CN113018427B - 基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗 - Google Patents
基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的一种基于新冠病毒主要中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗；疫苗主要包含了新型冠状病毒突刺蛋白S1区域；具有强烈抗原性并具有广泛人群免疫反应的抗原表位以及具有刺激抗体生成的佐剂；疫苗可以通过皮下或肌肉注射导致系统性免疫，也可通过喷鼻诱导对防止呼吸道病毒具有重要意义的粘膜免疫；通过有选择性地选择关键抗原表位作为免疫原，可以精准产生具有中和性的抗体，避免产生其他非中和性抗体，从而避免潜在的ADE风险，同时避免大量非中和抗体生成所导致过度“免疫消耗”；同时本发明设计和制备所需时间很短，生产简便，可以在新冠病毒，变异新冠病毒，或其他类似病毒发生流行后第一时间内生产和使用；在短时间内达到群体免疫的目的。
Description
技术领域
本发明涉及预防性疫苗领域，具体涉及一种基于新型冠状病毒S蛋白RBD区域内及附近区域主要中和抗原表位构建的多价融合蛋白疫苗领域。
背景技术
2020年初被发现的新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus 2，SARS-CoV-2）目前已经在全球流行，到目前为止造成全球上千万人感染，一百多万人死亡。在各种药物试验失败后，预防性疫苗成为通过“群体免疫”阻止病毒流行，保证人民身体健康的主要工具。
到2020年底，数种疫苗如灭活疫苗、病毒载体疫苗以及核酸疫苗，通过紧急使用授权在全球开始普遍接种。 而更多的疫苗，包括重组疫苗等仍在临床评估中。 在已经批准的疫苗中，灭活疫苗虽然技术成熟，生产过程所需要的细胞培养，以及所要求的高度生物安全性导致生产周期较长，成本较高。因此在新冠病毒流行时很难以最快速度满足全面免疫接种需求。而核酸疫苗虽然是一种新型快速疫苗技术，但是在新冠疫苗之前，并无任何成功案例。目前临床发现的严重副作用对于这类技术是否可以今后在预防性疫苗中应用造成一定的影响。同时这类疫苗在生产、保存和运输中的诸多困难也很难在短期内解决。病毒载体疫苗（主要是各类腺病毒载体疫苗）在这次新冠疫苗研发中表现一般，其中已知的问题如同“预存免疫”和ADE等问题还有待观察。
预防性疫苗从上世纪20年代开始进入快速发展期。早期疫苗主要是减毒病毒和灭活病毒。随着基因技术的发展，疫苗研究也进入精准分子阶段。新型疫苗技术包括重组蛋白技术和核酸技术，这类技术集中在病毒致病关键蛋白上而并非全病毒。这类技术大大降低了疫苗研发和生产的困难，同时提高了关键抗病毒“中和抗体”在总抗体中的比例。在新冠病毒中，其表面S蛋白对于病毒入侵细胞起着关键作用，而在S蛋白中负责与其受体ACE2结合的部分为约200个氨基酸长度的RBD区域。尽管RBD区域是病毒入侵的主要部位，从抗原性来看，在这一片段中也仅仅有数个片段具有强烈的抗原性。这些片段被称为“抗原表位”。这些表位可以被感染者的HLA所结合和递呈，最终导致特异性的抗病毒抗体和T细胞。因此通过选择和优化这类“抗原表位”可以设计成具有强烈“中和”特异性的抗病毒疫苗。
基于“病毒抗原表位”的疫苗可以采用不同的技术，包括合成多肽和核酸。由于合成或表达的多肽相对于全蛋白或者全病毒要小很多，并不有利于巨噬细胞等对抗原的吞噬和处理。解决问题的方法之一是将所设计的“抗原表位”组成融合蛋白来增加抗原的尺寸。融合蛋白还可以进一步通过多次序列重复，在增加抗原尺寸的同时增强疫苗的抗原性。而由于抗原表位长度一般不超过２０个氨基酸，融合蛋白不但可以包括多个抗原表位，同时也可以包括同一抗原表位的不同变异序列。从而大大扩大了疫苗抗不同病毒，尤其是新型变异病毒的广谱性。这一点是灭活病毒和重组疫苗难以实现的。
发明内容
本发明的目的：通过有选择性地选择关键抗原表位作为免疫原，可以精准产生具有中和性的抗体，避免产生其他非中和性抗体，从而避免潜在的ADE风险，同时避免大量非中和抗体生成所导致过度“免疫消耗”。
本发明的一种基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗，其特征在于：将多肽1至多肽8用(GGGGS)3序列作为融合蛋白接头序列依次以链接构建融合抗原表位蛋白，多肽序列信息如下：
多肽1：序列信息：QDLFLPFFSNVTWFH（52）；
多肽2：序列信息：DGVYFASTEKSNIIR（88）；
多肽3：序列信息：RGWIFGTTLDSKTQS（102）；
多肽4：序列信息：TRFQTLLALHRSYLT（236）；
多肽5：序列信息：TRFASVYAWNRKRIS（345）；
多肽6：序列信息：VLSFELLHAPATVCG（512）；
多肽7：序列信息：PKKSTNLVKNKCVNF（527）；
