CN102329391A - 一种能同时检测金黄色葡萄球菌a型和b型肠毒素的单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素(staphylococcalenterotoxins，Aand B，简称SEA和SEB)的单克隆抗体的制备方法。该方法以引起葡萄球菌食物中毒比较常见的金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素作为免疫原，采用混合免疫方法，运用杂交瘤技术，通过间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)法筛选制备得到同时针对SEA和SEB的单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体能够通过一次反应同时检测食品中存在的SEA和SEB，从而减少葡萄球菌食物中毒分析的工作量。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素的单克隆抗体的制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患致病菌，广泛存在于自然界中，其产生的肠毒素可通过污染食物而导致食物中毒。在金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒中，以肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，简称SEA)引起的食物中毒最多，此外，肠毒素B(staphylococcalenterotoxin B，简称SEB)不仅是葡萄球菌食物中毒和化脓感染的重要毒素，还是一种生化武器，具有巨大的杀伤性。因此，建立灵敏、快速的肠毒素检测方法，是食品安全检测的一项重要研究内容。
肠毒素的检测方法主要有动物学试验、免疫学方法、分子生物学方法、生物传感器技术和超抗原技术。在这些方法中，免疫学方法因其具有简便、快速、灵敏、特异性高等特点，是检测肠毒素广泛采用的一项技术。单克隆抗体纯度高，特异性强，一经研制出，便可大批量生产，将其用于肠毒素的免疫学检测将大大提高检测的特异性和灵敏度。商品化肠毒素ELISA检测试剂盒中采用的单克隆抗体主要是通过细胞融合技术，对实验动物单独免疫一种抗原所产生的单抗，一次实验只能检测一种肠毒素。这种传统的单克隆抗体制备过程，每次细胞融合只能制备一种抗原的单抗，存在成本高、产量低、制备程序繁杂、周期长的缺点。目前已知肠毒素种类多达20种，葡萄球菌食物中毒往往也不是由单一肠毒素引起的，在实际检测过程中，有时不需要对肠毒素血清型做出鉴定，只要判断有没有肠毒素存在即可，因此如果一次反应能同时检测多种肠毒素将大大减少葡萄球菌食物中毒分析的工作量。
在单克隆抗体制备过程中，如果改变传统的对小鼠一次免疫一种抗原的单一免疫方法，而采用混合免疫的方法，再用常规方法筛选制备能同时针对多种肠毒素抗原的共同决定簇的单克隆抗体，有可能实现一次反应检测多种肠毒素。由于混合免疫是一次对小鼠免疫多个抗原，进行一次细胞融合实验，筛选针对多个不同抗原的单克隆抗体，克服了传统单克隆抗体制备过程中，每次细胞融合只能制备一种抗原的单抗，且成本高、产量低、制备程序繁杂、周期长的缺点，而成为近年来通量化抗体制备研究的热点之一。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素的单克隆抗体的制备方法。
(二)技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
该方法以SEA和SEB等量混合作为免疫原免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术，通过间接ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay，简称ELISA)筛选制备得到同时针对SEA和SEB的单克隆抗体，其步骤为：
1.动物免疫
小鼠注射抗原前一周，在小鼠背部皮下注射1mg卡介苗，以增强机体对抗原的免疫应答水平。将适量的SEA和SEB等量混合，随后分别于不同间隔时间各注射抗原一次，每只每次免疫剂量约200～400μL。首次免疫时，先将抗原与等体积的完全福氏佐剂乳化均匀，以后各次均将抗原与等体积不完全弗氏佐剂完全乳化均匀，然后采用不同免疫程序进行动物免疫。
2.同时针对SEA和SEB杂交瘤细胞的筛选
(1)包被：用CBS(Carbonate buffer solution，简称CBS)将SEA和SEB稀释到1μg/mL，分别加入到各自的96孔微孔板中，每孔100μL，4℃过夜。待恢复至室温后，倾去包被液，PBST(Phosphate buffered saline Tween-20，简称PBST)满孔洗涤三次，每次5min，扣干。
(2)封阻：每孔加5％的脱脂牛奶(溶于PBST)200μL作为封阻液，置于37℃保温保湿2h，恢复至室温，倾去封阻液，洗涤同上。
