CN105044334A - 一种检测花生过敏原的表面等离子共振法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，具体通过分别制备抗花生Ara？h1单克隆抗体和抗花生Ara？h1多克隆抗体，然后通过偶联的方法将抗花生Ara？h1单克隆抗体固定在检测芯片上，将不同浓度的花生Ara？h1蛋白流经检测芯片，加入抗花生Ara？h1多克隆抗体用于放大信号，从而达到快速高效检测花生主要过敏原蛋白的目的。本发明方法具有灵敏度高、准确度高、检测快捷等特点，可成为花生过敏原检测的重要技术手段。

Description

一种检测花生过敏原的表面等离子共振法

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测花生过敏原的表面等离子共振法。

背景技术

FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品中，花生及其制品就是其中之一。在欧美的食品标签法中也规定了花生是必须标示的食物过敏原成分。Arah1蛋白是花生中的最主要过敏原。

花生过敏原的检测方法主要是针对花生中特异性过敏原蛋白质或编码过敏原的DNA片段为检测目标。因此，检测方法主要分为两类：以检测基因为基础的方法和以检测蛋白为基础的方法。以检测基因为基础的方法是依赖聚合酶链式反应（PCR）来扩增特定的DNA片段，这类方法有定性PCR和实时荧光定量PCR（Real-timePCR）等。定性PCR主要是通过掺入荧光染料的琼脂糖电泳来检测是否存有花生的特异性DNA。更好的DNA检测方法就是Real-timePCR，可以利用特异性探针提高检测的特异性。另外还有RT-PCR法，这一方法需要严格的实验操作，商业上得不到广泛应用。以检测蛋白为基础的方法是检测出花生的总蛋白或特异的花生过敏原，这类方法通常包括免疫分析检测方法，如DI（DotImmunoblotting）、RAST(Radio-allergosorbenttest)、RIE（Rocketimmuno-electrophoresis）、ELISA（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）、DSA（Dipstickassay）和LFIA(lateralflowimmunoassay)等。其中，DI，DSA和LFIA是定性和半定量方法，DSA通过连续的三步完成整个过程，耗时30min至3h；而LFIA仅通过一步完成，耗时约5min至10min；RIE需要电泳和免疫杂交，操作耗时，后期得不到广泛使用。RAST和ELISA是定量分析方法。ELISA因其准确性高和易操作，在常规食品分析中常用。这些方法取决于所用抗体的特异性与灵敏度。

当前商用的花生过敏原成分检测主要有三种方法：ELISA，胶体金法（LFIA）和实时荧光定量PCR法。ELISA和LFIA的蛋白检测方法主要是检测食品中的花生总蛋白或花生主要过敏原（Arah1或Arah2），ELISA的检测出限（LOD）一般是稍低于5ppm，LFIA的LOD一般约为5ppm。ELISA的检测所用时间大约2h，LFIA所用的约10min。与LFIA相比，ELISA更为灵敏，但需要较多的操作时间；与ELISA相比，LFIA不需要额外的检测仪器，更为简易，快速，并节约成本。但是，LFIA仅能提供是/否的检测结果，而ELISA可以半定量或全定量检测。商用的实时荧光定量PCR试剂主要是检测食品中的花生主要过敏原基因（Arah2）DNA水平，需要1h，LOD约10-50ppm。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，旨在解决现有检测方法存在的耗时耗力，灵敏度不高及对低剂量的过敏原检测不出或成本太高的问题。

本发明的技术方案如下：

一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，包括步骤：

A、制备花生Arah1蛋白；

B、以花生Arah1蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗花生Arah1多克隆抗体；

C、以花生Arah1蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗花生Arah1单克隆抗体；

D、通过偶联的方法将抗花生Arah1单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的花生Arah1蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤A具体包括：对花生进行丙酮去脂处理，然后通过PBS缓冲液对去脂后的花生进行花生蛋白提取，得到花生蛋白粗提液，最后通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法分离出花生蛋白粗提液中的花生Arah1蛋白。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B具体包括：以花生Arah1蛋白作为抗原，将花生Arah1蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将花生Arah1蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗花生Arah1多克隆抗体。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B之后还包括：对抗花生Arah1多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤C具体包括：以花生Arah1蛋白作为抗原，将花生Arah1蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将花生Arah1蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗花生Arah1单克隆抗体。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤C还包括对抗花生Arah1单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括：用花生Arah1蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成1×106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8～10d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到两株抗花生Arah1单克隆抗体，分别命名为2G9和5G4。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤C还包括采用免疫印迹法对抗花生Arah1单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗Arah1单克隆抗体进行抗体类型测定。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D具体包括步骤：

