CN104151416A - 抗人sST2单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人sST2单克隆抗体及其应用。本发明人第一次采用基因工程手段将编码人sST2蛋白的基因导入到适当的果蝇表达系统中，制备出一种在活性上与天然的人sST2蛋白非常接近的重组人sST2蛋白，用该蛋白免疫动物可获得灵敏地识别人体中天然的sST2蛋白的抗体，从而用于对相关疾病的诊断或检测。

Description

抗人sST2单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及抗人sST2单克隆抗体及其应用。

背景技术

ST2(IL1RL1，DER4，T1和FIT-1)是Toll样/白介素受体超家族的一员，属于IL-1受体亚家族。在人体内ST2基因编码3种亚型的蛋白质：分泌到细胞外的可溶型蛋白sST2，膜结合型受体蛋白ST2L和主要在人肠组织中表达的ST2V[1]。ST2L由细胞膜外3个串联的免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和细胞内的TIR(Toll/Interleukin-1receptor)结构域3部分组成[2]。ST2L广泛表达于多种造血细胞和非造血细胞[3]，在造血细胞中，ST2L选择性的的表达在Th2淋巴细胞表面，而不表达在Th1淋巴细胞表面，因此ST2L可以作为Th2细胞表面标记分子[4]。ST2L可以与胞外配体分子白介素-33(IL-33)及细胞膜上的白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)形成复合物，招募接头分子Myd88，激活细胞内多条信号通路，促进Th2相关的炎症因子的表达[5，6]。IL-33/ST2L/IL-1RAcP信号通路在体内衔接先天性免疫和适应性免疫进程，参与多种免疫相关疾病的调控过程，具体包括抗感染免疫，肝炎，过敏及哮喘，自身免疫病，抗肿瘤免疫，中枢神经系统炎症，糖尿病，心血管疾病等[7-10]。因此IL-33/ST2L信号通路可以作为多种疾病的潜在治疗靶点，在疾病治疗和诊断中具有重要价值。

sST2为分泌性的可溶型蛋白，缺少ST2L的跨膜结构域和胞内结构域，在C段与ST2L相比，存在9个不同的氨基酸片段[11]。sST2可作为诱骗受体，在细胞外与游离的IL-33结合，抑制IL-33/ST2L/IL-1RAcP复合物的形成，起到负调控作用，抑制Th2相关的炎症因子IL-4，IL-5，IL-13等的表达[12]。正常人体内，血清sST2浓度维持在非常低的水平，但是在病毒感染[13]、自身免疫性疾病[14]、哮喘[15]、肺纤维化[16]、心衰[17]、呼吸衰竭[18]、糖尿病[19]等多种病人体内，血清sST2水平明显升高。2004年，Shimpo，M.et al等发现血清sST2水平可作为心衰标志物，预测心衰病人的死亡率，具有极其重要的预后诊断价值[20]，随后的多项研究证明([7]Table1Studies examining sST2inserum/plasma of patients with CV disease)，sST2可以作为一种新型的心衰标志物，可用于预测急性心肌梗死[20]，急性呼吸衰竭[18，21]、非稳定的心力衰竭[22]，代偿性心力衰竭[23]，慢性心力衰竭和左心室收缩功能不全[24]等多种心血管相关疾病的死亡率。而且sST2与现有的心衰标志物CRP，BNP，ANP等具有功能互补作用，可以显著提高疾病预测的准确性[25，26]。因此sST2，IL-33及相关抗体等具有极其重要的临床应用价值[2，27]。

