttgaacc ggaactgctg 1920
atcccgacca tcctggtttt caccatcaaa tctttcctgg gttcttctga caacaaaaac 1980
aaagttatca aagctatcaa caacgctctg aaagaacgtg acgaaaaatg gaaagaagtt 2040
tactctttca tcgtttctaa ctggatgacc aaaatcaaca cccagttcaa caaacgtaaa 2100
gaacagatgt accaggctct gcagaaccag gttaacgcta tcaaaaccat catcgaatct 2160
aaatacaact cttacaccct ggaagaaaaa aacgaactga ccaacaaata cgacatcaaa 2220
cagatcgaaa acgaactgaa ccagaaagtt tctatcgcta tgaacaacat cgaccgtttc 2280
ctgaccgaat cttctatctc ttacctgatg aaactgatca acgaagttaa aatcaacaaa 2340
ctgcgtgaat acgacgaaaa cgttaaaacc tacctgctga actacatcat ccagcatggt 2400
tctatcctgg gtgaatctca gcaggaactg aactctatgg ttaccgacac cctgaacaac 2460
tctatcccgt tcaaactgtc ttcttacacc gacgacaaaa tcctgatctc ttacttc 2517
<210> 10
<211> 1236
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
aacaaattct tcaagcgtat caaatcctct tccgtgctga acatgcgtta caagaacgac 60
aaatacgtgg acacctccgg ttacgactcc aacatcaata tcaacggtga cgtgtacaaa 120
tacccaacca acaaaaacca gttcggtatc tacaacgaca aactgtccga agtgaacatc 180
tcccagaatg actacatcat ctacgacaac aaatacaaga acttctccat ctctttctgg 240
gtgcgtatcc caaactacga caacaaaatc gtgaacgtga ataacgaata caccatcatc 300
aactgcatgc gtgacaataa ctccggttgg aaagtgtctc tgaaccacaa tgaaatcatc 360
tggaccctgc aggacaacgc cggtatcaac cagaaactgg ccttcaacta cggtaatgcc 420
aacggtatct ccgactacat caacaaatgg atcttcgtga ccatcaccaa cgaccgtctg 480
ggtgactcca aactgtacat caacggtaac ctgatcgacc agaaatccat cctgaacctg 540
ggtaacatcc acgtgtccga caacatcctg ttcaagatcg tgaactgctc ctacacccgt 600
tacatcggta tccgttactt caacatcttc gacaaagaac tggacgaaac cgaaatccag 660
accctgtact ccaacgaacc aaacaccaac atcctgaagg acttctgggg taactacctg 720
ctgtacgaca aagaatacta tctgctgaac gtgctgaagc caaataactt catcgaccgt 780
cgtaaagact ccaccctgtc tatcaacaat atccgttcca ccatcctgct ggccaaccgt 840
ctgtactccg gtatcaaggt gaaaatccag cgtgttaata actcttccac caatgacaat 900
ctcgttcgta agaacgacca agtgtacatc aacttcgttg cctctaagac ccacctgttc 960
ccactgtacg ccgacaccgc cactaccaac aaagaaaaga ccatcaaaat ctcctcttcc 1020
ggtaaccgtt tcaaccaggt ggttgtgatg aactccgttg gtaataactg caccatgaac 1080
ttcaagaaca ataacggtaa taacatcggt ctgctgggtt tcaaagccga caccgttgtg 1140
gcctccacct ggtactatac ccacatgcgt gaccacacca actccaatgg ttgcttctgg 1200
aacttcatct ccgaagaaca cggttggcag gaaaaa 1236
<210> 11
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
aacaaattct tcaagcgtat caaatcctct tccgtgctga acatgcgtta caagaacgac 60
aaatacgtgg acacctccgg ttacgactcc aacatcaata tcaacggtga cgtgtacaaa 120
tacccaacca acaaaaacca gttcggtatc tacaacgaca aactgtccga agtgaacatc 180
tcccagaatg actacatcat ctacgacaac aaatacaaga acttctccat ctctttctgg 240
gtgcgtatcc caaactacga caacaaaatc gtgaacgtga ataacgaata caccatcatc 300
aactgcatgc gtgacaataa ctccggttgg aaagtgtctc tgaaccacaa tgaaatcatc 360
tggaccctgc aggacaacgc cggtatcaac cagaaactgg ccttcaacta cggtaatgcc 420
aacggtatct ccgactacat caacaaatgg atcttcgtga ccatcaccaa cgaccgtctg 480
ggtgactcca aactgtacat caacggtaac ctgatcgacc agaaatccat cctgaacctg 540
ggtaacatcc acgtgtccga caacatcctg ttcaagatcg tgaactgctc ctacacccgt 600
tacatcggta tccgttactt caacatcttc gacaaagaac tggacgaaac cgaaatccag 660
accctgtac 669
<210> 12
<211> 591
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
