CN102539787A - 肌钙蛋白ⅰ血清快速检测试剂盒(胶体金法) - Google Patents

Abstract

本发明公开了肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，属于生物检测试剂盒技术领域，其原理为：心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白和肌钙蛋白构成结构复合物，人体中的cTnI的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnI成为一个特异性的标志物，在心肌梗死发生时，cTnI便迅速释放入血液循环中，本发明采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应；若标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带；若没有就会保持无色，标本移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验结果正常；本发明具有快速检测、性能稳定、使用方便。

Description

肌钙蛋白Ⅰ血清快速检测试剂盒(胶体金法)

技术领域

本发明提供了一种快速检测心肌梗死病症的快速检测的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)。 

背景技术

心肌缺血性损伤，特别是急性心肌梗塞(AMI)是威胁人类生命的主要疾病之一，临床化学家和临床科学家一直努力寻找和探索特异性好、灵敏度高的血清指标，心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)具有高度的心肌特异性，当心肌细胞受损时，血液中的cTnI出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关，因此，它可作为心肌损伤的一种特异性指标。 

发明内容

本发明提供了一种用于快速检测心肌梗死病症的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，具有快速检测试，性能极其稳定，用户使用方便、能准确快速检测的功能。 

本发明是通过如下技术方案实现的： 

肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其原理为：心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人体中的cTnI与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnI成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnI便迅速释放入血液循环中，本发明采用双 抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带，如果没有就会保持无色，标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。 

本发明同时公开了肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)的制备及检测方法，其流程为： 

一、cTnI标记用单克隆抗体的预处理 

1.1  透析，纯化水，24小时； 

1.2  离心去上清，4～10℃，10000转/分钟、5分钟； 

1.3  BCA法则浓度(物料平衡)； 

1.4  PH的调节，0.1mol/LK2CO3量的确定； 

1.5  最佳标记量的确定； 

1.6  分装(5000人份量/支)、-20度冻存； 

二、试剂的配制 

2.1  1％的柠檬酸三钠的配制； 

2.2  1％的氯金酸的配制； 

2.3  0.01％的氯金酸的配制； 

2.4  0.1ml/L K2CO3的配制； 

2.5  10％的氯化钠的配制； 

2.6  1％的叠氮钠的配制； 

2.7  10％的BSA的配制； 

2.8  1mol/l PBS的配制； 

2.9  0.05mol/l PBS的配制； 

2.10  胶体金复溶液的的配制； 

三、胶体金的制备 

3.1  量取0.01％的HAuCL4溶液； 

3.2  加热至沸腾，迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，100ml 0.01％的HAuCL4溶液加1.6ml 1％柠檬酸三钠溶液； 

3.3  继续加热10分钟，然后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积； 

3.4  0.22μm微孔滤膜过滤除菌； 

3.5  送检、装瓶、贴标签； 

四、cTnI免疫金的制备和干燥 

4.1  cTnI标记抗体的稀释，按照每生产5000人份4mm宽的cTnI试纸条需1支cTnI标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0.05mol/l PBS稀释到0.5mg/ml； 

4.2  生产前小试 

a  取1ml胶体金； 

b  调PH值，0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min； 

c  根据生产指令加入CTnIAb1，混匀10min； 

d  加入100ul10％BSA，混匀10min； 

e  离心1000转/min，30min，要求环境温度4-10℃； 

f  30％复溶，浸泡聚酯膜0.8ml/条，0.6cm×30cm； 

g  温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时； 

h  送质检部检验； 

4.3  cTnI抗体标记 

1)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌，以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算； 

2)调PH值，0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min； 

3)根据最适标记量加入CTnIAb1，混匀10min； 

4)加入100ul10％BSA，混匀10min； 

5)离心1000转/min，30min，4-10℃； 

6)30％复溶，浸泡聚酯膜25.3ml/张，20cm×30cm； 

7)温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时； 

8)抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检测； 

9)cTnI免疫金送中间品室暂存； 

五、cTnI包被板的制备 

5.1包被抗体的稀释，羊抗鼠Ig0.05mol/LPBS稀释到1.2mg/ml工作浓度，cTnI捕获抗体用0.05mol/LPBS稀释到1.1mg/ml工作浓度； 

