CN108181469A - 一种定量sST2的Elisa检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量sST2的Elisa检测试剂盒及其制备方法与应用，旨在提供一种操作简单、检测时间缩短、准确度高、分析性能稳定；其技术方案包括所述检测试剂盒包含有sST2稀释液、洗涤液、检测抗体、显色液、终止液、多个不同浓度的sST2标准品、sST2质控品和微孔反应板，所述微孔反应板包被了sST2单克隆捕获抗体；所述的检测抗体为生物素山羊抗人sST2单克隆抗体。

Description

一种定量sST2的Elisa检测试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种Elisa试剂盒，具体地说，是一种定量sST2的Elisa检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法。

背景技术

移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞识别受体的不同组织相容性抗原而增生分化，在受体内增生到一定程度后把受体的某些组织或器官作为靶目标进行免疫攻击而产生损害，是异基因造血干细胞移植的主要并发症和死亡原因之一，按发生时间分为急性GVHD(aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)。急性GVHD的发生率为30％-45％，发生在移植后早期，是移植后早期死亡的重要并发症之一。由于aGVHD早期表现缺乏特异性，如仅有轻微的皮肤瘙痒、皮疹、恶心、腹泻等，易与感染或不良反应相混淆，不易在发病早期明确诊断并给予即使治疗；目前对aGVHD的治疗以免疫抑制为主，首选甲泼尼龙，但近半数患者疗效欠佳，并可能减弱移植物康白血病效应、增加感染机会；且激素无效的GVHD患者移植相关死亡率增加，总生存率降低。故及早评估出aGVHD及aGVHD是否向cGVHD进展对移植的成功率非常重要。

造血干细胞移植患者术后发生aGVHD，其主要原因是供者骨髓内的成熟T淋巴细胞识别受者体内的细胞表面MHC-I和MUC-II及所递呈的多肽而导致供者的T细胞的激活、增殖并浸润到GVHD的靶器官，攻击靶器官而造成靶器官的损伤，Th1和Th2细胞在aGVHD过程中发挥重要作用。

ST2(suppression of tumorigenicity-2)是IL-1受体家族的成员之一，其特意性配体为IL-33。ST2/IL-33途径在Th2细胞介导的疾病中发挥着关键的作用；可溶性ST2(soluble ST2，sST2)可以作为IL-33的诱骗性受体，使Th2细胞向Th1细胞漂移，在aGVHD的病理生理学过程中发挥重要作用。

美国R&D Systems公司研制的Human ST2/IL-33R ELISA试剂盒利用双抗体夹心酶联免疫法在微孔板上定量检测天然和重组人ST2的浓度，可用于检测培养细胞、血清和血浆样本。该试剂盒为非即用型试剂盒，仅包含粉末状的Capture Antibody、Detection Antibody、Standard以及Streptavidin-HRP。该产品需要自己配备96孔微孔板、PBS缓冲液、洗涤液、试剂稀释液、终止液及显色液；包被Capture antibody的微孔板需要自己制备，产品检测时间非常长；且内置高浓度标准品，检测时需要事先溶解配制并逐级稀释至各标准品点，过程较繁琐并容易引入操作误差；且所有粉末状试剂需要自行溶解配制，浓度控制不易统一。同时试剂盒同样不配备质控品，实验时对检测系统进行质量控制时需要额外购买校准物质，增加检测成本和检测时间。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种定量sST2的Elisa检测试剂盒制备及其制备方法，该试剂盒操作简单、检测时间缩短、准确度高、分析性能稳定。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种定量sST2的Elisa检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有sST2稀释液、洗涤液、检测抗体、显色液、终止液、多个不同浓度的sST2标准品、sST2质控品和微孔反应板，所述微孔反应板包被了sST2单克隆捕获抗体；所述的检测抗体为生物素山羊抗人sST2 单克隆抗体。

进一步的，上述定量sST2的Elisa检测试剂盒，所述的多个不同浓度的sST2标准品为八个不同浓度的标准品。

进一步的，上述定量sST2的Elisa检测试剂盒盒，所述的八个不同浓度sST2标准品的浓度为0pg/ml、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml。

进一步的，上述的定量sST2的Elisa检测试剂盒，所述的sST2标准品是R&D公司的Human Standard与稀释液配制而成。

进一步的，上述定量sST2的Elisa检测试剂盒盒，所述的sST2稀释液为1×稀释液。

进一步的，上述定量sST2的Elisa检测试剂盒盒，所述的洗涤液为0.05％的Tween20 加入适量的PBS缓冲液配置而成的TPBS溶液。

进一步的，上述定量sST2的Elisa检测试剂盒，所述质控品是搜集临床15例aGVHD阴性样本，收集血清后混合而成的。

本发明的后一技术方案是上述的sST2的Elisa检测试剂盒的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)制备稀释液：