D1、将抗花生Arah1单克隆抗体固定于检测芯片上；

D2、以3~7μL/min的流速注射花生Arah1蛋白流经检测芯片280~320s；

D3、以3~7μL/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s；

D4、以3~7μL/min的流速注射抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号；

D5、以25~35μL/min的流速注射8~10mMGlycine-HCl25~35s，3次用于抗花生Arah1单克隆抗体的表面；

在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代花生Arah1蛋白作为样本零浓度用来检测LOD。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D1中，所述抗花生Arah1单克隆抗体的固定具体包括步骤：

D11、注射HBS-EP缓冲液，以8~12μL/min的流速平衡检测芯片表面4~7min；

D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12μL/min的流速活化检测芯片表面5~10min；

D13、注射抗花生Arah1单克隆抗体，以8~12μL/min的流速偶联检测芯片5~10min；

D14、注射乙醇胺，以8~12μL/min的流速封闭检测芯片表面5~10min。

所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D2中，用HBS-EP缓冲液将花生Arah1蛋白稀释为5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的花生Arah1蛋白。

有益效果：本发明利用抗花生Arah1单克隆抗体作为固定抗体，捕抓花生Arah1蛋白，再通过抗花生Arah1多克隆抗体进行信号放大，达到快速高效进行检测花生主要过敏原蛋白的目的。本发明方法同时结合了双抗体夹心ELISA方法的特异性和SPR快速高效的特征，从而达到高效、准确、便捷的检测效果。

具体实施方式

本发明提供一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，其包括步骤：

A、制备花生Arah1蛋白；

B、以花生Arah1蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗花生Arah1多克隆抗体；

C、以花生Arah1蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗花生Arah1单克隆抗体；

D、通过偶联的方法将抗花生Arah1单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的花生Arah1蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。

表面等离子共振(SPR)法基于光学技术原理通过分析分子间相互作用信息，能够实时检测一种或多种分子之间的反应，是一种新型食品过敏原检测方法。此SPR方法无背景干扰，对样品的纯化程度较低，使用简单、快速、无需标记、灵敏度高。

本发明利用SPR方法检测花生主要过敏原花生Arah1蛋白。具体分别制备抗花生Arah1单克隆抗体和抗花生Arah1多克隆抗体，然后通过偶联的方法将抗花生Arah1单克隆抗体固定在检测芯片上，将不同浓度的花生Arah1蛋白流经检测芯片，加入抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号，从而达到快速高效检测花生主要过敏原蛋白的目的。本发明方法具有灵敏度高、准确度高、检测快捷等特点。

下面通过一具体实施例对本发明上述技术方案进行详细说明。

一、花生Arah1蛋白的制备

1、丙酮去脂

用飞利浦豆浆机将200g干燥的天然的花生粉碎，再将花生粉末置于500mL的烧杯中，加入适量丙酮，于4℃冰箱中磁力搅拌两小时，反复多次去脂，直至上清液澄清为止。然后倒去丙酮，将去脂花生粉末于通风橱中使丙酮风干，风干后得脱脂花生粉末。

2、花生蛋白的粗提

称量花生粉末，按每克样品7mL加入PBS缓冲液进行蛋白提取，4℃磁力搅拌24h。提完后用冷冻离心机在15000r/min，4℃条件下离心15min，上清液即为花生过敏原粗提液。

3、硫酸铵分级沉淀

将花生过敏原粗提液置于烧杯中，在磁力搅拌的情况下缓慢加入硫酸铵直至饱和度达到30%，待完全溶解，将粗提液在4℃下12000r/min离心10min。沉淀用适量的PBS完全溶解；按相同的操作使离心后的上清液的硫酸铵浓度达到70%，第三次达到100%。硫酸铵三次分级沉淀所得的蛋白溶液于4℃冰箱中保存。