5.2包被前小试 

1)各取20ul试包被1条20cm长的膜，线浓度1.0ul/cm； 

2)2℃-8℃过夜； 

3)贴膜； 

4)温度20-30℃、相对湿度30-35％干燥5小时，最后送质检部检验质检合格； 

5.3包被生产 

1)cTnI包被小试质检合格单； 

2)羊抗鼠IgG、cTnI捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度1.0ul/cm； 

3)2℃-8℃过夜； 

4)贴膜； 

5)温度20-30℃、相对湿度30-35％，干燥5小时； 

6)抽1板送质检部作膜金匹配； 

7)密封后送中间品库暂存。 

本发明的检测流程为：采用以上技术方案制作标本，加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，其分为以下三种情况： 

(一)、阳性：15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效，只要在检测区域出现有色带即可以读取结果，很低浓度的cTnI会在长于15分钟的时候出现两条带； 

(二)、阴性：如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效； 

(三)、无效试验：如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应选用另一个新的卡片重新测试。 

由于采用了以上技术方案，本发明具有的有益效果为：肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，性能极其稳定，用户使用极其方便、能准确快速检测。 

附图说明

图1、为本发明的制备的工艺流程图。 

其中： 

为必须在净化车间内操作； 

为必须在温度20-30℃、湿度30-35％操作， 

另外cTnI包被板的制备以及cTnI免疫金的制备的干燥过程也必须在温度20-30℃、湿度30-35％进行； 

为关键控制点。 

具体实施方式

肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其原理为：心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人的cTnI与骨 骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnI成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnI便迅速释放入血液循环中。 

本发明同时公开了肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)的制备及检测方法，其流程为： 

一、cTnI标记用单克隆抗体的预处理 

1.1  透析，纯化水，24小时； 

1.2  离心去上清，4～10℃，10000转/分钟、5分钟； 

1.3  BCA法则浓度(物料平衡)； 

1.4  PH的调节，0.1mol/LK2CO3量的确定； 

1.5  最佳标记量的确定； 

1.6  分装(5000人份量/支)、-20度冻存； 

二、试剂的配制 

2.1  1％的柠檬酸三钠的配制； 

2.2  1％的氯金酸的配制； 

2.3  0.01％的氯金酸的配制； 

2.4  0.1ml/L K2CO3的配制； 

2.5  10％的氯化钠的配制； 

2.6  1％的叠氮钠的配制； 

2.7  10％的BSA的配制； 

2.8  1mol/l PBS的配制； 

2.9  0.05mol/l PBS的配制； 

2.10  胶体金复溶液的的配制； 

三、胶体金的制备 

3.1  量取0.01％的HAuCL4溶液； 

3.2  加热至沸腾，迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，100ml 0.01％的HAuCL4溶液加1.6ml1％柠檬酸三钠溶液； 

3.3  继续加热10分钟，然后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积； 

3.4  0.22μm微孔滤膜过滤除菌； 

3.5  送检、装瓶、贴标签； 

四、cTnI免疫金的制备和干燥 

4.1cTnI标记抗体的稀释，按照每生产5000人份4mm宽的cTnI试纸条需1支cTnI标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0.05mol/l PBS稀释到0.5mg/ml； 

4.2  生产前小试 

a  取1ml胶体金； 

b  调PH值，0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min； 

c  根据生产指令加入CTnIAb1，混匀10min； 

d  加入100ul10％BSA，混匀10min； 

e  离心1000转/min，30min，要求环境温度4-10℃； 

f  30％复溶，浸泡聚酯膜0.8ml/条，0.6cm×30cm； 

g  温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时； 

h  送质检部检验； 

4.3  cTnI抗体标记 

1)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌，以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算； 

2)调PH值，0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min； 

3)根据最适标记量加入CTnIAb1，混匀10min； 

4)加入100ul10％BSA，混匀10min； 

5)离心1000转/min，30min，4-10℃； 

6)30％复溶，浸泡聚酯膜25.3ml/张，20cm×30cm； 

7)温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时； 

8)抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检测； 

9)cTnI免疫金送中间品室暂存； 

五、cTnI包被板的制备 

5.1包被抗体的稀释，羊抗鼠Ig0.05mol/LPBS稀释到1.2mg/ml工作浓度，cTnI捕获抗体用0.05mol/LPBS稀释到1.1mg/ml工作浓度； 

