CN115850398B - 新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子免疫学领域，具体提供了一种新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物及其应用。该新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物由以下10种多肽的一种或几种组成，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，本发明还提供了一种多肽组合物的制备方法和应用。本发明的多肽组合物可形成二硫键，符合病毒的天然结构，增加免疫原性，且更易于人工合成、加工和保存；本发明的多肽仅化学合成，不和载体蛋白偶联，在小鼠体内能产生较高有效中和效价。

Description

新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物及其应用

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属冠状病毒家族成员，它具有四个结构蛋白：S蛋白、N蛋白、M蛋白、E蛋白，其中成熟的S蛋白以三聚体形式表达在病毒包膜上。根据生物信息学的分析，S蛋白可以分为两个亚基S1(1-685aa)和S2(686-1273aa)亚基，在病毒感染宿主细胞过程中，位于S1亚基内RBD(Receptor binding domain)(330-583aa)结合ACE2受体，并在受体的诱导下发生构象的变化，导致S1结构域的融合肽暴露，最终促使病毒包膜和细胞膜的融合。据研究报道，在大部分新冠病毒感染者或者康复者体内都可以发现靶向新冠病毒S蛋白RBD结构域的中和抗体，然而SARS-CoV-2病毒仍处于不断变异中，使得某些中和抗体失效，而且使得部分疫苗的保护效力下降。

传播力和免疫逃逸能力都增强的新型冠状病毒奥密克戎(Omicron)变异株，已经成为全球流行的绝对优势基因型。随着新冠病毒在人群的持续流行传播，将来是否会出现同时具备免疫逃逸能力增强，并且致病力没有降低或增强的变异株病毒难以预警，必须做好疫苗技术储备，现阶段我国急需研制新一代的通用治疗性和预防性疫苗，来应对将来可能出现的致病力增强的变异株。因此需要一种及时有效，成本较低的疫苗可以在未来变异株刚出现的时候便进行快速设计和生产制备，达到及时有效对抗变异株的作用。

多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。由于完全是合成的，不存在毒力回升或灭活不全的问题，特别适合一些还不能通过体外培养方式获得足够量的抗原的微生物病原体，且选择特异性的表位可以避免整个蛋白产生的自身免疫反应。但是同样也存在一些技术瓶颈问题，其中最主要的问题就是多肽分子量小，免疫原性低、免疫应答效果较差。化学合成的线性B细胞表位通常不能引起较高中和抗体，其通常与载体偶联或以其他方式修饰以提高构象稳定性以增强其免疫原性。但是某些情况下，高功能线性表位可以折叠成三维结构，能够诱导对线性和构象结构的有效中和抗体反应，这类B细胞表位是当前研究的目标。专利申请CN114276422A公开了一种新型冠状病毒S蛋白多肽抗原及其应用，多肽能刺激产生S蛋白的结合抗体，也能刺激产生S蛋白RBD结构域的结合抗体，但需要与蛋白载体偶联，且抗体结合效价仅达10⁴，其多肽序列的481-482aa分别为天冬氨酸(Asn，N)和谷氨酸(Glu，G)，这在蛋白药物的生产和储存过程中，Asn的侧链容易存在脱酰胺的现象，而脱酰胺可能会导致蛋白结构发生改变、引起蛋白的聚集从而降低免疫原性。

所以当前急需一种不需要与载体蛋白偶联，可以产生功能性构象结果，且仅利用化学合成方式便能够产生较高抗体效价并且能够增加多肽免疫原性的奥密克戎系列变异株的多肽组合物。

发明内容

本发明的术语和声明：

1、如本文所用，冠词"一个"、"一种"和"所述"：除非以其它方式明确地限定到一个(种)对象，否则包括复数的对象。

2、如本文所用，数值范围：除非以其他方式明确指出，本文中公开的所有范围或比率将会被理解为包括其中包含的任何和所有的子范围或子比率。例如，声明的1至30的范围或比率应当被认为包含在最小值1和最大值30之间，并且包括断端点在内的任何子范围或子比率、整数、小数或由整数或小数构成的子范围或子比率。

3、如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“具有”、“可以”、“含有”及其变化形式的意义是不排除另外组成或结构的可能性的开放式连接词语或术语。

4、如本文所述，术语“抗原”或“免疫原性物质”指由接种目标的免疫系统识别且诱导免疫反应的物质。

5、如本文所述，术语“疫苗”指在药学上可接受的载体中(例如佐剂)包含抗原或免疫原性物质的组合物。

6、如本文所用，术语“氨基酸”：是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一，或人工合成的氨基酸之一。

为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物及其应用，该多肽可通过形成二硫键使得部分肽段展示为构象表位，增加多肽的免疫原性，并且可在仅化学合成不和载体蛋白偶联的情况下，产生较高抗体效价。未来若产生新的流行变异株，可以针对其氨基酸突变进行快速合成。

本发明具体的技术方案如下：

本发明提供了一种新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的多肽组合物，由以下10种多肽的一种或几种组成，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10所示的核苷酸序列。

