RU2712270C2 - Способы обнаружения маркера для активного туберкулеза - Google Patents
Способы обнаружения маркера для активного туберкулеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2712270C2 RU2712270C2 RU2017127905A RU2017127905A RU2712270C2 RU 2712270 C2 RU2712270 C2 RU 2712270C2 RU 2017127905 A RU2017127905 A RU 2017127905A RU 2017127905 A RU2017127905 A RU 2017127905A RU 2712270 C2 RU2712270 C2 RU 2712270C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- immobilized
- mycolic acid
- sterol lipid
- substrate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 138
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 124
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 88
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 272
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 256
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 216
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 216
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 216
- -1 sterol lipid Chemical class 0.000 claims abstract description 199
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims abstract description 183
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims abstract description 183
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 91
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 70
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 56
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 85
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 83
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 83
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 40
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 34
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 31
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 21
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 claims description 19
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 15
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 15
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 12
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 12
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 11
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 claims description 11
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 11
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 11
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 10
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 10
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 10
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 10
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 10
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 10
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 10
- 229960000292 pectin Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 8
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- 230000003627 anti-cholesterol Effects 0.000 claims description 7
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 6
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 claims description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004038 photonic crystal Substances 0.000 claims description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 3
- 238000001566 impedance spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 293
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 64
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 description 36
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 27
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 10
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 10
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 229920001643 poly(ether ketone) Polymers 0.000 description 8
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 6
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 6
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 6
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 3
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 3
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 201000006674 extrapulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 3
- YIKKMWSQVKJCOP-ABXCMAEBSA-N 7-ketocholesterol Chemical compound C1C[C@H](O)CC2=CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@]21C YIKKMWSQVKJCOP-ABXCMAEBSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000006854 communication Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 208000036984 extensively drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000010339 medical test Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 2
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJUPKRYGDFTMTM-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole;hydrate Chemical compound O.C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 PJUPKRYGDFTMTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 239000005149 Cholesterol Linoleate Substances 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- NAACPBBQTFFYQB-UHFFFAOYSA-N Linolsaeure-cholesterylester Natural products C12CCC3(C)C(C(C)CCCC(C)C)CCC3C2CC=C2C1(C)CCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)C2 NAACPBBQTFFYQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186360 Mycobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 150000001277 beta hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- NAACPBBQTFFYQB-LJAITQKLSA-N cholesteryl linoleate Chemical group C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CC[C@H]3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)C1 NAACPBBQTFFYQB-LJAITQKLSA-N 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000011998 interferon-gamma release assay Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000001483 monosaccharide substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/5695—Mycobacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56933—Mycoplasma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/15—Devices for taking samples of blood
- A61B5/150007—Details
- A61B5/150015—Source of blood
- A61B5/150022—Source of blood for capillary blood or interstitial fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/15—Devices for taking samples of blood
- A61B5/150007—Details
- A61B5/150206—Construction or design features not otherwise provided for; manufacturing or production; packages; sterilisation of piercing element, piercing device or sampling device
- A61B5/150251—Collection chamber divided into at least two compartments, e.g. for division of samples
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/15—Devices for taking samples of blood
- A61B5/150007—Details
- A61B5/150755—Blood sample preparation for further analysis, e.g. by separating blood components or by mixing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/15—Devices for taking samples of blood
- A61B5/157—Devices characterised by integrated means for measuring characteristics of blood
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0672—Integrated piercing tool
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0681—Filter
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/087—Multiple sequential chambers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/12—Pulmonary diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к способам и устройствам для обнаружения маркера активного туберкулеза. Раскрыт способ обнаружения маркера активного туберкулеза, включающий стадии предоставления образца от человека или животного; контактирования указанного образца со стериновым липидом, где указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное; получения по меньшей мере двух фракций указанного образца; контактирования первой фракции с подложкой, несущей иммобилизованный антиген, полученный из миколовой кислоты; контактирования второй фракции с подложкой, не несущей иммобилизованный антиген, полученный из миколовой кислоты; контактирования первой и второй фракций образца с тестовой и контрольной подложками, несущими иммобилизованный антиген, полученный из миколовой кислоты; обнаружения связывания антител с антигеном и сравнения степени или меры связывания между тестовой и контрольной подложками, причем какое-либо наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой представляет собой индикатор присутствия антител к антигену в образце, который указывает на активный туберкулез у человека или животного. Кроме того, раскрыты система и наборы для обнаружения маркера активного туберкулеза, а также способы, система и наборы для предварительной обработки образца, полученного от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза. Группа изобретений обеспечивает быстрый и надежный анализ, который можно осуществлять вне профессиональной медицинской среды. 11 н. и 22 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способам обнаружения маркера для активного туберкулеза, портативному устройству для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает систему для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза, способ предварительной обработки потока образца для человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, систему для предварительной обработки потока образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, и наборы для использования в указанных способах.
Введение
Микобактерия туберкулеза представляет собой патогенный вид бактерий в семействе Mycobacteriaceae и является причинным фактором большинства случаев туберкулеза (TB).
В 2013 году девять миллионов человек заболело TB, включая 1,5 миллиона случаев среди людей с ВИЧ. В 2013 году 1,5 миллиона людей умерло от TB, включая 360000 среди людей, которые являлись ВИЧ-положительными. TB является одним из трех главных убийц женщин по всему миру, 510000 женщин погибло от TB в 2013 году. Из смертей от TB среди ВИЧ-положительных людей 50% имели место среди женщин. По меньшей мере 550000 детей заболело TB и оценочно 80000 детей, которые были ВИЧ-отрицательными, погибли от TB в 2013 году. По всему миру в 2013 году оценочно у 480000 человек развился TB с множественной лекарственной устойчивостью (MDR-TB) и оценочно было 210000 смертей от MDR-TB. К концу 2013 года из 100 стран поступили сообщения о, по меньшей мере, одном случае TB с высокой лекарственной устойчивостью (XDR-TB). Усредненно оценочно 9% случаев MDR-TB имеют XDR-TB.
Следовательно, надежный и быстрый путь диагностирования туберкулеза имеет первостепенное значение.
Разработано несколько способов диагностирования туберкулеза, но все способы обладают своими недостатками. Диагностирование активного туберкулеза, основанное только на признаках и симптомах, является затруднительном, поскольку заболевание диагностируют у тех, кто имеет подавленный иммунитет. Кожный тест на TB (также называемый туберкулиновой кожной пробой Манту), анализы крови на TB (также называемые анализами на высвобождение интерферона-гамма или IGRA) и радиография грудной клетки (рентгенография) и тесты на присутствие кислотоустойчивых бацилл (AFB) в мазке мокроты показывают некоторых из инфицированных индивидуумов за дни. Окончательный диагноз TB ставят посредством идентификации M. tuberculosis в клиническом образце (например, мокроте, гное или биоптате ткани). Однако сложный процесс культивирования для этого медленно растущего организма может занимать от двух до шести недель для культуры крови или мокроты.
Человек или животное, инфицированное M. tuberculosis, обычно продуцирует антитела, направленные против Mycobacterium. Присутствие этих антител в образце, взятом у инфицированного индивидуума, указывает на инфекцию. В WO 2005/116654 описан способ на основании этого принципа и раскрыто обнаружение маркера для активного туберкулеза. Способ из WO 2005/116654 включает получение первого, второго и третьего образцов у субъекта, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, разведение первого образца и экспонирование его части для иммобилизованного антигена миколовой кислоты в тестовом сосуде и экспонирование его части для иммобилизованного миколового антигена в контрольном сосуде. Второй образец экспонируют для содержащих антиген миколовой кислоты липосом и третий образец экспонируют для липосом, не содержащих антигены миколовой кислоты. Добавляют второй образец в тестовый сосуд и третий в контрольный сосуд и обнаруживают связывание антител с миколовой кислотой и антигеном как в тестовом, так и в контрольном сосуде. Сравнивают степень связывания между тестовыми и контрольными сосудами и меньшее связывание в тестовом сосуде является индикатором присутствия антител к антигену миколовой кислоты.
Еще одна разработка описана в WO 2013/186679, где раскрыт способ обнаружения антигеноспецифичных антител к биологическому маркеру для диагностирования активного туберкулеза, способ включает стадии: предоставления липосомной композиции, представляющей липидный антиген, которая содержит липосомы, содержащие модифицированный стерином липид и очищенный липидный компонент микобактериальной клеточной стенки или его аналог или производное; иммобилизации липосом для получения иммобилизованных антигенов миколовой кислоты, содержащий очищенный липидный компонент микобактериальной клеточной стенки или его аналог или производное; получения первого, второго и третьего образца у человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, где каждый образец может содержать антитела к антигену, первый образец имеет более низкую концентрацию за счет разведения, чем второй и третий образцы; экспонирования части первого образца для иммобилизованных антигенов миколовой кислоты в тестовом сосуде; экспонирования части первого образца для иммобилизованных антигенов миколовой кислоты в контрольном сосуде; экспонирования второго образца для липосомной композиции, презентирующей липидный антиген, предоставленной на первой стадии; экспонирования третьего образца для липосом, не содержащих антиген миколовой кислоты; добавления второго образца, после экспонирования для липосомной композиции, содержащей антиген миколовой кислоты, которая предоставлена на первой стадии, в тестовый сосуд; добавления третьего образца, после экспонирования для липосом, не содержащих миколовую кислоту, в контрольный сосуд; обнаружения связывания антител с антигеном миколовой кислоты как в тестовом, так и в контрольном сосудах в реальном времени; и сравнения степени или меры связывания между тестовым и контрольным сосудами, более слабое связывание в тестовом сосуде является индикатором присутствия антител к антигену миколовой кислоты в образце, который указывает на активный туберкулез у человека или животного, от которого происходит образец.
Способы, описанные в WO 2005/116654 и WO 2013/186679, предусматривают надежные способы диагностирования туберкулеза, но имеют некоторые недостатки. Во-первых, способы, описанные в WO 2005/116654 и WO 2013/186679, требуют обеспечения нескольких образцов от одного и того же субъекта. Во-вторых, эти способы требуют несколько стадий разведения и несколько стадий переноса образцов в различные несоединенные отсеки, что требует сложного и большого набора инструментальных частей. В-третьих, эти способы включают отдельные стадии инкубации образца и его разведений и, следовательно, несколько отдельных измерений. По этим причинам способы из WO 2005/116654 и WO 2013/186679 являются сложными и требуют времени. Фактически, полное время от получения образца от субъекта, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, до определения того, является ли индивидуум инфицированным активным туберкулезом или нет с использованием способов, раскрытых в WO 2005/116654 и WO 2013/186679, составляет оценочное время, по меньшей мере, 2 часа на образец. Кроме того, поскольку приведенные выше способы требуют сложного и большого набора инструментальных частей, указанные способы можно использовать в больничной обстановке, но не в регионах, которые лишены больниц и хорошо развитого здравоохранения, например, в развивающихся странах. В частности, в тех странах, где туберкулез наиболее распространен и где надежный и быстрый диагноз наиболее желателен.
Следовательно, изобретение направлено на то, чтобы обеспечить путь определения того, является ли индивидуум инфицированным активным туберкулезом (например, легочным или внелегочным туберкулезом) или нет, который является быстрым и надежным и который можно осуществлять вне профессиональной медицинской среды, т. е. вне больницы, например, на улице.
Сущность изобретения
В первом аспекте изобретение относится к способу обнаружения маркера для активного туберкулеза в реальном времени, как определено в п. 1.
Во втором аспекте изобретение относится к способу обнаружения маркера для активного туберкулеза в конечном анализе, как определено в п. 3.
В третьем аспекте изобретение относится к способу предварительной обработки образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, как определено в п. 6.
В четвертом аспекте изобретение относится к портативному устройству, как определено в п. 11.
В пятом аспекте изобретение относится к системе для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза, как определено в п. 10 и п. 17.
В шестом аспекте изобретение относится к системе для предварительной обработки образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, как определено в пп. 15 и 16.
В седьмом аспекте изобретение относится к наборам, как определено в пп. 22 и 23.
Описание фигур
На фиг. 1 представлен образцовый вариант осуществления устройства по изобретению.
На фиг. 2 представлен образцовый вариант осуществления системы по п. 32.
Описание изобретения
Принцип изобретения основан на наблюдении автора изобретения о том, что антитела против производных миколовой кислоты в образце можно обнаруживать быстро и надежно, если образец предварительно обрабатывают в соответствии со стадиями i)-v) способов, описанных далее.
Способ обнаружения в реальном времени
Настоящее изобретение в одном из аспектов относится к способу обнаружения антител против производных миколовой кислоты, таких как антитела к факторам жгутообразования или антителам к миколовой кислоте (MA) в образце, в котором обнаружение имеет место в реальном времени.
Этот способ включает стадии:
i) предоставления образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) приведения указанного образца в контакт со стериновым липидом;
iii) получения, по меньшей мере, двух фракций указанного образца до или после его экспонирования для указанного стеринового липида;
iv) экспонирования первой из указанных фракций для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
v) экспонирования второй из указанных фракций для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
vi) экспонирования фракции образца, экспонированной на стадии iv), для тестовой подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и экспонирования фракции образца, экспонированной на стадии v), для контрольной подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
vii) обнаружения связывания антител с антигеном со стадии vi) в реальном времени; и
viii) сравнения степени или меры связывания антител между тестовой и контрольной подложками, какое-либо наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой является индикатором присутствия антител к антигену в образце, который указывает на активный туберкулез у человека или животного, от которого происходит образец. Этот способ на всем протяжении заявки упоминают как «способ в реальном времени».
Способ в реальном времени позволяет анализировать образцы, предпочтительно образцы крови, надежным и быстрым образом без необходимости переносить образцы из и в несколько сосудов. Последующие стадии предварительной инкубации образца со стериновым липидом, за которыми следует проведение стадии предварительной инкубации фракции образца с полученным из миколовой кислоты антигеном для того, чтобы получать тестируемый образец, и предварительной инкубации другой фракции образца без полученного из миколовой кислоты антигена для того, чтобы получать контрольный образец, делают образец подходящим для непосредственного применения на возможной стадии обнаружения, которая влечет связывание антигенов миколовой кислоты в предварительно обработанном образце с подложкой биологического датчика, несущей миколовую кислоту. Подложка биологического датчика, следовательно, не требует предварительной инкубации или предварительной обработки датчика с разведением образца. Соответственно, способ по изобретению не требует нескольких стадий разведения и переноса, требуемых в способах известного уровня техники.
Кроме того, способ в реальном времени по изобретению благоприятно подходит для осуществления посредством портативного устройства, в частности, посредством устройства, которое определено далее. Это делает возможным определение того, является ли или нет индивидуум инфицированным активным туберкулезом (например, легочным или внелегочным туберкулезом), быстрым и надежным путем, допуская обнаружение туберкулеза меньше чем за 15-25 минут. Кроме того, способ можно осуществлять вне профессиональной медицинской среды.
В частности, способ в реальном времени предусматривает быстрый способ определения того, является ли или нет индивидуум инфицированным активным туберкулезом, в качестве теста в месте оказания медицинской помощи, т.е. в качестве теста в месте ухода за пациентом или около него. Тест по настоящему изобретению предусматривает простые медицинские тесты, которые можно осуществлять около кровати.
Кроме того, способ в реальном времени требует взятия только одного образца у субъекта, этот образец можно использовать непосредственно в способе по изобретению.
Далее способ в реальном времени по изобретению объяснен более подробно со ссылкой на стадии способа в реальном времени.
Стадия i (способ в реальном времени).