5.2包被前小试 

1)各取20ul试包被1条20cm长的膜，线浓度1.0ul/cm； 

2)2℃-8℃过夜； 

3)贴膜； 

4)温度20-30℃、相对湿度30-35％干燥5小时，最后送质检部检验质检合格； 

5.3包被生产 

1)cTnI包被小试质检合格单； 

2)羊抗鼠IgG、cTnI捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度1.0ul/cm； 

3)2℃-8℃过夜； 

4)贴膜； 

5)温度20-30℃、相对湿度30-35％，干燥5小时； 

6)抽1板送质检部作膜金匹配； 

7)密封后送中间品库暂存。 

本发明的检测流程为：采用以上技术方案制作的标本，加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体 在检测区域反应，其分为以下三种情况： 

(一)、阳性：15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效，只要在检测区域出现有色带即可以读取结果，很低浓度的cTnI会在长于15分钟的时候出现两条带。 

(二)、阴性：如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效。 

(三)、无效试验：如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应选用另一个新的卡片重新测试。 

心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人的cTnI与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnI成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnI便迅速释放入血液循环中，释放的模式和CK-MB相同(在AMI发生4-6个小时以后)，然而，CK-MB的水平在36-48小时后恢复正常，cTnI可以持续升高6-10天，在正常健康人体内，cTnI水平是非常低的，在骨骼肌受损的病人体内也检测不到cTnI，因此cTnI是诊断心肌梗死的一个特异性指标。 

【产品名称】肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法) 

【规格】25人份/盒 

【适用范围】 

本试剂盒是免疫层析基础上的一步法体外诊断试剂盒，用来对发生心肌梗死时人血清中的心肌钙蛋白I进行定性检测。 

【检测原理】胶体金法 

采用双抗体夹心法，以胶体金作为指示标记，交联抗肌钙蛋白I抗体，另一抗体为捕获抗体，与血液中的肌钙蛋白I结合 并显色，测试时，样本向检测区及质控区移动，如果样品中含有肌钙蛋白I，它就会和试剂中的金标抗体组成抗原抗体复合物，再和检测区中的相对应的捕获抗体形成紫红色的色带，如果样品中肌钙蛋白I水平低于最低检测限，检测区中就不会有色带出现，在任何情况下，质控区色带都应出现，质控区色带的出现表明反应系统有效。 

【主要组成成分】 

测试卡片和一份干燥剂、一个滴管一起装于铝箔袋中，每个试剂盒有25个相同的铝箔袋。 

【自备材料】 

血清收集设备 

2、计时装置 

【样本要求】 

必须在标准实验室环境下采集血清标本。 

2、标本采集后最好马上就做检测。如不能在24小时内检测，血清标本应冷冻起来，在试验以前使标本回复到室温。 

3、可以加0.1％的叠氮钠作为防腐剂，不会影响试验结果。 

【质控方法】 

控制线是内对照试剂和步骤控制，只要正确操作试剂有效控制线总会出现。 

2、建议每次都使用对照品以确保试剂盒的有效性，本试剂盒内没有提供对照品，可外购。 

【操作步骤】 

使用前，将所有的试剂成分和病人样本置于室温。 

把测试卡片从铝箔袋中取出。 

用微量移液器吸取150μl样本。 

移液器垂直，加标本2-3滴(100-150μl)至样品槽中。 

5、15分钟读取显示结果。 

【产品性能指标】 

本试剂盒在cTnI≥1.5ng/ml时出现阳性结果。 

【注意事项】 

1.处理样品时，请戴一次性手套。 

2.测试时，测试卡应水平放置，不要倾斜。 

3.加样15分钟后显示的结果无诊断意义。 

4.测试结束，请彻底清洗双手剩余标本和废弃物应用1∶25稀释的84消毒液浸泡30分钟以上才能丢弃。 

5.一个吸管只能吸取一个样品，以免交叉污染。 

6.若用微量滴管头滴加样本，应迅速一次性加入到样品槽中，避免断续加入。 

7.本试剂结果仅供定性的辅助诊断，对实验结果解释需与临床症状相结合。 

【贮存】2-8℃保存。 

【有效期】12个月。 

【医疗器械注册证书编号】 

【产品标准编号】Q/YZ 021-2006。 

最后应说明的是：以上说明书仅用以说明本发明的技术方案和使用特征，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 