获取特异性的抗人sST2的单克隆抗体，不仅可以应用于科学研究，还可以用于临床诊断及治疗，具有极其巨大的应用前景，也越来越受到国际研究同行的重视。目前市面上现有的检测sST2的抗体主要来自R&D，MBL，SantaCruz，Abcam，sinobiological等公司，使用的抗原来源于大肠杆菌表达或者哺乳动物细胞如293等的表达。由于sST2是一个高度糖基化的蛋白，在大肠杆菌中缺乏糖基化修饰，因此使用大肠杆菌表达的重组蛋白在蛋白活性和构象上与天然蛋白具有极大的差异；使用哺乳动物细胞如293等表达的重组人sST2蛋白，虽然具有与人相似或者相同的糖基化修饰系统，但存在成本高产量低等缺陷。为了解决上述问题，本发明人采用昆虫细胞(果蝇S2细胞)，筛选得到了稳定表达重组人sST2蛋白的细胞株，所得到的重组蛋白不仅具有与人的sST2蛋白相似的天然构象和活性，也具有与哺乳动物表达系统类似的糖基化修饰。不仅避免了大肠杆菌表达系统中没有糖基化修饰的缺陷，也弥补了哺乳动物细胞表达重组蛋白成本高产量低的劣势，具有极大的新颖性。

发明内容

本发明的目的在于提供高效表达和纯化人sST2蛋白的方法；以及抗人sST2蛋白的单克隆抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种制备人sST2蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)将人sST2基因序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了人sST2基因序列的表达载体；所述的表达载体是果蝇S2表达系统使用的诱导分泌型表达载体；

(b)使(a)获得的插入了人sST2基因序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；所述的宿主细胞是果蝇S2细胞；

(c)培养转化的宿主细胞，从而表达出人sST2蛋白；

(d)分离获得人sST2蛋白。

在一个优选例中，所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His A载体。

在另一优选例中，在步骤(d)中，还包括用5±2μM CdCl₂诱导表达。

在本发明的另一方面，提供一种通过所述的方法制备的人sST2蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性地抗所述的人sST2蛋白。

在一个优选例中，所述的单克隆抗体的亚型为IgG，κ。

在另一优选例中，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：8D9，7C11，11E2，9B3或1A11。

在本发明的另一方面，提供一种制备抗人sST2蛋白单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：培养杂交瘤细胞8D9、7C11、11E2、9B3或1A11，使用上述杂交瘤细胞制备腹水，以及从腹水中分离纯化上述细胞分泌的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供抗人sST2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自：8D9，7C11，11E2，9B3或1A11。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，含有前面所述的抗体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、采用PCR扩增人sST2蛋白编码序列的电泳结果。

各泳道样品依次为：1,2,3：人sST2蛋白编码序列，Marker：DL2,000DNAMarker(Takara)，

图2、插入人sST2蛋白编码序列的表达载体菌液PCR鉴定的电泳结果。

图3、使用亲和层析方法纯化重组人sST2蛋白的SDS-PAGE图。

各泳道样品依次为：泳道1：hsST2蛋白纯化后使用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter(30KD)浓缩后样品；泳道2：PageRuler Prestained Protein Ladder(10-170kDa)；泳道3：His亲和层析柱纯化处理的穿透液；泳道4：使用Washing Buffer清洗的流穿液；泳道5-7：洗脱液(每管收集1ml样品)

图4、使用亲和层析方法纯化重组人sST2蛋白免疫印迹(WB)分析结果。所用抗体为His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart)，二抗使用抗体为Anti-MouseIgG(H+L)，AP Conjugate(Promega，S3721)

各泳道样品上样顺序与图3相同。

图5、Balb/c小鼠第二次免疫后血清抗体效价图，使用间接ELISA方法测定。从结果可以显示经过两次免疫后4只小鼠血清抗体效价都超过1:32000。

图6、为使用ProteinG亲和层析柱纯化腹水中抗体SDS-PAGE分析图。

各泳道样品依次为：泳道1：经结合缓冲液稀释处理后的腹水；泳道2：HiTrap PtoteinG HP亲和层析柱处理后的穿透液；泳道3：经结合缓冲液清洗柱子后的流穿液；泳道4-7：经洗脱缓冲液处理后的洗脱液。左图为使用浓度为7.5%的SDS-PAGE进行非还原性电泳结果；右图为使用浓度为10%的SDS-PAGE进行还原性电泳结果。从电泳结果可以看到纯化的抗体条带单一，没有其它的杂带。

图7、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公司的商业化抗体MAB523进行免疫印迹分析结果及分析灵敏度的定量比较。

