CN101344482A - 复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，包括以下步骤：(1)选择基片并清洗，在其上自组装一层聚苯乙烯纳米球；(2)用制作的聚苯乙烯纳米球自组装层做模具，通过真空蒸镀的方式，在自组装层上蒸镀银、金两种金属膜；(3)通过Lift－off工艺去除聚苯乙烯纳米球自组装层，得到阵列化的金属纳米阵列结构；(4)在金属纳米层上采用非定向共价连接法进行活化，在金属纳米结构表面形成一层抗SE羊单克隆抗体IgG的生物分子膜；(5)采用光谱仪提取该结构的消光光谱，获得其生物结合前的消光谱峰值；(6)将基片表面滴上待测溶液，反应后吹干，并重复步骤(5)；(7)通过步骤(6)前后的消光谱峰值对比，确定待测溶液中是否含有SE；在本方法中，待测溶液不需要进行纯化和标记，可应用于对SE或同类型毒素的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法，特别涉及一种利用金属纳米结构的局域表面等离子体共振识别金黄色葡萄球菌肠毒素的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素，分子量25200～28300，具有极强的耐热性和抗药性，普通的加热方法并不能去除食物中的毒素，因此只能通过在食品控制环节中对其进行检测和控制。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有乳胶凝集法、酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链反应法(PCR)。双抗体夹心ELISA法是检测金黄色葡萄球菌肠毒素最常用的方法，在这种测定方法中有三个必要的试剂：(1)固相的抗原或抗体；(2)酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”(conjugate)；(3)酶反应的底物。ELISA法优点是操作简便、检测方法标准化，所需试剂易得，主要的缺点是需要根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，设计出各种不同类型的检测方法，这对快速检测来讲操作繁琐，且检测时间较长，需用试剂较多。目前商用的ELISA试剂盒4小时可检测出肠毒素，22小时可检测出金黄色葡萄球菌，检测水平普遍为1～20ng/mL。聚合酶链反应法反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，PCR反应检测SEB的关键因素主要有引物的选择与设计、酶的质量、模板的制备，其优点是对于活体和死体均能检测，能检测多个样品，缺点是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，导致结果的误判，此外还需使用扩增仪等专业仪器，给普及化的检验工作带来困难。目前PCR分析技术检测时间根据实验方法和对象在2～5小时不等，检测水平小于1ng/mL。
局域表面等离子体共振(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)，是单个金属纳米粒子或纳米结构在光的照射下，产生光吸收的现象，其本质为光激发的表面等离子体被局限在周期结构、胶体或其他纳米结构中，产生的局域光学模式导致粒子周围极高的局域电磁场，伴随着对光的强烈吸收及散射作用，这些增强场对局部环境的改变非常敏感，因而可以用于分子结合的探测。
目前局域表面等离子体共振无法应用于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测中，其主要原因是激发局域表面等离子体的金属纳米结构材料为银，在银结构表面无法形成对金黄色葡萄球菌肠毒素有效识别的生物分子膜。当金属纳米结构材料为金时，虽然可以形成有效的生物分子膜，但局域表面等离子体共振强度很弱，信号响应不明显。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有金黄色葡萄球菌肠毒素检测时间长的缺点，以及金属纳米结构材料的限制，在激发高强度局域表面等离子体共振的同时，对金黄色葡萄球菌肠毒素进行有效识别，进而利用光学信号实现对金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法；其特征在于步骤如下：
(1)选择基片，并清洗；在基片上自组装一层聚苯乙烯纳米球；
(2)用制作的聚苯乙烯纳米球自组装层做模具，采用真空蒸镀在纳米球自组装层上依次镀上均匀的金属银膜和金属金膜，此时纳米球的球与球之间的间隙会同时填充复合金属薄膜；
(3)通过Lift-off工艺去除聚苯乙烯纳米球自组装层，得到阵列化的复合金属纳米阵列结构；
(4)在复合金属纳米层上采用非定向共价连接法进行活化，在复合金属纳米结构表面形成一层抗金黄色葡萄球菌肠毒素羊单克隆抗体IgG的生物分子膜；
(5)采用光谱仪提取所得复合金属纳米结构的消光光谱，获得其生物结合前的消光谱峰值；
(6)将基片表面的复合金属纳米结构上滴待测溶液，待反应后吹干，并重复步骤(5)；
(7)通过步骤(6)前后的消光谱峰值对比，确定待测溶液中是否含有金黄色葡萄球菌肠毒素。