gaaaccgaaa tccagaccct gtactccaac gaaccaaaca ccaacatcct gaaggacttc 60
tggggtaact acctgctgta cgacaaagaa tactatctgc tgaacgtgct gaagccaaat 120
aacttcatcg accgtcgtaa agactccacc ctgtctatca acaatatccg ttccaccatc 180
ctgctggcca accgtctgta ctccggtatc aaggtgaaaa tccagcgtgt taataactct 240
tccaccaatg acaatctcgt tcgtaagaac gaccaagtgt acatcaactt cgttgcctct 300
aagacccacc tgttcccact gtacgccgac accgccacta ccaacaaaga aaagaccatc 360
aaaatctcct cttccggtaa ccgtttcaac caggtggttg tgatgaactc cgttggtaat 420
aactgcacca tgaacttcaa gaacaataac ggtaataaca tcggtctgct gggtttcaaa 480
gccgacaccg ttgtggcctc cacctggtac tatacccaca tgcgtgacca caccaactcc 540
aatggttgct tctggaactt catctccgaa gaacacggtt ggcaggaaaa a 591

Claims (21)

1.E型肉毒毒素重组L-HN抗原在如下任一中的应用：
(A)制备E型肉毒毒素亚单位疫苗中的应用；
(B)作为免疫原在制备E型肉毒抗毒素中的应用；
所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为E型肉毒毒素的轻链和重链氨基酸融合区；
所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将编码所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的核酸分子导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID No.9所示的DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：在对所述重组大肠杆菌进行培养的过程中，待培养至对数生长期时加入IPTG至终浓度为0.2-0.8mmol/L，然后于30℃培养4～5h；培养结束后收集菌体，超声破碎，离心收集上清液，从所述上清液中即可获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在离心收集所述上清液后还包括用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化的步骤。
6.E型肉毒毒素亚单位疫苗，其活性成分为E型肉毒毒素重组L-HN抗原；所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为E型肉毒毒素的轻链和重链氨基酸融合区；
所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的E型肉毒毒素亚单位疫苗，其特征在于：所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将编码所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的核酸分子导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
8.根据权利要求7所述的E型肉毒毒素亚单位疫苗，其特征在于：所述核酸分子为SEQID No.9所示的DNA分子。
9.根据权利要求7或8所述的E型肉毒毒素亚单位疫苗，其特征在于：在对所述重组大肠杆菌进行培养的过程中，待培养至对数生长期时加入IPTG至终浓度为0.2-0.8mmol/L，然后于30℃培养4～5h；培养结束后收集菌体，超声破碎，离心收集上清液，从所述上清液中即可获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
10.根据权利要求9所述的E型肉毒毒素亚单位疫苗，其特征在于：在离心收集所述上清液后还包括用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化的步骤。
11.E型肉毒抗毒素，是以E型肉毒毒素重组L-HN抗原作为免疫原免疫动物后所得；
所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质。
12.权利要求11所述的E型肉毒抗毒素，其特征在于：所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将编码所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原的核酸分子导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
13.根据权利要求12所述的E型肉毒抗毒素，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID No.9所示的DNA分子。
14.根据权利要求12或13所述的E型肉毒抗毒素，其特征在于：在对所述重组大肠杆菌进行培养的过程中，待培养至对数生长期时加入IPTG至终浓度为0.2-0.8mmol/L，然后于30℃培养4～5h；培养结束后收集菌体，超声破碎，离心收集上清液，从所述上清液中即可获得所述E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
15.根据权利要求14所述的E型肉毒抗毒素，其特征在于：在离心收集所述上清液后还包括用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化的步骤。
16.蛋白质，为权利要求1中所述的E型肉毒毒素重组L-HN抗原。
17.核酸分子，为编码权利要求16所述蛋白质的核酸分子。
18.根据权利要求17所述核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID No.9所示的DNA分子。
19.含有权利要求18所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
20.用于预防和/或治疗肉毒毒素所引起的中毒病症的产品，含有权利要求16所述的蛋白质或权利要求17或18所述的核酸分子或权利要求19所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
21.权利要求16所述的蛋白质或权利要求17或18所述的核酸分子或权利要求19所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备用于预防和/或治疗肉毒毒素所引起的中毒病症的产品中的应用。
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