左图显示分别使用杂交瘤细胞株8D9，7C11,9B3,11E2，1A11，7F9，1A1分泌纯化的抗体与R&D公司的商业化抗体MAB523检测1μg重组人sST2蛋白结果，右图显示杂交瘤细胞株8D9，7C11与R&D公司的商业化抗体MAB523检测一系列浓度梯度的重组人sST2蛋白的检测结果。

经过定量WB分析，可以发现在本实施例中使用相同浓度的抗体检测相同量的重组人sST2蛋白时，经杂交瘤细胞株8D9和7C11分泌纯化的抗体比R&D公司的商业化抗体MAB523具有更加灵敏的检测效果。

图8、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公司的商业化抗体MAB523进行免疫沉淀分析结果。

分别使用杂交瘤细胞株8D9，7C11,9B3,11E2，1A11，7F9，1A1分泌纯化的抗体与R&D公司的商业化抗体MAB523，对果蝇S2细胞稳转细胞株无血清培养液(Serum free medium)和含有10%FBS培养液经CdCl₂诱导72h后收集样品进行免疫沉淀分析。检测过程中使用的一抗为His-Tag(2A8)MousemAb(Abmart)，二抗为IRDye800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)抗体。

从分析结果可以看出上述抗体均可以结合培养液中游离的重组人sST2蛋白。

图9、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公司的商业化抗体MAB523进行流式细胞术分析结果。

分别使用杂交瘤细胞株8D9，7C11,9B3,11E2，1A11，7F9，1A1分泌纯化的抗体与R&D公司的商业化抗体MAB523对人的PBL细胞进行染色分析。

从分析结果可以看出，杂交瘤细胞株7C11分泌纯化的抗体比R&D公司的商业化抗体MAB523具有更好的分析效果，在相同的细胞群中更多表达ST2L的细胞被染色标记。

图10、使用本发明中提供的双夹心酶联免疫法分析纯化的sST2重组蛋白和来源于商业化试剂盒中的sST2蛋白标准品的标准曲线。

分别使用抗体8D9，7C11，9B3作为包被抗体，生物素标记的抗体11E2和1A11作为检测抗体进行双夹心ELISA分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，发现通过基因工程手段，将编码人sST2蛋白的基因重组插入诱导分泌型表达载体pMT-BIP-V5/His A，将表达载体和筛选载体(pCoBlast)共同转染果蝇S2细胞，通过有限稀释法可筛选得到稳定表达人sST2重组蛋白的稳转细胞株，分离纯化可获取高纯度的人sST2重组蛋白，该蛋白具有与人的sST2蛋白类似的糖基化修饰和天然构象。利用果蝇S2细胞表达纯化的人sST2蛋白作为抗原，可以获得特异性的识别人sST2的高亲和力单克隆抗体，可以应用于WB，IP，FACS和ELISA分析。与R&D公司的商业化抗体MAB523相比，本发明的抗体应用于WB和FACS分析时，具有更好的分析效果，在临床诊断或治疗中具有重要的应用前景。

本发明人第一次采用基因工程手段将编码人sST2蛋白的基因导入到适当的果蝇表达系统中，制备出一种在活性上与天然的人sST2蛋白非常接近的重组人sST2蛋白，用该蛋白免疫动物可获得灵敏地识别人体中天然的sST2蛋白的抗体，从而用于对相关疾病的诊断或检测。

本发明的提供一种使用果蝇S2细胞高效表达和快速纯化人sST2蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

（a）PCR扩增得到编码人sST2蛋白编码序列

（b）将(a)所述的人sST2蛋白编码序列插入到果蝇S2细胞表达系统使用表达载体的多克隆位点，获得了插入人sST2蛋白编码序列的表达载体。

（c）使用(b)获得的插入人sST2蛋白编码序列的表达载体和筛选载体一起，利用磷酸钙转染方法共同转染S2细胞。

（d）使用抗生素筛选转染细胞，得到稳定转染筛选载体或筛选载体与表达载体共转染的稳定细胞株。

（e）使用有限稀释技术结合Western blot分析方法，筛选筛选载体与表达载体共转染的稳转单克隆细胞株。

（f）扩大培养(e)中获取的稳转单克隆细胞细胞株，加入诱导剂CdCl₂诱导重组人sST2蛋白表达。

（g）分离纯化获取人sST2重组蛋白。

在本发明的一个优选实施例中，使用的表达载体为诱导分泌型表达载体pMT-BiP-V5/His A，使用的筛选载体为pCoBlast，表达载体与筛选载体共转时比例为19:1.