多肽8：序列信息：KYFKNHTSPDVDLGD（1154）。
所述的融合抗原表位序列的链接方式为线性连接。
所述的连接肽序列中还包括特异性细胞内蛋白酶切点。
所述的融合蛋白C端带有Poly-His Tag。
疫苗制备方法：抗原表位的筛选集中于S蛋白的RBD区域。在必要时也包括RBD临近区域。目的是要集中产生竞争性或非竞争性中和抗体，以达直接干预病毒感染细胞的目的。
在经过计算机筛选后的多个抗原表位中出亲和力较强（Kd<100nM），同时具有较广泛人类HLA亚型结合能力的序列的8条符合要求抗原表位。其对应多肽序列信息如下:
多肽1：序列信息：QDLFLPFFSNVTWFH（52）；
多肽2：序列信息：DGVYFASTEKSNIIR（88）；
多肽3：序列信息：RGWIFGTTLDSKTQS（102）；
多肽4：序列信息：TRFQTLLALHRSYLT（236）；
多肽5：序列信息：TRFASVYAWNRKRIS（345）；
多肽6：序列信息：VLSFELLHAPATVCG（512）；
多肽7：序列信息：PKKSTNLVKNKCVNF（527）；
多肽8：序列信息：KYFKNHTSPDVDLGD（1154）。
2）融合蛋白的构建
将候选抗原表位的以一定的链接方式构建成融合抗原表位蛋白。融合抗原表位序列的链接方式为线性连接，连接时需要设计合适的融合蛋白接头序列（Linker）,Linker的长度一般不应小于3.5 nm , 这是由于相邻肽键的距离为0.38 nm, 因此连接肽至少应包含8-10个氨基酸。例如：GGGGS３序列．该序列在实验中表现出较高的复性效率，这可能是因为GGGGS３连接肽较长且结构柔软, 在复性时能够降低融合蛋白的抗原多肽之间的空间位阻, 从而更有利于排除融合蛋白各个结构域的干扰。所采用的接头序列中也可以包括特异性细胞内蛋白酶切点，如Tripsin，TMPRSS2等，以保证不同抗原表位切割后的完整性。融合蛋白序列中也可以包括“多肽标记＂（Tag），如Poly-His，或者生物素以便纯化和检测。
在本发明的一个实施方案中，我们采用(GGGGS)3序列作为融合蛋白接头序列（Linker）。融合蛋白C端带有Poly-His Tag。
3）佐剂
在动物免疫中，研究人员多采用佐剂包括常规铝佐剂、弗氏佐剂等作为疫苗佐剂。近年来，由于这类铝佐剂的潜在毒性和副作用，在人用疫苗中已经很少使用。而非铝佐剂，如MF59, AS01, AS04, CpG 和ISA51等则获得更大的发展和应用。这类佐剂均可以用于本品。
由于常用佐剂主要激活Ｂ细胞以产生抗体，对于刺激T细胞作用不强，疫苗中也可以加入T细胞免疫刺激佐剂，如包括但不限于Poly-ICLC, 以及脂类佐剂等。
本发明在动物实中开展试验，所采用的佐剂为B细胞佐剂。
4）动物免疫
因为新冠病毒对于试验动物均为“外源性抗原”。因此采用小鼠、大鼠、兔等都可以导致抗“新冠抗原”抗血清。在我们实验中，小鼠和兔均产生了抗抗原抗体。而为了收集和纯化抗体，主要试验在兔中进行。
5）免疫检测
本试验结果通过Elisa，新冠抗体特异性金标试剂，以及PRNT假病毒中和试验加以认证。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过实验发现，将数个“病毒抗原表位”构建表达的融合蛋白能够引起新西兰大白兔特异性抗体的产生，对新型冠装病毒S蛋白具有特异性中和作用。为后期研发新型冠状病毒重组蛋白疫苗提供了实验基础。同时由于抗原表位融合抗原的设计和制备都非常简单，可以提供一种快速设计、制备的方法。
附图说明
图1 Western blot检测重组融合蛋白载体在大肠杆菌细胞中的表达。载体转化大肠杆菌，利用抗HIS抗体检测外源基因表达。pET-28a(+)空载作为阴性对照。
图2 兔免疫后血清抗体ELISA检测结果,其中（-）代表未免疫兔血清，1:多肽1单独合成多肽，2:多肽2单独合成多肽，3:多肽3单独合成多肽，4:单独多肽4合成多肽，5:多肽5单独合成多肽，6:多肽6单独合成多肽，7:多肽7单独合成多肽，8：多肽8单独合成多肽，COV-19:融合蛋白。
图3胶体金检测试纸检测新冠病毒S蛋白结合实验结果。
图4刺突蛋白（S蛋白）与不同HLA II 亚型AFFINITY扫描图。
表1 不同突变类型假病毒中和实验结果。
具体实施方式
１）抗原分析方法
1.根据NCBI（https://www .ncbi .nlm .nih .gov）中提供的SARS-CoV-2不同病毒株的S蛋白RBD及N蛋白部分序列，使用NetMHCpan 4.1、IEDB等分析软件按照一定的多肽长度对其与人的不同HLA II亚型的亲和力进行分析，按照其亲和力的大小进行初步排序（如图4所示）；
2.筛选出亲和力较强（Kd<100nM）的候选多肽系列,按照本公司内部算法，筛选出8条符合要求的多肽，作为候选多肽。多肽序列信息如下:
多肽1：序列信息：QDLFLPFFSNVTWFH（52）；