所述步骤(1)中选择的基片为玻璃基片。
所述步骤(1)中的聚苯乙烯纳米球直径为100nm～500nm。
所述步骤(2)中金属银和金的膜层总厚度为40～60nm。
所述步骤(4)中的在金属纳米结构表面形成的抗金黄色葡萄球菌肠毒素SE羊单克隆抗体IgG的生物分子膜为抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEA型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEB型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEC型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SED型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEE型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEF型；分别对应于金黄色葡萄球菌肠毒素A型、B型、C型、D型、E型、F型的检测。
步骤(4)中的采用非定向共价连接法对金属纳米阵列结构进行活化的过程，在纳米结构表面采用亚二硫基二乙酸与纳米结构表面反应并用氮气吹干，然后将浓度0.3-0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和浓度0.05-0.1M的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的等体积混合溶液与纳米结构表面反应25至30分钟并用氮气吹干，将抗SEB羊单克隆抗体IgG与纳米结构表面反应并用氮气吹干，最后用乙醇胺水溶液浸泡后，用氮气吹干备用。
所述步骤(6)中的反应时间为10～30分钟。
所述步骤(7)中将滴上待测溶液与未滴入待测溶液所提取的消光谱峰值对比，如果消光谱峰值位置差值大于等于5nm，即可确定待测溶液中含有金黄色葡萄球菌肠毒素，若消光谱峰值位置没有差异或者差异在5nm以内，则表明待测溶液中不含有金黄色葡萄球菌肠毒素。
本发明与现有技术相比主要具有以下优点：
(1)检测过程无需标记或前处理；传统检测技术通常需要对被检测物进行标记或者前处理，耗费时间长；本发明的检测方法无需标记，直接通过被检测物与配对抗体/抗原的生化结合反应，检测出溶液中是否含有该物质；
(2)被测溶液无需进行纯化；传统检测技术一般需要对浑浊的被测溶液进行分离，提取上清液；而本检测方法通过对光谱信号的读取，能够检测浑浊溶液中的目标物质；
(3)本方法中利用金/银双层的金属纳米结构，解决了金属银难以表面化学处理的问题，比现有以金属银作为纳米结构的LSPR传感有更多可选择的传感对象。
附图说明
图1为测试局域表面等离子体芯片消光谱系统图；
图2为利用聚苯乙烯纳米球自组装获得的纳米球结构的俯视图；
图3为通过Lift-off工艺处理后形成的纳米金属结构的俯视图；
图4为本发明所制得纳米结构阵列剖面示意图；
图5为本发明所制得芯片结合金黄色葡萄球菌肠毒素之前的消光谱曲线；
图6为本发明所制得芯片结合金黄色葡萄球菌肠毒素之后的消光谱曲线；
图7为本发明所制得芯片结合金黄色葡萄球菌肠毒素前后的消光谱曲线对比；
图中：1为玻璃基片，2为铬膜，3为金属银膜，4为金属金膜。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，而且通过以下实施例本领域的技术人员即可以实现本发明权利要求的全部内容。
下面通过本发明的方法制作纳米结构特征尺寸小于70纳米的局域表面等离子体共振成像纳米结构，并利用该结构实现化学表面处理和对浓度为0.1μg/ml的SEB溶液进行探测识别。
(1)将尺寸为10mm×10mm的玻璃基片1在使用前用新制备的Piranha溶液(3∶1硫酸∶30％过氧化氢)中在70℃温浴20min，去除表面杂质，之后用去离子水冲洗；待玻璃基片1自然晾干后，采用纳升级的移液器在玻璃基片1表面滴入聚苯乙烯纳米球(直径：400nm，浓度：质量比2％)水溶胶，单个微区的滴入量0.2微升，通过聚苯乙烯纳米球的自组装得到单层规则排布的纳米球结构，如图2所示；
(2)将已组装了单层聚苯乙烯纳米球结构的玻璃基片1低温干燥后，在高真空下通过电阻蒸发在纳米球结构表面先垂直蒸镀-层厚度为2nm的金属铬膜2，以增加金属膜层牢固度；然后再依次蒸镀一层金属银膜(银纯度99.99％，)和一层金属金膜(金纯度99.99％，)，其中银膜3厚度为50nm，金膜4厚度为10nm；此时纳米球的球与球之间的间隙会同时填充金属；
(3)通过Lift-off工艺去掉聚苯乙烯纳米球和覆盖在聚苯乙烯纳米球表面的金属膜，仅留下周期为400nm，特征尺寸小于70纳米，成六角形分布的复合金属纳米列阵结构，如图3所示，纳米结构的剖面示意图如图4所示；
(4)在复合金属纳米结构表面采用2mM亚二硫基二乙酸与纳米结构表面反应30分钟并用氮气吹干，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐EDC(0.4M)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS(0.1M)的等体积混合溶液与纳米结构表面反应25至30分钟并用氮气吹干，将抗金黄色葡萄球菌肠毒素B型羊单克隆抗体IgG(10μg/mL)与纳米结构表面反应35分钟并用氮气吹干，最后用乙醇胺水溶液(1M)浸泡2分钟，封闭多余的活性酯基团；用氮气吹干后备用；