在本发明的一个优选实施例中，使用的诱导剂CdCl₂浓度为5μM。

在本发明的一个优选实施例中，洗脱缓冲液中使用的咪唑浓度为250mM

本发明提供一种使用(g)中纯化的人sST2重组蛋白作为抗原，制备抗人sST2蛋白的的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（a）免疫动物

（b）杂交瘤细胞株制备和筛选

（c）抗体亚型鉴定

（d）腹水制备和抗体纯化

在本发明的一个优选实施例中，抗体亚型鉴定用杂交瘤细胞培养上清液稀释比例为1:50

本发明提供一种抗人sST2蛋白的抗体，其特征在于所述抗体为IgG类，κ亚型。

在本发明的一个优选实施例中，所述单克隆抗体由8D9和7C11杂交瘤细胞株产生。

在本发明的一个优选实施例中，所述单克隆抗体由7C11杂交瘤细胞株产生。

本发明提供一种免疫偶联物，其特点在于该免疫偶联物含有：

（a）本发明的单克隆抗体或人sST2重组蛋白；和

（b）选自下组的偶联物部分：药物，毒素，细胞因子，酶，生物素或放射性核素。

本发明提供一种夹心酶联免疫方法，可以定量检测血清，组织液及细胞培养液中的sST2浓度，其含有本发明的人sST2重组蛋白，单克隆抗体或免疫偶联物，或所述抗体或免疫偶联物的组合。

在本发明的一个优选实施例中，所述包被抗体由8D9、7C11或9B3杂交瘤细胞株分泌。

在本发明的一个优选实施例中，所述抗体免疫偶联物含有由11E2或1A11杂交瘤细胞株分泌的抗体。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、人sST2蛋白编码基因的获取

通过检索GenBank数据库，查找得到关于人sST2基因的基本信息：NCBIReference Sequence:NM_003856.2，ORF Size:987nt Protein_id="NP_003847.2，328aa。人sST2基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO:2所示的蛋白。

从北京义翘神州生物技术有限公司购买包含有此基因ORF的T载体(Human IL1R4 ORF，Catalog Number:HG10105-M)以此T载体为模板，设计特异性引物，在目的片段两端分别引入两个酶切位点：Kpn I和ApaL I，通过PCR方法将sST2cDNA序列插入到果蝇S2表达系统(Drosophial Expression System，周保罗研究员惠赠，购自Invitrogen公司)使用的表达载体pMT/BiP/V5-His A(周保罗研究员惠赠，购自Invitrogen公司)中，使用引物序列如下：

Forward Primer：5’-CCGGGTACCTGGGTTTTGGATCTTAGC-3’(SEQ IDNO:3)

Reverse Primer：5’-CGCGGGCCCGAAACACTCCTTAC-3’(SEQ ID NO:4)

注：下划线分别表示Kpn I和ApaL I酶切位点

参照《分子克隆实验指南》方法使用上述特异性引物对人sST2cDNA进行扩增：

PCR体系：50μl

PCR程序：

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000 DNA Marker(D501A)。电泳结果如图1所示。

实施例2、人sST2重组蛋白表达载体构建

将实施例1中得到的PCR产物经KpnI和ApaL I两个酶同时双酶切后切胶回收，参照《分子克隆实验指南》，将sST2目的片段连接到同样使用KpnI和ApaL I双酶切的pMT/BIP/V5-His A载体中，获得pMT/BIP/V5-His-sST2重组载体，转化入感受态细胞DH5-α中，随机挑选两个克隆进行菌液PCR鉴定，鉴定结果如图2，结果显示挑取的两个克隆均为阳性克隆，在1000bp大小有明显的目的条带，取其中的1号阳性克隆结果送博尚生物技术有限公司测序验证，测序结果与目的片段完全一致。