Способ в реальном времени по изобретению основан на диагностическом тестировании образцов, в частности, образцов крови человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза. С этой целью на стадии i) способа в реальном времени по изобретению предоставляют образец от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза. Образец предпочтительно представляет собой образец цельной крови. Образец можно получать с помощью любого обычного средства получения крови от субъекта. Для использования в способе по изобретению можно использовать образцы, которые собраны на более раннем этапе, сохранены до использования в подходящих условиях и предоставлены в подходящий момент. Альтернативно, образец можно использовать в способе по изобретению по месту, т.е. в качестве теста в месте оказания медицинской помощи. В последней ситуации портативное устройство по изобретению будет особенно подходящим для использования.
В случае, если образец представляет собой образец цельной крови, образец, в зависимости от пути обнаружения связывания антител с антигеном, можно фильтровать или отделять на плазму или сыворотку перед стадией ii). В случае, если обнаружение осуществляют с помощью обнаружения различий в массе, стадия фильтрования может быть предпочтительной для того, чтобы отфильтровать компоненты большой массы, такие как клетки крови. В случае, если связывание обнаруживают посредством флуоресценции, можно выбирать не фильтровать образец. Это даже сократит время, необходимое для диагноза.
Образец предпочтительно представляет собой образец, полученный из крови. Образец может представлять собой образец цельной крови, образец плазмы или образец сыворотки. Сыворотка крови представляет собой плазму крови без факторов свертывания и является предпочтительной как плазма. Следовательно, в этой заявке слово плазма может также относиться к сыворотке (крови). Выбор плазмы крови или сыворотки крови зависит от того, разработано ли устройство по изобретению для разделения цельной крови на плазму или сыворотку. Сыворотка является предпочтительной, поскольку она содержит меньше различных материалов, чем плазма крови, что может вести к неспецифичным взаимодействиям или нежелательной биологической активности. Вдобавок сыворотка может иметь более низкую вязкость, чем плазма крови. Следовательно, использование сыворотки может устранять необходимость разбавлять образец, что экономит время и материалы.
Приблизительно 55% цельной крови состоит из плазмы/сыворотки. Если образец цельной крови не фильтруют превосходно или если физическое состояние пациента требует этого, может быть желательно разбавлять образец цельной крови или плазму или сыворотку. Слова плазма или сыворотка в этой заявке, следовательно, также могут относиться к разбавленной плазме или сыворотке.
Разведение крови или плазмы, следовательно, можно реализовать в способе в реальном времени по изобретению, например, разведение от 250× до 5000×, разведение от 750× до 1250×, например, такое как разведение 4000×, 2000× или 1000×. В зависимости от вязкости образца, такое разведение может иметь место до стадии отделения плазмы от крови или после стадии отделения или альтернативно стадии отделения. Например, стадия разведения может иметь место после стадии отделения, но перед стадией iv) или v), или после стадии v)/vi) и перед стадией vii). Предпочтительно разводить образец после стадии v)/vi) и перед стадией vii) т.е. непосредственно перед попаданием образца в биологический датчик. Таким образом, объем образца сохраняют как можно меньшим во время большинства стадий способа, что полезно для скорости процесса и компактности устройства, используемого в нем.
Разведение можно осуществлять с использованием любого подходящего разбавителя, например, буфера на основе PBS. Такой буфер, например, может представлять собой буфер PBS/AE, который содержит NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4 и EDTA в воде при физиологическом pH. Такой буфер может представлять собой буфер на основе PBS, состоящий из 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 0,2 г KH2PO4 и 1,05 г Na2HPO4 на литр дважды дистиллированной деионизированной воды, содержащей 1 мМ EDTA и 0,025% (масс./об.) азида натрия, которую корректируют до pH 7,4.
Образец цельной крови или плазмы или сыворотки дополнительно можно разбавлять средствами, которые предотвращают свертывание крови, такими как EDTA, гепарин или цитрат.
Необязательно детергент можно добавлять в низкой концентрации в кровь/плазму/сыворотку для того, чтобы избегать прилипания компонентов к стенкам трубок, сосудов или контейнеров.
Стадия ii (способ в реальном времени).
На стадии ii, образец экспонируют для стеринового липида, т.е. приводят в контакт с ним.
Несмотря на то, что авторы изобретения не желают ограничиваться какой-либо теорией, допускают, что стериновый липид удаляет антихолестериновые антитела из образца, которые иначе будут обеспечивать перекрестную реактивность с антигенами миколовой кислоты на подложке датчика и давать ложный положительный диагноз туберкулеза.
Время экспонирования образца для стеринового липида предпочтительно составляет меньше чем 10 минут, например, от 2 до 8, от 3 до 7, от 4 до 6 или приблизительно 5 минут. Время экспонирования зависит от способа, которым образец приводят в контакт со стериновым липидом.
Один образцовый способ экспонирования образца для стеринового липида состоит в том, чтобы вводить образец в длинный спиральный канал и пропускать его по длине канала, который предварительно покрывают стериновым липидом, который предпочтительно представляет собой холестерин. В конце канала экспонированный для стеринового липида образец может проходить средство для деления потока образца, такое как точка ветвления с пассивным клапаном, которое ведет разделенные потоки образца к следующей подложке, несущей иммобилизованный полученный из миколовой кислоты антиген со стадии v), и подложке, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген со стадии vi), т.е. к контейнеру, содержащему подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и контейнеру, содержащему подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, соответственно.
Альтернативный образцовый способ экспонирования образца для стеринового липида состоит в том, чтобы инъецировать его в контейнер, покрытый холестерином, после чего следует инкубация в нем в течение меньше чем 10 минут.
Цельная кровь/плазма/сыворотка содержит сотни молекул различных типов со свойствами от гидрофильных до гидрофобных. Следовательно, следует использовать материал подложки, который инертен к неспецифичному связыванию молекул этого образца. В этом контексте подложку следует понимать, как несущий материал.
Стадии iv и v (способ в реальном времени).
На следующей стадии фракцию экспонированного для стеринового липида образца экспонируют для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия iv)), а другую фракцию экспонированного для стеринового липида образца для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия v)).
Для того чтобы получать, по меньшей мере, две фракции, в определенный момент в процессе нужно делить поток крови/плазмы (стадия iii способа в реальном времени). В целях удобства и для того, чтобы оптимизировать надежность способа, предпочтительно делить поток после экспонирования для стеринового липида, т.е. этот экспонированный для стеринового липида образец делят, по меньшей мере, на две фракции для того, чтобы предоставить тестовый поток и контрольный поток. Предпочтительно образец делят на две равные или по существу равные фракции, поскольку это делает возможным простое сравнение обеих фракций без необходимости корректирующих вычислений. Деление потока образца можно осуществлять с помощью какого-либо средства для деления потока, образца, такого как точка ветвления с пассивным клапаном.
Альтернативно поток образца (который фильтруют до плазмы или сыворотки) делят, по меньшей мере, на две фракции после стадии фильтрования, но перед экспонированием для стеринового липида. Альтернативно кровоток делят перед фильтрованием. Это менее предпочтительно, поскольку в этом случае будут необходимы два фильтра.
Подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, со стадий iv) и v) предпочтительно выполняют из одного и того же материала.
Кроме того, поскольку как стериновые липиды, (например холестерин), так и производные миколовой кислоты являются гидрофобными, подложки для экспонирования на стадиях iv) и v) будут из того же материала, что подложка, которую можно использовать на стадии ii). Понятно, что подходящий материал подложки инертен к неспецифичному связыванию молекул этого образца.
Время экспонирования образца для стеринового липида предпочтительно составляет меньше чем 10 минут, например, от 2 до 8, от 3 до 7, от 4 до 6 или приблизительно 5 минут.
Один образцовый путь экспонирования образца для подложек со стадии iv) и v) состоит том, чтобы вводить разделенные потоки образца в длинные спиральные каналы, предпочтительно реализованные в микрочипах, или предварительно покрытые производным миколовой кислоты (стадия iv) или без производного миколовой кислоты (стадия v), и пропускать их вдоль длины этих каналов. Расстояние до биологического датчика в обоих каналах должно иметь одну и ту же длину. Важно, чтобы былокак можно меньше неспецифичного связывающего материала подложки.
Альтернативный образцовый путь экспонирования разделенных экспонированных для стеринового липида образцов для подложки, или покрытой производным миколовой кислоты или без производного миколовой кислоты, состоит в том, чтобы инъецировать первый поток в контейнер, содержащий подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия iv), и второй поток образца в контейнер, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия v), и инкубировать образцы в течение меньше чем 10 минут, например, от 2 до 8, от 3 до 7, от 4 до 6 или приблизительно 5 минут.
Стадия vi (способ в реальном времени).
На этой стадии разделенные потоки экспонированного для стеринового липида образца, или экспонированные для производных миколовой кислоты на стадии iv (тестовый поток) или не на стадии v (контрольный поток), пропускают к дополнительным подложкам, тестовой и контрольной подложкам соответственно, несущим производные миколовой кислоты, предпочтительно те же производные, что и на стадии iv.
Эти тестовые и контрольные подложки содержатся в биологическом датчике, содержащем первую камеру (тестовую камеру) с тестовой подложкой для приема тестового потока, экспонированных для производных миколовой кислоты на стадии iv), и во второй камере (контрольной камере) с контрольной подложкой для приема контрольного потока, не экспонированного для производных миколовой кислоты на стадии v). Подложки в обоих камерах предпочтительно выполняют из одного и того же материала и несут одно и то же производное миколовой кислоты. Биологический датчик в этом контексте может представлять собой какое-либо средство, способное генерировать поддающийся измерению сигнал, когда антитела контактируют с производными миколовой кислоты на тестовой и контрольной подложках.
Предпочтительно тестовая и контрольная подложки со стадии vi) основаны на диоксиде кремния, такие как подложки, основанные на диоксиде кремния. Подложки, основанные на диоксиде кремния, в частности, можно использовать при использовании технологии кольцевого резонанса для того, чтобы обнаруживать связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты. Предпочтительно обнаружение осуществляют с использованием чипа биологического датчика с использованием кольцевого резонатора на основе Si. Это позволяет осуществлять способ по изобретению с использованием очень компактного устройства.
Также вполне возможно, что подложки со стадии vi) основаны на золоте. Подложки на основе золота, в частности, можно использовать, когда поверхностный плазмонный резонанс или электрохимическую импедансную спектроскопию используют для того, чтобы обнаруживать связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты.
Стадии vii и viii (способ в реальном времени).
На стадии vii обнаруживают связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты. Поскольку обнаружение имеет место в реальном времени, связывание антител на подложках со стадии vi непосредственно обнаруживают во время процесса связывания. Следовательно, следует понимать, что стадии vi и vii не являются стадиями, которые должны иметь место в отдельные моменты времени. Также это применимо для стадии viii, т.е. сравнения связывания с тестовой и контрольной подложками, и обнаружение может иметь место, пока процесс связывания со стадии vii все еще протекает. Для обнаружения, в принципе, можно использовать все способы анализа без меток в реальном времени, такие как поверхностный плазмонный резонанс или калориметрия изотермического титрования, электрохимическая импедансная спектроскопия, интерферометрия биослоя, оптические решетки, фотонный кристалл, акустическое резонансное профилирование, микровесы с кристаллом кварца.
Обнаружение связывания антител и/или другого материала с антигеном миколовой кислоты можно осуществлять в автоматизированном устройстве. Различные автоматизированные устройства известны специалисту в данной области, и специалист сможет выбирать подходящие средства программного обеспечения, чтобы выполнять на стадии viii) сравнение степени или меры связывания между тестовой и контрольной подложками, где любое наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой представляет собой индикатор присутствия антител к антигену в образцах, который относится к активному туберкулезу у человека или животного, от которого происходят образцы. В этом контексте следует понимать, что меньшее можно интерпретировать качественно и количественно, т.е. меньшее связывание можно интерпретировать как наличие меньшего числа событий связывания, а также как наличие более слабого связывания.
Устройство для осуществления способа в реальном времени.
В другом аспекте изобретение относится к портативному устройству для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза в реальном времени, которое содержит, по меньшей мере, один контейнер, содержащий стериновый липид, который устроен и выполнен с возможностью принимать поток образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза; средство для деления указанного потока образца, по меньшей мере, на первый и второй поток образца; указанное средство подсоединено выше по потоку или ниже по потоку от указанного, по меньшей мере, одного контейнера, содержащего стериновый липид; дополнительный контейнер для приема указанного первого потока образца в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид и содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; еще один дополнительный контейнер для приема второго потока образца, расположенный параллельно указанному дополнительному контейнеру и в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и биологический датчик, содержащий первую камеру для приема первого потока образца в соединении с указанным дополнительным контейнером, который содержит подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и вторую камеру для приема второго потока образца в соединении с указанным еще одним дополнительным контейнером, содержащую ту же подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, что и первая камера.
Предпочтительно, устройство по изобретению содержит проникающий в кожу конец, соединенный с первой трубкой, которая устроена и выполнена с возможностью принимать образец крови от проникающего в кожу конца и нести указанный образец крови от участка кожи в указанный контейнер, содержащий стериновый липид.
В другом предпочтительном варианте осуществления устройство содержит блок фильтра в соединении с указанной первой трубкой для приема указанного образца крови и выполнено с возможностью отделять плазму от указанного образца цельной крови.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления портативное устройство содержит проникающий в кожу конец, соединенный с первой трубкой, который устроен и выполнен с возможностью принимать образец крови от проникающего в кожу конца и нести указанный образец крови от участка кожи; блок фильтра в соединении с указанной первой трубкой для приема указанного образца крови, и выполненный с возможностью отделять плазму от указанного образца цельной крови; первый контейнер для приема указанного образца, указанный первый контейнер содержит стериновый липид; средство для деления указанного образца, по меньшей мере, на первый и второй поток образца; второй контейнер для приема указанного первого потока образца, указанный второй контейнер содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; третий контейнер для приема второго потока образца, указанный третий контейнер содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; и биологический датчик, содержащий первую камеру для приема первого потока образца в соединении со вторым контейнером, который содержит подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и вторую камеру для приема второго потока образца в соединении с третьим контейнером, содержащим ту же подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, что и первая камера.
Поток через аппарат предпочтительно приводят в движение посредством насоса, предпочтительно насоса с непрерывным потоком, например, перистальтического насоса или диафрагменного насоса. Насос предпочтительно располагают ниже по потоку от биологического датчика для того, чтобы он мог всасывать образец через аппарат и предотвращать контаминацию образца перед анализом.
Проникающее в кожу средство может представлять собой любое подходящее средство для того, чтобы получать образец крови у человека или животного, такое как шприц с иглой или тому подобное.
Первая трубка имеет размеры, которые подходят для целей устройства, т.е. она должна быть хорошо адаптируемой к проникающему в кожу средству и первому контейнеру.
Компоненты устройства, т.е. контейнеры, средство для разведения, блок фильтра и биологический датчик, могут быть взаимосвязаны посредством подходящих связывающих трубок. Альтернативно компоненты устройства можно разрабатывать так, что их можно соединять непосредственно друг с другом. Материал трубок, используемых в изобретении, может представлять собой любой подходящий материал, который известен специалисту в области тестирования образцов крови. Подходящие материалы являются инертными к компонентам крови/плазмы/сыворотки и включают политетрафторэтилен (например Teflon®), полипропилен, полиэфиркетон (PEEK) и полиэтилен.
Дополнительные компоненты можно подсоединять между компонентами устройства. Такие дополнительные компоненты можно соединять в трубки, связывающие компоненты непосредственно прикрепляют к компонентам.