具体地，所述10种多肽的氨基酸序列如表1所示；

表1

优选地，所述奥密克戎系列变异株包括BA.1、BA.2、BA.4、BA.5、BA.2.75和BA.2.12.1中的一种或多种。

优选地，所述的多肽为环肽。

具体地，所述的环肽是人工合成的多肽，通过形成二硫键使得肽段展示为与RBD天然结构相同的构象表位，增加多肽的免疫原性。

优选地，所述的多肽不与载体蛋白偶联，不利用化学键修饰。

本发明还提供了一种疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物，所述疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物包含上述的多肽组合物以及任选的免疫学或药学上可接受的佐剂。

优选地，所述的佐剂为氢氧化铝，磷酸铝、硫酸铝、铵明矾、钾明矾、MF59、AS04、AS03、AS01、CpG1018、CpG-ODN、Matrix-M中的一种或多种。

进一步优选地，所述的佐剂为磷酸铝、CpG-ODN、氢氧化铝中的一种或多种。

最优选地，所述的佐剂为磷酸铝、CpG-ODN。

优选地，所述的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物是预防或治疗新型冠状病毒奥密克戎系列变异株感染的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物。

本发明还提供了一种上述多肽组合物的制备方法，通过新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的S蛋白RBD区段的446aa-488aa设计制备的多肽组合物。

具体地，通过新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的S蛋白RBD区段的480aa和488aa的两个半胱氨酸Cys形成链内二硫键设计制备的多肽组合物。

优选地，通过新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的S蛋白RBD区段的481aa-482aa设计制备的多肽组合物。

具体地，SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10根据新型冠状病毒奥密克戎系列变异株的S蛋白RBD区段的天然氨基酸481aa的天冬氨酸(Asn，N)和482aa的谷氨酸(Glu，G)，修饰为482aa为缬氨酸(Val，V)，避免天冬酰胺(Asn,N)的侧链为谷氨酸(Glu，G)时带来的脱酰胺现象。

本发明还提供了一种上述的多肽组合物或上述的制备方法制备得到的多肽组合物在制备提高预防或治疗新型冠状病毒奥密克戎系列变异株感染的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物效果的制剂中的应用。

优选地，所述的制剂为任何药学上可接受的剂量。

优选地，所述的制剂为任何药学上可接受的剂型。

本发明具有的有益效果如下：

1.本发明根据新型冠状病毒奥密克戎系列变异株BA.1、BA.2、BA.4、BA.5、BA.2.75和BA.2.12.1的S蛋白RBD区段，设计了十条针对每条变异株的多肽，可以产生有效保护性中和抗体；

2.本发明的多肽序列可在天然条件下形成链内二硫键，使得部分肽段展示为构象表位，增加了多肽的免疫原性；并且在人工合成多肽过程中，可使得B细胞环肽表位构象与病毒刺突蛋白的RBD区段天然环状构象相同；

3.本发明根据病毒的天然突变情况，SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10的481aa的天冬氨酸(Asn，N)和482aa的谷氨酸(Glu，G)，修饰为482aa为缬氨酸(Val，V)，避免天冬酰胺(Asn,N)的侧链为谷氨酸(Glu，G)时带来的脱酰胺现象，具有较良好的免疫原性，且更易于人工合成、加工和保存；

4.本发明多肽仅化学合成，不和载体蛋白偶联，能够使动物(小鼠)体内针对奥密克戎(Omicron)系列变异株活病毒产生最高1:512的中和效价。

附图说明

图1为实施例2中多肽结合抗体最终效价图；

图2为实施例2中RBD蛋白结合抗体最终效价图；

图3为实施例3中活病毒中和抗体滴度结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

本发明对所采用原料的来源不作限定，如无特殊说明，本发明所采用的原料均为本技术领域普通市售品。

RBD蛋白购自SinoBiological，China，货号40592-V08H121-100；

ELISA包被缓冲液购自上海源叶生物科技有限公司，货号R20934；

PBST(ELISA清洗液)购自上海源叶生物科技有限公司，货号R40025；

辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗鼠二抗购自中杉金桥，货号ZB-2305；3,30,5,50-四甲基二盐酸盐单组分TMB显色液购自Solarbio，货号PR1200。

实施例1目标多肽的合成

本实施例为体外人工合成目标多肽，具体步骤如下：

A、去保护(N端Fmoc保护基团的去除)，并通过pH测试验证Fmoc脱保护后过量哌啶的去除；使用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，使用茚三酮和氯苯胺法监测受保护的肽-树脂前体期间偶联反应的完成情况；下一种氨基酸衍生物的偶联(缩合)；使用DMF洗涤。

肽的合成从C端到N端重复这个循环过程，直到每条多肽合成完毕。该过程中使用的所有氨基酸衍生物都优先采用药用辅料或食品级原料。

B、用裂解混合液方法三氟乙酸(TFA)、水和二硫苏糖醇(DTT)处理树脂上的保护肽，将粗肽从树脂中分离出来。用高效液相色谱法(HPLC)测定肽粗品的纯度应，LC-MS(液相色谱-质谱联用仪)测定肽粗品的同源性。

