CN104059142A - 一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法，属于免疫分析技术领域。本发明利用突变型沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS）缺失了O特异性侧链的特点，采用EDC和NHS方法将LPS末端COOH与匙孔血蓝蛋白（KLH）进行偶联，免疫得到的小鼠血清对Ra-LPS和完整型LPS均有效价。用不同血清组的沙门氏菌菌体包被检测小鼠血清均有交叉反应，证明该免疫原可以用来制备沙门氏菌交叉型血清或者单克隆抗体。该免疫原的合成方法为制备沙门氏菌交叉型单克隆抗体，从而实现在菌属水平上检测沙门氏菌奠定了基础。

Description

一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法
技术领域
本发明涉及一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella）是一种全球性的食源性致病菌。生物学上沙门氏菌是一类两端钝圆的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。动物性食品如禽肉、蛋类、乳品容易污染沙门氏菌。人体摄入含菌食物后会引起急性肠胃炎，伤寒，免疫力低下的儿童等人群中甚至出现败血症等症状。
沙门氏菌有2000多种血清型，临床中常见的血清型主要是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制（HACCP）等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。同时，对原料和生产过程、产品的质量监测也是保障食品生物安全的重要手段。
目前检测沙门氏菌的方法主要有培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测沙门氏菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要5-10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；分子检测方法是基于沙门氏菌脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的。目前发展为传统PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。与传统PCR相比，RT-PCR具有实现定量检测目标DNA、特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。LAMP方法具有简单、快速、特异性强的特点。LAMP技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面不亚于常规PCR技术，不依赖专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR。然而，有文献报道LAMP方法在检测牛乳中的沙门氏菌时，会出现假阴性的问题。这可能是与引物受到样品基质影响所引起的。同样常规PCR和实时PCR也面临着检测成本高、对操作人员技术要求较高的问题。
免疫学检测方法主要有酶联免疫反应（ELISA）、免疫层析试纸条（Immuno chromatographic test strip）。ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为食源性致病菌的常规检测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于ELISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的决定作用。虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但一般而言，ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用空间。
由于沙门氏菌有2000多种血清型，一般沙门氏菌的抗体由于免疫原的限制，特异性较强，因此建立的ELISA方法很难检测到所有的沙门氏菌。本发明首次采用突变型的LPS与载体蛋白KLH进行化学偶联合成人工抗原，制备了可以与突变型LPS以及不同血清型沙门氏菌反应的血清，证明该免疫原合成方法可以用来制备沙门氏菌交叉型抗体。
发明内容
本发明的目的在于建立一种制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原合成方法，为实现沙门氏菌属快速检测提供了方法和思路。
本发明的技术方案，为实现上述目的，本发明首次选用突变型沙门氏菌LPS作为抗原，并用EDC/NHS方法合成了突变型沙门氏菌LPS与载体蛋白的人工抗原。
第一步，抗原选择为突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS），突变型沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS）作为抗原可以避免完整型LPS的O特异性侧链引起的免疫反应，制备的血清交叉反应更强。
沙门氏菌主要抗原有O抗原、H抗原。O抗原由O特异性侧链、核心多糖、类脂A组成。不同血清型的沙门氏菌O特异性侧链不同，而核心多糖具有一定的保守性，而且也暴露在菌体外，具有开发群选型抗体的基础。一般完整型的脂多糖O特异性侧链较长，合成免疫原免疫小鼠得到的血清特异性较强，对不同血清型的O抗原交叉较差。本发明选择突变型的鼠伤寒沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS，购买于Sigma）作为抗原，可以避免O特异性侧链引起的免疫反应，制备的血清交叉反应更强。
第二步，突变型和完整型LPS核心多糖的结构类似，末端带有3个COOH，而LPS其它部分只带有糖类的OH和H键。利用这一点，采用EDC/NHS方法将突变型LPS的COOH与载体蛋白的NH2偶联。这样偶联特点在于人工抗原增加了脂多糖的免疫原性，同时暴露了沙门氏菌的共同结构——核心多糖。
虽然完整型脂多糖分子量在10000到15000之间，突变型脂多糖分子量也在10000左右，但由于多糖多为重复性糖链结构，免疫原性较差，是胸腺非依赖性抗原 (thymus independent antigen ，TI-Ag)。因此直接免疫脂多糖效价很低，制备免疫血清或者单克隆抗体非常困难。本发明采用化学偶联的方法用EDC和NHS将突变型脂多糖末端的COOH和载体蛋白KLH的NH2进行偶联，反应质量比为Ra-LPS︰KLH=2︰1。需要指出的是BSA作为载体蛋白血清效价较低，可能因为KLH的免疫原性更强。