实施例3、稳定表达人sST2重组蛋白的果蝇S2稳转细胞株构建

（1）转染用质粒准备

取前述准备的pMT/BIP/V5-His-sST2重组质粒和pCoBlast质粒(周保罗研究员惠赠购自Invitrogen公司)DH5a感受态细胞，挑选单个克隆扩大培养后使用NucleoBond Xtra Midi Plus试剂盒提取质粒，并使用NanoDrop测定质粒浓度。

（2）转染试剂配制

参照Drosophila Expression System提供的protocol准备以下溶液：2XHEPES Buffered Saline(50 mM HEPES，1.5 mM Na₂HPO₄，280mM NaCl，pH7.1)；2.5MCaCl₂溶液，ddH₂O。

（3）转染细胞准备

转染前一天，准备状态好的果蝇S2细胞传代至六孔板中，每孔1.0-1.5x10⁶细胞，28℃培养12-18h后细胞密度达到2-4x10⁶个细胞即可以用于转染。

(4)转染

转染当天按照以下配方准备转染混合液：

溶液A：150μl

溶液B：2×HEPES Buffered Saline  150μl

细胞操作台上缓慢将溶液A滴加到溶液B中，同时用Vortex连续混匀。整个过程约1min左右。然后将混合液置细胞操作台静置30min直到形成大小较均一的沉淀物。均匀的将混合液滴加到铺有果蝇S2细胞的6孔板中，每孔150μl混合液。细胞置28℃培养16-24h。

(5)换液

转染后16-24h给细胞换液，离心去除磷酸钙溶液，用完全培养液洗细胞两次后用2ml完全培养液重悬转染的细胞并将细胞传代至原来的6孔板中。

(7)筛选稳定转染的细胞

转染后3天向细胞培养液中加入筛选抗生素Blasticidin HCl至终浓度为25μg/ml，间隔4-5天更换含有选择抗生素的培养液，经过2周左右的筛选即可获取稳定转染的细胞。

(8)筛选表达重组人sST2蛋白的稳转细胞株

通过有限稀释法，取步骤7中的细胞100个，稀释到预先准备好的10ml细胞密度为10⁵的正常细胞中，混匀后铺96孔板，每空加样量为100μl。24h后向96孔板中加入100μl筛选抗生素Blasticidin HCl浓度为50μg/ml的培养液，每隔4-5天向96孔板中补充50μl含25 μg/ml筛选抗生素Blasticidin HCl的培养液，10天后挑选单个细胞克隆孔传代至48孔板，并逐级扩大培养。细胞传代至24孔板48h换成无血清培养液并加入终浓度为5μM的诱导剂CdCl₂，72h后收集细胞培养液和细胞进行WB分析。WB分析使用抗体：一抗：His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart，M20001S)；二抗：Anti-Mouse IgG (H+L)，APConjugate(Promega,S3721)。

实施例4、重组人sST2蛋白大量诱导表达及纯化

（1）大量诱导表达

取实施例4中得到的稳定转染细胞株扩大培养后接种至3L Spinner Flask中，每瓶加入1L无血清培养液，接种细胞密度0.5-1×10⁶细胞/ml。28℃培养24-48h后向培养液中加入诱导剂CdCl₂使终浓度为5μM，加入诱导剂后3-4天收集细胞培养液。

（2）培养液浓缩

取(1)中细胞培养液4℃，6000rpm/min离心10min收集细胞培养上清液，0.45μm滤膜过滤后向培养上清液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，使终浓度为1mM。将上述培养液使用GE公司QuixStand^TM benchtop systems进行10倍浓缩和缓冲液交换。浓缩后样品可放-20℃储存。

（3）蛋白纯化

溶液配制：结合缓冲液：20mM磷酸钠，500mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4；清洗缓冲液：20mM磷酸钠，500mM NaCl，50mM咪唑，pH7.4；洗脱缓冲液：250mM磷酸钠，500mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4。