Устройство по изобретению также может содержать средство для разведения крови или плазмы. Такое средство можно реализовать перед содержащим стериновый липид контейнером, перед блоком фильтра, между блоком фильтра и содержащим стериновый липид контейнером, между содержащим стерин контейнером и другим (дополнительным и еще одним дополнительным или (вторым и третьим) контейнерами или между дополнительным/еще одним дополнительным или вторым/третьим контейнерами и соответствующими камерами биологического датчика. Предпочтительно средство для разведения образца подсоединяют между дополнительным или вторым контейнером и биологическим датчиком и между еще одним дополнительным или третьим контейнером и биологическим датчиком. Например, 10 мл контейнер можно реализовать на выпуске дополнительного или второго и еще одного дополнительного или третьего контейнеров. Подходящий буфер может уже присутствовать в контейнере или его можно добавлять в этот контейнер, чтобы обеспечивать желаемое разведение. Таким образом, объем образца должен быть как можно меньшим во время большинства стадий способа по изобретению, что полезно для скорости процесса и компактности устройства по изобретению.
Контейнеры могут представлять собой сосуды или канал или трубку, например, спиральный канал или спиральная труба. Спиральный канал или труба является предпочтительной, поскольку такая структура занимает мало места, при этом сохраняя длинный путь потока. Спиральный канал или трубу можно полезно реализовать на микрочип. Это вносит вклад в компактность устройства по изобретению.
Блок фильтра может содержать фильтровальную матрицу. Предпочтительно фильтр реализуют на фильтровальном микрочипе с целью компактности.
Материал контейнеров предпочтительно является одним и тем же, и подходящими материалами могут быть стекло bk-7, политетрафторэтилен, полипропилен, полиэфиркетон или полиэтилен.
Подложки контейнеров должны представлять собой материал, который инертен к неспецифичному связыванию молекул образца, например, стекло bk-7, политетрафторэтилен, полипропилен, полиэфиркетон или полиэтилен.
Устройство содержит контейнер, содержащий подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (второй контейнер), и контейнер, содержащий подложку, не несущую иммобилизованный полученный из миколовой кислоты антиген. Вместо иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты, антигена, последний контейнер может иметь инертное покрытие или не иметь покрытия, до тех пор, пока не возникает неспецифичное связывание.
Предпочтительно тестовая и контрольная подложки камер биологического датчика основаны на диоксиде кремния, например, подложки на основе диоксида кремния. Подложки, основанные на диоксиде кремния, в частности, можно использовать, когда технологию кольцевого резонанса используют для того, чтобы обнаруживать связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты.
Биологический датчик содержит первую и вторую камеру. Следует понимать, что две камеры не обязательно находятся в одном отсеке или корпусе. Например, биологический датчик может содержать два отдельных блока датчика, каждый содержит камеру с подложкой, несущей антигены производного миколовой кислоты, один блок датчика связан через трубку с контейнером, содержащим подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, другой блок датчика связан через трубку с контейнером, содержащим подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген.
Предпочтительно, биологический датчик содержит кольцевой резонатор на основе Si. Это позволяет устройству по изобретению быть очень компактным.
В этом отношении изобретение также относится к биологическому датчику, который содержит, по меньшей мере, две камеры, содержащих подложку на основе диоксида кремния с иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном и Si кольцевой резонатор.
Также вполне возможно, что подложки камер биологического датчика основаны на золоте. Подложки на основе золота, в частности, можно использовать, когда поверхностный плазмонный резонанс или электрохимическую импедансную спектроскопию используют для того, чтобы обнаруживать связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты.
Устройство по изобретению можно соединять с любым подходящим автоматизированным средством анализа, таким как компьютер с подходящими программами программного обеспечения, чтобы осуществлять сравнение связывания антител к миколовой кислоте с иммобилизованными антигенами в камерах биологического датчика.
Образцовый вариант осуществления устройства по изобретению представлен на фиг. 1.
На фиг. 1 представлена игла 1 для проникновения в кожу, соединенная с первой трубкой 2, которая устроена и выполнена с возможностью принимать кровь из иглы 1 и переносить определенное количество крови от участка кожи. Трубка 1 соединена с блоком 3 фильтра. Этот блок фильтра служит для отделения плазмы от указанного образца цельной крови. Блок 3 фильтра соединен через трубку 13 с первым контейнером 4, который имеет форму спирального канала, внутренняя стенка которого покрыта стериновым липидом. Спиральный канал соединен через трубку 14 со средством 5 для деления плазмы в форме точки ветвления с пассивным клапаном. Одна ветвь точки ветвления соединена через трубку 16 со вторым контейнером 6 для приема первого потока плазмы, который содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген. Другая ветвь точки ветвления соединена через трубку 15 с третьим контейнером 7 для приема второго потока плазмы, который содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген. Контейнеры 6 и 7 в этом варианте осуществления представлены в форме спирального канала, внутренняя стенка которого или покрыта полученным из миколовой кислоты антигеном (контейнер 6) или не покрыта полученным из миколовой кислоты антигеном (контейнер 7). Контейнеры 6 и 7 соединены, соответственно, через трубки 17 и 18 с контейнерами 11 и 12 для разведения, соответственно. Эти контейнеры можно предварительно заполнять подходящим буфером для разведения из впусков 21, 22 контейнеров для введения буфера для разведения. Контейнеры 11 и 12 для разведения соединяют через соответствующие трубки 19 и 20 с тестовой камерой 9 биологического датчика 8 и с контрольной камерой 10 биологического датчика 8, соответственно. Тестовые и контрольные камеры 9 и 10 содержат одну и ту же подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген.
Набор.
В другом аспекте изобретение относится к набору для использования в диагностировании туберкулеза с использованием способа обнаружения в реальном времени, который содержит одно или несколько проникающих в кожу средств; одну или несколько трубок; один или несколько контейнеров, покрытых стериновым липидом и необязательно фосфатидилхолином, пектином, амфотерицином B или β-циклодекстрином; один или несколько контейнеров, содержащих подложку с иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном; один или несколько контейнеров, содержащих подложку без иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты, антигена; и один или несколько биологических датчиков, содержащих, по меньшей мере, две камеры, содержащих подложку с иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном; и необязательно средство для разведения крови или плазмы и/или блок фильтра.
Набор также может содержать инструменты для того, чтобы собирать компоненты, такие как винты, зажимы, клей, лента, отвертки и т.д.
Набор также может содержать средства для того, чтобы разводить кровь или плазму во время анализа крови. Такое как контейнер (например, 10 мл), подлежащий реализации на выпуске второго и третьего контейнеров. Подходящий буфер уже может присутствовать в контейнере или его можно добавлять в этот контейнер, чтобы обеспечивать желаемое разведение.
Компоненты набора позволяют человеку, который должен осуществлять диагностический тест на туберкулез, собирать устройство по изобретению по месту, т.е. в месте оказания медицинской помощи. Следовательно, следует понимать, что компоненты набора имеют те же характеристики и предпочтительные свойства, как изложено выше, для устройства по изобретению. Устройство по изобретению легко собирать с помощью компонентов набора по изобретению, т.е. не требуется никаких специальных технических навыков. В целях удобства, набор можно предоставлять с инструкциями для сборки и использования.
Конечный способ.
Настоящее изобретение относится в дополнительном аспекте к способу обнаружения для обнаружения антител против производных миколовой кислоты, таких как антитела к факторам жгутообразования или антитела к миколовой кислоте (MA), в образце, в котором обнаружение происходит с помощью конечного анализа.
Этот способ включает стадии:
i) предоставления образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) приведения указанного образца в контакт со стериновым липидом;
iii) получения, по меньшей мере, двух фракций указанного образца до или после его экспонирования для указанного стеринового липида;
iv) экспонирования первой из указанных фракций для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
v) экспонирования второй из указанных фракций для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
vi) экспонирования, по меньшей мере, части фракции образца, экспонированной на стадии iv), для тестовой подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и экспонирования, по меньшей мере, части фракции образца, экспонированной на стадии v), для контрольной подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
vii) обнаружения связывания антител с антигеном со стадии vi) в конечном анализе; и
viii) сравнения степени или меры связывания антител между тестовой и контрольной подложками, какое-либо наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой является индикатором присутствия антител к антигену в образце, что указывает на активный туберкулез у человека или животного, от которого происходит образец. Этот способ на всем протяжении заявки упоминают «способ конечных точек».
За стадиями предварительной обработки i)-v) не обязательно должны следовать непосредственно стадии обнаружения vi-viii). Например, фракции образцов, получаемые после стадии v), можно хранить до последующего использования или для транспортировки к подложке для обнаружения. Таким образом, практик обладает большой гибкостью при планировании своего теста. Например, тот факт, что за стадиями i)-iv) не обязательно должны следовать стадии vi)-viii), позволяет собирать предварительно обработанные образцы с тем, чтобы их можно было тестировать все сразу на одном материале подложки, что повышает надежность и воспроизводимость. Это также упрощает тестирование образцов от нескольких пациентов в одних и тех же условиях.
Следовательно, в другом аспекте изобретение также относится к способу предварительной обработки образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, для обнаружения:
i) предоставление образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) экспонирование указанного образца для стеринового липида;
iii) получение, по меньшей мере, двух фракций указанного образца до или после экспонирования его для указанного стеринового липида;
iv) экспонирование первой из указанных фракций для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
v) экспонирование второй из указанных фракций для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
где после экспонирования на стадиях iv) и v), по меньшей мере, часть фракций образца хранят для дальнейшего использования. Этот способ на всем протяжении заявки упоминают как «способ предварительной обработки».
Также конечный способ по изобретению позволяет анализировать образцы, предпочтительно образцы крови, надежным и быстрым образом. Последующие стадии предварительной инкубации i)-v) образца стериновым липидом, после чего следует то, что подвергают фракцию образца стадии предварительной инкубации с полученным из миколовой кислоты антигеном для того, чтобы получать тестируемый образец, и другую фракцию образца предварительной инкубации без полученного из миколовой кислоты антигена для того, чтобы получать контрольный образец, делает образец подходящим для непосредственного применения на возможной конечной стадии обнаружения, которая влечет связывание антигенов миколовой кислоты с предварительно обработанным образцом с подложкой, несущей миколовую кислоту. Следовательно, не требуется предварительная инкубация или предварительная обработка подложки с использованием разведения образца. Соответственно, не требуется несколько стадий разведения и переноса, необходимых в способах известного уровня техники.
Кроме того, конечный способ позволяет определять, является ли или нет индивидуум инфицированным активным туберкулезом (например, легочным или внелегочным туберкулезом) быстрым и надежным путем, что допускает обнаружение туберкулеза меньше чем за 15-25 минут. В частности, это обусловлено стадиями предварительной обработки i)-v) конечного способа и способа предварительной обработки. Кроме того, конечный способ можно осуществлять вне профессиональной медицинской среды. В частности, настоящим предусмотрен быстрый способ для определения является ли или нет индивидуум инфицированным активным туберкулезом в качестве теста в месте оказания медицинской помощи т.е. в качестве теста в месте ухода за пациентом или около него. Тест по настоящему изобретению предусматривает простые медицинские тесты, которые можно осуществлять около кровати.
Кроме того, поскольку для стадий предварительной обработки i)-v) достаточно взятия одного образца у субъекта, этот образец можно использовать непосредственно для обнаружения без дополнительной обработки.
Принцип этого аспекта изобретения далее объяснен более подробно со ссылкой на стадии конечного способа и способа предварительной обработки.
Стадия i (конечный способ/способ предварительной обработки).
Конечный способ обнаружения по изобретению основан на диагностическом тестировании образцов, в частности, образцов крови человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза. С этой целью на стадии i) предоставляют образец от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза. Образец предпочтительно представляет собой образец цельной крови. Образец можно получать с помощью любого обычного средства получения крови от субъекта. Для того чтобы использовать в способах по изобретению, можно использовать образцы, которые взяты на более раннем этапе, сохранены до использования в подходящих условиях и предоставлены в подходящий момент. Альтернативно, образец можно использовать в способе обнаружения по изобретению по месту, т.е. в качестве теста в месте оказания медицинской помощи. Другая альтернатива состоит в том, что образец предварительно обрабатывают по месту в соответствии с вышеприведенными стадиями i)-v) и получаемые предварительно обработанные образцы хранят до дальнейшего использования и/или переносят в другое местоположение, где происходит обнаружение.
В случае, если образец представляет собой образец цельной крови, образец, в зависимости от способа обнаружения связывания антител с антигеном, можно фильтровать или разделять на плазму или сыворотку перед стадией ii). В случае, если обнаружение осуществляют с помощью обнаружения различий в массе, стадия фильтрования может быть предпочтительной для того, чтобы отфильтровать компоненты с большой массой, такие как клетки крови. В случае, если связывание обнаруживают посредством флуоресценции, можно не выбирать фильтрование образца. Это дополнительно укоротит время, необходимое для предварительной обработки и диагноза.
Образец предпочтительно представляет собой полученный из крови образец. Образец может представлять собой образец цельной крови, образец плазмы или образец сыворотки. Сыворотка крови представляет собой плазму крови без факторов свертывания и является предпочтительной как плазма. Слово «плазма» в этой заявке, следовательно, также может относиться к сыворотке (крови). Выбор плазмы крови или сыворотки крови зависит от того, разработано ли устройство по изобретению для того, чтобы разделять цельную кровь на плазму или сыворотку. Сыворотка является предпочтительной, поскольку она содержит меньше различных материалов, чем плазма крови, которые могут вести к неспецифичным взаимодействиям или нежелательной биологической активности. Кроме того, сыворотка может иметь более низкую вязкость, чем плазма крови. Использование сыворотки, следовательно, может позволять избежать необходимости разведения образца, что экономит время и материалы.
Приблизительно 55% цельной крови состоит из плазмы/сыворотки. Если образец цельной крови не фильтруют превосходно, или если физическое состояние пациента делает это необходимым, может быть желательно разводить образец цельной крови или плазмы или сыворотки. Слова плазма или сыворотка в этой заявке, следовательно, также могут относиться к разбавленной плазме или сыворотке.
Разведение крови или плазмы можно реализовать в способах по изобретению. Разведение от 10× до 250× является предпочтительным, в частности, когда применяемый конечный анализ представляет собой анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом, такой как точечный анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом. В зависимости от вязкости образца, такое разведение может иметь место перед стадией отделения плазмы от крови или после стадии отделения или альтернативно стадии отделения. Например, стадия разведения может иметь место после стадии отделения, но перед стадией iv) или v) или после стадии v)/vi) и перед стадией vii).
Разведение можно осуществлять с использованием любого подходящего разбавителя, например, буфера на основе PBS. Такой буфер, например, может представлять собой буфер PBS/AE, который содержит NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4 и EDTA в воде при физиологическом pH. Такой буфер может представлять собой буфер на основе PBS, состоящий из 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 0,2 г KH2PO4 и 1,05 г Na2HPO4 на литр дважды дистиллированной деионизированной воды, содержащей 1 мМ EDTA и 0,025% (масс./об.) азида натрия, которую корректируют до pH 7,4.
Образец цельной крови или плазму или сыворотку дополнительно можно разбавлять средствами, которые предотвращают свертывание крови, такими как EDTA, гепарин или цитрат.
Необязательно в кровь/плазму/сыворотку можно добавлять детергент в низкой концентрации для того, чтобы избегать прилипания компонентов к стенкам трубок, сосудов или контейнеров.
Стадия ii (конечный способ/способ предварительной обработки).
На стадии ii образец экспонируют, т.е. приводят в контакт со стериновым липидом.
Несмотря на то, что автор изобретения не желает ограничиваться какой-либо теорией, допускают, что стериновый липид устраняет антихолестериновые антитела из образца, которые иначе будут перекрестно реагировать с антигенами миколовой кислоты на подложке и давать ложный положительный диагноз туберкулеза.
Время экспонирования образца для стеринового липида предпочтительно составляет меньше чем 10 минут, например, от 2 до 8, от 3 до 7, от 4 до 6 или приблизительно 5 минут. Время экспонирования зависит от пути, который образец приводят в контакт со стериновым липидом.