一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法，步骤为：取突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS 10mg，用1mL pH为4.6的0.01M 2-吗啉代乙磺酸（MES）缓冲液溶解；称取0.48mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.29mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），均用超纯水溶解后滴加到突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS反应溶液中，25℃反应8h；然后称取5mg 钥孔血蓝蛋白（KLH）并溶解于2倍于MES反应溶液体积的0.01M的碳酸盐缓冲液（CB）中，此时将活化后的突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS反应液滴加到KLH溶液中，室温反应过夜，即得沙门氏菌交叉型抗体的免疫原。
将沙门氏菌交叉型抗体的免疫原经过免疫后得到沙门氏菌交叉型抗体或免疫血清。
本发明的有益效果：本发明提供的沙门氏菌脂多糖免疫原的合成方法采用沙门氏菌突变型LPS，并利用末端核心多糖COOH利用EDC/NHS方法合成了脂多糖人工抗原，免疫原免疫BALB/c小鼠制备的血清对突变型LPS和完整型LPS均具有效价，同时对不同O抗原的沙门氏菌菌体有效价。而直接免疫突变型LPS，血清对突变型LPS效价很低，直接免疫完整型LPS和鼠伤寒沙门氏菌加热灭活的菌体，血清仅对完整型LPS有微弱的效价，对突变型LPS无效价。结果说明合成的突变型LPS人工抗原在制备沙门氏菌交叉型抗体方面具有明显的优势。
附图说明
图1是不同免疫原免疫血清效果对比（Ra-LPS作为包被原）。
具体实施方式
实施例中所述突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS购自Sigma公司。
以下通过实施例进一步说明本发明。
仪器：
TGL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；KFLOW纯水机，凯佛隆公司；ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂；96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司；MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司；可调试移液器，Thermo Labsystems公司；涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。
试剂：
四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司；其他试剂均为分析纯试剂。
步骤如下：
1、免疫原的制备：
取突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS 10mg，用1mL pH为4.6的0.01M MES缓冲液溶解；称取0.48mg EDC和0.29mg NHS，均用超纯水溶解后滴加到突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS反应溶液中，25℃反应8h；然后称取5mg KLH并溶解于2倍于MES反应溶液体积的0.01M的CB液中，此时将活化后的突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS反应液滴加到KLH溶液中，室温反应过夜，即得沙门氏菌交叉型抗体的免疫原。
2、免疫血清或抗体的制备
（1）实验动物：选5只，7周龄的BALB/c小鼠进行免疫；
（2）抗原配置：将免疫原用生理盐水稀释，配成1mg/mL的溶液；
（3）乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；
（4）免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；
（5）采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。
3、ELISA反应过程：
（1）抗体效价测定步骤：
将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μL PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；
（2）充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用；
（3）将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1h后洗涤、拍干；
（4）每孔加入100μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；
（5）每孔加入100 μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。具体结果如图1所示。

Claims (2)

1.一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法，其特征在于步骤为：取突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS 10mg，用1mL pH为4.6的0.01M 2-吗啉代乙磺酸MES缓冲液溶解；称取0.48mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和0.29mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，均用超纯水溶解后滴加到突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS反应溶液中，25℃反应8h；然后称取5mg 钥孔血蓝蛋白KLH并溶解于2倍于MES反应溶液体积的0.01M的碳酸盐缓冲液中，此时将活化后的突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖Ra-LPS反应液滴加到KLH溶液中，室温反应过夜，即得沙门氏菌交叉型抗体的免疫原。
2.根据权利要求1所述用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法，其特征在于：将沙门氏菌交叉型抗体的免疫原经过免疫后得到沙门氏菌交叉型抗体或免疫血清。
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