CN103760351A - 一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素d的双抗体夹心法 - Google Patents

Abstract

一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明应用购于北京军事医学科学院的重组金黄色葡萄球菌肠毒素D（SED）免疫8周龄BALB/c小鼠，经正常的免疫、细胞融合、筛选后得到10株SED单克隆抗体。10株抗体分别标记辣根过氧化物酶并进行两两配对。最后选定以5F2（CGMCC No.7212）、10F1（CGMCC No.7213）分别为包被抗体和酶标抗体，以SED为标准品建立了SED的双抗体夹心法。LOD为0.006ng/mL，线性范围0.02-2.5ng/mL。本发明采用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，与金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E无交叉反应，为食品中SED的检测提供了快速高效的分析手段。

Description

一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法

技术领域

本发明涉及了一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，虽然近年来不断有新型的金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE）被发现，但肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。从生牛乳、生肉及乳酪中分离的金黄色葡萄球菌以产生D型肠毒素为主。

在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100℃ 30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。

近年来，ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于肠毒素的检测，虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用价值。

发明内容

(一)要解决的技术问题

  本发明的目的在于提供一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中SED的批量、快速检测。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D（SED）的双抗体夹心法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用重组SED经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到0.006ng/mL，R²为0.992。

本发明方法的检测分析原理是：

酶标板上包被了包被抗体5F2，即CGMCC No.7212，合适的浓度下可以最大限度捕获SED；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体10F1-HRP，即CGMCC No.7213-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色15min。如果样品中SED浓度≥0.02ng/mL，那么样品中SED被包被抗体捕获并与酶标抗体10F1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；如果样品中SED浓度＜0.02ng/mL，那么样品中SED不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

（1）SED单克隆抗体的制备

     以重组表达的SED（北京军事医学科学院提供）为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度30ng/mL标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释800倍使用；在此条件下，实验成功得到了11对P/N值>10的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限最稳定的配对，即以5F2为包被抗体，以10F1作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：1μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：0.01M、pH7.2 的PBS，

检测抗体浓度：1μg/mL，

反应时间：包被、封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色15min；

优化后SED夹心法，LOD：0.006ng/mL，检测限0.02ng/mL。

 (三)有益效果

本发明提供的检测金黄色葡萄球菌肠毒素SED双抗体夹心法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏

1、一株单克隆细胞株，细胞株12号，株号为5F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC No. 7212，保藏曰期为2013年1月23日。

2、一株单克隆细胞株，细胞株13号，株号为10F1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC No. 7213，保藏曰期为2013年1月23日。

附图说明

图1  金黄色葡萄球菌肠毒素SED双抗体夹心法的标准曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；

KFLOW纯水机，凯佛隆公司；                                                    

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂；                                         

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司；

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司；

可调试移液器，Thermo Labsystems公司；

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂；

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司；

其他试剂均为分析纯试剂；

三、步骤

1、单克隆抗体的制备

1)实验动物：选5只8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；

2)抗原配置：将免疫原用生理盐水稀释，配成1mg/mL的溶液；

3)乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；

免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；

4)采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；

5)融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；

6)抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；

2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用；

3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

4)每孔加入100 μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h后洗涤、拍干；

5)每孔加入100 μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15 min，取出后每孔加入50 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

金黄色葡萄球菌肠毒素D双抗体夹心法测定步骤：

a、包被:用1μg/mL的5F2包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL /孔，然后甩干反应板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS；

c、封闭:含0.2%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤:同b；

e、样品:用PBS将SED母液稀释成0.01953，0.03976，0.07812，0.1563，0.3125，0.625，1.25，2.5ng/mL系列浓度，另设一个PBS空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体(10F1-HRP，1μg/mL), 100μL /孔，37℃反应1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加显色液 100μL /孔，显色15min；

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用；

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水；

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm，绘制SED双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD₄₅₀nm值对应求得样品中SED含量。

3、交叉率的测定

将金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE母液精确稀释成10μg/mL、100ng/mL，在建立的SED双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔，每个浓度做6次，测定平均值，做3次重复实验；

试验结果如下：

1、标准曲线：本实验所获得的抗原检测的线性范围是为0.02～2.5ng/mL，R²=0.992，具体请见说明书附图；

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的标准偏差对应的抗原浓度，SED双抗体夹心法LOD为0.006ng/mL；

3、交叉反应率(CR%)

结果：100ng/mL以下金黄色葡萄球菌肠毒素SED夹心法与肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE无交叉反应，特异性良好，在10μg/mL与SEE的交叉反应为0.06%。

Claims (2)

1.一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，其特征在于：酶标板上包被了包被抗体5F2，即CGMCC No.7212，合适的浓度下可以最大限度捕获SED；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体10F1-HRP，即CGMCC No.7213-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色15min；

样品中SED浓度≥0.02ng/mL，那么样品中SED被包被抗体捕获并与酶标抗体10F1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；

样品中SED浓度＜0.02ng/mL，那么样品中SED不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性；

（1）SED单克隆抗体的制备

     以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度30ng/mL标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释800倍使用；在此条件下，实验成功得到了11对P/N值>10的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限最稳定的配对，即以5F2为包被抗体，以10F1作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：1μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：0.01M、pH7.2 的PBS，

检测抗体浓度：1μg/mL，

反应时间：包被、封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色15min；

优化后SED夹心法，LOD：0.006ng/mL，检测限0.02ng/mL。

2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，其特征在于：测定步骤为：

a、包被:用1μg/mL的5F2包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL /孔，然后甩干反应板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS；

c、封闭:含0.2%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤:同b；

e、样品:用PBS将SED母液稀释成0.01953，0.03976，0.07812，0.1563，0.3125，0.625，1.25，2.5ng/mL系列浓度，另设一个PBS空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；

f、洗涤：同b；

g、加1μg/mL的酶标抗体10F1-HRP，100μL /孔，37℃反应1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加显色液 100μL /孔，显色15min；

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用；

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水；

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm，绘制SED双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD₄₅₀nm值对应求得样品中SED含量。

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