Один образцовый путь экспонирования образца для стеринового липида состоит в том, чтобы вводить образец в длинный спиральный канал и пропускать его по длине канала, который предварительно покрыт стериновым липидом, который предпочтительно представляет собой холестерин. В конце канала экспонированный для стеринового липида образец может проходить средство для деления потока образца, такое как точка ветвления с пассивным клапаном, которое направляет разделенные потоки образца к следующей подложке, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген со стадии v), и подложке, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген со стадии vi), т.е. к контейнеру, содержащему подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и контейнеру, содержащему подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген соответственно.
Альтернативный образцовый путь экспонирования образца для стеринового липида состоит в том, чтобы инъецировать его в контейнер, покрытый холестерином, после чего следует инкубация в нем в течение меньше чем 10 минут.
Другой альтернативный образцовый путь состоит в том, чтобы экспонировать образец для стеринового липида, где стериновый липид содержится в отсеке колонки. В таком отсеке стериновым липидом предпочтительно покрыты гранулы.
Цельная кровь/плазма/сыворотка богата молекулами сотен различных типов со свойствами от гидрофильных до гидрофобных. Следовательно, используют материал подложки, который инертен к неспецифичному связыванию молекул этого образца. В этом контексте следует понимать, что подложка представляет собой несущий материал.
Стадии iv и v (конечный способ/способ предварительной обработки)
На следующей стадии фракцию экспонированного для стеринового липида образца экспонируют для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия iv)), и другую фракцию экспонированного для стеринового липида образца для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия v)).
Для того, чтобы получать, по меньшей мере, две фракции, в определенный момент в процессе следует делить поток крови/плазмы (стадия iii). Для удобства и для того, чтобы оптимизировать надежность способа, поток можно делить после экспонирования для стеринового липида, т.е. этот экспонированный для стеринового липида образец делят, по меньшей мере, на две фракции, чтобы предоставить тестовый поток и контрольный поток. Предпочтительно чтобы образец делят на две равные или по существу равные фракции, поскольку это делает возможным простое сравнение обеих фракций без необходимости корректирующих вычислений. Деление потока образца можно осуществлять с помощью любого средства для деления потока образца, такого как точка ветвления с пассивным клапаном.
Альтернативно поток образца (который фильтруют до плазмы или сыворотки) делят, по меньшей мере, на две фракции после стадии фильтрования, но перед экспонированием для стеринового липида. Альтернативно кровоток делят перед фильтрованием. Это является менее предпочтительным, поскольку в этом случае потребуются два фильтра.
В случае использования колонок, поток в этом случае делят перед экспонированием для стеринового липида на стадии ii) с тем, чтобы стадии ii) и iv) могли иметь место в одной и той же колонке и стадии ii) и v) могли иметь место в другой колонке.
Подложка, несущая иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и подложка, не несущая иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген со стадий, iv) и v) предпочтительно представляют собой один и тот же материал.
Кроме того, поскольку как стериновые липиды, (например, холестерин), так и производные миколовой кислоты являются гидрофобными, подложки для экспонирования на стадиях iv) и v) могут быть из того же материала, что подложка, которую можно использовать на стадии ii). Понятно, что подходящий материал подложки инертен для неспецифичного связывания молекул из этого образца.
Время экспонирования образца для стеринового липида предпочтительно составляет меньше чем 10 минут, например, от 2 до 8, от 3 до 7, от 4 до 6 или приблизительно 5 минут.
Один образцовый путь экспонирования образца для подложек со стадии iv) и v) состоит в том, чтобы вводить разделенные потоки образца в длинные спиральные каналы, предпочтительно реализованные в микрочипах, или предварительно покрытые производным миколовой кислоты (стадия iv) или без производного миколовой кислоты (стадия v) и пропускать их вдоль длины этих каналов.
Альтернативный образцовый путь экспонирования разделенных экспонированных для стеринового липида образцов для подложки, или покрытой производным миколовой кислоты или без производного миколовой кислоты, состоит в том, чтобы инъецировать первый поток в контейнер, содержащий подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия iv), и второй поток образца в контейнер, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (стадия v), и инкубировать образцы в течение меньше чем 10 минут, например, от 2 до 8, от 3 до 7, от 4 до 6 или приблизительно 5 минут.
Другой альтернативный путь состоит в том, что стадии iv) и v) происходят в колонке. Поток в этом случае делят перед экспонированием для стеринового липида на стадии ii) с тем, чтобы стадии ii) и iv) могли проходить в одной колонке и стадии ii) и v) могли проходить в другой колонке.
Несмотря на то, что по причинам воспроизводимости и надежности способа обнаружения предпочтительно, чтобы на стадии v) указанную другую фракцию экспонированного для стеринового липида образца экспонировали для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, также может быть возможно, что стадию экспонирования указанной фракции для подложки, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, пропускают и что указанную фракцию хранят до дальнейшего использования, например, на стадии vi). Например, это может иметь место в одной и той же колонке или контейнере, в которой имела место инкубация со стериновым липидом.
Следовательно, изобретение также относится к способу, который включает стадии:
i) предоставления образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) приведения указанного образца в контакт со стериновым липидом;
iii) получения, по меньшей мере, двух фракций указанного образца до или после экспонирования его для указанного стеринового липида;
iv) экспонирования первой из указанных фракций для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
v) хранения, по меньшей мере, части второй из указанных фракций до стадии vi);
vi) экспонирования, по меньшей мере, части фракции образца, экспонированной на стадии iv), для тестовой подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и экспонирования, по меньшей мере, части фракции образца, хранимой на стадии v), для контрольной подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
vii) обнаружение связывания антител с антигеном со стадии vi) в конечном анализе; и
viii) сравнение степени или меры связывания антител между тестовой и контрольной подложками, любое наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой является индикатором присутствия антител к антигену в образце, что указывает на активный туберкулез у человека или животного, от которого происходит образец.
Наряду с этим, изобретение также относится к способу предварительной обработки образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза для обнаружения:
i) предоставление образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) экспонирование указанного образца для стеринового липида;
iii) получение, по меньшей мере, двух фракций указанного образца до или после экспонирования его для указанного стеринового липида;
iv) экспонирование первой из указанных фракций для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген;
v) хранение, по меньшей мере, части второй из указанных фракций для дальнейшего использования;
где после экспонирования на стадии iv), по меньшей мере, часть экспонированной первой фракции образца хранят для дальнейшего использования.
Стадия vi (конечный способ).
На этой стадии разделенные потоки экспонированного для стеринового липида образца, или экспонированный для производных миколовой кислоты на стадии iv (тестовый поток) или не на стадии v (контрольный поток), пропускают к дополнительным подложкам, тестовой и контрольной подложкам, соответственно, несущим производные миколовой кислоты, предпочтительно, те же производные, что и на стадии iv.
Тестовая и контрольная подложки могут представлять собой любую подложку, которая может нести иммобилизованный антиген производного миколовой кислоты и на которой можно обнаруживать связывание между антителами, содержащимися в образце, с указанными антигенами.
В предпочтительном варианте осуществления обнаружение происходит посредством анализа фильтрования с иммунным окрашиванием золотом. В таком анализе тестовая и контрольная подложки представляют собой микропористую мембрану, предпочтительно нитроцеллюлозную мембрану, которую покрывают иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном.
Тестовая подложка и контрольная подложка могут представлять собой отдельные объекты. Альтернативно тестовую подложку и контрольную подложку можно реализовать в виде различных положений на одном объекте подложки. Например, в случае микропористой мембраны тестовую подложку и контрольную подложку можно формировать посредством первой микропористой (например, нитроцеллюлозной) мембраны и второй микропористой (например, нитроцеллюлозной) мембраны. Альтернативно, тестовую подложку и контрольную подложку содержит одна мембрана. В таком случае имеет место тестовая область, где может происходить взаимодействие антитело/антиген (например, пятно) в одном положении мембраны, и контрольная область, где может происходить взаимодействие антитело/антиген, в другом положении мембраны.
Стадии vii и viii (конечный способ).
На стадии vii) связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты обнаруживают в конечном анализе. По меньшей мере, часть полученных предварительно обработанных фракций подвергают указанному конечному анализу обнаружения. Возможно использовать целые фракции для конечного анализа. Альтернативно часть фракций используют для того, чтобы обнаруживать связывание антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты в конечном анализе и другую часть хранят для дальнейшего тестирования в зависимости от результатов для первой части фракций.
Термин «конечный анализ» следует понимать как анализ, в котором результат, представляющий интерес, представляет собой конечный результат после фиксированного периода инкубации в анализе, в отличие от так называемого анализа в реальном времени. В контексте способа обнаружения по изобретению это означает, что обработанные образцы, полученные после стадий iv) и v), берут и подвергают тесту, который предусматривает указание количества антител, которые присутствуют в обработанных образцах после стадий iv) и v).
Конечный анализ обнаружения позволяет, например, обнаруживать изменения в уровне цвета, флуоресценции, поглощения или люминесценции в конце теста. В конечном анализе обнаружение можно подходящим образом осуществлять с помощью способов, таких как фотоспектроскопические, флуоресцентные микроскопические, хемолюминесцентные или электрохемилюминесцентные способы обнаружения. Это может включать использование, например, спектрофотометрических/колориметрических считывателей планшетов, флуоресцентных считывателей планшетов или хемилюминесцентных считывателей.
Подходящий конечный анализ может включать твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, анализ радиоактивного мечения, фотоспектрометрический анализ, иммунофлуоресценцию, иммунопреципитацию, иммуноцитохимию, иммуногистохимию, электрохимическую импедансную спектроскопию (EIS) и т.д. ELISA, например, включает, по меньшей мере, одно антитело со специфичностью к конкретному антигену. В контексте изобретения антиген представляет собой полученный из миколовой кислоты антиген и антитело представляет собой антитело против антигенов производного миколовой кислоты.
В конечном анализе взаимодействие антител с полученными из миколовой кислоты антигенами можно осуществлять с использованием вторичных антител, которые связывают тяжелую цепь антител против производных миколовой кислоты. Многие подходящие вторичные антитела коммерчески доступны. Вторичное антитело можно связывать с гранулами, например, золотыми гранулами, или связывать с липосомами. Примерами вторичных антител могут быть белок A или G, возможно, конъюгированный с ферментом, который делает возможным обнаружение.
Конкретный подходящий способ обнаружения связывания антител с иммобилизованными антигенами миколовой кислоты на стадии vii) представляет собой так называемый анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом (IGFA) и, в частности, точечный анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом (DIGFA).
Анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом представляет собой способы, объединяющие ELISA и способ иммунного окрашивания золотом, и представляют собой способы, в которых образец, подлежащий анализу, фильтруют через микропористую мембрану, предпочтительно нитроцеллюлозную мембрану, и захватывают посредством захватывающего зонда, которым покрыта мембрана. Зонд, меченный коллоидным золотом, фильтруют через микропористую мембрану аналогичным образом. С использованием микропористой мембраны в качестве носителя для захватывающего зонда и капиллярного эффекта и проницаемости мембраны, антигены и антитела могут легко вступать в реакцию и, в целях удобства, их можно подвергать необязательным стадиям промывания и/или блокирования. Когда зонд, меченный коллоидным золотом, связывается с захватывающим зондом, происходит агрегация частиц коллоидного золота и возникает красное пятно, которое видно невооруженному глазу.
Анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом представляет собой простой и быстрый способ обнаружения, поскольку не требуются приборы, за исключением мембраны и реактивов, и результаты можно наблюдать невооруженным глазом в пределах нескольких минут.
В анализе фильтрования с иммунным окрашиванием золотом микропористая мембрана может представлять собой, например, нитроцеллюлозную мембрану, мембрану из ацетата целлюлозы или PVDF мембрану с подходящим диаметром пор. Предпочтительно используют нитроцеллюлозу. Подходящий диаметр пор составляет от 0,2 до 5 мкм.
В конечном способе антитела, содержащиеся в образце, обнаруживают посредством конечного анализа. В случае, если конечный анализ представляет собой анализ фильтрования с иммунным окрашиванием золотом, подложка, упомянутая на стадиях vi) и viii) способа обнаружения по изобретению, представляет собой микропористую мембрану, предпочтительно нитроцеллюлозную мембрану, которую покрывают иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном. После иммобилизации полученного из миколовой кислоты антигена на микропористой мембране, фракции образца, предварительно обработанного на стадиях с i) до v), можно наносить на мембрану. После добавления фракций образца и реакции иммобилизованных, полученных из миколовой кислоты, антигенов с антителами, содержащимися в образцах на мембране, меченные коллоидным золотом вторые антитела добавляют на мембрану, чтобы иметь агрегирование золотых частиц в месте реакции антиген-антитело. В случае агрегирования происходит формирование видимых красных или коричневых пятен. Интенсивность пятна пропорциональна количеству реакций между антигеном и антителом, т.е. количеству антител в предварительно обработанном образце. В случае, если контрольная подложка демонстрирует более интенсивный сигнал, чем тестовая подложка, то это указывает на активный туберкулез у человека, от которого получен образец. С другой стороны, в случае, если контрольная подложка показывает нулевые (или только незначительные) различия в сигнале интенсивности цвета по сравнению с тестовой подложкой, то это указывает на то, что человек или животное, у которого получен образец, не имеет активного туберкулеза.
Между различными стадиями анализа фильтрования с иммунным окрашиванием золотом мембрану можно промывать подходящим буфером, например, буфером на основе PBS. Такой буфер, например, может представлять собой буфер PBS/AE, содержащий NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4 и EDTA в воде при физиологическом pH. Такой буфер может представлять собой буфер на основе PBS, состоящий из 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 0,2 г KH2PO4, и 1,05 г Na2HPO4 на литр дважды дистиллированной деионизированной воды, содержащей 1 мМ EDTA и 0,025% (масс./об.) азида натрия, которую корректируют до pH 7,4.
В случае использования DIGFA микропористую мембрану можно покрывать указанным полученным из миколовой кислоты антигеном точечно. В DIGFA анализе образцы, предварительно обработанные на стадиях с i) до vi), наносят на мембрану в форме точек. Также меченные коллоидным золотом вторые антитела добавляют в форме точек. В таком варианте осуществления контрольная и тестовая подложки предпочтительно представляют собой одну и ту же микропористую мембрану с точками полученных из миколовой кислоты антигенов, иммобилизованных на ней. Способ обнаружения по изобретению делает возможным обнаружение как контрольной, так и тестовой фракций на одной и той же мембране. Это повышает надежность теста и экономически эффективно. DIGFA анализ является особенно предпочтительным, поскольку в различных пятнах на нескольких мембранах можно иммобилизовать различные антигены, полученные из различных микобактериальных штаммов. Таким образом, становится возможно предоставлять информацию о том, каким микобактериальным штаммом инфицирован пациент. Другое преимущество использования DIGFA состоит в том, что образцы, полученные от различных людей, подозреваемых в наличии активного туберкулеза, можно сравнивать в одном тесте, поскольку DIGFA допускает быстрое и надежное обнаружение взаимодействия антитело-антиген в неограниченном количестве пятен, в зависимости от размер мембраны.
Обнаружение связывания антител и/или другого материала с антигеном миколовой кислоты, например, красное окрашивание в случае DIGFA анализа используют в качестве способа обнаружения, можно осуществлять в автоматизированном устройстве. Различные автоматизированные устройства известны специалисту в данной области, и специалист сможет выбирать подходящие средства программного обеспечения, чтобы выполнить на стадии viii) сравнение степени или меры связывания между тестовой и контрольной подложками, где какое-либо наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой является индикатором присутствия антител к антигену в образцах, который относятся к активному туберкулезу у человека или животного, от которого происходят образцы. В этом контексте следует понимать, что меньшее можно интерпретировать качественно и количественно, т.е. меньшее связывание можно интерпретировать как наличие меньшего числа событий, а также наличие более слабого связывания.