取10×稀释浓缩液(R&D Systems,Catalog#DY995)用超纯无菌水按1:10比例稀释待用；

2)制备定量sST2的Elisa检测试剂盒标准品和质控品：使用稀释液将人致癌抑制因子2标准品稀释得到八个浓度的sST2标准品，同时使用临床aGVHD阴性样本血清混合物作为质控品；

3)制备洗涤液：取适量Tween 20加入磷酸盐缓冲溶液PBS，配制成体积分数为0.05％的TPBS；

4)制备sST2单克隆捕获抗体工作液：取适量Human ST2捕获抗体粉末溶解于适量pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中，溶解成120ug/ml的保存液，-20℃保存。再以同样的缓冲液120倍稀释成CAW使用；

5)制备sST2单克隆抗体检测工作液：取适量的Human ST2检测抗体粉末，于1ml 的稀释液溶解成2ug/ml的保存液，再进行100倍稀释；

6)制备Stand工作液：取55ng的人致癌抑制因子2标准品溶于0.5ml稀释液配成110ng/ml的保存液；再以40ul的SAS溶于1060ul的稀释液，配置成4000pg/ml的最大浓度工作液，再依次稀释成浓度为2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml；

7)制备HRP工作液：取1ml的HRP原液加入39ml的稀释液配置成40×的HRP稀释液，再取上述溶液与稀释液配置成1×的HRP工作液；

8)制备终止液：量取10mL质量分数为18mol/L的浓硫酸沿烧杯壁缓慢注入170ml的蒸馏水中混匀，即按1:18倍稀释；或自选浓度为1mol/L的2N H₂SO₄作为终止液；

9)制备sST2单克隆抗体包被的微孔反应板：取适量Human ST2单克隆捕获抗体，加入磷酸盐缓冲液溶解成终浓度为120ug/ml的CAS保存液，-20℃储存备用；取微孔板，每孔加入50ul稀释后的sST2单克隆捕获抗体工作液CAW，覆膜后置于暗室，在20-22℃放置16-20h，甩去孔内液体，倒扣在吸水纸上拍干；用TPST清洗2次,甩去孔内液体，用吸水纸拍干；加入150ul稀释液，室温放置1h，甩去板内液体，拍干孔板，加入150ul含 2％的蔗糖的PBS溶液SP，室温放置5-10min；甩去板内液体，拍干孔板，倒扣孔板在干净的空间里干燥2h；将孔板放置在铝箔袋中，20-22℃放置过夜次日检测使用，或保存于 -20℃保存待用。

本发明提供的最后一个方案是上述定量sST2的Elisa检测试剂盒用于检测造血干细胞移植术后急性移植物抗宿主病aGVHD。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案的有益效果如下：

本发明的定量sST2的Elisa试剂盒中的多种不同浓度的sST2标准品无需进行稀释处理可以直接使用，简化了操作步骤，缩短了检测时间，实现了高效、快速检测，同时sST2质控品可以鉴定检测结果是否准确，多个不同浓度的sST2标准品可以得到不同规格的检测试剂盒，适应不同客户的使用需求；试剂盒中的微孔反应板使用的sST2单克隆捕获抗体具有高度特异性，且sST2标准品可以实现对人体血清样本中的sST2蛋白分子进行专一的定量检测；提供的八个不同浓度的sST2标准品可以得到标准曲线，根据标准曲线可以得到待测样品中人的sST2的浓度；是结合可与全自动酶标仪相结合，可以进一步有效缩短检测时间，降低检测成本和人力花费。

附图说明

图1是定量sST2的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，但并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供的一种定量sST2的Elisa试剂盒，包含有微孔反应板、检测抗体、样本稀释液、洗涤液、终止液、显色液、八个不同浓度sST2标准品、sST2质控品。

其中，sST2标准品是以稀释液对人sST2重组抗原进行稀释得到的，sST2质控品是搜集保存了临床aGVHD阴性的外周血样本所得，如图1中所示的为浓度0-4000pg/ml的标准品得到标准曲线，能够对人体血清样本中的sST2蛋白分子的表达量进行专一定量检测。

所述的八个不同浓度sST2标准品的浓度为0pg/ml、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、 500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml。

所述的sST2标准品是B&D公司的Human Standard与稀释液配制而成。所述质控品是搜集临床15例aGVHD阴性的外周血样本所得，如图1中所示的为浓度0-4000pg/ml的标准品得到标准曲线，能够对人体血清样本中的sST2蛋白分子的表达量进行专一定量检测。

所述的洗涤液为0.05％的Tween20加入适量的PBS缓冲液配置而成的TPBS溶液。

实施例2

发明提供的一种本发明提供的一种定量sST2的Elisa试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