多肽2：序列信息：DGVYFASTEKSNIIR（88）；
多肽3：序列信息：RGWIFGTTLDSKTQS（102）；
多肽4：序列信息：TRFQTLLALHRSYLT（236）；
多肽5：序列信息：TRFASVYAWNRKRIS（345）；
多肽6：序列信息：VLSFELLHAPATVCG（512）；
多肽7：序列信息：PKKSTNLVKNKCVNF（527）；
多肽8：序列信息：KYFKNHTSPDVDLGD（1154）。
２）融合蛋白制备
2.1.表达载体的构建
将以上8条多肽基因用(GGGGS)3序列作为融合蛋白接头序列进行适当排序设计成融合蛋白基因PET28a（+）-COV19，按照大肠杆菌密码子偏好优化后由苏州金唯智进行合成，构建于质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点间，经测序鉴定后备用，序列表如下：MQDLFLPFFSNVTWFHGGGGSGGGGSGGGGSDGVYFASTEKSNIIRGGGGSGGGGSGGGGSRGWIFGTTLDSKTQSGGGGSGGGGSGGGGSTRFQTLLALHRSYLTGGGGSGGGGSGGGGSTRFASVYAWNRKRISGGGGSGGGGSGGGGSVLSFELLHAPATVCGGGGGSGGGGSGGGGSPKKSTNLVKNKCVNFGGGGSGGGGSGGGGSKYFKNHTSPDVDLGDHHHHHH。
2.2.转化
取100µL大肠杆菌感受态BL21，加入20µL质粒载体PET28a（+）-COV19（20ng/µL）。冰浴40min后，42℃水浴热激90s，马上放回冰上，冰浴3min加入100µL 不含卡那霉素的LB液体培养基，37℃水浴45min。用接种环蘸取少许菌液在含100µg/mL卡那霉素的LB固体培养基上划线，待干燥后，37℃倒置培养过夜。
2.3诱导分泌表达
用接种环挑取单菌落至3mLTB培养基，37℃，250rpm，培养3小时。取1mL活化的含载体PET28a（+）-COV19的BL21重组菌株，接种到100mL含100µg/mL,卡那霉素的新鲜TB培养基中，37℃，250rpm，培养3小时。取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加IPTG（0.22µm过滤除菌）使最终浓度为0.1mmol/L，然后20℃继续培养16小时。10000转离心15分钟，分离收集上清液。沉淀加0.3mL的20mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0），超声波功率40%，超声6秒暂停9秒，超声1小时，冰上操作。10000转离心30分钟离心，分离并收集上清液。沉淀中加30mL的20mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）8M 尿素，获得溶液。通过Western- Blot的方法，用His抗体检测外源基因表达。经鉴定，该融合蛋白在重组菌株裂解液上清中成功表达(见图1）。
2.4 纯化
2.4.1柱子制备
轻轻颠倒翻转瓶子几次，使介质混合均匀；吸取10mL的介质加入到柱子中，让介质自由沉降，并放干储存液； 加入 4 倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析介质。
2.4.2柱子纯化
将COV19重组多肽裂解液上样至柱中，流速控制为 0.5‐1 ml/分钟，收集流出液以待后续分析； 以流速为 1 ml/分钟的洗涤缓冲液洗涤柱子以去除杂蛋白，一般用量为 8倍柱体积； 用 5‐10 倍柱体积的洗脱缓冲液以 0.5‐1 ml/分钟的流速洗脱，收集洗脱液。将目的蛋白透析到 20 mM Tris‐HCl（pH 8.0 ）或者 1 × PBS（pH 7.4） 中。经WesternBlot 检测蛋白纯化情况。
３）动物免疫
取1只雄性2月龄、体重1.5-2.0Kg的健康新西兰大白兔，取回后先适应性喂养一周。免疫前先于一侧耳缘抽取2ml静脉血，取血清做阴性对照。将融合蛋白按150-250ug/只，佐剂按1:1(v:v)比例将融合蛋白与弗氏佐剂进行充分混匀后于第一周皮下注射免疫1次，间隔两周之后每隔一周用弗氏不完全佐剂加融合蛋白，同样剂量继续免疫三次。第36天，心脏采血30ml，4℃静置取血清。
４）Elisa检测（如图2所示）
抗原包被：96孔酶标板，50ul ，5ug/ml的多肽，封膜，4℃过夜；
洗涤：甩去抗原包被液，在吸水纸轻拍掉残留包被液，250ul/孔 PBS缓冲液洗涤三次；
封闭：每孔加260ul 1%bsa-pbs，封膜，室温放置1h；
吸取过夜新西兰大白兔血清按1：500 进行稀释，250ul/孔， PBS缓冲液洗涤三次，每孔加入稀释血清100ul，封膜，37℃放置1h；
重复洗涤步骤（2）；
二抗孵育：加入HRP标记羊抗兔二抗，100ul/孔，封膜，37℃放置1h