Claims (3)

1.肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其原理为：心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人体中的cTnI与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnI成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnI便迅速释放入血液循环中，其特征在于：采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带，如果没有就会保持无色，标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。

2.根据权利要求1所属的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其制备及检测方法，其流程为：

一、cTnI标记用单克隆抗体的预处理

1.1  透析，纯化水，24小时；

1.2  离心去上清，4～10℃，10000转/分钟、5分钟；

1.3  BCA法则浓度(物料平衡)；

1.4  PH的调节，0.1mol/LK2CO3量的确定；

1.5  最佳标记量的确定；

1.6  分装(5000人份量/支)、-20度冻存；

二、试剂的配制

2.1  1％的柠檬酸三钠的配制；

2.2  1％的氯金酸的配制；

2.3  0.01％的氯金酸的配制；

2.4  0.1ml/L K2CO3的配制；

2.5  10％的氯化钠的配制；

2.6  1％的叠氮钠的配制；

2.7  10％的BSA的配制；

2.8  1mol/l PBS的配制；

2.9  0.05mol/l PBS的配制；

2.10胶体金复溶液的的配制；

三、胶体金的制备

3.1  量取0.01％的HAuCL4溶液；

3.2  加热至沸腾，迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，100ml 0.01％的HAuCL4溶液加1.6ml 1％柠檬酸三钠溶液；

3.3  继续加热10分钟，然后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积；

3.4  0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

3.5  送检、装瓶、贴标签；

四、cTnI免疫金的制备和干燥

4.1cTnI标记抗体的稀释，按照每生产5000人份4mm宽的cTnI试纸条需1支cTnI标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0.05mol/l PBS稀释到0.5mg/ml；

4.2  生产前小试

a  取1ml胶体金；

b  调PH值，0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min；

c  根据生产指令加入CTnIAb1，混匀10min；

d  加入100ul10％BSA，混匀10min；

e  离心1000转/min，30min，要求环境温度4-10℃；

f  30％复溶，浸泡聚酯膜0.8ml/条，0.6cm×30cm；

g  温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时；

h  送质检部检验；

4.3  cTnI抗体标记

1)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌，以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算；

2)调PH值，0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min；

3)根据最适标记量加入CTnIAb1，混匀10min；

4)加入100ul10％BSA，混匀10min；

5)离心1000转/min，30min，4-10℃；

6)30％复溶，浸泡聚酯膜25.3ml/张，20cm×30cm；

7)温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时；

8)抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检测；

9)cTnI免疫金送中间品室暂存；

五、cTnI包被板的制备

5.1包被抗体的稀释，羊抗鼠Ig0.05mol/LPBS稀释到1.2mg/ml工作浓度，cTnI捕获抗体用0.05mol/LPBS稀释到1.1mg/ml工作浓度；

5.2包被前小试

1)各取20ul试包被1条20cm长的膜，线浓度1.0ul/cm；

2)2℃-8℃过夜；

3)贴膜；

4)温度20-30℃、相对湿度30-35％干燥5小时，最后送质检部检验质检合格；

5.3包被生产

1)cTnI包被小试质检合格单；

2)羊抗鼠IgG、cTnI捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度1.0ul/cm；

3)2℃-8℃过夜；

4)贴膜；

5)温度20-30℃、相对湿度30-35％，干燥5小时；

6)抽1板送质检部作膜金匹配；

7)密封后送中间品库暂存。

3.根据权利要求1所属的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其检测流程为：采用以上技术方案制作标本，加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，其分为以下三种情况：

(一)、阳性：15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效，只要在检测区域出现有色带即可以读取结果，很低浓度的cTnI会在长于15分钟的时候出现两条带；

(二)、阴性：如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效；

(三)、无效试验：如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应选用另一个新的卡片重新测试。

Images