Обнаружение связывания антител и/или другого материала с антигеном миколовой кислоты можно осуществлять посредством визуального способа обнаружения или какого-либо другого подходящего способа обнаружения. В конкретном предпочтительном варианте осуществления обнаружение посредством конечного анализа происходит визуально, предпочтительно невооруженным глазом. Это обладает преимуществом легкого обнаружения без необходимости дорогостоящей и сложной технологии обнаружения.
В случае DIGFA используют связывание антитела антител и/или другого материала с антигеном миколовой кислоты, которое можно оценивать невооруженным глазом.
Визуальный сигнал, например, красное окрашивание в случае DIGFA анализа, применяемого в качестве конечного анализа, также можно обнаруживать с помощью мобильного приложения, т.е. компьютерной программы, разработанной для исполнения на мобильных устройствах, таких как планшетные компьютеры или смартфоны. Например, можно использовать приложение, которое разработано для того, чтобы сравнивать сигнал связывания тестовой и контрольной подложек, и которое показывает, имеет ли человек или животное, от которого происходит образец, активный туберкулез.
Система.
В другом аспекте изобретение относится к системе или устройству, предпочтительно портативной системе или устройству, для осуществления конечного способа обнаружения маркера для активного туберкулеза. Эту систему можно подразделять на 1) систему или устройству для предварительной обработки потока образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, чтобы делать образец подходящим для обнаружения с использованием способа по изобретению; и 2) средство обнаружения, чтобы делать возможным обнаружение взаимодействия антител, содержащихся в предварительно обработанном образце.
В одном из вариантов осуществления система содержит, по меньшей мере, один контейнер, содержащий стериновый липид, который устроен и выполнен с возможностью принимать поток образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза; средство для деления указанного потока образца, по меньшей мере, на первый и второй потоки образца; указанное средство подсоединено или выше по потоку или ниже по потоку от указанного, по меньшей мере, одного контейнера, содержащего стериновый липид; дополнительный контейнер для приема указанного первого потока образца в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид и содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; еще один дополнительный контейнер для приема второго потока образца, расположенный параллельно указанному дополнительному контейнеру и в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и первую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, чтобы принимать, по меньшей мере, часть первого потока образца и вторую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, чтобы принимать, по меньшей мере, часть второго потока образца.
В конкретном варианте осуществления система для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза содержит, по меньшей мере, один контейнер, содержащий стериновый липид, который устроен и выполнен с возможностью принимать поток образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза; средство для деления указанного потока образца, по меньшей мере, на первый и второй потоки образца; указанное средство подсоединено или выше по потоку или ниже по потоку от указанного, по меньшей мере, одного контейнера, содержащего стериновый липид; дополнительный контейнер для приема указанного первого потока образца в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид и содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; еще один дополнительный контейнер для приема второго потока образца, расположенный параллельно указанному дополнительному контейнеру и в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и первую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, чтобы принимать, по меньшей мере, часть первого потока образца из указанного дополнительного контейнера, и вторую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, чтобы принимать, по меньшей мере, часть второго потока образца из указанного еще одного дополнительного контейнера, где первая и вторая подложки для обнаружения представляют собой микропористую мембрану.
Первая и вторая подложки для обнаружения предпочтительно представляют собой микропористую мембрану, предпочтительно нитроцеллюлозную мембрану. Первая и вторая подложки для обнаружения в этом случае могут иметь отдельные пятна, т.е. первое и второе пятна для обнаружения, на одной и той же мембране. Таким образом, одну и ту же мембрану можно использовать для обнаружения взаимодействия антитело/антиген. Это повышает надежность обнаружения и упрощает сравнение взаимодействия, обнаруживаемого на тестовой и контрольной подложках. Кроме того, это делает возможным тестирование нескольких образцов одновременно.
Подложки для обнаружения не обязаны быть в физическом соединении с другими компонентами системы. Например, образцы, полученные после прохождения указанных дополнительного и еще одного дополнительного контейнеров, можно хранить до дальнейшего использования или для транспортировки к подложке для обнаружения. Таким образом, практик имеет большую гибкость при планировании своего теста. Например, это позволяет собирать предварительно обработанные образцы от множества субъектов с тем, чтобы их можно было тестировать все сразу на одном материале подложки. Это также упрощает тестирование образцов от нескольких пациентов в одних и тех же условиях.
Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к системе или устройству, предпочтительно портативной системе или устройству, для предварительной обработки потока образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза для того, чтобы делать образец подходящим для обнаружения в способе обнаружения, которое содержит, по меньшей мере, один контейнер, содержащий стериновый липид, который устроен и выполнен с возможностью принимать поток образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза; средство для деления указанного потока образца, по меньшей мере, на первый и второй потоки образца; указанное средство соединено или выше по потоку или ниже по потоку от указанного, по меньшей мере, одного контейнера, содержащего стериновый липид; дополнительный контейнер для приема указанного первого потока образца в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид и содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; еще один дополнительный контейнер для приема второго потока образца, расположенный параллельно указанному дополнительному контейнеру и в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и средство для хранения или транспортировки обработанных образцов. Это или эти средства не обязаны быть в физическом соединении с контейнерами, содержащими указанную первую и вторую подложки, соответственно, и расположены ниже по потоку от этих контейнеров, когда систему используют, чтобы принимать предварительно обработанные фракции образца.
В одном из вариантов осуществления система или устройство для предварительной обработки потока образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, для того, чтобы делать образец подходящим для обнаружения с использованием способа по изобретению, может содержать две колонки. Каждая колонка содержит два отсека или контейнера. Верхний отсек или контейнер содержит подложку, покрытую стериновым липидом, например, гранулы, покрытые холестерином. Нижний отсек одной из колонок содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и нижний отсек другой колонки содержит подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген.
В этом отношении изобретение также относится к системе для предварительной обработки потока образца, полученного от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, которая содержит средство для деления указанного потока образца, по меньшей мере, на первый и второй потоки образца; по меньшей мере, первую и вторую колонки, выполненные с возможностью принимать указанные первый и второй потоки образца, соответственно; указанная первая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и дополнительный отсек, содержащий первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид; и указанная вторая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и еще один дополнительный отсек, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид; и средство для хранения или транспортировки обработанных образцов, пропущенных через указанные колонки. Это или эти средства для хранения и транспортировки не обязаны быть в физическом соединении с контейнерами, содержащими указанную первую и вторую подложки, соответственно, и расположены ниже по потоку от колонок, когда систему используют, для того, чтобы принимать предварительно обработанные фракции образца.
Этот принцип также можно применять к системе для осуществления конечного способа обнаружения маркера для активного туберкулеза. В этом отношении изобретение также относится к системе для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза в образце, полученном от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, которая содержит средство для деления указанного потока образца, по меньшей мере, на первый и второй потоки образца; по меньшей мере, первую и вторую колонки, выполненные с возможностью принимать указанные первый и второй потоки образца, соответственно; указанная первая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и дополнительный отсек, содержащий первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид; и указанная вторая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и еще один дополнительный отсек, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид и первую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, для того, чтобы принимать, по меньшей мере, часть первого потока образца, и вторую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, для того, чтобы принимать, по меньшей мере, часть второго потока образца.
Предпочтительно система или устройство содержит проникающий в кожу конец, соединенный с первой трубкой, которая устроена и выполнена с возможностью принимать образец крови от проникающего в кожу конца и нести указанный образец крови от участка кожи к указанному контейнеру/отсеку, содержащему стериновый липид.
В другом предпочтительном варианте осуществления система или устройство содержит блок фильтра в соединении с указанной первой трубкой для приема указанного образца крови, выполненный с возможностью отделять плазму от указанного образца цельной крови.
В дополнительном варианте осуществления система или устройство содержит проникающий в кожу конец, соединенный с первой трубкой, которая устроена и выполнена с возможностью принимать образец крови от проникающего в кожу конца и нести указанный образец крови от участка кожи; блок фильтра в соединении с указанной первой трубкой для приема указанного образца крови, выполненный с возможностью отделять плазму от указанного образца цельной крови; первый контейнер для приема указанного образца, указанный первый контейнер содержит стериновый липид; средство для деления указанного образца по меньшей мере, на первый и второй потоки образца; второй контейнер для приема указанного первого потока образца, указанный второй контейнер содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; третий контейнер для приема второго потока образца, указанный третий контейнер содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген; и средство для хранения или транспортировки обработанных образцов.
Поток через систему или устройство предпочтительно приводят в движение посредством насоса, предпочтительно насоса с непрерывным потоком, например, перистальтического насоса или диафрагменного насоса. В случае применения колонок поток можно приводить в движение посредством гравитации или капиллярного эффекта.
Проникающее в кожу средство может представлять собой любое подходящее средство для того, чтобы получать образец крови у человека или животного, такое как шприц с иглой или тому подобное.
Первая трубка имеет размеры, которые подходят для цели устройства, т.е. она должна быть хорошо адаптируемой к проникающему в кожу средству и первому контейнеру.
Компоненты системы или устройства, т.е. контейнеры, средство для разведения и блок фильтра, можно соединять посредством подходящих связывающих трубок. Альтернативно компоненты устройства можно разрабатывать так, что их можно соединять непосредственно друг с другом и разделять, например, фильтрами, через которые образец, но не подложка, может проходить избирательно. Материал трубок, используемых в изобретении, может представлять собой любой подходящий материал, который известен специалисту в области тестирования образцов крови. Подходящие материалы инертны к компонентами крови/плазмы/сыворотки и включают политетрафторэтилен (например, Teflon®), полипропилен, полиэфиркетон (PEEK) и полиэтилен.
Дополнительные компоненты можно подсоединять между компонентами устройства. Такие дополнительные компоненты можно подсоединять в трубках, взаимосвязывающих с компонентами, непосредственно прикрепленными к компонентам.
Система или частное устройство для осуществления стадий i-v способов по изобретению также может содержать средство для разведения крови или плазмы. Такое средство можно реализовать перед содержащий стериновый липид контейнер, перед блоком фильтра, между блоком фильтра и содержащим стериновый липид контейнером, между содержащим стерин контейнером и другим (дополнительным и еще одним дополнительным или (вторым и третьим) контейнерами или между дополнительным/еще одним дополнительным или вторым/третьим контейнерами и средством для хранения и транспортировки. Например, 10 мл контейнер можно реализовать на выпуске дополнительного или второго и еще одного дополнительного или третьего контейнеров. Подходящий буфер может уже присутствовать в контейнере или его можно добавлять в этот контейнер, чтобы обеспечивать желаемое разведение. Таким образом, объем образца сохраняют как можно меньшим во время большинства стадий способов по изобретению, что полезно для скорости процесса и компактности устройства по изобретению.
Блок фильтра может содержать фильтровальную матрицу. Предпочтительно фильтр реализуют на фильтровальном микрочипе с целью компактности.
Контейнеры могут представлять собой сосуды или канал или трубку, например, спиральный канал или спиральную трубу. Спиральный канал или труба являются предпочтительными, поскольку такая структура занимает небольшое пространство, при этом сохраняя длинный путь потока. Спиральный канал или трубу можно полезно реализовать на микрочипе. Это вносит вклад в компактность устройства по изобретению. Термин «контейнер» следует интерпретировать в широком смысле, т.е. его можно рассматривать как определенную область в другом блоке, т.е. отсек, например, отсек колонки. Термины «контейнер» и «отсек», таким образом, можно использовать взаимозаменяемо в контексте настоящего изобретения. Важно то, что содержащий стериновый липид контейнер и другие (дополнительный и еще один дополнительный или (второй и третий) контейнеры пространственно разделены. В этом отношении содержащий стерин контейнер может содержаться в колонке вместе с указанным дополнительным (или вторым) контейнером, тогда как другой содержащий стерин контейнер содержится в колонке вместе с еще одним дополнительным (или третьим) контейнером. В контексте изобретения колонка для получения потока, подлежащего тестированию на тестовой подложке, может содержать верхнюю подложку (или выше по потоку), покрытую стериновым липидом, которую отделяют барьером от неё, но в соединении по текучей среде с нижней подложкой (или ниже по потоку), покрытой полученными из миколовой кислоты антигенами. Колонка для получения потока, подлежащего тестированию на контрольной подложке, может содержать верхнюю подложку (или выше по потоку), покрытую стериновым липидом, которую отделяют барьером от неё, но в соединении по текучей среде с нижней подложкой (или ниже по потоку), не покрытой полученными из миколовой кислоты антигенами. Следует понимать, что в соединении в этом контексте обозначает, что образец, подлежащий тестированию, может проходить через указанный барьер, при этом барьер не позволяет проходить подложкам. Подходящими подложками для таких колонок являются гранулы. В этом отношении вариант осуществления системы по изобретению для предварительной обработки потока образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, для того, чтобы сделать образец подходящим для обнаружения с использованием способа по изобретению, содержит, по меньшей мере, первую и вторую колонки, выполненные с возможностью принимать указанные первый и второй потоки образца, соответственно, указанная первая колонка содержит контейнер, содержащий стериновый липид, и указанный дополнительный контейнер, содержащий первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген, и указанная вторая колонка содержит контейнер, содержащий стериновый липид, и указанный еще один дополнительный контейнер, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген.
Материал контейнеров предпочтительно является одним и тем же, и подходящие материалы могут представлять собой стекло bk-7, политетрафторэтилен, полипропилен, полиэфиркетон или полиэтилен. Граница между двумя контейнерами может представлять собой фильтр, который не позволяет проходить материалу подложки, но который допускает прохождение потока образца. Подложки контейнеров должны представлять собой материал, который инертен к неспецифичному связыванию молекул образца, например, стекло bk-7, политетрафторэтилен, полипропилен, полистирол полиэфиркетон или полиэтилен. Подложки могут быть в форме гранул, необязательно сшитых гранул, например, гранул полистирола.
Системы по изобретению содержат контейнер, содержащий подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (второй контейнер), и контейнер, содержащий подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген. Взамен иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты, антигена, последний контейнер может содержать инертное покрытие или не содержать покрытие, до тех пор, пока не возникает неспецифичное связывание.
Средство для хранения или транспортировки обработанных образцов может представлять собой небольшие флаконы, в которых образцы хранят для дальнейшего анализа, например, посредством точечного анализа фильтрования с иммунным окрашиванием золотом. Альтернативно, средство можно формировать с помощью пипетки, которую можно применять для того, чтобы переносить фракции образца, обработанного на стадиях i)-v) способов по изобретению на подложки с иммобилизованными, полученными из миколовой кислоты, антигенами для конечного анализа, например, для нанесения фракций в виде точек в точечном анализе фильтрования с иммунным окрашиванием золотом.
Устройство/систему можно соединять с любым подходящим автоматизированным средством анализа, таким как компьютер, с использованием подходящих программ программного обеспечения для того, чтобы осуществлять сравнение связывания антител к миколовой кислоте с иммобилизованными антигенами на подложке.
Образцовый вариант осуществления системы по п. 32 представлен на фиг. 2.