使用GE公司His GraviTrap Column通过亲和层析的方法对人sST2重组蛋白进行纯化。纯化过程如下：His GraviTrap预装柱→10ml纯水清洗→10ml结合缓冲液平衡→上样→10ml-清洗缓冲液清洗→3ml洗脱缓冲液洗脱，每ml收集一管→10ml-清洗缓冲液清洗→10ml纯水清洗→10ml 20%乙醇清洗→5ml20%乙醇柱子置4℃储存。纯化后收集的洗脱液可使用超滤管(截留分子量30KD)浓缩。

（4）纯化结果SDS-PAGE和WB分析结果如图3和图4所示。

实施例5、抗人sST2单克隆抗体制备

（1）动物免疫

取实施例4中纯化的人sST2重组蛋白作为免疫原，免疫Balb/c小鼠(6-8周，雌鼠)4只，免疫三次，每次间隔两周。具体方法如下：

初次免疫抗原50μg，加福氏完全佐剂皮下多点注射

↓2周后

第二次免疫剂量减半，加福氏不完全佐剂皮下多点注射，5-7天后采集血清测抗体效价

↓2周后

第三次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下多点注射

↓1～2周

加强免疫，抗原25μg，不加佐剂，皮下多点注射

↓3天后

取脾细胞融合

第二次免疫后测定血清抗体效价如图5所示。

（2）杂交瘤制备和筛选

A．骨髓瘤细胞株培养

骨髓瘤细胞采用单克隆抗体制备的常用细胞株SP2/0。融合前细胞用含有8-氮鸟嘌呤的培养液处理，杀死对HAT不敏感的返祖细胞。融合时选择对数期生长且细胞形态和活性好的细胞，融合前一天用新鲜培养液调整细胞密度约为2×10⁵cells/ml，第二天的细胞即可用于融合。

B．饲养层细胞制备

刚融合的细胞比较脆弱，难以生长，需要添加一些饲养层细胞才能较快的促进细胞生长。细胞融合所用饲养层细胞为小鼠腹腔细胞。选择与免疫小鼠相同品系的Balb/c小鼠(6-8周)，无菌条件下向小鼠腹腔注入预冷的培养液5-6ml，轻揉几次后取出即为小鼠腹腔细胞，无血清培养液洗两次后，用10%FBS培养液重悬，调整细胞密度至1×10⁵cells/ml。提前一天铺96孔板。

C．细胞融合

加强免疫后第三天，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在50%的PEG介导下进行细胞融合，随后用培养液终止融合作用。融合时脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为10:1。融合完成后将细胞加入到提前一天铺有饲养层细胞的96孔板中。

D．阳性克隆筛选及亚克隆

使用间接ELISA方法筛选阳性克隆。筛选用抗原为实施例4中纯化的重组人sST2蛋白，二抗使用HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体(Abmart)。经确认的阳性克隆使用有限稀释法进行亚克隆，经三次克隆化后均为阳性的细胞克隆即为单克隆株，可扩大培养和冻存。

（3）腹水制备

选择6-8周Balb/c小鼠用于腹水的制备。具体操作为每只小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-10天后注射已经定株的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞量为1-3×10⁶cells。1-2周后可见小鼠腹部明显膨大，用注射器抽取腹水，从腹水中即可纯化获得大量的抗体

（4）抗体纯化

使用仪器：Bio-Rad EM-1 Econo UV Monitor，Econo Gradient Pump

溶液配制：结合缓冲液:20mM sodium phosphate，pH7.0;洗脱缓冲液:0.1M glycine-HCl，pH2.7;中和缓冲液:1M Tris-HCl，pH9.0;PBS:10mM sodiumphosphate，pH 7.4

处理过程：

取腹水离心(2000rpm离心5min)，吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，用冷的结合缓冲液进行20倍稀释，12000rpm离心15min，取上清用0.45μm滤膜过滤后静置至无气泡。按照Bio-Rad仪器的使用操作规程使用甲醇和ddH₂O对仪器管道进行清洗。连接好HiTrap PtoteinG HPcolumn(1ml或5ml)，设置好流速和紫外吸收值。然后按照以下步骤进行纯化。