(5)将步骤(4)所制得的复合金属纳米结构传感芯片置于透射光谱测试系统中，如图1所示，测试其消光谱曲线，本例中采用的光源为LS-1卤钨灯光源(Ocean Optics，USA)，光谱仪为USB4000(Ocean Optics，USA)，测试曲线如图5所示，消光谱谱峰位置在618.74nm处；
(6)将待测的溶液滴在玻璃基片1表面的复合金属纳米结构上，反应25分钟后吹干，并重复步骤(5)检测其生物结合后的消光谱曲线和消光谱峰值，如图6所示，消光谱峰值位置在595.14nm处；
(7)将消光谱曲线进行对比，如图7，可以看到前后曲线变化明显，消光谱谱峰位置发生移动，移动量为Δλmax＝23.6nm，大于5nm的最低判断值，表明该溶液含有金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)。
Claims (8)
1、复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)选择基片，并清洗；在基片上自组装一层聚苯乙烯纳米球；
(2)用制作的聚苯乙烯纳米球自组装层做模具，采用真空蒸镀在纳米球自组装层上依次镀上均匀的金属银膜和金属金膜，此时纳米球的球与球之间的间隙会同时填充复合金属薄膜；
(3)通过Lift-off工艺去除聚苯乙烯纳米球自组装层，得到阵列化的复合金属纳米阵列结构；
(4)在复合金属纳米层上采用非定向共价连接法进行活化，在复合金属纳米结构表面形成一层抗金黄色葡萄球菌肠毒素羊单克隆抗体IgG的生物分子膜；
(5)采用光谱仪提取所得复合金属纳米结构的消光光谱，获得其生物结合前的消光谱峰值；
(6)将基片表面的复合金属纳米结构上滴待测溶液，待反应后吹干，并重复步骤(5)；
(7)通过步骤(6)前后的消光谱峰值对比，确定待测溶液中是否含有金黄色葡萄球菌肠毒素。
2、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中选择的基片为玻璃基片。
3、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的聚苯乙烯纳米球直径为100nm～500nm。
4、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中金属银和金的膜层总厚度为40～60nm。
5、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的在金属纳米结构表面形成的抗金黄色葡萄球菌肠毒素SE羊单克隆抗体IgG的生物分子膜为抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEA型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEB型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEC型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SED型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEE型、或抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEF型；分别对应于金黄色葡萄球菌肠毒素A型、B型、C型、D型、E型、F型的检测。
6、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：步骤(4)中的采用非定向共价连接法对金属纳米阵列结构进行活化的过程，在纳米结构表面采用亚二硫基二乙酸与纳米结构表面反应并用氮气吹干，然后将浓度0.3-0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐EDC和浓度0.05-0.1M的N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS的等体积混合溶液与纳米结构表面反应25至30分钟并用氮气吹干，将抗SEB羊单克隆抗体IgG与纳米结构表面反应并用氮气吹干，最后用乙醇胺水溶液浸泡后，用氮气吹干备用。
7、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：所述步骤(6)中的反应时间为10～30分钟。
8、根据权利要求1所述的一种复合金属纳米结构检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于：所述步骤(7)中将滴上待测溶液与未滴入待测溶液所提取的消光谱峰值对比，如果消光谱峰值位置差值大于等于5nm，即可确定待测溶液中含有金黄色葡萄球菌肠毒素，若消光谱峰值位置没有差异或者差异在5nm以内，则表明待测溶液中不含有金黄色葡萄球菌肠毒素。
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