На фиг. 2 представлена игла 1 для проникновения в кожу, соединенная с первой трубкой 102, которая устроена и выполнена с возможностью принимать кровь из иглы 101 и переносить определенное количество крови от участка кожи. Трубка 101 соединена с блоком 103 фильтра. Этот блок фильтра служит для отделения плазмы от указанного образца цельной крови. Блок 103 фильтра соединен через трубку 113 с первым контейнером 14, который имеет форму спирального канала, внутреннюю стенку которого покрывают стериновым липидом. Спиральный канал соединен через трубку 114 со средством 105 для деления плазмы в форме точки ветвления с пассивным клапаном. Одна ветвь точки ветвления соединена через трубку 116 со вторым контейнером 106 для приема первого потока плазмы, который содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген. Другая ветвь точки ветвления соединена через трубку 115 с третьим контейнером 107 для приема второго потока плазмы, который содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген. Контейнеры 106 и 107 в этом варианте осуществления представлены в форме спирального канала, внутреннюю стенку которого или покрывают полученным из миколовой кислоты антигеном (контейнер 106) или не покрывают полученным из миколовой кислоты антигеном (контейнер 107). Контейнеры 106 и 107 соединяют через, соответственно, трубки 117 и 118 с контейнерами 111 и 112 для разведения, соответственно. Эти контейнеры можно предварительно заполнять подходящим буфером для разведения из впусков 121, 122 контейнеров для введения буфера для разведения. Контейнеры 121 и 122 для разведения можно соединять через соответствующие трубки 119 и 120 со средством для хранения или транспортировки 108 и 109, соответственно. Альтернативно, контейнеры 121 и 122 для разведения можно соединять через соответствующие трубки 119 и 120 с тестовой и контрольной подложками с иммобилизованными, полученными из миколовой кислоты, антигенами, которые тестируют в конечном анализе.
Набор.
В другом аспекте изобретение относится к набору для использования в диагностировании туберкулеза или предварительной обработки образцов для диагностирования туберкулеза, который содержит одно или несколько проникающих в кожу средств; одну или несколько трубок; один или несколько контейнеров, покрытых стериновым липидом и необязательно фосфатидилхолином, пектином, амфотерицином B или β-циклодекстрином; один или несколько контейнеров, содержащих подложку иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном; один или несколько контейнеров, которые содержат подложку без иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты, антигена; необязательно один или несколько контейнеров для транспортировки и хранения образцов; необязательно средство для разведения крови или плазмы и/или блок фильтра; по меньшей мере, одну микропористую мембрану с полученным из миколовой кислоты антигеном, иммобилизованным на ней, и необязательно вторичные антитела, связывающиеся с тяжелой цепью антител против полученных из миколовой кислоты антигенов, содержащихся в образце, полученном от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, предпочтительно меченные коллоидным золотом вторые антитела.
В предпочтительном варианте осуществления набор содержит: одно или несколько проникающих в кожу средств; одну или несколько трубок; одну или несколько колонок, которые содержат отсек, содержащий подложку, покрытую стериновым липидом и необязательно фосфатидилхолином, пектином, амфотерицином B или β-циклодекстрином; и отсек, содержащий подложку, покрытую иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты, антигеном, ниже указанного отсека, содержащего подложку, покрытую стериновым липидом; одну или несколько колонок, которые содержат отсек, содержащий подложку, покрытую стериновым липидом и необязательно фосфатидилхолином, пектином, амфотерицином B или β-циклодекстрином; и отсек, содержащий подложку, покрытую без использования иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты, антигена, под указанным отсеком, содержащим подложку, покрытую стериновым липидом, необязательно один или несколько контейнеров для транспортировки и хранения образцов; необязательно средство для разведения крови или плазмы и/или блок фильтра; необязательно, по меньшей мере, одну микропористую мембрану с полученным из миколовой кислоты антигеном, иммобилизованным на ней, и необязательно вторичные антитела, связывающиеся с тяжелой цепью антител против полученных из миколовой кислоты антигенов, содержащихся в образце, полученном от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза.
Набор также может содержать одно или несколько средств для того, чтобы переносить фракции образца, предварительно обработанного в соответствии со стадиями с i) до v) способов по изобретению, на микропористую мембрану, например, пипетку и аксессуары для пипетки, такие как наконечники для пипетки.
Набор также может содержать одно или несколько средств для хранения фракций образца, предварительно обработанного в соответствии со стадиями с i) до v), для дальнейшего использования, таких как флаконы или пробирки.
Набор также может содержать инструменты для того, чтобы собирать компоненты, такие как винты, зажимы, клей, лента, отвертки и т. д.
Набор также может содержать средство для разведения крови или плазмы во время анализа крови, такое как контейнеры (например, по 10 мл), которые можно реализовать на выпуске второго и третьего контейнеров. Подходящий буфер уже может присутствовать в контейнере или его можно добавлять в этот контейнер, чтобы обеспечивать желаемое разведение.
Компоненты набора позволяют человеку, который собирается осуществлять диагностический тест на туберкулез, собирать системы по изобретению по месту, т.е. в месте оказания медицинской помощи. Следовательно, следует понимать, что компоненты набора имеют те же характеристики и предпочтительные свойства, как изложено выше для систем по изобретению. Системы по изобретению легко собирать с помощью компонентов набора по изобретению, т.е. не требуются технические навыки специалиста. Набор можно в целях удобства предоставлять с инструкциями по сборке и использованию.
Стериновые липиды.
Стериновый липид, используемый в контексте изобретения, предпочтительно представляет собой холестерин или его производное. Стериновый липид также может представлять собой модифицированный стерином фосфолипид. Такой модифицированный стерином липид может представлять собой модифицированный стерином фосфолипид, например, модифицированный стерином липид фосфатидилхолин или глицерофосфолипид. В таком модифицированном стерином липиде стерин предпочтительно представляет собой холестерин. Хорошим примером модифицированного стерином липида, подходящего для целей изобретения, является 1-пальмитоил-2-холестерил карбоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин.
Стериновый липид предпочтительно иммобилизуют на поверхности. Примером является подложка, которая имеет покрытие, содержащее холестерин или сложный эфир холестерина, где сложным эфиром холестерина является линолеат холестерина, в котором массовое соотношение линолевой кислоты и холестерина находится в диапазоне от 1:3 до 1:20.
Подложку также можно покрывать стериновым липидом, предпочтительно холестерином, в комбинации с другими молекулами.
Предпочтительно указанный стериновый липид представляет собой холестерин, иммобилизованный на подложке вместе с фосфатидилхолином. Стериновый липид устраняет антихолестериновые антитела из крови/плазмы/сыворотки, которые иначе будут перекрестно реагировать с антигенами миколовой кислоты на подложке и вести к ложному положительному диагнозу туберкулеза. Фосфатидилхолин будет связываться с гидрофобными материалами в образце крови, делая образец более гидрофильным после экспонирования. С получаемым гидрофильным образцом будет легче обращаться на последующих стадиях способа, и он будет меньше подвержен коагуляции.
В одном из вариантов осуществления стериновый липид, предпочтительно холестерин иммобилизуют вместе с пектином на подложке, например, внутренней стенке трубки. В этом варианте осуществления стериновый липид устраняет антихолестериновые антитела из крови/плазмы/сыворотки, которые иначе будут перекрестно реагировать с антигенами миколовой кислоты на подложке и вести к ложному положительному диагнозу туберкулеза. Вдобавок пектин устраняет холестерин в образце и при этом также холестериновые антитела. Это ведет к еще более высокой надежности обнаружения.
Альтернативно, стериновый липид, предпочтительно холестерин, иммобилизуют вместе с соединением, связывающимся с холестерином в образце, полученном из крови, таким как связывающий холестерин гетерополисахарид, такой как β-циклодекстрин, пектин, амфотерицин B или декстрин. Такие молекулы устраняют холестерин в образце и при этом также холестериновые антитела. Это ведет к еще более высокой надежности обнаружения.
Например, стериновый липид, предпочтительно холестерин, иммобилизуют с β-циклодекстрином или пектином, амфотерицином B на подложке, такой как половолоконные полипропиленовые мембраны или стекло.
Известно множество способов иммобилизации стеринового липида, в частности, холестерина, на подложке. Специалист сможет выбирать протокол, подходящий для этого конкретного нанесения покрытия. Например, покрытие можно наносить посредством изначального растворения холестерина в органическом растворителе и дополнительного разбавления растворенного холестерина в растворе этанола, допущения испарения раствора в месте внутри контейнера, промывания покрытого контейнера буферным физиологическим раствором, сушки контейнера на воздухе и закупоривания контейнера в паронепроницаемых пакетах с десикантом.
Полученные из миколовой кислоты антигены.
Полученный из миколовой кислоты антиген можно получать из микобактерий, выбранных из вирулентных и патогенных микобактерий. Предпочтительно, антиген миколовой кислоты получают из Mycobacterium tuberculosis. Указанный полученный из миколовой кислоты антиген представляет собой, по меньшей мере, одно, выбранное из группы: миколовой кислоты, фактора жгутообразования, химически модифицированной миколовой кислоты, химически модифицированного фактора жгутообразования, синтетического производного миколовой кислоты, синтетического производного фактора жгутообразования.
Природные источники производных миколовой кислоты включают клеточные стенки микобактерий, например, Mycobacterium tuberculosis содержит смеси соединений различных классов и различные гомологи миколовой кислоты, часто в виде производных, в виде которых они связаны со стенкой клетки.
В дополнение к самим миколовым кислотам, клетки микобактерий также содержат соединения, полученные из кислоты, такие как сложные эфиры сахаров и миколовых кислот. Встречающиеся в природе сложные эфиры сахаров включают, например, трегалоза-6,6'-димиколат, обычно обозначаемый как TDM, также известный как «факторы жгутообразования»; и мономиколаты трегалозы (часто обозначаемые как TMM). Эти сложные эфиры сахаров встречаются в природе в виде сложных смесей миколовых кислот различных классов и различных гомологов в каждом классе.
Поскольку сложно устанавливать отличительные черты факторов жгутообразования, присутствующих в природных продуктах, и выделять индивидуальные молекулярные частицы, предпочтительно использовать полусинтетические или более предпочтительно синтетические производные миколовой кислоты для целей изобретения. Кроме того, известно, что структура звена миколовой кислоты влияет на биологическую активность фактора жгутообразования. Следовательно, когда природные производные миколовой кислоты будут использовать в настоящем изобретении, различия в биологической активности между этими производными и, таким образом, обнаружением связывания антител с антигеном в образце, может создавать фактор непредсказуемости и неопределенности для исхода обнаружения. Кроме того, отклонения при получении природных производных миколовой кислоты могут вести к проблемам, касающимся воспроизводимости различных партий тестов.
Следовательно, для того, чтобы быть способным обеспечивать обнаружение с высокой надежностью и воспроизводимыми результатами, предпочтительно использовать полусинтетические или даже более предпочтительно синтетические производные миколовой кислоты, которые идентичны или близко аналогичны отдельным соединениям, которые находят в природных смесях.
Подходящие полусинтетические производные включают полусинтетические факторы жгутообразования, которые можно получать посредством присоединения миколовых кислот к сахарной группе. Эти полусинтетические факторы, однако, все же содержат смеси различных гомологов.
Следовательно конкретные подходящие производные миколовых кислот для использования в контексте настоящего изобретения представляют собой синтетические факторы жгутообразования, например, синтетические факторы жгутообразования, описанные в WO 2010/08667, т.е. соединения формулы (M)x(S)y(M')z, в которой x составляет от 1 до 6, y составляет от 1 до 12, z составляет от 0 до 10, каждый M и каждый M' независимо представляет собой остаток миколовой кислоты, в том числе фрагмент β-оксикислоты, и каждый S представляет собой моносахаридное звено.
Антиген миколовой кислоты может быть в форме, выбранной из гомогенных и гетерогенных смесей соединений. Полученный из миколовой кислоты антиген, например, можно использовать в комбинации с фосфолипидом, таким как фосфатидилхолин.
Антиген миколовой кислоты можно иммобилизовать на подложках различными способами, которые известны специалисту. Синтетические, полученные из миколовой кислоты, антигены можно синтезировать с использованием конкретных активных групп, которые допускают иммобилизацию на материале подложки.
Например, для иммобилизации на диоксиде кремния, можно применять реакции сочетания с силанами.
В случае нитроцеллюлозной подложки полученный из миколовой кислоты антиген можно подходящим образом иммобилизовать следующим образом. Полученные из миколовой кислоты антигены можно получать в лиофилизированной форме и восстанавливать в смеси растворителей, например, смеси хлороформ:метанол:вода, и разбавлять до концентрации порядка нескольких наномолей, например, 1 нМ. Затем это разведение можно наносить пятнами на нитроцеллюлозную мембрану, на которой каждое пятно отделяют предварительно определяемым расстоянием, например, 1 см. После сушки пятен, полученные из миколовой кислоты антигены иммобилизованы на мембране. Альтернативные способы иммобилизации, например, могут включать растворение антигенов в гексане или горячем PBS для того, чтобы формировать покрывающий раствор антигена перед нанесением раствора пятнами на мембрану.
Примеры.
Следующий пример предназначен для того, чтобы иллюстрировать принцип изобретения, и его не следует интерпретировать в качестве ограничения объема формулы изобретения. В примере образец сыворотки человека тестировали на антитела против производных миколовой кислоты в анализе ELISA. В качестве способа обнаружения выбирали способ ELISA, поскольку он менее чувствителен, чем, например, поверхностный плазмонный резонанс или электрохимическая импедансная спектроскопия (EIS) или кольцевой резонанс (интерферометрия). Следовательно, можно заключить, что если удовлетворительные результаты получают с использованием ELISA, их также получат с использованием более чувствительных способов обнаружения.
Материалы:
• Образец (плазма или сыворотка человека)
• 0,2 мкм центробежные фильтры (Whatman)
• гранулы, связанные с миколовой кислотой и холестерином
• поликлональная миколовая кислота, растворенная в гексане
• полистироловые планшеты для ELISA
• PBS
• блокирующий буфер: 0,5% казеин в PBS
• раствор субстрата 1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Scientific)
• 2 М серная кислота
• вторичное антитело: кролика против Ig человека с HRP (DAKO)
Процедуры.
Покрывание планшетов для ELISA.
В каждую лунку 96-луночных планшетов для ELISA добавляли 50 мкл гексана с поликлональной миколовой кислотой в концентрации 3 мкг/мл. Гексан без миколовой кислоты использовали в качестве контроля. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 4°C и впоследствии промывали два раза в PBS.
Получение гранул.
В данном примере гранулы использовали в качестве подложки, представляющей подложку, упомянутую на стадиях ii), iv и v) способов по изобретению.
Для целей этого примера использовали гранулы Toyopearl AF-Amino-650M (Tosoh Bioscience). Гранулы получали в соответствии с инструкциями производителя. В качестве холестерина 7-кетохолестерин конъюгировали с гранулами, в целом, как описано у Abdel-Magid AF et al. (Reductive Amination of Aldehydes and Ketones with Sodium Triacetoxyborohydride. Studies on Direct and Indirect Reductive Amination Procedures. J. Org. Chem. 1996:61;3849-3862) посредством смешивания 7-кетохолестерина (100 мг, 0,25 ммоль) и взвеси Toyopearl (2,5 мл, 0,25 ммоль реакционноспособных групп) в ацетонитриле (3,5 мл), после чего следовала обработка триацетоксиборогидридом натрия (80 мг, 0,375 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в атмосфере N2 в течение 1,5 ч. После этого реакционную смесь гасили посредством добавления водного насыщенного NaHCO3. Гранулы тщательно промывали H2O, 1 М NaCl и, наконец, H2O для того, чтобы удалять избыток лиганда. После этого остаточные аминогруппы ацетилировали посредством добавления 8 мл 0,2 М ацетата натрия и 4 мл уксусного ангидрида к смоле при 0°C в течение 30 минут, после чего следовало добавление других 4 мл уксусного ангидрида и инкубация при 25°C в течение 30 минут.