1)制备稀释液：

取10×稀释浓缩液(R&D Systems,Catalog#DY995)用超纯无菌水按1:10比例稀释待用；

2)制备定量sST2的Elisa试剂盒标准品和质控品：使用稀释液将Human ST2Standard(R&D Systems,Catalog#840355)稀释得到八个浓度的sST2标准品，同时使用临床aGVHD阴性样本血清混合物作为质控品。

3)制备洗涤液：取适量Tween 20加入磷酸盐缓冲溶液PBS，配制成体积分数为0.05％的TPBS。

4)制备sST2单克隆捕获抗体工作液(CAW)：取适量Human ST2捕获抗体(R&DSystems, Catalog#844213)粉末溶解于适量pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中，溶解成120ug/ml 的保存液(CAS)，-20℃保存。再以同样的缓冲液120倍稀释成CAW使用。

5)制备sST2单克隆检测抗体工作液(DAW)：取适量的Human ST2DetectionAntibody(R&D Systems,Catalog#840354)粉末，于1ml的稀释液溶解成2ug/ml的保存液(DAS)，再进行100倍稀释。

6)制备Stand工作液(SAW)：取55ng的Human ST2standard(R&D Systems,Catalog#840355)溶于0.5ml稀释液配成110ng/ml的保存液(SAS)；再以40ul的SAS溶于1060ul 的稀释液，配置成4000pg/ml的最大浓度工作液，再依次稀释成浓度为2000pg/ml， 1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml。

7)制备HRP工作液：取1ml的HRP原液加入39ml的稀释液配置成40×的HRP稀释液，再取上述溶液与稀释液配置成1×的HRP工作液。

8)制备终止液：量取10mL质量分数为18mol/L的浓硫酸沿烧杯壁缓慢注入170ml的蒸馏水中混匀，即按1:18倍稀释。或自选浓度为1mol/L的2N H₂SO₄作为终止液。

9)制备sST2单克隆抗体包被的微孔反应板：取适量Human ST2单克隆捕获抗体 (#844213)，加入磷酸盐缓冲液溶解成终浓度为120ug/ml的CAS保存液，-20℃储存备用；取微孔板，每孔加入50ul稀释后的sST2单克隆捕获抗体工作液CAW，覆膜后置于暗室(20-22℃)放置16-20h。甩去孔内液体，倒扣在吸水纸上拍干。用TPST清洗2次，清洗即每孔加入150ul的TPBS，静置1min，甩去孔内液体，用吸水纸拍干。加入150ul 稀释液，室温放置1h，甩去板内液体，拍干孔板，加入150ul含2％的蔗糖的PBS溶液SP，室温放置5-10min；甩去板内液体，拍干孔板，倒扣孔板在干净的空间里干燥2h；将孔板放置在铝箔袋中，20-22℃放置过夜次日检测使用，或保存于-20℃保存待用。

本发明提供的定量sST2的Elisa试剂盒的检测原理为：采用双抗体夹心法测定sST2 蛋白的浓度水平，用sST2单克隆捕获抗体包被微孔反应板制成固相抗体，后加入sST2检测抗体孵育固定后，在微孔反应板中的不同孔中分别加入待测样本、不同浓度的sST2 标准品、质控品，加入辣根过氧化物酶制成的酶标记物，孵育后形成酶标记抗体的复合物，充分洗涤后加入TMB显色液，然后加入终止液终止反应，以sST2标准品的OD值为纵坐标、浓度为横坐标制作标准曲线，然后根据待测样本的OD值判定样本中含有的sST2的浓度。

为了更好的使用本申请提供的试剂盒，下面给出本发明的定量sST2的Elisa检测试剂盒的使用方法为：

(1)实验所需试剂及样本、平底微孔反应板从冰箱取出，在室温(18-25℃)下平衡30min；

(2)取各个浓度的标准品、质控品及实验样本50ul分别加入相应编号的孔中，覆膜后并于室温条件下100RPM摇床1h；

(3)除去孔内液体，用洗涤液清洗3次，每次甩干后均需拍干板孔内液体。

(4)于每孔内加入50ul的detection antibody，室温条件下100RPM摇床1h。

(5)甩干板孔内液体，并用洗涤液清洗3次，每次甩干后均需拍干板孔内液体。

(6)加入50ul的酶标记物HRP，避光条件下100RPM摇床20min。

(7)甩干板内液体，并用洗涤液清洗3次，每次甩干后均需拍干板孔内液体。

(9)每孔加入50ul的显色液TMB，37℃避光孵育10min后，于每孔加入30ul的终止液2N H2SO4。

(10)轻微摇晃30s，确保孔内无气泡产生，后用酶标仪在450纳米波长条件下测定各孔的OD值。

(11)以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的sST2标准品浓度为横坐标(X)，通过四参数拟合方程得到相应的曲线，根据样本的OD值计算从标准曲线上读取样本中含有的 sST2的含量。