(3)抗原抗体反应：每孔加入细胞培养上清液和以PBST代替上清液作为空白对照，每孔100μL，37℃保温保湿1h，洗涤同上。
(4)酶标二抗与抗原抗体复合物反应：每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1∶4000稀释)，37℃保温保湿1h，PBST洗涤5次，每次5min，扣干。
(5)底物显色反应：每孔加底物液100μL(40mg邻苯二胺溶于100mL底物缓冲液，再加入150μL H2O2，现配现用)后，37℃保温保湿，避光反应30min后，每孔加入50μL 2mol/LH2SO4终止反应，5min后，以空白对照调零，于492nm测吸光值。以P/N≥2.1判为阳性(P、N分别代表阳性上清液和阴性上清液的492nm处的吸光值)，从而筛选对SEA和SEB都呈阳性的孔。
3.同时针对SEA和SEB的单克隆抗体的制备
在接种杂交瘤细胞前，先给BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL的液体石蜡，7～10d后，取对数生长期的杂交瘤细胞，调整浓度为1～2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。7～12d后， 可见小鼠腹部明显膨大，间隔2～3d抽取小鼠腹水一次，8000r/min离心10min，收集上清液，加0.02％叠氮化钠分装，于-20℃保存。
具体实施方式
实施例1同时检测SEA和SEB单克隆抗体的制备方案一
1)动物免疫方法一
小鼠注射抗原前一周，在小鼠背部皮下注射1mg卡介苗，以增强机体对抗原的免疫应答水平。将15μg的SEA和15μg的SEB等量混合，分别于第1、20、50、80d各注射抗原一次，每只每次免疫剂量约200～400μL。首次免疫时，将抗原与等体积的完全福氏佐剂乳化，以后各次均与等体积不完全弗氏佐剂完全乳化后免疫BALB/c小鼠。第一、二次免疫时，小鼠免疫途径为颈背部皮下多点注射，以后免疫时采用腹腔注射。
2)同时针对SEA和SEB杂交瘤细胞的筛选
①包被：用CBS将SEA和SEB稀释到1μg/mL，分别加入到各自的96孔微孔板中，每孔100μL，4℃过夜。待恢复至室温后，倾去包被液，PBST满孔洗涤三次，每次5min，扣干。
②封阻：每孔加5％的脱脂牛奶(溶于PBST)200μL作为封阻液，置于37℃保温保湿2h，恢复至室温，倾去封阻液，洗涤同上。
③抗原抗体反应：每孔加入细胞培养上清液和以PBST代替上清液作为空白对照，每孔100μL，37℃保温保湿1h，洗涤同上。
④酶标二抗与抗原抗体复合物反应：每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1∶4000稀释)，37℃保温保湿1h，PBST洗涤5次，每次5min，扣干。
⑤底物显色反应：每孔加底物液100μL(40mg邻苯二胺溶于100mL底物缓冲液，再加入150μL H2O2，现配现用)后，37℃保温保湿，避光反应30min后，每孔加入50μL 2mol/LH2SO4终止反应，5min后，以空白对照调零，于492nm测吸光值。以P/N≥2.1判为阳性(P、N分别代表阳性上清液和阴性上清液的492nm处的吸光值)，从而筛选对SEA和SEB都呈阳性的孔。
3)同时针对SEA和SEB单克隆抗体的制备
在接种杂交瘤细胞前，先给BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL的液体石蜡，7～10d后，取对数生长期的杂交瘤细胞，调整浓度为1～2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。7～12d后，可见小鼠腹部明显膨大，间隔2～3d抽取小鼠腹水一次，8000r/min离心10min，收集上清液，加0.02％叠氮化钠分装，于-20℃保存。
实施例2同时检测SEA和SEB单克隆抗体的制备方案二
1)动物免疫方法二
小鼠注射抗原前一周，在小鼠背部皮下注射1mg卡介苗，以增强机体对抗原的免疫应答水平。将10μg的SEA和10μg的SEB等量混合，随后分别于第1、14、28、42d各注射抗原一次，每只每次免疫剂量约200～400μL。首次免疫时，将抗原与等体积的完全福氏佐剂乳化后，在小鼠颈背部皮下多点免疫，以后各次均与等体积不完全弗氏佐剂完全乳化后腹腔免疫。
2)同时针对SEA和SEB杂交瘤细胞的筛选
①包被：用CBS将SEA和SEB稀释到1μg/mL，分别加入到各自的96孔微孔板中，每孔100μL，4℃过夜。待恢复至室温后，倾去包被液，PBST满孔洗涤三次，每次5min，扣干。
②封阻：每孔加5％的脱脂牛奶(溶于PBST)200μL作为封阻液，置于37℃保温保湿2h，恢复至室温，倾去封阻液，洗涤同上。
③抗原抗体反应：每孔加入细胞培养上清液和以PBST代替上清液作为空白对照，每孔100μL，37℃保温保湿1h，洗涤同上。