重复洗涤步骤（2）；
每孔加100ul 显色液 ，室温避光反应15min后，每孔加50ul终止液，450nm测定吸光度。
经免疫后的新西兰大白兔较未免疫之前产生了明显的特异性抗体，与融合蛋白抗原有明显特异性结合，同时将抗体分别与八种多肽进行ELISA检测，发现都有强弱不等的特异性结合，说明免疫后新西兰白兔产生了针对这八种特异性抗原表位的抗体，抗体滴度约为1:2500。
５）新冠病毒S蛋白结合实验（如图3所示）
我们采用了新型冠状病毒抗体检测试纸（胶体金法）进行了抗体结合S蛋白的检测，操作按说明书进行：
1、将纯化后的抗体样本用稀释液按1：1000稀释比例稀释。
2、将试纸条及待测的样本恢复至室温（20-30℃）。
3、从原包装中取出试剂卡，往试剂卡的加样孔中滴加2-3滴经稀释的样本。
4、15分钟内观察并记录实验结果。
经检测，在试纸卡检测线和质控对照线处出现两条紫红色条带。结果表明：标本中含有新型冠状病毒S蛋白特异性抗体。
６）假病毒中和实验
抗体的病毒中和作用采用了中检院研发的假病毒感染试验方法。假病毒表面带有新冠病毒S蛋白，可以通过类似新冠病毒感染的类似机制感染试验细胞。感染情况可以通过检测病毒携带的荧素酶的活性来判定。中和抗体抑制加病毒感染的效率可以通过50%抑制性浓度（EC50）定义。具体方法如下：
假病毒与试验样品的连续稀释液（以3倍逐步方式稀释6次）在37℃下一起培养1小时。实验中还包括病毒对照和细胞对照共六孔。然后，试验细胞被添加到每个孔中。在37°C、5%CO2环境中培养24小时后，测量发光度。结果采用GraphPad Prism 8（GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）计算EC50值。具体情况如下表：
| ID50 | |
| WH-1 | 3 ug/mL |
| D614G | >6 ug/mL |
| N501Y | >6 ug/mL |
| K417N | >6 ug/mL |
| E484K | >6 ug/mL |
| 南非 | >6 ug/mL |
| B117 | >6 ug/mL |
由于本疫苗的设计基于原始病毒序列，因此没有包括后期发现的集中变异病毒的关键抗原部， 如N501Y（英国变异病毒株）， K417T, E484K（南非变异病毒株），L452R（美国变异病毒株）中的特异性抗原表位。因此通过实验发现，本疫苗所诱发的抗体抗原始病毒株感染作用明显强过抗其他变异病毒株的作用。这一结果符合目前世界各地发现的情况。
本发明提供了一种基于包括新冠病毒S病毒，尤其是其中RBD区域的抗原表位设计和表达的新冠抗原表位融合抗原制备的新冠疫苗。 通过集中选择S蛋白中，尤其是关键RBD区域中的抗原表位作为免疫原，可以精准产生具有病毒感染中和性的抗体，避免产生其他非中和性抗体，从而避免可能潜在的ADE风险，同时避免大量非中和抗体生成所导致过度“免疫消耗”。同时由于抗原表位融合抗原的设计和制备都非常简单，可以提供一种快速设计、制备的方法。
在实验中，免疫新西兰大白兔后产生了相应免疫反应。所产生的兔抗血清对新冠病毒S蛋白RBD部分表现出特异性结合。由此可以预计可以对新冠病毒侵入产生特异性中和作用。依据现有在动物体内的实验结果，可以预见此种融合蛋白在人体内也能以同样的机制来激活对新冠病毒所表达抗原的特异性免疫反应，为进一步研制成人新型冠状病毒预防性疫苗奠定了坚实的基础。
由于基于病毒抗原表位的疫苗设计、表达、测试和使用都非常快捷和简便，在病毒发生关键性变异，如S1区和RBD区的变异时，可以在最短时间改变疫苗中抗原表位的组成，以最低生产成本生产针对变异病毒，包括多价变异病毒的有效疫苗。这一特点是其他疫苗无法在短期内达到的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏健安生物科技有限公司
江苏欣生元生物科技有限公司
<120> 基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 1
Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 2
Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 3
Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 4
Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 5
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 6
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 7
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 8
Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1 5 10 15
<210> 9
<211> 232
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)
<400> 9
Met Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
20 25 30
Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Trp
50 55 60
Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Arg Phe Gln Thr
85 90 95
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
115 120 125
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
145 150 155 160
Pro Ala Thr Val Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
180 185 190
Cys Val Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu
210 215 220
Gly Asp His His His His His His
225 230
Claims (5)
1.一种基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗，其特征在于：将多肽1至多肽8用(GGGGS)3序列作为融合蛋白接头序列依次链接构建融合抗原表位蛋白，多肽1至多肽8序列信息如下：
多肽1：序列信息：QDLFLPFFSNVTWFH（52）；
多肽2：序列信息：DGVYFASTEKSNIIR（88）；
多肽3：序列信息：RGWIFGTTLDSKTQS（102）；
多肽4：序列信息：TRFQTLLALHRSYLT（236）；
多肽5：序列信息：TRFASVYAWNRKRIS（345）；
多肽6：序列信息：VLSFELLHAPATVCG（512）；
多肽7：序列信息：PKKSTNLVKNKCVNF（527）；
多肽8：序列信息：KYFKNHTSPDVDLGD（1154）。
2.根据权利要求1所述的基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗，其特征在于：所述的融合抗原表位序列的链接方式为线性连接。
3.根据权利要求2所述的基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗，其特征在于：所述的连接肽序列中还包括特异性细胞内蛋白酶切点。
4.根据权利要求1所述的基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗，其特征在于：所述的融合蛋白C端带有可酶切Poly-His Tag。
5.一种基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）抗原表位分析和优选：筛选出的出亲和力较强即Kd<100nM，同时具有较广泛人类HLA亚型结合能力的序列的8条符合要求抗原表位；其对应多肽序列信息如下:
多肽1：序列信息：QDLFLPFFSNVTWFH（52）；
多肽2：序列信息：DGVYFASTEKSNIIR（88）；
多肽3：序列信息：RGWIFGTTLDSKTQS（102）；
多肽4：序列信息：TRFQTLLALHRSYLT（236）；
多肽5：序列信息：TRFASVYAWNRKRIS（345）；
多肽6：序列信息：VLSFELLHAPATVCG（512）；
多肽7：序列信息：PKKSTNLVKNKCVNF（527）；
多肽8：序列信息：KYFKNHTSPDVDLGD（1154）；
（2）融合蛋白的构建：将（1）多肽用(GGGGS)3序列作为融合蛋白接头序列依次以链接方式构建成融合抗原表位蛋白，蛋白序列如下:MQDLFLPFFSNVTWFHGGGGSGGGGSGGGGSDGVYFASTEKSNIIRGGGGSGGGGSGGGGSRGWIFGTTLDSKTQSGGGGSGGGGSGGGGSTRFQTLLALHRSYLTGGGGSGGGGSGGGGSTRFASVYAWNRKRISGGGGSGGGGSGGGGSVLSFELLHAPATVCGGGGGSGGGGSGGGGSPKKSTNLVKNKCVNFGGGGSGGGGSGGGGSKYFKNHTSPDVDLGDHHHHHH。
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