4、阴离子交换层析法分离花生Arah1蛋白

平衡缓冲液、洗脱缓冲液的制备：平衡缓冲液含8M尿素，20mM的Tris-HCl（pH8.0）。洗脱缓冲液与平衡缓冲液配制方法相同,除多加600mM的NaCl。

过层析柱蛋白样品的制备：先将硫酸铵沉淀的蛋白样品1mL混合3mL的平衡缓冲液，于15mL的MILLIPORE超滤离心管中超滤离心，5000r/min离心10min。倒去滤液，再添加平衡缓冲液3mL，超滤离心，如此反复5次。使蛋白样品溶液与平衡缓冲液相似，最终样品体积为1mL。

在?KTApurifier全自动层析仪系统（GE公司），采用强阴离子交换层析MonoQ5/50GL进行蛋白分离纯化，花生蛋白上柱后，用洗脱缓冲液以0～600mM/NaCl连续梯度洗脱，280nm检测紫外吸收峰，收集各洗脱峰。

5、SDS-PAGE电泳分析

采用不连续体系SDS-PAGE电泳平板凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，先用80V恒压电泳15min，然后120V恒压跑电泳。电泳结束后经考马斯亮蓝R250染色、醋酸脱色。

6、花生Arah1蛋白浓度的测定

采用BCA法，用BCA蛋白含量试剂盒，配制出不同浓度的标准花生Arah1蛋白溶液。用紫外分光光度计在562nm处分别测定不同浓度标准花生Arah1蛋白溶液的吸光值，以吸光度值(A562)为纵坐标，标准蛋白含量(ug/uL)为横坐标，绘制标准曲线。

7、免疫印迹法鉴定花生Arah1蛋白

取10uL的纯化蛋白液进行SDS-PAGE电泳，电泳完后取出SDS-PAGE凝胶，按凝胶的大小剪取硝酸纤维素膜（NC膜），然后在350mA条件下，于4℃冰箱中转膜50min。取下NC膜用3%BSA于4℃冰箱中封闭过夜，加入过敏病人的阳性混合血清(按1:10稀释)。摇床上摇2h后，将NC膜转入生物素标记羊抗人IgE抗体(按1:1500稀释)中摇2h。链霉亲和素(HRP)按1:1000稀释后将NC膜放入其中摇2h。最后DAB显色，待条带清晰后即用水冲洗，终止显色反应。。

二、抗花生Arah1多克隆抗体制备

1、首次免疫

取100μg花生Arah1蛋白和等体积的福氏完全佐剂混合乳化后，皮下注射小鼠颈背部。加强免疫共2次，蛋白量同前，混入等量的福氏不完全佐剂。每次免疫间隔约3周，第3次免疫后，第5天，采取夹眼球取血，离心取血清。对于抗花生Arah1多克隆抗体的鉴定采用了免疫印迹法（Western-blotting）鉴定，先用提取的花生Arah1蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上，用免疫后小鼠血清为一抗，以免疫前小鼠血清为阴性对照，用标记HRP的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，用DAB显色。

2、抗花生Arah1多克隆抗体的效价测定与纯化

采用常规的间接ELISA法进行检测，提取的花生Arah1蛋白按100ng/孔4℃包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37℃封闭2h，以获取的多抗血清为一抗，同时用免疫前小鼠血清做平行阴性对照试验，从1:100开始对倍稀释，37℃反应1h，PBST洗三次后，加入抗鼠IgG-HRP作为二抗，37℃反应1h，洗三次后加底物TMB显色。测定孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为阳性判断标准，抗体的稀释度即为抗体的效价。鉴定与效价测定后，采用夹眼球取血，离心取血清，用于血清抗体纯化。抗体纯化参照HiTrapproteinG亲和层析说明书进行。

3.抗花生Arah1多克隆抗体的特异性测定

用间接ELISA检测该抗花生Arah1多克隆抗体能否认别一些坚果类（杏仁、胡桃、核桃、榛子和开心果）、一些豆类品（大豆、蚕豆、豌豆、黑豆、绿豆、红豆）和葵花种子、小麦、乔麦、黑麦、鸡蛋、牛奶、芝麻、虾、鱼等蛋白。每孔按100ng蛋白/孔4℃包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37℃封闭2h，以该抗花生Arah1多克隆抗体为一抗，同时用花生Arah1蛋白为阳性对照，以PBS为阴性对照。