20ml纯水清洗→20ml结合缓冲液平衡→上样→10ml结合缓冲液清洗→20ml洗脱缓冲液洗脱(在吸光值到达高值之前，用单独的收集管收集，一旦出现吸光值，马上分多管收集，建议前一两管单独收集，并且一管收集1-2ml，每ml洗脱液中可加入60–200μl中和缓冲液。)→20ml纯水清洗→20ml 20%乙醇清洗，拆下柱子置4℃储存。各个流程均取样品，加入loading缓冲液，沸水浴10min，样品用SDS-PAGE分析抗体纯度(如图6所示)。其余的洗脱液收集至预处理好的透析袋中，用PBS溶液在4℃透析24h，中间更换3-4次透析液。收集透析后样品加入甘油至终浓度为50%，用Bio-Rad Bradford试剂测定抗体浓度，纯化好的抗体分装后置-80℃冰箱保存。

实施例6、单克隆抗体免疫印迹(Western Blot)应用与比较

样品处理：取实施例2中纯化的重组人sST2蛋白经Bio-Rad Bradford试剂。测定浓度后，稀释样品至重组人sST2蛋白浓度为0.2mg/ml，加等量的2×SDS-PAGE loading缓冲液，100℃处理10min，上样(10孔PAGE胶每孔上样量为20μl，重组人sST2蛋白含量1μg，每条泳道加入0.2μl PageRuler PrestainedProtein Ladder 10-170kDa，Cat No.:26616用于指示泳道位置)，10%的SDS-PAGE电泳，(电泳条件90V，30min，接着120V，40min)转膜(恒流条件下200mA，60min)。转印完成后的PVDF膜室温下置5%脱脂牛奶中封闭60min。TBST洗3次后，将膜按照泳道位置剪成小条，每一条分别置1ml终浓度为1μg/ml的单克隆抗体中(单克隆抗体来自于实施例5中纯化的抗体8D9，7C11，9B3，11E2，1A11，7F9，1A1和R&D公司的商业化抗体MAB523)，室温孵育1h后用TBST溶液洗5次，将所有膜小片置1:5000稀释的IRDye 800CW Goatanti-Mouse IgG(H+L)抗体溶液中孵育1h，TBST洗5次后使用ODYSSEYINFRARED IMAGING SYSTEM扫描，并使用仪器自带的分析软件进行定量WB分析，结果如图7所示。

定量WB分析结果显示单克隆抗体8D9，7C11比R&D公司商业化抗体MAB523检测效果好。

另取相同的样品用15孔胶进行免疫印迹分析灵敏度验证，将处理好的样品使用2×SDS-PAGE上样缓冲液进行2倍梯度稀释，共稀释5个梯度(每孔上样量分别为1μg，0.5μg，0.25μg，0.125μg，0.063μg)，按照上面的免疫印迹处理方法分析，结果如图7所示，结果分析显示单克隆抗体8D9，7C11分析灵敏度比R&D公司商业化抗体MAB523高。

通过上述免疫印迹分析显示，单克隆抗体8D9，7C11在免疫印迹分析中具有比R&D公司商业化抗体MAB523更好的分析效果。

实施例7、单克隆抗体免疫沉淀(IP)应用

取实施例2中筛选得到的果蝇S2细胞稳转株，正常传代至T75 Flask后48h，加入终浓度为5μM的诱导剂CdCl₂，诱导重组人sST2蛋白表达。加入诱导剂后72h收集细胞培养上清液，取1ml上清液液加至1.5mlEP管中，向上清液中加入20μl Recombinant Protein G (rProtein G)Agarose(Invitrogen：15920-010)，EP管置旋转摇床上4℃孵育1h，12000rpm离心5min，收集离心上清液，分别向每个EP管中加入50μl Recombinant Protein G (rProtein G)Agarose和实施例5中纯化的抗体8D9，7C11，9B3，11E2，1A11，7F9，1A1和R&D公司的商业化抗体MAB523各1μg，EP管置旋转摇床上4℃孵育过夜，12000rpm离心5min，收集离心后的沉淀物，用预冷的PBS洗3次后向每个EP管中加入100μl2×SDS-PAGE loading 缓冲液，100℃煮10min后，12000rpm离心5min收集上清液，取20μl样品跑10%SDS-PAGE胶，经转印，封闭，一抗(His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart))孵育，清洗，二抗IRDye 800CW Goatanti-Mouse IgG(H+L)孵育，清洗后用ODYSSEY INFRARED IMAGINGSYSTEM扫描，结果如图8所示。