④酶标二抗与抗原抗体复合物反应：每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1∶4000稀释)，37℃保温保湿1h，PBST洗涤5次，每次5min，扣干。
⑤底物显色反应：每孔加底物液100μL(40mg邻苯二胺溶于100mL底物缓冲液，再加入150μL H2O2，现配现用)后，37℃保温保湿，避光反应30min后，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应，5min后，以空白对照调零，于492nm测吸光值。以P/N≥2.1判为阳性(P、N分别代表阳性上清液和阴性上清液的492nm处的吸光值)，从而筛选对SEA和SEB都呈阳性的孔。
3)同时针对SEA和SEB单克隆抗体的制备
在接种杂交瘤细胞前，先给BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL的液体石蜡，7～10d后，取对数生长期的杂交瘤细胞，调整浓度为1～2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。7～12d后，可见小鼠腹部明显膨大，间隔2～3d抽取小鼠腹水一次，8000r/min离心10min，收集上清液，加0.02％叠氮化钠分装，于-20℃保存。
核心参考文献
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[3]陈彬，黄晓蓉，汤敏英，郑晶，林杰.基因探针法快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研 究.现代预防医学，2007，34：1017-1018
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Claims (3)
1.一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素(staphylococcal enterotoxins，简称SEA和SEB)的毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于首先将适量的SEA和SEB等量混合，然后免疫雌性BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，运用间接ELISA(Enzyme linked immunosorbentassay，简称ELISA)筛选出能同时针对SEA和SEB的杂交瘤细胞株，然后用小鼠体内生产腹水的方法制备得到能同时检测SEA和SEB的单克隆抗体。
2.按权利要求1所述的一种能同时检测SEA和SEB的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的SEA和SEB混合免疫BALB/c小鼠的过程为：小鼠注射抗原前一周，在小鼠背部皮下注射1mg卡介苗，以增强机体对抗原的免疫应答水平，将适量的的SEA和SEB等量混合，随后分别于不同间隔时间各注射抗原一次，每只每次免疫剂量约200～400μL，首次免疫时，先将抗原与等体积的完全福氏佐剂乳化均匀，以后各次均将抗原与等体积不完全弗氏佐剂完全乳化均匀，然后采用不同免疫程序进行动物免疫。
3.按权利要求1或2所述的一种能同时检测SEA和SEB的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的运用间接ELISA法筛选出能同时针对SEA和SEB的杂交瘤细胞株的过程为：
(1)包被：用CBS(Carbonate buffer solution，简称CBS)将SEA和SEB稀释到1μg/mL，分别加入到各自的96孔微孔板中，每孔100μL，4℃过夜，待恢复至室温后，倾去包被液，PBST(Phosphate buffered saline Tween-20，简称PBST)满孔洗涤三次，每次5min，扣干；
(2)封阻：每孔加5％的脱脂牛奶(溶于PBST)200μL作为封阻液，置于37℃保温保湿2h，恢复至室温，倾去封阻液，洗涤同上；
(3)抗原抗体反应：每孔加入细胞培养上清液和以PBST代替上清液作为空白对照，每孔100μL，37℃保温保湿1h，洗涤同上；
(4)酶标二抗与抗原抗体复合物反应：每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1∶4000稀释)，37℃保温保湿1h，PBST洗涤5次，每次5min，扣干；
(5)底物显色反应：每孔加底物液100μL(40mg邻苯二胺溶于100mL底物缓冲液，再加入150μL H2O2，现配现用)后，37℃保温保湿，避光反应30min后，每孔加入50μL 2mol/LH2SO4终止反应，5min后，以空白对照调零，于492nm测吸光值，以P/N≥2.1判为阳性(P、N分别代表阳性上清液和阴性上清液的492nm处的吸光值)，从而筛选对SEA和SEB都呈阳性的孔。
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