三、抗花生Arah1单克隆抗体制备

1、抗花生Arah1单克隆抗体的制备与其纯化

先用纯化后花生Arah1蛋白免疫BALB/C小鼠，具体要求按照多抗制备过程中的动物免疫，然后取用纯化花生Arah1蛋白免疫后的BALB/C小鼠的脾细胞，将与NS-1鼠骨髓瘤细胞按2∶1的比例混合，用PEG法进行细胞融合。加到已有饲养细胞层的96孔板内，置37℃、5%CO₂培养箱中培养。HAT选择培养，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，阳性孔经4次亚克隆后，选取最后克隆扩大培养，生产抗体。用间接免疫酶标法筛选阳性克隆及亚类鉴定。用纯化花生Arah1蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应。取生长良好的杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成1×106/mL，接种小鼠腹腔每只0.5mL，待8～10d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，-20℃保存备用。腹水中单抗的纯化参照用抗体纯化的ProteinG亲和交换层析柱（GE公司）说明书。主要得到两株抗Arah1抗体，分别命名为2G9和5G4。

2、抗花生Arah1单克隆抗体的鉴定、抗体类型和抗体效价的测定

对于抗花生Arah1单克隆抗体的鉴定采用了免疫印迹法（Western-blotting）鉴定，先用提取的花生Arah1蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上，用纯化后的抗花生Arah1单克隆抗体为一抗，以免疫前小鼠血清为阴性对照，用标记HRP的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，显色。采用不同的抗IgG类型单抗对纯化后的抗花生Arah1单克隆抗体进行抗体类型测定。采用常规的间接ELISA法进行检测，天然的花生过敏原蛋白Arah1按100ng/孔4℃包被过夜，封闭液为3%BSA-PBST，37℃封闭2h，以纯化后的抗花生Arah1单克隆抗体为一抗，同时用免疫前小鼠血清做平行阴性对照试验，从1:100开始对倍稀释，37℃反应1h，PBST洗三次后，加入抗鼠IgG-HRP作为二抗，37℃反应1h，洗三次后加底物TMB显色。测定孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为阳性判断标准，抗体的稀释度即为抗体的效价。

3、抗花生Arah1单克隆抗体的特异性测定

用间接ELISA检测该两株抗花生Arah1单克隆抗体（2G9和5G4）能否认别一些坚果类（杏仁、胡桃、核桃、榛子和开心果）、一些豆类品（大豆、蚕豆、豌豆、黑豆、绿豆、红豆）和葵花种子、小麦、乔麦、黑麦、鸡蛋、牛奶、芝麻、虾、鱼等蛋白。每孔按100ng蛋白/孔4℃包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37℃封闭2h，以该抗体为一抗，同时用花生蛋白为阳性对照，以PBS为阴性对照。

四、SPR检测

本实验使用SPR方法（GEHealthcare，BIAcoreT200）进行检测。

材料

CM5芯片，Cat.No.BR-1005-30(GEHealthcare)；

NHS：100mMN-羟基琥珀酰亚胺；

EDC：400mM二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；

HBS-EP缓冲液；

乙醇胺：1M乙醇胺，pH8.5；

纯化花生Arah1蛋白：纯度>90%，1.0mg/mL，保存在PBS缓冲液中；

纯化抗花生Arah1单克隆抗体5G4：纯度>90%，1.8mg/mL，保存在PBS缓冲液中；

纯化抗花生Arah1多克隆抗体：纯度>90%，1.0mg/mL，保存在PBS缓冲液中；

方法

纯化抗花生Arah1单克隆抗体5G4的固定

用氨基偶联的方法将纯化抗花生Arah1单克隆抗体5G4固定在CM5芯片上：

表面平衡：HBS-EP缓冲液，以10μL/min的流速平衡芯片表面5min；

表面活化：注射“NHS+EDC”1:1混合液，以10μL/min的流速活化芯片表面7min；

偶联：注射纯化抗花生Arah1单克隆抗体5G4（稀释在10mM醋酸钠，pH4.5缓冲液中），以10μL/min的流速偶联7min；

表面封闭：注射乙醇胺，以10μL/min的流速封闭表面7min。

抗体灵敏度检测

用HBS-EP缓冲液将纯化花生Arah1蛋白稀释为5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL进行检测，所有浓度均重复以下过程：