实施例8、单克隆抗体流式细胞术(FACS)应用与比较

细胞染色过程：冻存的PBL细胞复苏后，37℃培养4-6小时，收集细胞，用预冷的FACS Buffer(PBS，5%FBS，0.1%NaN3 sodium azide)调整细胞数至5×10⁶cell/ml。加入100μl细胞悬液至12x75mmBD Falcon tubes (cat # 352052)中，加入1μg实施例5中纯化的抗体8D9，7C11，9B3，11E2，1A11，7F9，1A1和R&D公司的商业化抗体MAB523，冰上孵育1h后，用FACS 缓冲液洗3次(1000rpm、5min)。取5μl IgG (H+L)，Goat Anti-Mouse，(R-PE)(Invitrogen：M30004-1)稀释至1ml预冷的FACS 缓冲液中，取100μl重悬细胞，冰上孵育1h后用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞3次。用200μl FACS 缓冲液重悬后使用BD LSRII仪器进行分析，结果如图9所示。

实施例9、双抗体夹心ELISA检测sST2

利用竞争ELISA方法和抗体配对实验分析实施例5中纯化的27株单克隆抗体。通过配对分析可获得3组抗体对(8D9&11E2，7C11&11E2，9B3&1A11，上述3对抗体对中，“&”前面的抗体为包被抗体，后面的抗体为生物素标记的检测抗体)用于夹心ELISA检测sST2，可获得较好的分析效果。

双抗体夹心ELISA检测sST2操作如下：

取上述3对抗体中的包被抗体(如8D9)用包被缓冲液(Na2CO₃：1.59g，NaHCO₃：2.93g溶解在800ml水中，调节 pH至 9.6，定容至1000ml)稀释至2μg/ml，包被空白ELISA板(Nunc：468667)，100μl/well，4℃过夜，洗涤后加入封闭液(1%BSA，PBST，pH7.4)37℃封闭2h。充分洗涤后加入待测抗原(实施例4中纯化的重组人sST2蛋白或R&D公司的ST2 Standard【(Part 893764)，0-2000pg/ml的一系列浓度梯度】37 ℃孵育1h后，用PBST洗涤4次后，加入生物素标记的检测抗体100μl(如Biotin-11E2)，37℃孵育1h后用PBST洗涤4次，加入用封闭液20000倍稀释过的 High Sensitivity Streptavidin HRPConjugate(Pierce：21130)100μl，37℃孵育30min后用PBST洗涤4次，加入HRP底物溶液(TMB)100μl，37℃孵育20min，加入50μl终止液(2MH₂SO₄)，用Molecular Device SpectraMax 190酶标仪记录450nm波长下每孔的吸光度，利用Excel表格对测定结果进行分析，测定结果如图10所示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备人sST2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将人sST2基因序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了人sST2基因序列的表达载体；所述的表达载体是果蝇S2表达系统使用的诱导分泌型表达载体；

(b)使(a)获得的插入了人sST2基因序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；所述的宿主细胞是果蝇S2细胞；

(c)培养转化的宿主细胞，从而表达出人sST2蛋白；

(d)分离获得人sST2蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His A载体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，还包括用5±2μMCdCl₂诱导表达。

4.一种通过权利要求1所述的方法制备的人sST2蛋白。

5.一种单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性地抗权利要求4所述的人sST2蛋白。

6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的亚型为IgG，κ。

7.如权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：8D9，7C11，11E2，9B3或1A11。

8.一种制备抗人sST2蛋白单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：培养杂交瘤细胞8D9、7C11、11E2、9B3或1A11，使用上述杂交瘤细胞制备腹水，以及从腹水中分离纯化上述细胞分泌的单克隆抗体。

9.抗人sST2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自：8D9，7C11，11E2，9B3或1A11。

10.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求5-7任一所述的抗体。