为了证明本申请提供的技术方案的效果，下面给出本申请提供的产品效果的研究数据：

随机抽取用本发明的检测试剂盒分别对造血干细胞移植后的两例血清样本和一例正常人血清样本的检测结果，公布如下：

从以上随机结果可以看出，本发明试剂盒对造血干细胞移植后的aGVHD的阳性检出符合临床预后，因此本发明试剂盒对造血干细胞移植后aGVHD预测的临床辅助诊断具有十分重要的参考价值。

本发明sST2标准品的浓度不局限于0pg/ml、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml八个浓度；sST2质控品的浓度不局限于1000pg/ml。通过调整sST2标准品和sST2质控品的浓度，同时按照上述方法制备微孔反应板、酶标记物、样本稀释液、洗涤液、显色液和终止液，可以制备出不同规格的定量 sST2的Elisa试剂盒。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含有sST2稀释液、洗涤液、检测抗体、显色液、终止液、多个不同浓度的sST2标准品、sST2质控品和微孔反应板，所述微孔反应板包被了sST2单克隆捕获抗体；所述的检测抗体为生物素山羊抗人sST2单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的多个不同浓度的sST2标准品为八个不同浓度的标准品。

3.根据权利要求2所述定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的八个不同浓度sST2标准品的浓度为0pg/ml、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml。

4.根据权利要求3所述的定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的sST2标准品是R&D公司的Human Standard与稀释液配制而成。

5.根据权利要求4所述定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的sST2稀释液为1×稀释液。

6.根据权利要求1所述的定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为0.05％的Tween20加入适量的PBS缓冲液配置而成的TPBS溶液。

7.根据权利要求1所述的定量sST2的Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述质控品是搜集临床15例aGVHD阴性样本，收集血清后混合而成的。

8.制备权利要求1所述的sST2的Elisa检测试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备稀释液:取10×稀释剂浓缩液用超纯无菌水按1:10比例稀释待用；

2)制备定量sST2的Elisa检测试剂盒标准品和质控品：使用稀释液将人致癌抑制因子2标准品稀释得到八个浓度的sST2标准品，同时使用临床aGVHD阴性样本血清混合物作为质控品；

3)制备洗涤液：取适量Tween 20加入磷酸盐缓冲溶液PBS，配制成体积分数为0.05％的TPBS；

4)制备sST2单克隆捕获抗体工作液：取适量Human ST2捕获抗体粉末溶解于适量pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中，溶解成120ug/ml的保存液，-20℃保存。再以同样的缓冲液120倍稀释成CAW使用；

5)制备sST2单克隆检测抗体工作液：取适量的Human ST2检测抗体粉末，于1ml的稀释液溶解成2ng/ml的保存液，再进行100倍稀释；

6)制备Stand工作液：取55ng的人致癌抑制因子2标准品溶于0.5ml稀释液配成110ng/ml的保存液；再以40ul的SAS溶于1060ul的稀释液，配置成4000pg/ml的最大浓度工作液，再依次稀释成浓度为2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml；

7)制备HRP工作液：取1ml的HRP原液加入39ml的稀释液配置成40×的HRP稀释液，再取上述溶液与稀释液配置成1×的HRP工作液；

8)制备终止液：量取10mL质量分数为18mol/L的浓硫酸沿烧杯壁缓慢注入170ml的蒸馏水中混匀，即按1:18倍稀释；或自选浓度为1mol/L的2N H₂SO₄作为终止液；

9)制备sST2单克隆抗体包被的微孔反应板：取适量Human ST2单克隆捕获抗体，加入磷酸盐缓冲液溶解成终浓度为120ug/ml的CAS保存液，-20℃储存备用；取微孔板，每孔加入50ul稀释后的sST2单克隆捕获抗体工作液CAW，覆膜后置于暗室，在20-22℃放置16-20h，甩去孔内液体，倒扣在吸水纸上拍干；用TPBS清洗2次,甩去孔内液体，用吸水纸拍干；加入150ul稀释液，室温放置1h，甩去板内液体，拍干孔板，加入150ul含2％的蔗糖的PBS溶液SP，室温放置5-10min；甩去板内液体，拍干孔板，倒扣孔板在干净的空间里干燥2h；将孔板放置在铝箔袋中，20-22℃放置过夜次日检测使用，或保存于-20℃保存待用。

9.权利要求1所述的定量sST2的Elisa检测试剂盒用于检测造血干细胞移植术后急性移植物抗宿主病aGVHD。