以5μL/min的流速注射一定浓度的纯化花生Arah1蛋白300s；

以5μL/min的流速注射HBS-EP缓冲液180s平衡表面；

以5μL/min的流速注射0.3mg/mL纯化抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号；

以30μL/min的流速注射10mMGlycine-HCl（pH2.0）30s，3次用于再生纯化抗花生Arah1单克隆抗体5G4的表面。

在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代一定浓度的纯化花生Arah1蛋白作为样本零浓度（n=5）用来检测LOD（即最低检测限：背景信号下能够检测出的被检物的最低浓度；计算方法为样本零浓度信号平均值SD的三倍）。

通过上述建立起的SPR检测花生主要过敏原Arah1蛋白的方法，抗花生Arah1单克隆抗体的LOD为2.58ng/mL；抗花生Arah1多克隆抗体的LOD为0.77ng/mL，相比于其他方法，本发明方法最大的优势在于无需对样品进行标记，检测方便、快捷、灵敏度高、并且可以多次利用，样品需要的量极少，能高通量、高质量地分析数据。

本发明利用抗原抗体专一识别的原理，结合SPR高效、准确、快速的优点对花生的主要过敏原Arah1蛋白进行检测。与现有技术相比，本发明的核心改进之处在于通过SPR技术，利用高效价的抗花生Arah1单克隆抗体作为固定抗体，捕抓花生Arah1蛋白，再通过抗花生Arah1多克隆抗体进行信号放大，快速高效进行检测花生主要过敏原蛋白。这种方法同时结合了双抗体夹心ELISA方法的特异性和SPR快速高效的特征，从而达到高效、准确、便捷的检测效果。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，包括步骤：

A、制备花生Arah1蛋白；

B、以花生Arah1蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗花生Arah1多克隆抗体；

C、以花生Arah1蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗花生Arah1单克隆抗体；

D、通过偶联的方法将抗花生Arah1单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的花生Arah1蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。

2.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤A具体包括：对花生进行丙酮去脂处理，然后通过PBS缓冲液对去脂后的花生进行花生蛋白提取，得到花生蛋白粗提液，最后通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法分离出花生蛋白粗提液中的花生Arah1蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B具体包括：以花生Arah1蛋白作为抗原，将花生Arah1蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将花生Arah1蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗花生Arah1多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B之后还包括：对抗花生Arah1多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。

5.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤C具体包括：以花生Arah1蛋白作为抗原，将花生Arah1蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将花生Arah1蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗花生Arah1单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤C还包括对抗花生Arah1单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括：用花生Arah1蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成1×106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8～10d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到两株抗花生Arah1单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤C还包括采用免疫印迹法对抗花生Arah1单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗花生Arah1单克隆抗体进行抗体类型测定。

8.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D具体包括步骤：

D1、将抗花生Arah1单克隆抗体固定于检测芯片上；

D2、以3~7μL/min的流速注射花生Arah1蛋白流经检测芯片280~320s；

D3、以3~7μL/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s；

D4、以3~7μL/min的流速注射抗花生Arah1多克隆抗体用于放大信号；

D5、以25~35μL/min的流速注射8~10mMGlycine-HCl25~35s，3次用于抗花生Arah1单克隆抗体的表面；

在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代花生Arah1蛋白作为样本零浓度用来检测LOD。

9.根据权利要求8所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D1中，所述抗花生Arah1单克隆抗体的固定具体包括步骤：

D11、注射HBS-EP缓冲液，以8~12μL/min的流速平衡检测芯片表面4~7min；

D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12μL/min的流速活化检测芯片表面5~10min；

D13、注射抗花生Arah1单克隆抗体，以8~12μL/min的流速偶联检测芯片5~10min；

D14、注射乙醇胺，以8~12μL/min的流速封闭检测芯片表面5~10min。

10.根据权利要求8所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D2中，用HBS-EP缓冲液将花生Arah1蛋白稀释为5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的花生Arah1蛋白。