В качестве миколовых кислот использовали смесь изоформ миколовой кислоты, встречающихся в природе (молекулярная масса ~1100-1300), для связывания с гранулами, в целом, как описано у Law B, Immunoassay: A Practical Guide. London: Taylor & Francis. 2005: стр. 11-31 и Hermanson GT. Bioconjugate Techniques. 3-е изд. London; Elsevier. 2013: стр. 535-545. Вкратце, N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимида гидрохлорид (EDC.HCl) (57,7 мг, 0,3 ммоль (1,2 экв.)) и N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA) (81,3 мг, 0,625 ммоль (2,5 экв.)) добавляли в раствор амина (амино-активированные Toyopearl, 2,5 мл, 0,25 ммоль реакционноспособных групп), кислоты (изолитохолевая кислота: 93,8 мг, 0,25 ммоль (1 экв.)/миколовые кислоты: 300 мг, 0,25 ммоль (1 экв.)) и HOBt (гидрат 1-гидроксибензотриазола)(40,5 мг, 0,3 ммоль (1,2 экв.)) в DMF (2,5 мл (10 мл/1 ммоль)) и перемешивали/встряхивали в течение 24 часов при комнатной температуре под азотом. Растворитель удаляли посредством испарения и гранулы промывали в воде и 1 М NaCl и воде. Избыток (несвязанных) аминогрупп блокировали с использованием ацетилирования. Гранулы промывали с использованием воды, 1 М NaCl и воды. Сначала создают инертную атмосферу с использованием азота или аргона. Порядок реактивов: миколовые кислоты с DMF (при 0°C), затем (HOBt), через 10 мин гранулы, через 10 мин основание (DIPEA) и, наконец, через 15 мин EDC.
Получение образца.
Сыворотку, полученную от человека, о котором известно, что он страдает туберкулезом, разводили 1:5 в блокирующем буфере. Используемые образцы получали от пациентов как положительных по мазку, так и отрицательных по мазку. Получали две фракции по 0,5 мл и каждую переносили на 0,2 мкм центробежный фильтр и центрифугировали на 10000g. Фильтрат объединяли от 1:5 до 1:20 в блокирующем буфере.
250 мкл фильтрата добавляли к гранулам, которые были покрыты холестерином, поликлональными миколовыми кислотами или блокирующим средством. Гранулы перемешивали при комнатной температуре. После инкубации гранулы быстро осаждали центрифугированием и супернатант использовали в качестве образца. Полная предварительная обработка образцов с использованием гранул (в соответствии со стадиями i)-v) способа(ов) по изобретению в этой конкретной постановке может занимать меньше чем 10 минут, после чего может непосредственно следовать анализ.
ELISA-процедура.
Чтобы блокировать неспецифичное связывание антител с миколовыми кислотами в лунках планшетов для ELISA, 300 мкл блокирующего буфера добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа. Впоследствии, блокирующий буфер заменяли на 45 мкл образца. Блокирующий буфер использовали в качестве отрицательного контроля. После инкубации планшеты промывали три раза в PBS. Промывающий буфер PBS заменяли на HRP-конъюгированное вторичное антитело в блокирующем буфере. После инкубации, планшет промывали снова три раза в PBS. Впоследствии в лунки добавляли 50 мкл раствора субстрата TMB-ELISA на лунку и инкубировали в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали посредством добавления 50 мкл 2 М серной кислоты на лунку. Поглощение при 450 нм измеряли для того, чтобы количественно определять связывание антител с подложкой с миколовой кислотой в планшете для ELISA.
Обработка образцов.
Образцы обрабатывали следующим образом.
1. В первом сравнительном исследовании две фракции (1 и 2) брали из каждого из 6 образцов, полученных от различных людей. Все фракции отдельно инкубировали с гранулами без какого-либо связанного средства (фракция 1 и 2) и хранили до ELISA обнаружения. Определяли усредненный ELISA сигнал, получаемый от каждой фракции. Обе фракции имели одни и те же результаты. ELISA сигнал этих двух фракций принимали за 100%.
2. Во втором сравнительном исследовании две фракции (3 и 4) брали из каждого из вышеупомянутых 6 образцов. Образцы фракции 3 отдельно инкубировали с гранулами, связанными только с блокирующим средством, и впоследствии хранили до ELISA обнаружения. Образцы фракции 4 отдельно инкубировали с гранулами, связанными с холестерином и впоследствии хранили до ELISA обнаружения.
3. В третьем сравнительном исследовании две фракции (5 и 6) брали из каждого из вышеупомянутых 6 образцов. Образцы фракции 5 отдельно инкубировали с гранулами, связанными с холестерином, и впоследствии хранили до ELISA обнаружения. Образцы фракции 6 сначала отдельно инкубировали с гранулами, связанными с холестерином, впоследствии образцы быстро центрифугировали и супернатант использовали для второй инкубации с гранулами, связанными с поликлональной миколовой кислотой. Впоследствии образцы хранили до ELISA обнаружения.
4. В дополнительном исследовании две фракции (7 и 8) брали из каждого из вышеупомянутых 6 образцов. Обе фракции 7 и 8 инкубировали с гранулами, связанными с холестерином, и гранулами в качестве подложки, связанными с поликлональной миколовой кислотой, одновременно и впоследствии хранили до ELISA обнаружения.
За исключением различий в гранулах, все другие условия были одинаковыми для всех обработок.
Результаты.
Определяли усредненный ELISA сигнал, получаемый от каждой фракции 6 образцов. ELISA сигнал фракций 1 и 2 был одинаковым, и его принимали за 100%. Далее в таблице I ELISA сигнал других фракций показан в процентных долях от сигнала фракции 1 (или 2).
Таблица I Результаты ELISA
| Фракция | ELISA сигнал |
| Фракция 1 | 100% |
| Фракция 2 | 100% |
| Фракция 3 | 81% |
| Фракция 4 | 68% |
| Фракция 5 | 73% |
| Фракция 6 | 54% |
| Фракция 7 | 96% |
| Фракция 8 | 96% |
Эти результаты показывают, что образцы, которые экспонировали сначала для стеринового липида и впоследствии для подложки, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты, антиген (образцы фракции 6), имеют более низкий ELISA сигнал, чем любые из других протестированных фракций. Четкие различия можно видеть между фракциями 5 и 6, сравнительное исследование которых можно рассматривать как образцовый вариант осуществления конечного способа обнаружения маркера для активного туберкулеза в соответствии с изобретением. К удивлению, низкий ELISA сигнал, получаемый от фракции 6, нельзя получить посредством инкубации образца с гранулами, связанными с холестерином, и гранулами, связанными с поликлональной миколовой кислотой, одновременно. Фактически, ELISA сигналы от фракций 7 и 8 даже выше, чем ELISA сигнал от гранул, связанных только с блокирующим средством, или гранул, связанных с холестерином. Также не получали удовлетворительные результаты, когда фракцию экспонировали для гранул, связанных только с миколовой кислотой. Из этого, похоже, важно, что предварительная обработка образца происходит в двух последовательных стадиях 1) экспонирования для стеринового липида и 2) экспонирования для производного миколовой кислоты, чтобы получать наиболее заметное снижение сигнала и, следовательно, связывание антител по сравнению с контрольным образцом, который не экспонировали для производного миколовой кислоты.
Кроме того, из примера следует, что полная предварительная обработка образцов с использованием гранул (в соответствии со стадиями i)-v) способа(ов) по изобретению) в этой конкретной постановке может занимать меньше чем 10 минут, после чего может непосредственно следовать анализ.
Время, которое необходимо для анализа, зависит от анализа обнаружения, который применяют. Как указано выше, вместо анализа с использованием ELISA, возможен другой анализ обнаружения. Образцы, предварительно обработанные, как описано выше, можно анализировать с использованием любой подходящей технологии без использования меток. Автор изобретения обнаружил, в частности, что, когда применяют электрохимическую импедансную спектроскопию (EIS), обнаружение связывания антител, присутствующих в образцах, с подложками для обнаружения может происходить в пределах секунд. Это дает возможность определять, является ли или нет индивидуум инфицированным активным туберкулезом быстрым и надежным путем, допуская обнаружение туберкулеза меньше чем за 10 минут.
Claims (91)
1. Способ обнаружения маркера для активного туберкулеза, включающий стадии:
i) предоставления образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) контактирования указанного образца со стериновым липидом, где указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, где указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное и где указанный стериновый липид удаляет антихолестериновые антитела из образца;
iii) получения по меньшей мере двух фракций указанного образца до или после его контактирования с указанным стериновым липидом;
iv) контактирования первой из указанных приведенных в контакт со стериновым липидом фракций с подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
v) контактирования второй из указанных приведенных в контакт со стериновым липидом фракций с подложкой, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
vi) контактирования фракции образца, приведенной в контакт на стадии iv), с тестовой подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, и контактирования фракции образца, приведенной в контакт на стадии v), с контрольной подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
vii) обнаружения связывания антител с антигеном со стадии vi) в реальном времени; и
viii) сравнения степени или меры связывания между тестовой и контрольной подложками, причем какое-либо наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой представляет собой индикатор присутствия антител к антигену в образце, который указывает на активный туберкулез у человека или животного, от которого происходят образцы.
2. Способ по п. 1, в котором обнаружение осуществляют с использованием поверхностного плазмонного резонанса или электрохимической импедансной спектроскопии, калориметрии изотермического титрования, интерферометрии биослоя, оптических решеток, фотонного кристалла, акустического резонансного профилирования, микровесов с кристаллом кварца или с использованием чипа биологического датчика с использованием Si кольцевого резонатора.
3. Способ обнаружения маркера для активного туберкулеза, включающий стадии:
i) предоставления образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) контактирования указанного образца со стериновым липидом, где указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, где указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное и где указанный стериновый липид удаляет антихолестериновые антитела из образца;
iii) получения по меньшей мере двух фракций указанного образца до или после его контактирования с указанным стериновым липидом;
iv) контактирования первой из указанных приведенных в контакт со стериновым липидом фракций с подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
v) контактирования второй из указанных приведенных в контакт со стериновым липидом фракций с подложкой, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген; или хранения по меньшей мере части второй из указанных фракций до стадии vi), пропуская стадию контактирования второй из указанных фракций с подложкой, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
vi) контактирования по меньшей мере части фракции образца, приведенного в контакт на стадии iv), с тестовой подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, и контактирования по меньшей мере части фракции образца, приведенного в контакт или сохраненного на стадии v), с контрольной подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
vii) обнаружения связывания антител с антигеном со стадии vi) в конечном анализе; и
viii) сравнения степени или меры связывания между тестовой и контрольной подложками, причем какое-либо наблюдаемое меньшее связывание с тестовой подложкой представляет собой индикатор присутствия антител к антигену в образце, который указывает на активный туберкулез у человека или животного, от которого происходят образцы.
4. Способ по п. 3, в котором конечный анализ выбирают из группы, состоящей из твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), вестерн-блоттинга, анализа радиоактивного мечения, фотоспектрометрического анализа, иммунофлуоресценции, иммунопреципитации, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, электрохимической импедансной спектроскопии, анализа фильтрования с иммунным окрашиванием золотом или точечного анализа с иммунным окрашиванием золотом (DIGFA).
5. Способ по любому из пп. 3 или 4, в котором обнаружение ведет к визуальному сигналу, который анализируют посредством мобильного приложения, которое разработано для того, чтобы сравнивать сигнал связывания тестовых и контрольных подложек, и который указывает, имеет ли человек или животное, от которого происходит образец, активный туберкулез.
6. Способ предварительной обработки образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, для обнаружения маркера для активного туберкулеза, включающий стадии:
i) предоставления образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза;
ii) контактирования указанного образца со стериновым липидом, где указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, где указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное и где указанный стериновый липид удаляет антихолестериновые антитела из образца;
iii) получения по меньшей мере двух фракций указанного образца до или после его контактирования с указанным стериновым липидом;
iv) контактирования первой из указанных приведенных в контакт со стериновым липидом фракций с подложкой, несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
v) контактирования второй из указанных приведенных в контакт со стериновым липидом фракций с подложкой, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген; или хранения по меньшей мере части второй из указанных фракций для дальнейшего использования, пропуская стадию контактирования второй из указанных фракций с подложкой, не несущей иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
при этом после контактирования на стадиях iv) и v) по меньшей мере часть приведенных в контакт фракций образца хранят для дальнейшего использования.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором указанный полученный из миколовой кислоты антиген представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из групп: миколовой кислоты, фактора жгутообразования, химически модифицированной миколовой кислоты, химически модифицированного фактора жгутообразования, синтетического производного миколовой кислоты, синтетического производного фактора жгутообразования.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, которая содержит указанный стериновый липид и соединение, связывающееся с холестерином в образце, такое как пектин, амфотерицин B или β-циклодекстрин.
9. Способ по любому из пп. 1-7, в котором указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, которая содержит указанный стериновый липид и фосфатидилхолин.
10. Система для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза, которая содержит по меньшей мере один первый контейнер, содержащий стериновый липид, где указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное, устроенный и выполненный с возможностью принимать поток образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза; средство для деления указанного потока образца по меньшей мере на первый и второй потоки образца; указанное средство соединено или выше по потоку или ниже по потоку от указанного по меньшей мере одного первого контейнера, содержащего стериновый липид; второй контейнер для приема указанного первого потока образца в соединении ниже по потоку с указанным первым контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген; третий контейнер для приема второго потока образца, расположенный параллельно указанному второму контейнеру и в соединении ниже по потоку с указанным первым контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген,
причем система дополнительно содержит первую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, чтобы принимать по меньшей мере часть первого потока образца от указанного второго контейнера, и вторую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, чтобы принимать по меньшей мере часть второго потока образца от указанного третьего контейнера.
11. Система по п. 10, которая представляет собой портативное устройство для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза, которое содержит
биологический датчик (8), содержащий первую камеру (9) для приема первого потока образца в соединении с указанным вторым контейнером (6), содержащую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, и вторую камеру (10) для приема второго потока образца в соединении с указанным третьим контейнером (7) и содержащую ту же подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, что и первая камера (9).
12. Система по п. 10 или 11, которая содержит
- проникающий в кожу конец (1), соединенный с первой трубкой (2), которая устроена и выполнена с возможностью принимать образец крови от проникающего в кожу конца (1) и нести указанный образец крови от участка кожи;
- блок (3) фильтра в соединении с указанной первой трубкой (2) для приема указанного образца крови и выполненный с возможностью отделять плазму от указанного образца цельной крови;
- указанный первый контейнер (4) для приема указанного образца, указанный первый контейнер (4) содержит стериновый липид;
- средство (5) для деления указанного образца по меньшей мере на первый и второй потоки образца;
- указанный второй контейнер (6) для приема указанного первого потока образца, указанный второй контейнер содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген;
- указанный третий контейнер (7) для приема второго потока образца, указанный третий контейнер содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген; и
- биологический датчик (8), содержащий первую камеру (9) для приема первого потока образца в соединении со вторым контейнером (6), которая содержит подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, и вторую камеру (10) для приема второго потока образца в соединении с третьим контейнером (7) и содержащую ту же подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, что и первая камера (9).
13. Система по п. 12, которая дополнительно содержит блок (3) фильтра в соединении с указанной первой трубкой (2) и указанным первым контейнером (4) и выполненный с возможностью отделять плазму от образца цельной крови, предпочтительно,
причем блок (3) фильтра содержит фильтровальную матрицу.
14. Система по любому из пп. 11-13, в которой подложка из первой и второй камер (9, 10) основана на диоксиде кремния, предпочтительно, причем указанный биологический датчик содержит Si кольцевой резонатор.