C、用反向高效液相色谱柱采用TFA(三氟乙酸)对肽初纯。用RP-HPLC检测，纯度应≥90％。

D、用反向高效液相色谱柱采用HOAc(冰醋酸)对肽精纯。用RP-HPLC检测，纯度应≥95％，除非已鉴别，否则不得有≥3％的单一杂质。

E、冻干：用0.2μm除菌滤器过滤后冻干，即可得到原料药的醋酸盐。

委托北京百肽生物科技有限公司和杭州丹港生物科技有限公司通过人工合成SEQID NO：1到SEQ ID NO：10这10条抗原多肽，多肽序列如下：

SEQ ID NO：1为SGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNC；

SEQ ID NO：2为GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNC；

SEQ ID NO：3为GGNYNYQYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNC；

SEQ ID NO：4为GGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNC；

SEQ ID NO：5为SGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNC；

SEQ ID NO：6为SGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNVVAGFNC；

SEQ ID NO：7为GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNVVAGFNC；

SEQ ID NO：8为GGNYNYQYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNVVAGFNC；

SEQ ID NO：9为GGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNVVAGVNC；SEQ ID NO：10为SGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNVVAGFNC。

实施例2酶联免疫吸附测定实验

将100μg单条多肽与40μg CpG-ODN佐剂和磷酸铝佐剂(铝含量100μg)混合，在0和21天免疫C57BL/6J小鼠两次，第二次免疫后的14天安乐死小鼠并收集小鼠血清。用含针对不同变异株的每条多肽(2μg/mL，100μL/孔)或RBD蛋白(1μg/mL，100μL/孔)的ELISA包被缓冲液500mL 4℃过夜。用PBST(含0.05％吐温20)1000mL，洗板4次，然后用2％牛血清白蛋白(BSA)在室温(RT)下封闭1h。

对于多肽和RBD，将血清从1:100连续稀释5倍。分别加入各孔中(100μL/孔)，室温孵育1h。再次清洗平板，然后用1:5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗鼠二抗，室温孵育1小时。加入3,30,5,50-四甲基二盐酸盐(TMB,Solarbio)底物20min后用2M盐酸终止反应，用酶板在450nm处测定吸光度。当OD₄₅₀值大于或等于阴性小鼠血清OD₄₅₀值的2.1倍时，认为该值为阳性。

对所得结果进行logistic曲线四参数拟合，进行最高抗体结合效价的计算。结果如图1和图2所示，计算结果的血清对多肽和RBD蛋白最高抗体结合效价可达到10⁵。

实施例3活病毒中和实验

将100μg化学合成95％以上纯度的单条多肽与40μg CpG-ODN佐剂和氢氧化铝(铝含量100μg)佐剂混合，在0和21天免疫C57BL/6J小鼠两次，第二次免疫后的14天安乐死小鼠并收集小鼠血清。血清在56℃下加热30分钟进行灭活，然后使用96孔板将血清在细胞培养基中从1:4开始以2倍稀释进行连续稀释。将稀释的血清(50μL/孔)与含100病毒半数组织感染量(TCID50)的Omicron BA.1、BA.2、BA.4、BA.5、BA.2.75和BA.2.12.1的活病毒等体积溶液混合。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h后，向vero-E6(非洲绿猴肾)细胞(1×10⁴/100μL/孔)中加入血清和病毒。在显微镜下记录每个孔的细胞病变效应(CPE)之前，将感染细胞在37℃和5％CO₂条件下孵育4天。

中和滴度计算为Karber法中和50％病毒感染所需最大稀释度的对数。图3结果显示，多肽产生的中和抗体滴度最高可达1:512。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种SARS-CoV-2奥密克戎系列变异株的多肽组合物，其特征在于，由以下2种多肽的一种或两种组成，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6所示；所述奥密克戎系列变异株包括BA.1；所述的多肽为环肽。

2.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含权利要求1所述的多肽组合物以及任选的免疫学或药学上可接受的佐剂。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝，磷酸铝、硫酸铝、铵明矾、钾明矾、MF59、AS04、AS03、AS01、CpG1018、CpG-ODN、Matrix-M中的一种或多种。

4.一种权利要求1所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，通过SARS-CoV-2奥密克戎系列变异株BA.1的S蛋白RBD区段的446aa-488aa设计制备所述的多肽组合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体地，通过SARS-CoV-2奥密克戎系列变异株BA.1的S蛋白RBD区段的480aa和488aa的两个半胱氨酸Cys形成链内二硫键设计制备所述的多肽组合物。

6.权利要求1所述的多肽组合物或权利要求4-5任一项所述的制备方法制备得到的多肽组合物在制备提高预防或治疗SARS-CoV-2奥密克戎系列变异株BA.1感染的疫苗组合物效果的制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂为任何药学上可接受的剂量。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂为任何药学上可接受的剂型。

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