15. Система для предварительной обработки потока образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, которая содержит по меньшей мере один контейнер, содержащий стериновый липид, устроенный и выполненный с возможностью принимать поток образца от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза; средство для деления указанного потока образца по меньшей мере на первый и второй потоки образца; указанное средство соединено или выше по потоку или ниже по потоку от указанного по меньшей мере одного контейнера, содержащего стериновый липид; дополнительный контейнер для приема указанного первого потока образца в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген; еще один дополнительный контейнер для приема второго потока образца, расположенный параллельно указанному дополнительному контейнеру и в соединении ниже по потоку с указанным контейнером, который содержит стериновый липид; и содержит вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, и средство для хранения или транспортировки обработанных образцов,
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
16. Система для предварительной обработки потока образца, полученного от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, которая содержит средство для деления указанного потока образца по меньшей мере на первый и второй потоки образца; по меньшей мере первую и вторую колонки, выполненные с возможностью принимать указанный первый и указанный второй потоки образца, соответственно; указанная первая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и дополнительный отсек, содержащий первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид; и указанная вторая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и еще один дополнительный отсек, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид; и средство для хранения или транспортировки обработанных образцов, прошедших через указанные колонки,
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
17. Система для осуществления способа обнаружения маркера для активного туберкулеза в образце, полученном от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза, которая содержит средство для деления указанного потока образца по меньшей мере на первый и второй потоки образца; по меньшей мере первую и вторую колонки, выполненные с возможностью принимать указанный первый и указанный второй потоки образца, соответственно; указанная первая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и дополнительный отсек, содержащий первую подложку, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид; и указанная вторая колонка содержит отсек, содержащий стериновый липид, и еще один дополнительный отсек, содержащий вторую подложку, не несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, ниже по потоку от указанного отсека, содержащего стериновый липид,
причем система дополнительно содержит первую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, чтобы принимать по меньшей мере часть первого потока образца, и вторую подложку для обнаружения, несущую иммобилизованный, полученный из миколовой кислоты антиген, чтобы принимать по меньшей мере часть второго потока образца, и
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
18. Система по п. 16 или 17, в которой указанный стериновый липид иммобилизуют на гранулах и указанные первая и вторая подложки представляют собой гранулы.
19. Система по любому из пп. 10, 17, 18, в которой первая и вторая подложки для обнаружения представляют собой микропористую мембрану, предпочтительно нитроцеллюлозную мембрану.
20. Система по пп. 10 и 17-19, в которой первую и вторую подложки для обнаружения формируют посредством отдельных пятен на одной и той же мембране.
21. Система по любому из пп. 10-20, в которой указанный стериновый липид иммобилизуют на подложке, которая содержит указанный стериновый липид и соединение, связывающееся с холестерином в образце, такое как пектин, амфотерицин B или β-циклодекстрин.
22. Набор для использования в диагностировании туберкулеза, который содержит:
- одно или несколько проникающих в кожу средств;
- одну или несколько трубок;
- один или несколько контейнеров, покрытых стериновым липидом;
- один или несколько контейнеров, содержащих подложку с и без иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты антигена;
- один или несколько контейнеров для транспортировки и хранения образцов и/или по меньшей мере одну микропористую мембрану с полученным из миколовой кислоты антигеном, иммобилизованным на ней; или один или несколько биологических датчиков, содержащих по меньшей мере две камеры, содержащие подложку с иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты антигеном;
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
23. Набор для использования в диагностировании туберкулеза, который содержит:
- одно или несколько проникающих в кожу средств;
- одну или несколько трубок;
- одну или несколько колонок, которые содержат отсек, содержащий подложку, покрытую стериновым липидом; и отсек, содержащий подложку, покрытую иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты антигеном, ниже указанного отсека, содержащего подложку, покрытую стериновым липидом;
- одну или несколько колонок, которые содержат отсек, содержащий подложку, покрытую стериновым липидом; и отсек, содержащий подложку, покрытую без иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты антигена, ниже указанного отсека, содержащего подложку, покрытую стериновым липидом;
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
24. Набор для использования в предварительной обработке образцов для диагностирования туберкулеза, который содержит:
- одно или несколько проникающих в кожу средств;
- одну или несколько трубок;
- один или несколько контейнеров, покрытых стериновым липидом;
- один или несколько контейнеров, содержащих подложку с и без иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты антигена;
- один или несколько контейнеров для транспортировки и хранения образцов и/или по меньшей мере одну микропористую мембрану с полученным из миколовой кислоты антигеном, иммобилизованным на ней, или один или несколько биологических датчиков, содержащих по меньшей мере две камеры, содержащие подложку с иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты антигеном;
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
25. Набор для использования в предварительной обработке образцов для диагностирования туберкулеза, который содержит:
- одно или несколько проникающих в кожу средств;
- одну или несколько трубок;
- одну или несколько колонок, которые содержат отсек, содержащий подложку, покрытую стериновым липидом; и отсек, содержащий подложку, покрытую иммобилизованным, полученным из миколовой кислоты антигеном, ниже указанного отсека, содержащего подложку, покрытую стериновым липидом;
- одну или несколько колонок, которые содержат отсек, содержащий подложку, покрытую стериновым липидом; и отсек, содержащий подложку, покрытую без иммобилизованного, полученного из миколовой кислоты антигена, ниже указанного отсека, содержащего подложку, покрытую стериновым липидом;
причем указанный стериновый липид представляет собой холестерин или его производное.
26. Набор по п. 22 или 24, в котором указанный один или несколько контейнеров дополнительно покрыты фосфатидилхолином, пектином, амфотерицином B или β-циклодекстрином.
27. Набор по пп. 22, 24 или 26, который содержит вторичные антитела, связывающиеся с тяжелой цепью антител против полученных из миколовой кислоты антигенов, содержащихся в образце, полученном от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза.
28. Набор по пп. 22, 24, 26 или 27, который содержит средство для разведения крови или плазмы и/или блок фильтра.
29. Набор по п. 23 или 25, в котором указанная подложка, покрытая указанным стериновым липидом, дополнительно покрыта фосфатидилхолином, пектином, амфотерицином B или β-циклодекстрином.
30. Набор по пп. 23, 25 или 29, который дополнительно содержит один или несколько контейнеров для транспортировки и хранения образцов.
31. Набор по пп. 23, 25, 29 или 30, который дополнительно содержит средство для разведения крови или плазмы и/или блок фильтра.
32. Набор по пп. 23, 25 или по любому из пп. 29-31, который дополнительно содержит по меньшей мере одну микропористую мембрану с полученным из миколовой кислоты антигеном, иммобилизованным на ней.
33. Набор по пп. 23, 25 или по любому из пп. 29-32, который дополнительно содержит вторичные антитела, связывающиеся с тяжелой цепью антител против полученных из миколовой кислоты антигенов, содержащихся в образце, полученном от человека или животного, подозреваемого в наличии активного туберкулеза.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL2014085A NL2014085B1 (en) | 2015-01-05 | 2015-01-05 | A method, portable device, kit and biosensor for detecting a marker for active tuberculosis. |
| NL2014085 | 2015-01-05 | ||
| NL2015553A NL2015553B1 (en) | 2015-10-02 | 2015-10-02 | A method for detecting a marker for active tuberculosis. |
| NL2015553 | 2015-10-02 | ||
| PCT/NL2016/050002 WO2016111619A1 (en) | 2015-01-05 | 2016-01-04 | Methods for detecting a marker for active tuberculosis |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017127905A RU2017127905A (ru) | 2019-02-07 |
| RU2017127905A3 RU2017127905A3 (ru) | 2019-06-24 |
| RU2712270C2 true RU2712270C2 (ru) | 2020-01-28 |
Family
ID=55911026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017127905A RU2712270C2 (ru) | 2015-01-05 | 2016-01-04 | Способы обнаружения маркера для активного туберкулеза |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10921322B2 (ru) |
| EP (1) | EP3243076B1 (ru) |
| KR (1) | KR20170102344A (ru) |
| CN (1) | CN107438767B (ru) |
| ES (1) | ES2755679T3 (ru) |
| HK (1) | HK1246393A1 (ru) |
| PH (1) | PH12017501240B1 (ru) |
| PL (1) | PL3243076T3 (ru) |
| RU (1) | RU2712270C2 (ru) |
| WO (1) | WO2016111619A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201705206B (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL2017204B1 (en) | 2016-06-08 | 2017-12-18 | Kei International Ltd | Solid substrate comprising antigens immobilised thereto, biosensor comprising said solid substrate and method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample |
| NL2021443B1 (en) * | 2018-08-08 | 2020-02-20 | Kei International Ltd | Synthetic antigens for tuberculosis detection |
| NL2022166B1 (en) * | 2018-12-10 | 2020-07-02 | Kei International Ltd | Nitrocellulose sheet comprising immobilized immunoglobulins and lipid based antigens and use thereof |
| WO2021201324A1 (en) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Revosketch Inc. | Cartridge for sandwich elisa pre-loaded with antigen customized detection reagent and sandwich elisa device using the cartridge |
| KR102486474B1 (ko) * | 2021-02-04 | 2023-01-06 | 안영관 | 자가진단 패치형 aldh2 유전변이체질 검사 키트 및 aldh2 유전변이체질 관리 시스템 |
| NL2027721B1 (en) | 2021-03-08 | 2022-09-26 | Tomorrows Ip Ltd | Method of preparing a detection substrate, detection substrate, and uses thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7851166B2 (en) * | 2004-05-13 | 2010-12-14 | The University Of Pretoria | Method for detecting mycobacterial infection |
| WO2012119128A1 (en) * | 2011-03-02 | 2012-09-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed diagnostic systems |
| RU2470801C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-12-27 | Открытое акционерное общество "Инженерно-маркетинговый центр Концерна "Вега" (ОАО "ИМЦ Концерна "Вега") | Мобильный комплекс забора и заготовки крови |
| WO2014184768A1 (en) * | 2013-05-16 | 2014-11-20 | University Of Pretoria | A method of diagnosing tuberculosis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8277826B2 (en) | 2008-06-25 | 2012-10-02 | Baxter International Inc. | Methods for making antimicrobial resins |
| WO2013186679A1 (en) * | 2012-06-11 | 2013-12-19 | University Of Pretoria | A liposomal composition comprising a sterol-modified lipid and a purified mycobacterial lipid cell wall component and it's use in the diagnosis of tuberculosis |
-
2016
- 2016-01-04 PL PL16720577T patent/PL3243076T3/pl unknown
- 2016-01-04 CN CN201680012300.9A patent/CN107438767B/zh active Active
- 2016-01-04 EP EP16720577.2A patent/EP3243076B1/en active Active
- 2016-01-04 ES ES16720577T patent/ES2755679T3/es active Active
- 2016-01-04 KR KR1020177021903A patent/KR20170102344A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-01-04 US US15/541,683 patent/US10921322B2/en active Active
- 2016-01-04 RU RU2017127905A patent/RU2712270C2/ru active
- 2016-01-04 WO PCT/NL2016/050002 patent/WO2016111619A1/en active Application Filing
-
2017
- 2017-07-04 PH PH12017501240A patent/PH12017501240B1/en unknown
- 2017-08-01 ZA ZA2017/05206A patent/ZA201705206B/en unknown
-
2018
- 2018-04-27 HK HK18105520.8A patent/HK1246393A1/zh unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7851166B2 (en) * | 2004-05-13 | 2010-12-14 | The University Of Pretoria | Method for detecting mycobacterial infection |
| WO2012119128A1 (en) * | 2011-03-02 | 2012-09-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed diagnostic systems |
| RU2470801C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-12-27 | Открытое акционерное общество "Инженерно-маркетинговый центр Концерна "Вега" (ОАО "ИМЦ Концерна "Вега") | Мобильный комплекс забора и заготовки крови |
| WO2014184768A1 (en) * | 2013-05-16 | 2014-11-20 | University Of Pretoria | A method of diagnosing tuberculosis |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HAMILTON R.G. et al. Naturally Occurring Carbohydrate Antibodies: Interference in Solid-Phase Immunoassays // Journal of Immunological Methods, 1985, V.77, pp.95-108. * |
| HAMILTON R.G. et al. Naturally Occurring Carbohydrate Antibodies: Interference in Solid-Phase Immunoassays // Journal of Immunological Methods, 1985, V.77, pp.95-108. THANYANI S.T. et al. A novel application of affinity biosensor technology to detect antibodies to mycolic acid in tuberculosis patients // Journal of Immunological Methods, 2008, V.332, pp.61-72. * |
| THANYANI S.T. et al. A novel application of affinity biosensor technology to detect antibodies to mycolic acid in tuberculosis patients // Journal of Immunological Methods, 2008, V.332, pp.61-72. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017127905A3 (ru) | 2019-06-24 |
| HK1246393A1 (zh) | 2018-09-07 |
| PH12017501240A1 (en) | 2017-10-30 |
| PH12017501240B1 (en) | 2017-10-30 |
| BR112017014491A2 (pt) | 2018-02-06 |
| PL3243076T3 (pl) | 2020-03-31 |
| ES2755679T3 (es) | 2020-04-23 |
| RU2017127905A (ru) | 2019-02-07 |
| EP3243076B1 (en) | 2019-08-14 |
| EP3243076A1 (en) | 2017-11-15 |
| KR20170102344A (ko) | 2017-09-08 |
| CN107438767B (zh) | 2020-05-15 |
| ZA201705206B (en) | 2018-12-19 |
| CN107438767A (zh) | 2017-12-05 |
| US20170328901A1 (en) | 2017-11-16 |
| WO2016111619A1 (en) | 2016-07-14 |
| US10921322B2 (en) | 2021-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2712270C2 (ru) | Способы обнаружения маркера для активного туберкулеза | |
| CA2865496C (en) | Anti-lipoarabinomannan antibody and immunoassay for acid-fast bacillary infection using the antibody | |
| JP3969722B2 (ja) | カンジダの検出 | |
| EP2631649A1 (en) | Method and device for the rapid diagnosis of diseases in faecal samples | |
| US11768202B2 (en) | Method of detecting anti-Ri in a subject with a previous streptococcal infection | |
| CN101014622B (zh) | 用于检测分枝杆菌感染的富集抗体，应用方法和应用其的诊断检测 | |
| DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
| US12000830B2 (en) | Serological assay for the detection of zika virus-specific antibodies utilizing overlapping peptides comprising an NS2B epitope | |
| US11243204B2 (en) | Method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample using at least two antigens | |
| WO2017211316A1 (en) | Method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample using at least two antigens | |
| WO2006043614A1 (ja) | メンブランエンザイムイムノアッセイ法 | |
| WO2017143985A1 (en) | Method for detecting marker for active tuberculosis | |
| RU2769578C1 (ru) | Способ получения флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума для выявления возбудителей риккетсиозов и коксиеллезов, флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум и его применение | |
| JP3312204B2 (ja) | 血小板減少症の診断用キット | |
| NL2014085B1 (en) | A method, portable device, kit and biosensor for detecting a marker for active tuberculosis. | |
| CN109900901A (zh) | 改进的诊断真菌感染的方法 | |
| NL2015553B1 (en) | A method for detecting a marker for active tuberculosis. | |
| BR112017014491B1 (pt) | Métodos para detectar um marcador para tuberculose ativa | |
| CN117491650B (zh) | 一种外周血Hb-Aβ复合物定量检测试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN103374048A (zh) | 链霉素半抗原及其制备方法和应用 | |
| RU2695525C1 (ru) | Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида | |
| US20200408758A1 (en) | Compositions and methods for detecting mycobacterium tuberculosis | |
| NL2016913B1 (en) | Solid substrate comprising antigens immobilised thereto and use thereof in a method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample | |
| RU2127883C1 (ru) | Способ экспресс-диагностики дифтерийной инфекции | |
| JP2007300817A (ja) | 細菌の検出方法、検出用試薬及び検出用キット。 |